CN104662160A - 极端pcr - Google Patents

Abstract

提供具有改进的效率和产量的用于在<20秒钟循环内进行PCR的方法、装置和试剂盒。

Description

极端PCR

发明背景

聚合酶链式反应(PCR)是一种广泛用于分子生物学的技术。其名称来源于其关键成分之一，一种通过体外酶促复制扩增一段DNA的DNA聚合酶。随着PCR进行，所产生的DNA (扩增子)本身用作复制的模板。这使链式反应处于运转中，其中DNA模板以指数扩增。随着PCR，有可能扩增几个数量级的单拷贝或几个拷贝的一段DNA，产生数百万或更多拷贝的DNA片段。PCR利用热稳定聚合酶、dNTP和一对引物。

PCR在概念上分成3个反应，每个反应通常假定在3种温度的每一种下随时间推移而发生。根据每个循环在3种温度下在3个时段内发生的3个反应(变性、退火和延伸)，容易理解PCR的这种“平衡范例”。然而，该平衡范例并不与物理现实良好契合。不会发生瞬时温度变化；需要花时间改变样品温度。此外，各个反应速率随温度而变化，且一旦发生引物退火，则聚合酶延伸紧随其后。特别对于快速PCR，更准确的是其中反应速率和温度总在变化的动力学范例。在PCR期间保持温度恒定不是必需的，只要产物变性和引物退火。在PCR的动力学范例下，产物变性、引物退火和聚合酶延伸可能短时重叠，并且其速率随温度而不断变化。在平衡范例下，循环通过各持续一段时间的3种温度界定，而动力学范例需要转缓变率和目标温度。图15a-15b显示了平衡和动力学范例的说明性时间/温度曲线图。然而，要理解，这些温度曲线图只是说明性的，且在某些PCR实施中，退火和延伸步骤合并，使得只需要2种温度。

范例无对错，但它们在其实用性上不同。平衡范例易于理解，良好地付诸于工程理念和仪器制造。动力学范例与生物化学、快速循环PCR和解链曲线分析更相关。

当PCR在1980年代后期首次推广时，过程缓慢。一个典型方案是在94℃下变性1分钟，在55℃下退火2分钟，在72℃下延伸3分钟。在包括用于温度间的转变的时间时，8分钟循环是典型的，导致在4小时内完成30个循环。25%的循环时花费在温度转变上。当循环速度提高时，花在温度转变上的时间的比例也提高，且动力学范例变得越来越相关。在快速循环PCR期间，温度常常改变。对于短的产物(<100 bp)的快速循环PCR，100%的时间可能花在温度转变上，不需要保持时间。对于较长产物的快速循环PCR，可包括保持在最佳延伸温度上的温度。

孤立来看，术语“快速PCR”既是相关的，又是不明确的。与4小时相比，1小时PCR是快速的，但与15分钟相比则是慢的。此外，如果以较高模板浓度开始或使用较少循环，则可使PCR方案较短。一个更具体的度量是每个循环需要的时间。因此，“快速循环PCR” (或“快速循环”)在1994年定义为在10-30分钟内完成30个循环(1)，导致各为20-60秒钟的循环。每个循环的这个实际时间比通常针对变性、退火和延伸编程的时间总和长，因为需要时间以使这些阶段每个之间的温度缓变。1990年代早期的初步研究证实了使用用于温度控制的毛细管和热气进行快速循环的可行性。多年来，系统变得更快，且变性、退火和延伸的动力学要求变得更清楚。

在一个早期快速系统中，发热元件和干发器的风扇、温差电偶和毛细管中的PCR样品被封闭在一个室内(2)。风扇产生快速流动的热风通过温差电偶和毛细管。通过使温差电偶的热反应与样品匹配，温差电偶的温度密切跟踪样品的温度，甚至在温度变化期间。尽管空气具有低的导热性，但空气沿着由毛细管所暴露的大的表面积快速移动足以使样品在变性、退火和延伸温度间循环。电子控制器监测温度，调节发热元件的功率，并提供循环所需要的计时和次数。对于冷却，控制器激活螺线管，螺线管打开通向外部空气的入口，将冷却空气引入否则密封的室中。

使用毛细管/空气系统可快速改变温度。使用低热质量室、循环空气和玻璃毛细管中的样品，仅在10分钟的PCR (30个循环，各20秒钟)后，就在溴化乙锭染色凝胶上观察到>500 bp的PCR产物(3)。产物产量受延伸时间和聚合酶浓度的影响。以30秒钟循环时间(对于延伸，在70和80℃间约10秒钟)，随聚合酶浓度增强的谱带强度从0.1单位/10 μl反应物增加到0.8单位/10 μl反应物。注意，聚合酶单位定义可能混乱。对于天然Taq聚合酶，在典型的快速循环条件下，0.4 U/10 μl为约1.5 nM (50)。

在变性和退火温度下，快速方案利用瞬间或“0”秒钟保持。也就是说，温度-时间曲线显示变性和退火的温度峰值，而不保持顶部和底部温度。变性和退火可非常快地发生。

温度的快速和精确的控制允许分析研究PCR所需要的温度和时间。对于人基因组DNA的说明性536 bp片段(β-珠蛋白)，介于91℃和97℃之间的变性温度是同样有效的，变性时间从<1秒钟到16秒钟同样如此。然而，发现长于16秒钟的变性时间实际上降低产物产量。用50-60℃的退火温度获得呈良好产量的特定产物，只要限制引物退火的时间。也就是说，通过从变性到退火的快速冷却和<1秒钟的退火时间，获得最佳特异性。产量在75-79℃的延伸温度下最佳，并且随至多约40秒钟的延伸时间而提高。

从这项早期研究到出的结论是：1) PCR产物的变性非常快，无需保持变性温度，2)引物的退火可极快地发生，且退火温度保持可能不是必需的，和3)所需的延伸时间取决于PCR产物长度和聚合酶浓度。此外，就特异性和产量而言，快速循环PCR不仅仅更快，而且更好(4，5)，只要精确控制温度。PCR速度不受可获得的生物化学的限制，但受无法严密或快速控制样品温度的仪器的限制。

然而，最新的实验室PCR仪器以瞬间的变性和退火时间而表现不佳，许多甚至不允许“0”秒钟保持时间的编程。通过圆锥管壁的热传递的时间延迟、低的表面积-体积比率和大样品的加热迫使大多数仪器在变性和退火时依靠时间延长以确保样品达到所需温度。随着这些时间延迟，确切温度与时程变得不明确。结果是商品化产物内再现性有限且商品化产物之间变化性高(6)。许多仪器显示在温度转变期间明显的温度改变(7，8)。温度的下冲和/或过冲是一个惯常问题，试图通过取决于样品体积的软件预测难以解决。可随老化而变化的仪器的热性质使所述困难复杂化。

随时间推移，常规加热块仪器变得更快，具有“薄壁”管的改进增加、样品间更多传导的热分布、低热质量块(mass block)和其它“快速”改进。然而，对于循环快到足以在少于60秒钟内完成一个循环的这些系统是不常见的。很少加热块系统可达到<60秒钟循环，在有限的温度范围间通常限于2种温度循环。通过平整样品容器，快速循环可通过电阻加热和空气冷却(9)，或通过移动保持在恒定温度下的加热区间柔性管中的样品(美国专利号6,706,617)来实现。

对于PCR自1991 (1)以来，而对于实时PCR自1996 (10，11)以来，可获得空气/毛细管系统的商品化形式。通常将其它仪器的快速循环能力与最早显示20-60秒钟循环的空气/毛细管标准进行比较。最奇怪的是，多年来有将毛细管/空气系统运行得更慢的趋势，或许反映了许多用户对“0”秒钟变性和退火时间的不适。此外，热激活的酶需要长的激活期，常常使运行时间加倍，甚至当使用“快速”活化酶时。另一种远离快速循环的折衷方法是使用塑料毛细管。这些毛细管不与仪器热匹配，因此在变性和退火时通常需要20秒钟保持以达到目标温度(12)。

进一步减少PCR循环时间的某些进展发生在微系统中，其中自然处理小的体积(13，14)。然而，即使用高表面积-体积比的样品室，如果发热元件具有高热质量并在室的外部，循环也可能长(15)。随着薄膜电阻加热器和温度传感器接近样品，可现实10-30分钟扩增(16，17)。

虽然低热质量系统的冷却一般通过被动热扩散和/或通过强迫通风，但是开发了数种有价值的加热方法。红外辐射可用于加热(18)，以标准化红外高温计用于温度监测(19)。或者，玻璃毛细管上的薄金属膜可用作用于快速循环的电阻发热元件和温度传感器两者(20)。最后，PCR溶液通过电解电阻的直接焦耳加热和温度监测是可能的，并且已在毛细管中实施(21)。所有上述方法将热在固定样品间来回传递。

可将样品以物理方法移动到不同的温度浴，或通过具有固定温度区的通道，作为将热在静止样品间来回传递的替代。微型流体方法变得流行起来，其PCR流体通过保持在变性、退火和延伸温度的不同节段在通道内通过。在经过3个温度区来回通过的蜿蜒通道内(22)，并且在经过3个温度扇区的递增或递减半径的环路内(23)，已证实连续流PCR。具有蜿蜒布局的变体使用静止热梯度而不是等温区，以更严密地契合PCR的动力学范例(24)。为了限制PCR所必需的微通道的长度，一些系统通过双向压力驱动流(25)、气体力学(26)或动电力(27)使样品在温度区之间来回穿梭。单一环状通道可与作为磁性铁磁流体(28)或通过对流(29)驱动的样品移动一起使用，以替代样品的线性穿梭。微系统PCR (包括连续流方法)的一个潜在优势是循环速度。

虽然一些微系统仍需要>60秒钟循环，但是许多在快速循环PCR的20-60秒钟循环范围运转(13，30)。已报道了红外线加热范围为16-37秒钟的最小循环时间(18，19)。涂覆金属的毛细管已达到40秒钟PCR循环(20)，而直接电解加热扩大为21秒钟循环(20)。已报告的闭环对流PCR的最小循环时间的范围为24-42秒钟(29，31)。几个小组致力于将PCR循环时间减至<20秒钟，快于1990年首次表明的快速循环PCR的最初定义。对于25 μl样品，静止样品的薄膜电阻加热减少循环时间低至17秒钟(32)，对于100 nl样品减少低至8.5秒钟(17)。以热梯度PCR (24)和样品穿梭(26)，连续流系统已实现12-14秒钟循环，而铁磁流体环(ferrofluid loop)声称以9秒钟循环的成功PCR (28)。对于不同大小的PCR产物，通过玻璃和塑料基质的连续流系统已实现6.9秒钟(22)和5.2秒钟(23)的循环时间。通过铝基质的交替冷热水传导在油的情况下以5.25秒钟循环扩增1 μl液滴(33)。同样，通过多孔铜块的水传导以4.6秒钟循环扩增5 μl样品(34)。通过蒸气压扩大的1 μl反应塞(reaction plug)的连续流装置实现了3秒钟循环(35)。另外，有报告称，通过将毛细管浸入夹在Peltier元件(Peltier element)间的镓中，在毛细管中以2.7秒钟循环扩增大肠杆菌(E. coli)的Stx噬菌体的85 bp片段(36)。或者，在通过加压的冷热气体循环的毛细管中的PCR扩增得到2.6秒钟循环(48)。

表1概括了使PCR循环时间最小化至低于最初定义的“快速PCR”的20秒钟循环的研究。在过去的20年间，开发了逐步提高循环速度的新的原型仪器。然而，实际的PCR性能(效率和产量)常常低下。作为常规，在循环变得越来越短时，对成功PCR的申明与以较高起始浓度(参见例如美国专利号6,210,882，其中使用5 ng扩增子作为起始样品)使用的较低复杂性目标(细菌、噬菌体、多拷贝质粒或甚至PCR产物)相关。实际上，表1所列<20秒钟循环的研究无一使用复杂的真核DNA例如人DNA。模板分子的起始拷贝数常常非常高(例如180,000,000拷贝的λ噬菌体/μl)，使得在声称成功前，几乎不需要扩增。此外，在许多研究中缺乏无模板对照引起了有关阳性结果有效性的疑问，尤其在具有高模板浓度的环境中。一种仪器导向的报告深入致力于热循环装置的设计和建模，其最终的简要PCR说明使用高浓度的低复杂性目标。根据无PCR样品存在的建模和测量，报告了加热和冷却速率(高达175℃/s) (17)。

减少循环时间的一种方法是将变动引入PCR方案以减少温度循环要求。具有较高Tm的较长引物允许较高的退火温度。通过限制产物长度及其Tm，可降低变性温度至恰在产物Tm之上。较高的退火和较低变性温度联合起来降低成功扩增所需要的温度范围。将3步循环(变性、退火和延伸)减少为2步(变性和联合退火/延伸步骤)同样简化温度循环要求。温度范围降低和2步循环两者对于表1中循环时间<20秒钟的研究是典型的。然而，如果联合退火/延伸步骤在低于最适的70-80℃温度(其中聚合酶最具活性)的温度下进行，则2步循环可能损害聚合酶延伸速率。随着直到约70-80℃的温度，聚合酶延伸速率是对数线性的，60-120 bp/s为报告的最大值(50)。

即使有方案变动，但是在与对照反应相比时，当循环时间<20秒钟时，扩增效率和产量常常低下(22，23)。朝着更快PCR的这些努力似乎以工程占主导，几乎不关注生物化学。随循环时间从20秒钟向2秒钟降低，PCR产量减少，最后消失，反映了甚至用高拷贝数的简单目标都缺乏稳健性。

表1中公开的各参考文献中的仪器可能适于极快PCR，如果反应条件相容的话。如本文所公开的，致力于引物、聚合酶和Mg++的浓度增加允许“极端PCR (extreme PCR)” (具有<20秒钟循环的PCR (在<10分钟内30个循环))，同时保持反应稳健性和产量。

发明概述

在本发明的一个方面，提供用于在扩增期间扩增生物样品中的目标核酸序列的方法，所述方法包括将配置用于目标核酸序列扩增的热稳定聚合酶和引物加入生物样品中的步骤，其中聚合酶以至少0.5 μM的浓度提供，且引物各以至少2 μM的浓度提供，并且利用其中每个循环在少于20秒钟/循环内完成的极端温度循环特征(extreme temperature cycling profile)，通过使生物样品通过多个扩增循环在至少变性温度和延伸温度之间热循环，经聚合酶链式反应扩增目标核酸序列。

在本发明的另一个方面，提供用于在扩增期间扩增生物样品中的目标核酸序列的方法，所述方法包括将配置用于目标核酸序列扩增的热稳定聚合酶和引物加入生物样品中的步骤，其中聚合酶与引物的比率为(约0.03-约0.4聚合酶):(总引物浓度)，聚合酶浓度为至少0.5 μM；并且利用其中每个循环在少于20秒钟内完成的极端温度循环特征，通过使生物样品通过多个扩增循环在至少变性温度和延伸温度之间热循环，经聚合酶链式反应扩增目标核酸序列。

在本发明的又一个方面，提供用于进行PCR的装置，所述装置包括用于容纳PCR样品的样品容器、用于加热样品的工具、用于冷却样品的工具和用于使样品容器重复置于用于加热样品的工具和用于冷却样品的工具中以至少200℃/s的缓变率使样品热循环的控制工具。

在再一个实施方案中，提供用于对目标核酸进行PCR的试剂盒，试剂盒包括：dNTP、以至少0.5 μM的浓度提供的聚合酶和配置用于扩增目标核酸的一对引物，其中引物各以至少2 μM的浓度提供。

考虑下列优选实施方案的详细描述，本发明的其它特征对于本领域技术人员而言是显而易见的，所述优选实施方案举例说明了如目前理解的实施本发明的最佳方式。

附图简述

图1a显示用于进行极端PCR的原理图。

图1b是进行具有用于监测水浴中的一个样品管的实时能力的极端PCR的说明性装置。

图1c是进行具有3种温度循环的极端PCR的说明性装置。

图1d中图1b中所述装置的光学部件的近视图，其还显示了温度参比毛细管。

图2a是使图1b的样品夹具的位置(-----)与样品的温度(——)重叠的曲线图。

图2b是使用图1b所示装置的极端PCR的温度曲线。

图2c是针对图2b进行比较所显示的使用旋转式传送带LightCycler的快速循环PCR的温度曲线。

图3a显示采用图2b的温度曲线图扩增的极端PCR产物(-----)和快速循环PCR产物(—··—)的导数解链曲线，含极速(——)和快速(— ? —)循环的阴性对照。

图3b是图3a的相同样品的2% SeaKem LE琼脂糖凝胶，泳道1和8是大小标志物，泳道2和3是产生于30秒钟极端PCR的产物，泳道4是30秒钟极端PCR的无模板对照，泳道5和6是产生于12分钟PCR的产物，泳道7是12分钟PCR的无模板对照。

图3c显示扩增图3a和3b所示相同产物的极端PCR温度迹线(-----)，以及所述反应的实时监测(——)。

图4a显示通过温度控制提高延伸速率的极端PCR温度迹线。

图4b显示图4a的放大部分，使图1b的样品夹具的位置(——)与样品的温度(-----)重叠。

图4c是IRL10RB的58 bp扩增子的负导数解链曲线(-dF/dT)，其中显示了AA (——)、AG (— ? —)和GG (-----)基因型。

图5a是采用极端PCR，绘制聚合酶浓度相对于引物浓度相对于PCR产物浓度的三维图。

图5b是图5a中所用的极端PCR温度迹线。

图5c显示来自图5a的4 μM Klentaq聚合酶(KT POL)产物的负导数解链曲线。

图5d是显示在来自图5a的10 μM引物浓度下使用不同聚合酶浓度的极端PCR结果的琼脂糖凝胶。

图6a是在19号不锈钢管中进行的极端PCR的温度迹线。

图6b是根据图6a的极端温度循环产生的PCR产物的凝胶。

图7a是具有长的(1秒钟)联合退火/延伸步骤的极端PCR温度迹线。

图7b是采用针对102 bp产物的极端PCR，绘制聚合酶浓度相对于引物浓度相对于PCR产物浓度的三维图。

图8a显示采用1秒钟联合退火/延伸步骤用于扩增226 bp产物的极端PCR温度曲线图。

图8b显示采用4秒钟联合退火/延伸步骤用于扩增428 bp产物的极端PCR温度曲线图。

图8c显示获自图8a的实时结果和采用2秒钟退火/延伸步骤的类似温度迹线，包括每个的无模板对照。

图8d显示获自图8b的实时结果和采用5秒钟退火/延伸步骤的类似温度迹线，包括每个的无模板对照。

图9a显示在不同起始浓度下KCNE1的45 bp片段的扩增曲线。

图9b是Cq相对于来自图9a数据的log-₁₀ (初始模板拷贝)的曲线。反应以一式五份进行。图9c-9d类似于图9a-9b，只是显示NQO1的102 bp片段的扩增。

图10a是采用针对300 bp产物的极端PCR (20个循环，4.9秒钟/循环)，绘制聚合酶浓度相对于引物浓度相对于PCR产物浓度的三维图。

图10b显示使用KAPA2G FAST聚合酶和1-5秒钟延伸时间针对500 bp合成模板的PCR扩增的荧光与循环数曲线。

图10c是对于几种KlenTaq聚合酶浓度和KAPA2G FAST聚合酶，延伸长度相对于最小延伸时间的示图。

图11a-11c显示以下大小的产物的PCR扩增的荧光与循环数曲线：100 bp (图11a)、200 bp (图11b)、300 bp(图11c)、400 bp (图11d)和500 bp (图11e)。

图12a显示使用不同的镁浓度，在35个极端PCR循环后AKAP10的60 bp片段的负导数解链曲线。

图12b是图12a的负导数解链曲线中所显示的PCR产物的凝胶。

图13a显示采用不同循环时间与5 mM Mg⁺⁺，在35个循环后AKAP10的60 bp片段的负导数解链曲线。循环时间为0.32秒钟(——)、0.42秒钟(—··—)、0.52秒钟(— ? —)和0.62秒钟(-----)。循环时间包括保持在60°浴槽中0.1-0.4秒钟。

图13b是图13a的负导数解链曲线中所显示的PCR产物的凝胶。

图14a显示在以下3种不同仪器上扩增的AKAP10的60 bp片段的负导数解链曲线：(1)极端PCR，(2) LightCycler (Roche)，和(3) CFX96 (BioRad)。

图14b是图14a的负导数解链曲线中所显示的PCR产物的凝胶。

图15a-15b显示PCR的平衡范例(图15a)和动力学范例(图15b)的说明性概况。实心黑色表示热循环期间核酸的变性，有条纹的表示退火，实心白色表示延伸。

发明详述

本文所用术语“a”、“an”和“the”定义为意指一个或多个，并包括复数，除非上下文中不相适宜。范围在本文可表示为从“约”一个具体值和/或到“约”另一个具体值。术语“约”在本文用来意指近似、大约、大致上或左右。当术语“约”与数值范围联用时，通过延伸高于和低于所示数值的边界来修饰该范围。一般来说，本文使用术语“约”修饰数值高于和低于规定值达5%的差异。在表示这种范围时，另一个实施方案包括从一个具体值和/或到另一个具体值。同样，当值通过使用前项“约”表示为近似值时，则应理解具体值形成另一个实施方案。还应理解，每个范围的终点在相对于另一个终点和独立于另一个终点两者上均是有效的。

本文使用的措词“或”意指具体列表的任一个成员，还包括该列表成员的任何组合。

所谓“样品”意指按本文所述测定的动物；来自动物的组织或器官；细胞(可在受试者内、直接取自受试者或保持在培养中或来自培养的细胞系的细胞)；细胞裂解物(或裂解物级分)或细胞提取物；含有来源于细胞、细胞物质或病毒物质的一种或多种分子(例如多肽或核酸)的溶液；或含有天然或非天然存在的核酸的溶液。样品还可以是含有细胞、细胞成分或核酸的任何体液或排泄物(例如但不限于血液、尿液、大便、唾液、眼泪、胆汁)。

本文所用短语“核酸”是指通过Watson-Crick碱基配对能够与互补核酸杂交的天然存在的或合成的寡核苷酸或多核苷酸，不论DNA或RNA或DNA-RNA杂交体、单链或双链、有义或反义。本发明的核酸还可包括核苷酸类似物(例如BrdU、dUTP、7-脱氮杂-dGTP)和非磷酸二酯核苷间键(例如肽核酸(PNA)或硫代二酯键)。具体地说，核酸可包括而不限于DNA、RNA、cDNA、gDNA、ssDNA、dsDNA或其任何组合。

所谓“探针”、“引物”或“寡核苷酸”意指可与含有互补序列(“靶”)的第二DNA或RNA分子碱基配对的规定序列的单链DNA或RNA分子。所得杂交体的稳定性取决于长度、GC含量、最近邻堆集能和发生碱基配对的程度。碱基配对的程度受例如探针和靶分子之间互补性的程度和杂交条件的严格性程度等参数影响。杂交严格性程度受例如温度、盐浓度和有机分子(例如甲酰胺)的浓度等参数影响，并通过本领域技术人员已知的方法测定。探针、引物和寡核苷酸可以是通过本领域技术人员熟知的方法放射性、发荧光或非放射性可检测标记的。dsDNA结合染料(当与双链DNA结合时比当与单链DNA结合或游离于溶液中更强地发荧光的染料)可用来检测dsDNA。要理解，“引物”经特别配置以通过聚合酶延伸，而“探针”或“寡核苷酸”可以或可以不如此配置。

所谓“特异性杂交”意指探针、引物或寡核苷酸识别基本互补的核酸(例如样品核酸)，并且在高严格性条件下与基本互补的核酸在物理上相互作用(即碱基配对)，且基本上不与其它核酸碱基配对。

所谓“高严格性条件”意指允许相当于产生于以下情况下的杂交的条件：使用长度为至少40个核苷酸的DNA探针，在含有0.5 M NaHPO4 (pH 7.2)、7% SDS、1 mM EDTA和1% BSA (组分V)的缓冲液中在65℃的温度下或含有48%甲酰胺、4.8X SSC、0.2 M Tris-Cl (pH 7.6)、1X Denhardt溶液、10%硫酸葡聚糖和0.1% SDS的缓冲液中在42℃的温度下。用于高严格性杂交的其它条件，例如用于PCR、RNA印迹、DNA印迹或原位杂交、DNA测序等的其它条件是分子生物学领域普通技术人员熟知的(47)。

在说明性的实施方案中，提供循环时间<20秒钟的PCR的方法和试剂盒，其中一些实施方案使用<10秒钟、<5秒钟、<2秒钟、<1秒钟和<0.5秒钟循环时间。按这些循环时间，30个循环PCR分别在<10分钟、<5分钟、<2.5分钟、<1分钟、<30秒钟和<15秒钟内完成。因为PCR速度变得越来越快，所以引物和聚合酶浓度提高，从而保持PCR效率和产量。

损害PCR的3组成反应(引物退火、聚合酶延伸和模板变性)的任一个可能限制PCR的效率和产量。例如，如果引物退火至仅模板的95%，则PCR效率不会大于95%，即使100%的模板变性，且100%的引物模板延伸至全长产物。同样，如果延伸效率仅95%，则最大可能的PCR效率仅为95%。为了使PCR产物浓度每个循环都翻番，所有的组成都必须达到100%完成。在下面的段落中将依次考虑变性、退火和延伸。

在慢(>60秒钟循环)、快(20-60秒钟循环)和极端(<20秒钟循环) PCR温度循环中，不充足的变性是PCR失败的常见原因。目标是每个循环完全变性，提供可用于引物退火的定量模板。在PCR前，模板，特别是基因组DNA的初始变性，常常需要比PCR期间扩增产物变性更严格的条件。在煮沸模板(一种确保基因组DNA的初始变性的好方法)后，进行快速循环PCR的最初优化(4)。用高Tm靶标，特别是具有高稳定性的侧翼区的那些靶标，可能产生不完全的初始变性(37)。特别是如果在变性期间较小温度差异影响PCR效率，则这可能损害定量PCR (例如对于基因组插入或缺失) (37-39)。如果不需要在前的煮沸或限制性消化(37)，且较高的变性温度损害聚合酶，则可使用降低产物Tm的辅助剂辅助变性。

虽然94℃常用作变性的默认目标温度，但它不经常是最佳的。PCR产物在40℃范围内解链，主要取决于GC含量和长度(43)。当PCR产物解链足够低，使得可以使用更低的变性温度时，低变性目标温度具有速度和特异性优势两者。变性温度越低，样品可越快地达到变性温度，并且可越快地进行PCR。额外的特异性产生自消除具有较高变性温度的所有潜在产物，因为这些潜在产物可保持双链，并且将不能用于引物退火。为了扩增高Tm产物，目标温度可能需要提高到94℃以上。然而，最通用的热稳定聚合酶在97℃以上开始变性，且PCR溶液在95和100℃之间可能煮沸，这取决于海拔，因此升高温度没有太多余地。降低一价盐和Mg⁺⁺浓度降低产物Tm。同样，掺入dUTP和/或7-脱氮杂-dGTP也降低产物Tm，但可能降低聚合酶延伸速率。大多数专用PCR “增强剂”是降低产物Tm的简单有机物，使高Tm产物能够变性(并扩增)。这些中最通用的是DMSO、甜菜碱、甘油、乙二醇和甲酰胺。除了降低Tm以外，这些添加剂中的一些还提高PCR混合物的沸点(在高海拔下特别有用)。当增强剂的浓度增加时，产物Tm降低，但聚合酶抑制可能增加。

然而，变性甚至在极端循环条件下都不必是限速的，因为DNA解旋是一级的并且非常快(10-100 msec)，甚至当温度只略高于产物Tm。变性在高于扩增产物Tm 2-3℃下发生得如此快使得它难以测量，但扩增子的完全变性可能在少于0.1秒钟内发生。如果产物在多个结构域中解链，则目标变性温度应为高于最大解链结构域的2-3℃。只要样品达到该温度，变性便非常快，甚至对于长的产物。使用毛细管和水浴(40)，超过20 kB的PCR产物的完全变性在少于1秒钟内发生(52)。用DNA染料和高分辨解链根据实验说明性地测定产物Tm和解链结构域(41)。虽然Tm估算可通过软件预测获得(42)，但其准确度有限。此外，所观察的Tm很大程度上取决于局部反应条件，例如盐浓度及任何染料和辅助剂的存在。因此，所观察的Tm通常与反应条件更好地匹配。

在对效率没有任何作用的情况下，至变性的接近速率可尽可能地快，例如200-400℃/s，如图2a和6a所示。在这些速率下，只需要约0.1-0.2秒钟就达到变性温度。然而，当接近目标温度时，较慢的速率降低超过目标温度的风险，并且避免可能的聚合酶失活或溶液的煮沸。达到较慢的接近温度的一种说明性方法是将样品浸入超过目标温度达5-10℃的热水浴中。目标温度和浴温间的温度差异决定了当差异减小时自动减慢的指数接近曲线。通过连续监测温度，当达到变性目标时，引发下一阶段(朝退火冷却)。总的来说，PCR中的完全产物变性要求在高于产物的最高解链结构域温度2-3℃的温度下<0.2 s，并且尽可能快地接近变性温度，以40-400℃/秒钟为例说明。由于变性是一级的，因此其速率只取决于产物浓度，且效率(或变性产物的百分比)不依赖于产物浓度。

不完全和/或错向的引物退火可导致差的PCR。如果不是所有模板位点被引发，则产生低效率。此外，如果引发发生在非期望的位点，则可能产生替代产物。目标是每个循环基本上整个引物仅退火至所需位点，为聚合酶延伸提供定量引物模板。

具有20-60秒钟循环的快速PCR方案表明在低于500 nM引物Tm 5℃下退火时间<1秒钟(52)。对于试图<20秒钟循环的仪器，引物浓度的范围各为200-1,000 nM (表1)。这些浓度类似于用于其中使用长的退火时间的常规PCR (>60秒钟循环)的浓度。降低引物浓度常用于提高特异性，而因有关非特异性扩增的顾虑所致，几乎不考虑增加引物浓度。然而，随着快速循环，提高的特异性归因于较短的退火时间(5)。如果这种趋势持续，则可预期极端PCR极短的退火时间应耐受高引物浓度。为了促进退火，对于20-60秒钟循环推荐低于引物Tm 5℃的退火温度。最好在用于扩增的相同缓冲条件下，使用饱和的DNA染料和寡核苷酸通过解链分析，根据实验测量Tm。将引物与其具有5’-延伸作为悬垂端的互补靶混合，以最大程度地接近退火至其模板的引物的稳定性，并进行解链分析。

与变性形成对比，退火效率取决于引物浓度。引物退火在非常快的循环速度下可变成限制性的。引物退火是依赖于引物和目标浓度两者的二级反应。然而，在大部分PCR期间，引物浓度比目标浓度高得多，退火实际上是准一级的，并且只取决于引物浓度。在这种情况下，被引发的产物的分数(退火效率)只取决于引物浓度，而非产物浓度，使得较高的引物浓度应允许较短的退火时间。此外，虽然不受理论束缚，但是认为这种关系是线性的。在退火时间变得越来越短时，高的引物浓度变得对保持PCR的效率和产量是必要的。例如，在低于引物Tm 5℃的温度下，快速循环允许约1-3秒钟用于退火(3)。如果该退火时间(在Tm-5℃下或低于Tm-5℃)在极端PCR中降低10倍，则如果引物浓度增加10倍可预期类似的引发效率。因为可获得的退火时间变得越来越短，应使引物浓度变得越来越高达近似相同的倍数。典型的快速PCR方案使用500 nM各引物。如果极端PCR中的退火时间降低3-40倍，则获得相同引发效率所需要的引物浓度为1,500 – 20,000 nM各引物。这相当于3,000 – 40,000 nM总引物，高于表1中的任何引物浓度。这表明了在<20秒钟循环的较早尝试中效率差的一个原因是退火效率差，次于不充分的引物浓度。在极端PCR中，引物浓度各增加至1.5-20 μM以获得优异的退火效率，尽管退火时间为0.05 – 0.3秒钟。对于总是较短的退火时间可考虑总是较大的引物浓度，使用升高的引物浓度抵销减少的退火时间以获得相同的退火效率。注意，大部分市售仪器需要至少1秒钟的保持时间，虽然少数仪器允许“0”秒钟的保持时间，但市售仪器不允许几分之一秒的保持时间。对于极端PCR的一些说明性实例，可能需要以0.1或0.01秒钟递增的保持时间。

提高退火速率和缩短退火时间而不损害效率的另一种方法是增加Mg⁺⁺浓度。本领域已知用增加离子强度来提高退火速率，并且对于提高杂交速率，包括引物退火，二价阳离子是特别有效的。

说明性地，至退火目标温度的接近速率可尽可能地快。例如以200-800℃/s (图2a和6a)，可在0.05-0.2秒钟内达到退火温度。快速冷却还使全长产物再次杂交减至最小。就冷却期间双链体扩增产物形成而言，由于引物不能退火至双链体产物，因此PCR效率降低。尽管这在PCR早期少见，但随着产物浓度增加，越来越多的双链体在冷却期间形成。用SYBR? Green I的连续监测表明，这种产物重退火可能是PCR平稳期的主要原因(44)。

聚合酶延伸也需要时间，并且当延伸时间短时，可能限制PCR效率。已知在PCR期间较长的产物需要较长的延伸时间，在PCR结束时，常常附加几分钟的最终延伸，据推测以完成所有产物的延伸。用于长产物的常用方法是延长用于延伸的时间。使用较低的延伸温度进一步延长所需时间，正如在2步循环的一些情况下，在2步循环中引物退火和聚合酶延伸在相同温度下进行。

对于最佳PCR效率，需要基本上每个循环引物模板的完全延伸。大多数聚合酶延伸速率随温度提高，达到某个最大值。对于Taq聚合酶，最大值为在75-80℃下约100个核苷酸/s，对于温度每降低10℃，最大值降低约4倍(50)。对于536 bp β-珠蛋白产物，发现76℃在快速循环PCR中最适宜(4)。最近引进了更快的聚合酶，其在商业上宣称可减少总的PCR时间，表明它们能够消除或缩短较长产物的延伸保持时间。

作为更快的聚合酶延伸速率的替代或补充，已发现提高聚合酶浓度减少所需要的延伸时间。考虑到用500 nM各引物的PCR的标准Taq聚合酶浓度(0.04 U/μl)或1.5 nM (49)，如果各引物与模板连接，则每次只有足够的聚合酶延伸0.15%的模板，要求聚合酶反复再循环至新的引物模板以将其全部延长。通过增加聚合酶浓度，更多可获得的引物模板被同时延伸，减少延伸所有模板所需要的时间，据推测不是通过较快的延伸速率，而是通过在任何指定时间内延伸较大比例的引物模板。

大致上，对于小的PCR产物(<100 bp)，所需的聚合时间显得与酶的聚合速率(其本身随温度而变)和聚合酶浓度成正比。所需时间还与待延伸的模板长度(产物长度减去引物长度)成反比。通过提高聚合酶活性高于PCR中0.04 U/μl的标准活性20-300倍，具有<20秒钟循环的极端PCR可产生高产量的特异性产物。也就是说，0.8 – 12 U/μl (1-16 μM的KlenTaq)的活性使具有0.1-1.0秒钟的联合退火/延伸时间的两步极端PCR成为可能。之前所用的最高聚合酶活性为0.5 U/μl (表1)。对于用于极端PCR的说明性实例的两步PCR，在70-75℃下联合退火/延伸步骤对于较快的聚合速率是有利的。此外，因为两步PCR简化了温度循环，因此它通常被用于极端循环(<20秒钟循环)的说明性实例，并且在联合退火/延伸步骤期间快速退火和快速延伸两者必须发生。因此，升高的引物浓度和升高的聚合酶浓度两者用于说明性实例，产生在极端两温度循环下的稳健的PCR。说明性地，各1.5-20 μM的引物浓度和任何标准聚合酶的0.4 – 12 U/μl的聚合酶浓度(0.5-16 μM的KlenTaq)是在50-75℃下具有0.05 – 5.0秒钟的联合退火/延伸时间所必需的，如下面的实施例中所说明的。因为对于退火和延伸两者只有一个PCR循环环节，所以极端PCR条件需要加强以增加引物和聚合酶两者的浓度为例说明的两个过程。

还展望了极端三温度循环，其中退火和延伸步骤在不同温度下保持分开。在这种情况下，分配给退火和延伸步骤的时间可个别控制并调整以适应特殊需要。例如，如果仅退火时间短(0.05 – 0.2秒钟)，且延伸时间保持相对地长(以1、2、5、10或15秒钟用作说明)，则对于有效的PCR仅引物浓度需要增加。或者，如果延伸时间短(在70-80℃内< 1 sec)，但退火时间长，则认为仅聚合酶浓度需要增加以获得有效的PCR。要理解，有效的PCR具有至少70%的说明性效率，更多说明性的为至少80%，甚至至少90%。

对于长于100 bp的产物，采用极端PCR的高效延伸可能需要高聚合酶浓度和延长的延伸时间的组合。如果聚合酶过量，则最少时间说明性地应为单位为碱基的延伸长度(定义为产物长度减去引物长度)除以单位为碱基/秒钟的聚合酶延伸速率。然而，如前所述，聚合酶通常只在PCR开始时，在模板浓度增加到大于聚合酶浓度之前是饱和的。减少循环时间的一种方法是采用接近聚合酶的温度最大值(通常为70-80℃)的两温度PCR。可采用实时PCR并监测量化循环(quantification cycle)或Cq，根据实验确定所需要的延伸时间。例如，如果聚合酶浓度过量，则在75℃下在100碱基/秒钟的聚合酶延伸速率下，可预期200 bp产物需要约2秒钟。同样，使用此相同的聚合酶，可预期400 bp产物需要约4秒钟，只要其浓度大于被延伸的模板。如果聚合酶不过量，则加入更多的聚合酶允许更多模板在同一时间延伸，减少所需要的与聚合酶浓度成比例的延伸时间。

任何DNA分析方法的实用性都取决于它可如何快地进行、获得多少信息、进行时如何困难。与常规克隆技术相比，PCR快而简单。快速循环和极端PCR致力于所需时间的持续减少。实时PCR通过每个循环获取数据来增加信息含量。解链分析可在PCR期间或在PCR之后进行以连续监测随温度升高的DNA杂交。

回到PCR的平衡和动力学范例(图15a-15b)，产物<100 bp的极端PCR是动力学模型良好应用的实例。温度总在变化，并且变性、退火和延伸的速率取决于温度，因此通过对跨温度的组成反应速率积分，可仅获得PCR的适当评价。对于大于100 bp的产物，较长的延伸时间可能是必需的，且动力学和平衡模型两者的组成是适当的。

当反应条件按照本文的至少一个实施方案设定时，发现PCR可以极快的速率进行，以对于完成扩增低于1分钟的一些实施方案为例说明，其循环时间少于2秒钟。说明性地，增加的聚合酶和引物浓度的各种组合被用于这种极端PCR。虽然不受任何特殊理论的束缚，但是认为过量的引物浓度通常允许完全引物退火，从而提高PCR效率。此外不受任何特殊理论的束缚，认为聚合酶浓度的增加通过允许更多的完全延伸来提高PCR效率。升高的聚合酶浓度有利于与退火的引物结合，并且如果在完全延伸前聚合酶脱落，也有利于重新结合。下面的实施例显示极端PCR是成功的，甚至在用复杂的真核基因组DNA开始时。

虽然KlenTaq用于接下来的实施例，但认为考虑聚合酶延伸速率，类似活性的任何热稳定的聚合酶都可在极端PCR中以类似方式进行。例如，Herculase、Kapa2G FAST、KOD Phusion、天然或克隆的栖热水生菌(Thermus aquaticus)聚合酶、Platinum Taq、GoTaq和Fast Start是商品化的聚合酶制备物，所述聚合酶当以本文提供的高浓度使用(针对酶活性速率的差异作说明性调节)时，使极端PCR成为可能。

因为没有最近的商用PCR仪器允许2秒钟循环时间，设置了系统4以检验极端PCR的概念验证。然而，要理解，系统4是说明性的，且可快速热循环的其它系统也在本公开内容的范围内。如图1a所示，95.5℃ (进行本文实例所在之处Salt Lake City，UT的沸水温度)的热水浴10和30-60℃的冷水浴14用来改变样品容器20中所含1-5 μl样品的温度。说明性水浴10、14是4.5夸脱不锈钢贮槽(Lab Safety Supply，#41634)，但是500 ml玻璃烧杯用于一些实例中，并在磁性搅拌(Fisher Scientific Isotemp Digital Hotplates (#11-300-49SHP)的同时在电热板12、16上加热。然而，要理解，其它实施方案可用来加热和冷却样品。在图1a所示实施方案中，样品容器20是复合玻璃/塑料反应管(BioFire Diagnostics #1720，0.8 mm ID，1.0 mm OD)。然而，在其它实例中，皮下注射器针头(Becton Dickenson #305187，0.042”ID，0.075”OD)和由不锈钢管(Small Parts，0.042”ID/0.075”OD，0.035”ID/0.042”OD或0.0265”ID/0.035”OD)制造并套入BioFire管的塑料盖的复合不锈钢/塑料反应管用作样品容器20。虽然其它样品容器在本发明的范围内，但是最好样品容器具有大的表面积/体积比，并具有快的传热率。对于某些实施方案，通过使用火焰气加热至红白色并用夹钳压紧，使金属管的开口端密封。对于实时PCR，需要光学上透明或具有光学透明部分的管。通过短暂离心，使样品离心到各管底部。

样品容器20用通过臂21与步进电机轴26连接的管夹22夹住。管夹22自黑色Delrin塑料经机器加工以夹住2-5个样品容器20 (图1a中仅可见一个样品容器20，但是可存在一排这样的样品容器20)，使得将反应溶液保持在6.5 – 7.5 cm的半径范围内。虽然在图1a中看不见，但温差电偶(Omega T型精密细金属丝温差电偶#5SRTC-TT-T-40-36，36”引线，0.003’直径，具有Teflon绝缘体)可用来测量温度。参照图1d，该图显示具有代表类似组件的相似部件的图1b的类似的管夹和臂，存在被设计成夹住2个样品容器的管夹222，其中管夹222的一个位置被温差电偶228占据。要理解在有或没有温差电偶的情况下，本文所述的任何实施方案可使用任何数量的样品容器20或220，如图所示1d。温差电偶放大和线性化用Analog Devices AD595芯片(未显示)进行。先从AD595输出计算温差电偶电压为T型电压= (AD595输出/247.3) – 11 μV。然后采用T型温差电偶的电压/温度相关性的美国国家标准与技术研究院(National Institute of Standards and Technology)系数，将温差电偶电压转换成温度。通过安装在CPU 40上的LabView软件(2010版，National Instruments)将模拟信号数字化(PCIe-6363采集板)并进行处理，在用户界面42上观察。步进电机在87-92℃和60-75℃时说明性地被强有力的起动，或可被保持在各水浴中持续计算机控制的一段时间。通常进行30-50个循环。

将步进电机24 (Applied Motion Products，#HT23-401，3V,3A)置于水浴10和14之间，使得管夹22中所有样品容器20都可在各水浴10和14之间翻动，使得含有样品的各样品容器20的部分完全浸入水中。步进电机24说明性地被4SX-411 nuDrive (National Instruments，未显示)驱动，并受安装在CPU 40上的PCI-7344运动控制器和NI-Motion软件(8.2版，National Instruments)控制。步进电机24在约0.1秒钟内在水浴10和14之间旋转。图2a显示对于当步进电机在90℃和50℃下被引发时的运行，与样品容器20位置的迹线(-----)并列的样品温度迹线(——)。如图2中可见，有一些过冲至低于50℃的温度，据推测是由将样品容器20移动到水浴14之外所需的时间引起。因此，如上所述，可能需要在某种较高温度下起动步进电机24。在下面的实例中，给定温度是针对所达到的样品温度，而不是起动温度。自图2a计算的最大加热速率为385℃/s，最大值冷却速率为333℃/s。说明性地，极端PCR可以至少200℃/s的缓变率进行。在其它实施方案中，缓变率可为300℃/s或更大。

在一些实例中，系统4也被配置成用于实时监测。如图1a所示，对于实时监测，光学单元25的纤维光学头50被装在样品容器20上方，使得当通过步进电机24将样品容器20从热水浴10移动到冷水浴时，样品容器20在保持或不保持在该监测位置的情况下通过纤维光学头50。在这个说明性实施方案中，提供水浴上方空气中的纤维光学头。热循环装置4被CPU 40控制，并通过用户界面42观察。

图1b显示类似于图1a的实施方案。提供热板212和216用于控制热水浴210和冷水浴214的温度。提供步进电机224用于通过说明性地由铝制成的移动臂221和管夹222来移动样品容器220和温差电偶228 (图1d中显示)。然而，在这个实施方案中，纤维光缆252的端头250通过定位单元254保持在水浴214中。纤维光缆252通过端口248进入水浴214，并将信号提供给光学单元225。热循环装置204可被CPU 240控制，并在用户界面242上观察。

来自Ocean Optics LLS-455 LED Light Source 256的光被纤维光缆252 (Ocean Optics P600-2-UV-VIS，600 μm纤芯直径)引导至具有440 +/-20 nm激发光干涉滤光片、束分裂458 nm二向色性和490 +/- 5 nm发射光滤光片(均来自Semrock，未显示)的Hamamatsu光学单元258。毛细管的表面荧光照明用另一个纤维光缆(未显示)实现，另一纤维光缆当位于冷却器水浴中时被置于距1个样品毛细管约1-2 mm距离并与平行排列。发射光检测用Hamamatsu PMT 62。

图1c显示三温度PCR的说明性系统304。95.5℃的热水浴310、30-60℃的冷水浴314和70-80℃的中温水浴313用来改变样品容器320中所含1-5 μl样品的温度，在磁性搅拌的同时在3个电热板312、316和318上加热。样品容器320被通过臂321与步进电机324连接的管夹322夹住。温差电偶328也被管夹322夹住。在步进电机324旋转时臂321可被提起。说明性地提供中温水浴313中的纤维光学头350，但是要理解，它可置于空气中，与图1a一样。由该说明性实施方案的设置所致，不可能将3个水浴310、313和314彼此等距地放置。因此，将最大空间置于热水浴310和冷水浴314之间，因为需要这些浴槽之间样品的冷却，而样品在待加热的其它水浴之间移动。然而，要理解，这种配置只是说明性的，其它配置在本公开内容的精神之内。因为同时使用2个步进电机(一个将毛细管抬出水以外，一个在水浴之间转移)，所以可使每个的角动减到最低以减少浴槽之间运动的时间。在2水浴系统中，在浴槽之间转移样品的步进器所需的角动大于270度。然而，在3水浴系统中，将样品提升的步进电机需要低于45度横向移动，而在水浴之间移动样品的步进器只需要移动90度或更小。水浴还可在配置成圆形的扇面(饼形楔)以进一步限制所需的角运动。使角运动减到最小减少水浴间的移动时间。预期少于100毫秒或甚至少于50毫秒的移动时间。这个系统304的其它组件类似于图1a-b所示系统4、204，在图1c中未显示。

实施例1

除非另有说明，否则PCR在5 μl反应体积中进行，该体积中含有50 mM Tris (pH 8.3，在25℃下)、3 mM MgCl₂、200 μM各dNTP (dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、500 μg/ml非乙酰化牛血清白蛋白(Sigma)、2% (v/v)甘油(Sigma)、50 ng纯化的人基因组DNA和1X LCGreen^? Plus (BioFire Diagnostics)。引物和聚合酶的浓度随具体实验方案变化。Klentaq1^TM DNA聚合酶获自AB Peptides, St. Louis, MO或获自Wayne Barnes，Washington University (St. Louis)。KlenTaq的分子量为62.1 kD，在280 nm处的消光系数为69,130 M^-1cm^-1，从所述序列计算(美国专利号5,436,149)。质谱法证实占优势的分子量为62 kD，并且变性聚丙烯酰胺凝胶显示通过积分主要条带的纯度大于80%。利用吸光度和纯度计算浓度表明在10%甘油中的80 μM原液。最终的聚合酶浓度通常为0.25-16 μM。1 μM KlenTaq等于0.75 U/μl，其单位定义为在72℃下在30分钟内用活化鲑精DNA合成的10 nmol产物。引物通过犹他大学核心设施合成，脱盐，浓度通过A₂₆₀测定。各引物的终浓度通常为2.5-20 μM不等。

使用引物CCCATTCAACGTCTACATCGAGTC (SEQ ID NO:1)和TCCTTCTCTTGCCAGGCAT (SEQ ID NO:2)，从人基因组DNA扩增KCNE1的45 bp片段。引物把变体rs#1805128 (c.253G>A)括起，并扩增序列：CCCATTCAACGTCTACATCGAGTCC(G/A)ATGCCTGGCAAGAGAAGGA (SEQ ID NO:3)。

图3a显示使用图1a所示装置，通过极端PCR产生的PCR产物的解链曲线，其中使用0.64 μM KlenTaq和10 μM各引物，并在91℃和50℃之间循环，如图2b所示，持续35个循环，总扩增时间为28秒钟。每个循环需要0.8秒钟。图3a同样显示了在LightCycler中通过快速循环产生的同一扩增子的解链曲线，其中使用0.064 μM KlenTaq和0.5 μM各引物，且循环介于90℃和50℃之间持续35个循环，总扩增时间为12分钟(图2c)。每个循环需要10.3秒钟。注意因为图2b和2c中不同的时间标度，所以图2b的整个极端PCR方案以少于其快速循环对应物2个循环完成。两个反应产生具有类似Tm和凝胶电泳上的强条带的扩增子(图3b)，而阴性对照通过解链分析或凝胶电泳都不显示扩增。在这个说明性实施例中，当对凝胶分析时，极端PCR条件显示比快速循环PCR条件大的产量(图3b)。解链曲线Tm的0.5℃差异被认为是因各反应中甘油的不同量引起，这产生自聚合酶储存缓冲液中的甘油含量(PCR中甘油的终浓度在极速条件下为1.3%，在快速条件下为0.1%)。图3b还证实扩增子的大小相似并如所预测的一样。另外，尽管高浓度的聚合酶和引物，反应显得是特异性的，没有非特异性产物的迹象。然而，高分辨解链分析不能够区分3个基因型。聚合酶与总引物浓度的化学计量百分比对于极端PCR为3%，对于快速循环PCR为6.4%。

使用1 μM聚合酶、10 μM各引物和1.3%甘油进行45 bp KCNE1反应的实时监测。采用图1a的装置，监测每个循环2个水浴之间空气中的样品。封闭室空气温度保持在70℃下，每个循环探测样品0.2秒钟。如温度参比毛细管所测量的一样，样品在60和90℃之间循环，如图3c所示。因为用于定位和测量的额外时间，所以该循环时间从0.8秒钟增加到1.12秒钟。因此，50个循环在56秒钟内完成。在约30个循环或在约34秒钟后，根据荧光增加，扩增是明显的(图3c)。温度保持接近60℃，然而样品在空气中测量，限制了聚合酶的延伸速率。

如图3c中所见，该反应具有约25个循环的量化循环(Cq)，但似乎直到至少50个循环才达到平稳期。此外，因为反应在64个循环后停止，所以可能扩增子的数量可持续增加，直到相当晚期后才达到平稳期。不受理论束缚，认为引物浓度的增加允许改进产量并延迟平稳期，以Cq后20个循环为例说明，更多说明性地为Cq后25个循环或更多。

实施例2

在该实施例中，白介素10 β受体中将A>G变体括在括号内的58 bp片段(rs#2834167)用引物CTACAGTGGGAGTCACCTGC (SEQ ID NO:4)和GGTACTGAGCTGTGAAAGTCAGGTT (SEQ ID NO:5)扩增以产生下列扩增子：CTACAGTGGGAGTCACCTGCTTTTGCC(A/G)AAGGGAACCTGACTTTCACAGCTCAGTACC (SEQ ID NO:6)。使用图1a所示仪器，如实施例1所述，进行极端PCR。使用1 μM聚合酶、10 μM各引物和1.3%甘油(聚合酶与总引物的百分比= 5%)。为了提高聚合酶延伸的温度至70-80℃，在该温度下聚合酶具有较高延伸速率，采用了不同的定位方案。在达到退火温度后，将样品转移到热水浴中直到达到延伸温度，而不是立即定位在空气中用于监测。然后将样品定位于恰在热水浴上方的空气中，产生图4a和4b所示温度循环，并使得在70和77℃之间的最适温度下能够更快的聚合酶延伸。使用0.97秒钟循环，在38秒钟中完成39个循环，通过极端PCR分别扩增3种不同的基因型。在极端PCR后，在经改动以接受LC24毛细管的HR-1仪器上获得各基因型的高分辨解链曲线。图4c显示按预期，扩增并鉴定了所有3种基因型。

实施例3

实施例1的反应混合物对于极端PCR和快速循环PCR两者是相同的，不同的是聚合酶和引物的量以及如图3a所见明显引起Tm位移的甘油浓度的微小差异。在这个实施例和所有未来的实施例中，需要时，通过补足甘油浓度使其浓度保持在2%。对于极端PCR，使用1 μM聚合酶和10 μM各引物，而对于快速循环PCR，使用0.064 μM聚合酶和0.5 μM各引物。如上所述，认为较快的退火时间提供改进的引物特异性。以这种改进的特异性，可使用升高浓度的引物，这被认为有利于引物结合，并允许减少退火时间。同样，增加的聚合酶浓度有利于与退火的引物结合，并且如果聚合酶在完全延伸前脱落，则还有利于与不完全扩增子重新结合。另外，因为较高的聚合酶浓度，所以甚至在PCR后期，较大比例的引物模板可一次性延伸，减少单个聚合酶必须延伸的模板数，并减少总体延伸时间。

图5a概括了用不同聚合酶和引物浓度的极端PCR循环的结果。在该实施例中，白介素10 β受体的49 bp片段用引物GGGAGTCACCTGCTTTTGCC (SEQ ID NO:7)和TACTGAGCTGTGAAAGTCAGGTTCC (SEQ ID NO:8)和3 mM MgCl₂扩增，产生：GGGAGTCACCTGCTTTTGCCAAAGGGAACCTGACTTTCACAGCTCAGTA (SEQ ID NO:9)。对于各极端PCR反应，使用图1b所示的没有实时监测的装置。温度在90℃和63℃之间循环35个循环持续恰好少于26秒钟的总反应时间(0.73秒钟循环)，如图5b所示。反应条件如实施例1所述，只是聚合酶和引物的量不同，如图5a所示。图5a中的垂直轴量化为解链曲线的负导数图的峰值，解链曲线在HR-1仪器中在没有归一化时获得。在0.5 μM聚合酶下，在任何水平的引物浓度下几乎观察不到扩增。然而，在1.0 μM聚合酶下，在5 μM和以上的引物浓度下，观察到可识别水平的扩增。随着聚合酶水平提高，扩增子的量也增加，直到约4 μM的水平。在8 μM聚合酶下，扩增子的量达到稳定或下降，这取决于引物浓度，其中在16 μM下在较低引物浓度下显著下降。似乎在这些极端温度循环条件下对于49 bp产物，聚合酶具有介于约1和8 μM之间的有利的浓度范围，更特别是介于2和8 μM之间，这取决于引物浓度。

同样，用2.5 μM的引物浓度几乎观察不到扩增。然而，在5 μM引物下扩增是成功的，其中KlenTaq浓度为2-8 μM，且扩增随着浓度增加而提高。用约10-20 μM引物的引物浓度达到优异的扩增。图5c显示在4 μM KlenTaq下不同引物浓度的解链曲线，而图5d证实产物的大小随聚合酶浓度变化，同时引物浓度保持在10 μM。尽管高浓度的聚合酶和引物，但未观察到非特异性扩增。

不受理论束缚，似乎酶的量和引物的量之间的比率对于极端PCR循环是重要的，条件是两者都高于阈值量。注意，上述量根据各引物提供。假定聚合酶与双链体化引物的每一个结合，则总引物浓度可能是最重要的。对于KlenTaq，合适的比率为0.03-0.4 (3-40%酶/总引物浓度)，对于极端PCR，说明性的最小KlenTaq浓度为约0.5 μM，更多说明性地为约1.0 μM。至于不对称PCR，引物可以等摩尔量提供，或一个可以过量提供。最佳聚合酶:引物百分比还可取决于温度循环条件和产物大小。例如，标准(慢的)温度循环常常使用更低得多的聚合酶:引物百分比，通常对于0.15%的百分比为1.5 nM (0.04 U/μl)聚合酶(49)和1,000 nM总引物浓度，这是比发现对极端PCR有效的百分比的1/10以下。

实施例4

将与实施例3相同的PCR靶以8 μM聚合酶和20 μM各引物在19号钢皮下注射器针头中扩增，以提高热传递和循环速度。聚合酶/总引物的百分比为20%。扩增在图1b的仪器中进行，并使用各0.46秒钟、在91℃和59-63℃之间循环的35个循环在16秒钟内完成(图6a)。在循环期间最大加热速率为407℃/s，最大值冷却速率为815℃/s，表明了PCR可在无保持(holds)的情况下以大于400℃/s的缓变率发生。在4% NuSieve 3:1琼脂糖凝胶上对产物的分析显示正确大小的强特异性条带(图6b)。无模板对照显示49 bp处无产物，但确实显示出与阳性样品类似的突出的引物条带。

实施例5

在没有实时组分的情况下，使用引物CTCTGTGCTTTCTGTATCCTCAGAGTGGCATTCT (SEQ ID NO:10)和CGTCTGCTGGAGTGTGCCCAATGCTATA (SEQ ID NO:11)和图1b的仪器，扩增NQO1基因的102 bp片段。聚合酶浓度在0.25和4 μM之间变化，而各引物浓度在0.5和8 μM之间变化。设计引物在较高温度下退火(低于70s)，使得在联合退火/延伸期的延伸可处于聚合酶的更佳温度。预期在这些温度下较大的聚合速率能够扩增较长的产物。将冷却器水浴控制在72℃下，且退火/延伸期的结束由时间(1秒钟)而不是温度起动。对于30个循环，使用1.93秒钟循环，在72和90℃之间的循环需要58秒钟(图7a)。如图7a所见，样品温度下降约3℃低于退火/延伸温度，同时通过空气传递至热水浴中。图7b显示通过量化图5a中的解链曲线放大的产物的量。解链曲线分析显示仅Tm 84℃的单一产物。在0.25 μM聚合酶或1 μM各引物下观察到极少的产物。在2 μM各引物下发生一些扩增，最佳扩增在2-4 μM聚合酶和8 μM各引物下。在2-4 μM的引物浓度下，产量随聚合酶浓度增加而降低，尽管这在8 μM引物浓度下未观察到。虽然热循环和目标长度不同于实施例3，但最佳扩增发生在聚合酶/总引物的浓度为3.1-50%时。

实施例6

使用具有实时监测的图1b的仪器，采用极端PCR扩增BBS2基因的135 bp和337 bp片段。为了研究产物长度对极端PCR的作用和对不同引物可能的混淆作用的控制，使用具有共同5’端突出端的引物，从基因组DNA先扩增片段。对于135 bp片段，引物为ACACACACACACACACACACACACACACACACACACAAAAATTCAGTGGCATTAAATACG (SEQ ID NO:12)和GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAAAAACCAGAGCTAAAGGGAAG (SEQ ID NO:13)。对于337 bp片段，引物为ACACACACACACACACACACACACACACACACACACAAAAAGCTGGTGTCTGCTATAGAACTGATT (SEQ ID NO:14)和GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAAAAAGTTGCCAGAGCTAAAGGGAAGG (SEQ ID NO:15)。在基因组DNA的标准PCR扩增之后，引物和dNTP用ExoSAP-IT (Affymetrix，CA)降解，接着使用QuickStep? 2 PCR纯化试剂盒(目录号33617，Edge BioSystems，Gaithersburg，MD)进行PCR产物纯化。将PCR产物稀释约100万倍，并通过补足用标准实时PCR获得的Cq来调节至相等浓度以获得25个循环的Cq (约10,000拷贝/10 μl反应)。

使用各为2 μM的通用引物ACACACACACACACACACACACACACACACACACACAAAAA(SEQ ID NO:16)和GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAAAAA (SEQ ID NO:17)与2 μM聚合酶和2%甘油，在5 μl的总体积中对1,000拷贝已扩增的模板进行极端PCR。135 bp BBS2片段产生需要延伸176或185个碱基(取决于引物)的226 bp产物，而337 bp BBS2片段产生需要延伸378或387个碱基的428 bp PCR产物。在琼脂糖凝胶上并通过解链分析验证了特异性扩增。图8a显示了用于226 bp产物的极端PCR温度曲线图，其包括1秒钟在75℃下的联合退火/延伸和在87℃下的变性。还进行了2秒钟在相同温度下的退火/延伸期(迹线未显示)。图8c显示了这些扩增的实时PCR结果，显示了与2秒钟延伸相比，以1秒钟延伸约5个循环变化至较高Cq，据推测反映出当延伸时间减少时效率的降低。图8显示了用于428 bp产物的极端PCR温度曲线图，表明了4秒钟在75℃下联合退火/延伸和在87℃下的变性。还进行了5秒钟在相同温度下的退火/延伸期(迹线未显示)。图8d显示了这些扩增的实时PCR结果，显示了与5秒钟延伸相比，以4秒钟延伸约2个循环转变到较高的Cq，据推测反映了当延伸时间减少时效率的降低。

实施例7

使用稀释系列的人基因组DNA，对于NQO1使用2 μM KlenTaq和8 μM各引物，对于KNCE1使用8 μM KlenTaq和20 μM各引物，针对实施例5的NQO1的102 bp片段和实施例1的KCNE1的45 bp片段，采用图1b的实时仪器评价了PCR的定量性能。以至少4个十进制的动态范围，如图9a和9b所见，自标准曲线计算的扩增效率对于NQO1为95.8%，对于为KCNE1为91.7%。无模板的对照反应在50个循环后不扩增，且对于较高浓度，单一拷贝复制(1.5拷贝的平均拷贝数/反应)的扩增曲线形状和强度是类似的(图9A和9C)。在0.15拷贝的平均拷贝数/反应下，17个中的2个反应是阳性的(结合NQO1和KCNE1试验两者)，其通过二项展开式计算的预期值为0.13拷贝/反应。

实施例8

采用实时PCR不同产物长度所需要的延伸时间(图10a-c)。为了控制不同引物可能的混淆作用，使用下列通用高Tm (77℃)引物的100-500 bp的合成模板：

ACTCGCACGAACTCACCGCACTCC (SEQ ID NO:18)和GCTCTCACTCGCACTCTCACGCACA (SEQ ID NO:19)。

合成模板序列为：

100 bp模板：

ACTCGCACGAACTCACCGCACTCCGGATGGATTGTGAAGAGGCCCAAGATACTGGTCATATTATCCTTTGATCTAGCTCTCACTCGCACTCTCACGCACA (SEQ ID NO:20)。

200 bp模板：

ACTCGCACGAACTCACCGCACTCCTCAATGCTGACAAATCGAAAGAATAGGAATAGCGTAATTACTAGAGGACTCCAATATAGTATATTACCCTGGTGACCGCCTGTACTGTAGGAACACTACCGCGGTTATATTGACAGCTTAGCAATCTACCCTGTTGGGATCTGTTTAAGTGGCTCTCACTCGCACTCTCACGCACA (SEQ ID NO:21)。

300 bp模板：

ACTCGCACGAACTCACCGCACTCCCCTTCGAATATAAAGTACGACATTACTAGCAATGACAGTTCCAGGATTTAAGAAAGTAGTGTTCCACATCAATGCATATCCAGTGAAAGCATAACGTCAAAAAAAGCCTGGCACCGTTCGCGATCTGGACTTACTTAGATTTGTTGTAGTCAAGCCGGCTATCAGCGATTTATCCCGGAAACACATACTAGTGAGTTATTTGTATGTTACCTAGAATAGCTGTCACGAATCACTAATACATTCACCCACCAGCTCTCACTCGCACTCTCACGCACA (SEQ ID NO:22)。

400 bp模板：

ACTCGCACGAACTCACCGCACTCCTGAATACAAGACGACAGTCCTGATTATATTTTCATTTAATTACGCCAATTTAATTATGATGAATATTAACGGAATTAAATATGTATTGATAAGTACTAAGTAATGGTTTACCCACGGCGATCTATATGCAAGGGAAACATTAACAAATTTAAACATCTGATGTGGACAAAACTTGTAATGTGGTATAGTTAAAAATATAGGTTTCAGGGACACGTAAGTATCTATCTTGAATGTTTAAGTAGGTCCTGTCTACCATTCTGAAATTTAGAAAATCGCGTTCATCGGGCTGTCGGCTACACCTCAGAAAACCATTTCGTGTTGCACAGGAGGAACTTTCGAGGGTTCGTATGAGCTCTCACTCGCACTCTCACGCACA (SEQ ID NO:23)。

500 bp模板：

ACTCGCACGAACTCACCGCACTCCACCGCTTGACGACGTAGGGTATTTGGTATCTGAATCTACTCATTTACCTACATACTGAAGATTTTGCGATCGTCTAATATATTGGACTAATGCCCGATTTCTGATCAATTACTCTAGGCGATACTTCATCGCTGGCCTTATTTGGATTTTGCTCAAGTGCTAAACTCTCTGCGCGTCAATACTAGTCTGACATCAGTCAAGACCTGCTATCTGAAAACTACTAGAGAGATATACCTAACAACTTTAGTGGATAAATCAGGTCTGGAGATTGTCATATAATGCCACTAGGGTCAGAAGGCTGTGTCAAAGTTAGTGGTTAGTAGGTCTCCGCTCTGCGGTACTATTCTTATATTCTCTTACTATGCATCAAACAAAATAGAATGCATAGACAAACCGCCTGCCAAGTTTACAAGATAACTTGCGTATAGGTTTATAAGGGTTCTTCTGTATCGCTCTCACTCGCACTCTCACGCACA (SEQ ID NO:24)。

使用4秒钟联合退火/延伸段以4.9秒钟/循环最先测定用于中间长度300-bp产物的引物和聚合酶的最佳浓度(图10a)。然后将相同的引物(4 μM)和聚合酶(2 μM)浓度用于所有产物长度，并测定最小延伸时间(图11a-e)。根据产物长度，延伸时间延长导致分数量化循环(Cq)降低直到不再观察到变化，反映出有效PCR所需要的最小延伸时间。例如，图10b显示了使用KAPA2G? FAST聚合酶(Kapa Biosystems)针对500 bp产物的扩增曲线。与使用KlenTaq1 (Taq聚合酶的一种缺失突变型，AB Peptides)的7 s相比，使用KAPA2G FAST聚合酶的最小延伸时间为3 s。当聚合酶的特性保持不变时，较长的产物需要较长的延伸时间(图10c)。对于KlenTaq1聚合酶，对各60 bp需要约1秒钟，而对于KAPA2G FAST，对各158 bp需要1秒钟。注意，选择这2种聚合酶，因为它们是以足够浓度市售可获得的，而大多数其它的聚合酶无法以如此高的浓度市售获得。要理解，延伸所需时间直接取决于待延伸的长度并与其成线性关系，且与聚合酶浓度和聚合酶速度负相关。可定义将这3个参数关联的比例常数(k2)：

所需延伸时间= k2*(延伸长度)/([聚合酶]*(聚合酶速度))

实施例9

用高Mg⁺⁺浓度也可减少极端PCR时间。AKAP10的60 bp片段用以下引物扩增：GCTTGGAAGATTGCTAAAATGATAGTCAGTG (SEQ ID NO:25)和TTGATCATACTGAGCCTGCTGCATAA (SEQ ID NO:26)，以产生扩增子GCTTGGAAGATTGCTAAAATGATAGTCAGTGAC(A/G)TTATGCAGCAGGCTCAGTATGATCAA (SEQ ID NO:27)。

使用2-7 mM MgCl₂，各反应在1 μl体积中，以基于时间的控制(在94℃水浴中0.07秒钟，在60℃水浴中0.1-0.4秒钟)进行35个循环。样品体积为1 μl，含5 ng人基因组DNA、20 μM引物和8 μM聚合酶。使用0.42秒钟/循环方案，当MgCl₂为2-3 mM时，在解链曲线(图12a)或凝胶(图12b)上未观察到产物。在4 mM下存在极少的产物，但以5-7 mM MgCl₂扩增后观察到大量产物。在5 mM MgCl₂下，在以0.32秒钟的循环时间的解链曲线(图13a)或凝胶(图13b)上未观察到产物，但在0.42秒钟、0.52秒钟和0.62秒钟的循环时间下观察到大量产物，表明了在15秒钟下进行的PCR (14.7秒钟内35个循环)中，可获得特异性高产量60 bp产物。因此，说明性Mg++浓度为至少4 mM、至少5 mM、至少6 mM、至少7 mM或更高，要理解，这些说明性Mg++浓度可与本文所述的任何实施方案一起使用。

实施例10

当在较慢的循环速度下使用时，用于极端PCR的高浓度的引物和聚合酶可能具有有害作用。在分别为慢1/32或1/106倍的基于快速循环或模块的仪器上，获得非特异性产物。图14a-b显示比较用于实施例9的AKAP10 60 bp产物的扩增的结果，其中采用以下条件，使用20 μM各引物、8 μM KlenTaq和10 ng人基因组DNA进行扩增40个循环：(1)在94°下设定时间为0.5 s和在60°下为0.2秒钟的极端PCR，得到约17秒钟的总时间，(2)使用在94°下设定时间为10 s用于初始变性，接着85°的循环0秒钟，60° 0秒钟的快速循环PCR (Roche LightCycler)，得到约9分钟的总时间，和(3)在94°下10 s初始变性接着在85°下0 s和在60°下5 s的温度循环，总时间为约30分钟的Legacy (模块)温度循环(BioRad CFX96)。正如所见，即使LightCycler的快速循环产生相当多的非特异性扩增，而极端循环条件产生单一解链峰和凝胶上最小的非特异性扩增。

还注意到，极端PCR中产量提高，这产生于高的引物和聚合酶浓度。与快速循环PCR相比，极端PCR产生产物的量超过30倍，采用定量PCR用于比较(数据未显示)。

采用图1a – 1d中描述的一个或多个装置或在这些构造上有少量变化来进行所有的实施例1 – 10。然而，要理解，本文描述的方法和反应可发生在各种仪器中。用于这些实施例的水浴和管允许足够快的温度改变以研究升高浓度的引物和聚合酶的作用。然而，其它实施方案可能在商业上更合适。具有低体积和高表面积/体积比的微流体系统，可能充分适于极端PCR。所述系统允许用于极端PCR的高浓度的引物和聚合酶所需要的快速温度变化。微流体系统包括整合到重复运送样品通过变性、退火和延伸温度区的小型化通道的微流量系统(35，53)。这些系统的一些已被证实用于较低复杂性靶标的有效PCR，具有快至3秒钟的循环时间。预期如果聚合酶以至少0.5 μM的浓度提供，且引物各以至少2 μM的浓度提供，则在该系统中可扩增更复杂的靶标。静止PCR芯片和PCR液滴系统(54)也可获益于升高的引物和探针浓度，因为体积可小至1 nl或更小，并且可低到足以允许极快的循环。要理解，确切仪器对于本发明是不重要的，只要仪器温度循环快得足以利用升高的引物和聚合酶浓度而不遭受与在较低循环速度下的较高引物浓度有关的特异性损失。

虽然上述实施例全都采用PCR，但是要理解，PCR只是说明性的，预期升高的引物和酶浓度结合较短的扩增时间用于PCR以外的核酸扩增方法。其量值可提高的说明性酶活性包括聚合(DNA聚合酶、RNA聚合酶或反转录酶)、连接、解螺旋(解旋酶)或外切核酸酶活性(5’-3’或3’-5’)、链置换和/或切割、内切核酸酶活性和DNA/RNA杂交体的RNA消化(RNAse H)。扩增反应包括而不限于聚合酶链式反应、连接酶链式反应、转录介导的扩增(包括基于转录的扩增系统、自动维持序列复制和基于核酸序列的扩增)、链置换扩增、全基因组扩增、多重置换扩增、反义RNA扩增、环介导的扩增、线性连接的扩增(linear-linked amplification)、滚环扩增、分支扩增、等温寡核苷酸扩增、解旋酶链式反应和连续侵入性信号扩增。

一般来说，当酶活性变化时，扩增时间随相同因素相反地变化。对于包括引物的反应，当引物浓度变化时，扩增时间随相同因素相反地变化。当扩增需要引物和酶两者时，酶和引物浓度两者应改变以使反应速度达到最大。如果引物退火发生在特定的扩增循环节段(例如在3温度PCR期间的特定温度)时，则预期在该节段令人满意地完成引物退火所需要的时间与引物浓度负相关。同样，如果在特定的扩增循环节段(例如在3温度PCR期间的特定温度)需要酶活性时，则预期在该节段令人满意地完成酶过程所需要的时间与某一范围内的酶浓度负相关。改变引物或酶浓度可用来改变其各个节段所需要的时间，或如果两者发生在相同条件(例如在2-温度PCR中或在等温反应过程期间)下，预期可能需要两者浓度的改变以防止一个反应限制反应速度。升高的Mg++浓度也可用于与升高的酶和引物浓度组合以进一步加快扩增过程。较高的Mg++浓度同时提高引物退火的速度和减少用于核酸扩增的许多酶反应的时间。

较高浓度的Mg++、酶和引物当伴随有较短的扩增时间或时段时是特别有用的。当在不缩短时间的情况下采用较高浓度时，在一些情况下可能产生非特异性扩增产物，因为反应的“严格性”降低。减少扩增时间或节段时间引入较高严格性，这似乎抵销来了自升高的反应物浓度所引起的严格性损失。相反地，如果这些较低的浓度通过延长的扩增时间或节段时间抵销，则可通过降低反应物的浓度使试剂成本减至最小。

增加聚合酶浓度可减少长范围PCR所需的时间，以其中目标为5-50 kb为例说明。通常，使用10分钟-30分钟延伸期以扩增大的目标，因为该目标太长使得需要所述时间：1)使聚合酶完成单一目标的延伸，和2)使酶再循环以使其它引物模板聚合。在PCR开始时，当可获得的酶多于引物模板分子时，不需要聚合酶的这种再循环。然而，甚至在指数期完成之前，聚合酶分子的数目常常变成限制性的，并且酶再循环是必需的。通过增加聚合酶的浓度，所需延伸期可减少到少于5分钟，且可能少于2分钟，同时保持因高引物浓度引起的高产量。虽然实际酶速度不提高，但需要较少的再循环，影响了与酶浓度大致呈线性方式的所需要的最少时间。

还可通过增加引物和聚合酶浓度来减少循环测序时间。通常，在标准循环测序中，引物浓度为0.16 μM，且联合退火/延伸期在50-60℃下为10分钟。通过增加引物和聚合酶浓度达10倍，退火/延伸所需时间可减少约10倍。在长PCR和循环测序两者中，预期所需时间与聚合酶或引物浓度成反比，不论哪一个是限制性的。

在具有在大量平行测序的制备中用作的引物的连接接头的片段的PCR，可在比现行通过将极端温度循环与较高浓度的引物、聚合酶和/或Mg++组合进行的少得多的时间内完成。

在所有的上述应用中，预期通过较短的扩增时间保持反应的特异性。虽然本领域熟练技术人员预期高的引物和聚合酶浓度引起来自非特异性扩增的困难，但使总体循环时间和/或各节段时间减到最小导致高的PCR特异性和效率。

极端PCR的具体条件见表2。提供了所有数据，只是对于目标中的3种的聚合酶和引物浓度的同时优化实验除外。在表3中，详细描述了变量之间的定量关系。将需要的退火时间与引物浓度联系起来的反比例性约为常数(k1)，由方程式(所需退火时间) = k1/[引物]限定。使用在legacy (标准) PCR、快速循环PCR和极端PCR的条件下这些变量的各种典型值，产生大部分重叠的反比例常数的范围(legacy 0.75 – 30，快速循环0.2 – 10，极端1 – 20)。由于该常数反比例性，因此目前所进行的之外的所需退火时间可用来预测对于所需时间的所需要的引物浓度。例如，使用5 (s * μM)的常数，可计算出对于退火时间为0.01 s，引物浓度为500 μM。相反地，如果需要0.01 μM的引物浓度，则所需退火时间应为500秒钟。虽然这些条件在legacy和极端PCR的界限之外，但它们预测了可用于PCR成功的引物浓度和退火时间之间的关系。对于k1在legacy、快速循环和极端PCR间的合理界限为0.5 - 20 (s x μM)，更优选1 – 10 (s x μM)，最优选3 – 6 (s x μM)。

可进行类似计算以将所需延伸时间与聚合酶浓度、聚合酶速度和待扩增产物的长度联系起来。然而，由于随时间推移在不同实验室进行的legacy、快速循环和极端PCR之间影响PCR的许多其它变量(聚合酶、Mg++、缓冲液)，因此最好注意本文提供的极端PCR的严格控制的条件以确立变量间的反比例性。这就可供在极端PCR条件下聚合酶浓度、聚合酶速度、产物长度和所需延伸时间之间的定量表达式之用。定义方程式为(所需延伸时间) = k2(产物长度)/([聚合酶]*(聚合酶速度))。根据实验确定的k2定义为在恒定温度、Mg⁺⁺、聚合酶类型、缓冲液、添加剂和dsDNA染料浓度的条件下上述方程式的比例常数。对于具有[聚合酶]和[引物]的2维优化的3极端PCR目标，可在引物浓度间辨别在成功扩增边缘上的[聚合酶]，并与其它3个变量相关联。如表3所示，对于这3个不同目标，k2的值变化低于2倍，从中推断，k2是常数，并且如果其它变量是已知的，则可用来预测一个变量。所需延伸时间与延伸长度(产物长度减去引物长度)成比例，并与聚合酶速度和聚合酶浓度成反比。k2具有(1/μM)的单位和本文所用极端PCR条件0.3 – 0.7 (1/μM)范围内0.5 (1/μM)的最佳值。可推导k2的类似值用于在聚合酶类型、Mg++浓度或不同的缓冲液或染料条件下不同的其它反应条件。

极端PCR可在任何类型的容器中进行，只要样品的温度可快速改变。除标准管和毛细管以外，悬浮在油流或薄2维糯米纸中的水性反应物的微液滴提供良好的热接触。通过不同温度下的空间节段的样品流(或作为液滴分散、被气泡分隔或其它方法以防止混合)的连续流PCR是用于极端PCR的速度所需温度控制的良好方法。

参考文献

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虽然参照优选的实施方案对本发明进行了详细详述，但变化和改动存在于随附权利要求书中描述和限定的本发明的范围和精神内。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种在扩增期间扩增生物样品中的目标核酸序列的方法，所述方法包括以下步骤：

将配置用于目标核酸序列扩增的热稳定聚合酶和引物加入生物样品中，其中聚合酶以至少0.5 μM的浓度提供，且引物各以至少2 μM的浓度提供；和

使用在少于20秒钟/循环的循环时间内完成每个循环的极端温度循环特征，通过多个扩增循环使生物样品在至少变性温度和延伸温度之间热循环，通过聚合酶链式反应扩增目标核酸序列。

2.权利要求1的方法，其中每个循环在少于2秒钟/循环内完成。

3.权利要求1的方法，其中缓变率为至少200℃/s。

4.权利要求3的方法，其中缓变率为至少300℃/s。

5.权利要求4的方法，其中缓变率为至少400℃/s。

6.权利要求1的方法，其中平稳期为Cp后至少20个循环。

7.权利要求1的方法，其中各引物的浓度大于2.5 μM。

8.权利要求1的方法，

所述方法还包括不同于延伸温度的退火温度，

其中扩增步骤产生大于100 bp的扩增子，和

其中所述极端温度循环特征包括在延伸温度下保持大约等于碱基配对的延伸长度(扩增子长度-引物长度)除以单位为碱基/秒钟的热稳定聚合酶的延伸速率的时间。

9.权利要求1的方法，其中所述扩增步骤还包括与延伸温度相同或低于延伸温度的退火温度，且扩增步骤包括在退火温度下保持0.05-0.9秒钟。

10.权利要求1的方法，其中Mg⁺⁺浓度为至少4 mM。

11.权利要求1的方法，其中所述聚合酶和引物浓度乘以某一因数，和循环时间除以所述因数。

12.权利要求1的方法，其中所述极端温度特征包括由以下定义的退火时间

退火时间= k1/[引物]

其中k1为常数，且

[引物]为各引物的浓度。

13.权利要求12的方法，其中k1是根据实验确定的。

14.权利要求1的方法，其中所述温度循环特征包括在由下定义的延伸温度下的时间

延伸时间 = k2(延伸长度)/([聚合酶]*(聚合酶速度))

其中k2为比例常数，

[聚合酶]是聚合酶的浓度，和

聚合酶速度是聚合酶掺入碱基的速率，单位为核苷酸/s。

15.权利要求14的方法，其中k2是根据实验确定的。

16.权利要求1的方法，其中所述目标核酸以至少70%的效率扩增。

17.一种在扩增期间扩增生物样品中的目标核酸序列的方法，所述方法包括以下步骤：

将配置用于目标核酸序列扩增的热稳定聚合酶和引物加入生物样品中，其中聚合酶与引物的比率为(约0.03至约0.4聚合酶):(总引物浓度)，且聚合酶浓度为至少0.5 μM；和

采用其中每个循环在少于20秒钟内完成的极端温度循环特征，通过多个扩增循环使生物样品在至少变性温度和延伸温度之间热循环，通过聚合酶链式反应扩增目标核酸序列。

18.权利要求17的方法，其中每个循环在少于10秒钟内完成。

19.权利要求18的方法，其中每个循环在少于5秒钟内完成。

20.权利要求19的方法，其中每个循环在少于2秒钟内完成。

21.权利要求17的方法，其中所述目标核酸为基因组DNA。

22.权利要求17的方法，其中所述生物样品含有真核基因组DNA。

23.权利要求17的方法，其中所述聚合酶是以至少1.0 μM的浓度提供的KlenTaq。

24.权利要求17的方法，其中非特异性扩增低于可检出水平。

25.权利要求17的方法，其中总引物浓度为至少5 μM。

26.一种用于进行PCR的装置，其包括：

用于容纳PCR样品的样品容器；

用于加热样品的工具；

用于冷却样品的工具；和

用于使样品容器重复置于用于加热样品的工具和用于冷却样品的工具中以至少200℃/s的缓变率使样品热循环的控制工具。

27.权利要求26的装置，其还包括在监测位置上光学激发样品以使样品发荧光的工具；和用于检测扩增期间激发样品的荧光的工具。

28.权利要求27的装置，其中所述缓变率为至少300℃/s。

29.权利要求28的装置，其中所述缓变率为至少400℃/s。

30.权利要求26的装置，其中用于加热的工具是热水浴，用于冷却的工具为冷水浴。

31.权利要求26的装置，其中所述装置是微流体系统。

32.权利要求26的装置，其中所述样品容器包含

目标核酸，

dNTP，

以至少0.5 μM的浓度提供的聚合酶，和

配置用于扩增目标核酸的一对引物，其中引物各以至少2 μM的浓度提供。

33.一种用于对目标核酸进行PCR的试剂盒，所述试剂盒包含：

dNTP，

以至少0.5 μM的浓度提供的聚合酶，和

配置用于扩增目标核酸的一对引物，其中引物各以至少2 μM的浓度提供。

34.权利要求33的试剂盒，其还包含利用其中每个循环在少于20秒钟/循环的循环时间内完成的温度循环特征进行PCR的说明书。

Claims (34)

1.一种在扩增期间扩增生物样品中的目标核酸序列的方法，所述方法包括以下步骤：

将配置用于目标核酸序列扩增的热稳定聚合酶和引物加入生物样品中，其中聚合酶以至少0.5μM的浓度提供，且引物各以至少2μM的浓度提供；和

使用在少于20秒钟/循环的循环时间内完成每个循环的极端温度循环特征，通过多个扩增循环使生物样品在至少变性温度和延伸温度之间热循环，通过聚合酶链式反应扩增目标核酸序列。

2.权利要求1的方法，其中每个循环在少于2秒钟/循环内完成。

3.权利要求1-2中任一项的方法，其中缓变率为至少200℃/s。

4.权利要求3的方法，其中缓变率为至少300℃/s。

5.权利要求4的方法，其中缓变率为至少400℃/s。

6.权利要求1-5中任一项的方法，其中平稳期为Cp后至少20个循环。

7.权利要求1-6中任一项的方法，其中各引物的浓度大于2.5μM。

8.权利要求1-7中任一项的方法，

所述方法还包括不同于延伸温度的退火温度，

其中扩增步骤产生大于100bp的扩增子，和

其中所述极端温度循环特征包括在延伸温度下保持大约等于碱基配对的延伸长度(扩增子长度-引物长度)除以单位为碱基/秒钟的热稳定聚合酶的延伸速率的时间。

9.权利要求1的方法，其中所述扩增步骤还包括与延伸温度相同或低于延伸温度的退火温度，且扩增步骤包括在退火温度下保持0.05-0.9秒钟。

10.权利要求1的方法，其中Mg⁺⁺浓度为至少4mM。

11.权利要求1的方法，其中所述聚合酶和引物浓度乘以某一因数，和循环时间除以所述因数。

12.权利要求1的方法，其中所述极端温度特征包括由以下定义的退火时间

退火时间＝k1/[引物]

其中k1为常数，且

[引物]为各引物的浓度。

13.权利要求12的方法，其中k1是根据实验确定的。

14.权利要求1的方法，其中所述温度循环特征包括在由下定义的延伸温度下的时间

延伸时间＝k2(延伸长度)/([聚合酶]*(聚合酶速度))

其中k2为比例常数，

[聚合酶]是聚合酶的浓度，和

聚合酶速度是聚合酶掺入碱基的速率，单位为核苷酸/s。

15.权利要求14的方法，其中k2是根据实验确定的。

16.权利要求1的方法，其中所述目标核酸以至少70％的效率扩增。

16.一种在扩增期间扩增生物样品中的目标核酸序列的方法，所述方法包括以下步骤：

将配置用于目标核酸序列扩增的热稳定聚合酶和引物加入生物样品中，其中聚合酶与引物的比率为(约0.03至约0.4聚合酶):(总引物浓度)，且聚合酶浓度为至少0.5μM；和

采用其中每个循环在少于20秒钟内完成的极端温度循环特征，通过多个扩增循环使生物样品在至少变性温度和延伸温度之间热循环，通过聚合酶链式反应扩增目标核酸序列。

17.权利要求16的方法，其中每个循环在少于10秒钟内完成。

18.权利要求17的方法，其中每个循环在少于5秒钟内完成。

19.权利要求18的方法，其中每个循环在少于2秒钟内完成。

20.权利要求16的方法，其中所述目标核酸为基因组DNA。

21.权利要求16的方法，其中所述生物样品含有真核基因组DNA。

22.权利要求16的方法，其中所述聚合酶是以至少1.0μM的浓度提供的KlenTaq。

23.权利要求16的方法，其中非特异性扩增低于可检出水平。

24.权利要求16的方法，其中总引物浓度为至少5μM。

25.一种用于进行PCR的装置，其包括：

用于容纳PCR样品的样品容器；

用于加热样品的工具；

用于冷却样品的工具；和

用于使样品容器重复置于用于加热样品的工具和用于冷却样品的工具中以至少200℃/s的缓变率使样品热循环的控制工具。

26.权利要求25的装置，其还包括在监测位置上光学激发样品以使样品发荧光的工具；和用于检测扩增期间激发样品的荧光的工具。

27.权利要求26的装置，其中所述缓变率为至少300℃/s。

28.权利要求27的装置，其中所述缓变率为至少400℃/s。

29.权利要求25的装置，其中用于加热的工具是热水浴，用于冷却的工具为冷水浴。

30.权利要求25的装置，其中所述装置是微流体系统。

31.一种用于进行PCR的装置，其中所述样品容器包含

目标核酸，

dNTP，

以至少0.5μM的浓度提供的聚合酶，和

配置用于扩增目标核酸的一对引物，其中引物各以至少2μM的浓度提供。

32.一种用于对目标核酸进行PCR的试剂盒，所述试剂盒包含：

dNTP，

以至少0.5μM的浓度提供的聚合酶，和

配置用于扩增目标核酸的一对引物，其中引物各以至少2μM的浓度提供。

33.权利要求32的试剂盒，其还包含利用其中每个循环在少于20秒钟/循环的循环时间内完成的温度循环特征进行PCR的说明书。