KR20080029233A - 핵산 증폭 및 혼성화를 단일 고체 지지체에서 수행하는방법 및 장치 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 프로브가 고정화된 고체 지지체 표면을 갖는 챔버 내로 핵산 함유 시료와 핵산 증폭 시약을 도입하는 단계; 핵산 증폭 반응을 수행하여 핵산을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭된 핵산과 상기 고정화된 프로브를 혼성화시키는 단계를 포함하는 핵산 증폭 및 혼성화를 단일 고체 지지체에서 수행하는 방법 및 장치에 관한 것이다.

Description

핵산 증폭 및 혼성화를 단일 고체 지지체에서 수행하는 방법 및 장치{Method and apparatus for accomplishing nucleic acid amplification and hybridization in single solid support}
도 1은 핵산 증폭 및 혼성화를 수행하는 기존 방법과 본 발명의 방법을 비교하는 모식도이다.
도 2는 혼성화 버퍼 첨가 유무에 따른 혼성화 결과를 나타내는 도면이다.
본 발명은 핵산 증폭 및 혼성화를 단일 고체 지지체에서 수행하는 방법 및 장치에 관한 것이다.
핵산 증폭 기술은 유전 물질의 연구에 대한 강력한 도구를 제공한다. 특히 중합효소 연쇄반응(PCR)은 클로닝, 유전자 발현 분석, DNA 서열결정(sequencing), 유전자 맵핑, 약물 개발, 범죄 수사 등에서 주요한 도구가 되었다.
많은 중요한 적용에 대해, 표적 핵산 서열을 증폭하는 것 외에, 핵산 혼성화 프로브, 즉 표적 서열의 전부 또는 일부에 상보적인 표지된 단일 가닥 폴리뉴클레오티드를 이용한 처리에 의해 상기 서열을 추가로 규명하는 것이 바람직하다. 프 로브 혼성화는 단순한 PCR 증폭에 비해 부가적인 서열 선택성을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 표적 핵산 서열 내의 다중 서열 부위의 규명을 허용한다.
통상적으로, PCR 및 프로브 혼성화 과정은 별개의 작업으로서 수행되어 왔다. 그러나, PCR 시약 및 혼성화 시약을 포함하는 단일 시약 혼합물을 이용하여 조합된 방식으로 PCR 및 프로브 혼성화 반응 양자를 수행하는 것이 매우 바람직하다. PCR 및 혼성화 과정을 조합하면 하기의 이점이 있다: (i) 단지 단일 시약 첨가 단계가 필요하므로, 조합된 반응을 반응 튜브를 개방하지 않고 진행할 수 있어, 시료 오염을 줄일 수 있으며; (ii) 더 작은 수의 시약이 필요하며; (iii) 더 작은 시약 첨가 단계가 필요하므로, 자동화를 더욱 용이하게 한다.
유럽 공개특허공보 EP 0601889 A2에는 핵산 증폭 및 혼성화 과정의 조합 방법이 개시되어 있다. 상기 방법은 표적 핵산에 상보적인 단편 및 하나 이상의 헤어핀을 형성할 수 있는 단편을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 그러나, 상기 방법은 프로브 서열이 헤어핀 구조를 형성해야 한다는 한계를 가진다.
본 발명의 발명자들은 상기와 같은 종래 기술을 바탕으로 핵산 증폭 및 혼성화 과정을 연구하던 중, 단일 칩에 프로브를 고정화하고, 상기 칩의 챔버 내에서 PCR 반응을 수행한 후, PCR 산물을 칩에 고정된 프로브와 혼성화시킴으로써 단일 칩에서 핵산 증폭 및 혼성화 반응을 수행할 수 있음을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 시료 오염, 시간 및 비용을 최소화할 수 있는 핵 산 증폭 및 혼성화를 단일 고체 지지체에서 수행하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 시료 오염, 시간 및 비용을 최소화할 수 있는 핵산 증폭 및 혼성화를 단일 고체 지지체에서 수행하는 장치에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 핵산 농축 및 혼성화 장치를 포함하는 랩온어칩(lab-on-a-chip)에 관한 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 프로브가 고정화된 고체 지지체 표면을 갖는 챔버 내로 핵산 함유 시료와 핵산 증폭 시약을 도입하는 단계;
핵산 증폭 반응을 수행하여 핵산을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭된 핵산과 상기 고정화된 프로브를 혼성화시키는 단계를 포함하는 핵산 증폭 및 혼성화를 단일 고체 지지체에서 수행하는 방법을 제공한다.
본 발명은 핵산 증폭 및 혼성화를 단일 고체 지지체, 예를 들면 단일 칩에서 수행하는 기술이다. 도 1은 핵산 증폭 및 혼성화를 수행하는 기존 방법과 본 발명의 방법을 비교하는 모식도이다. 기존의 방법은 핵산 증폭을 수행하는 칩과 혼성화를 수행하는 마이크로어레이의 2개의 칩을 이용하여 핵산 증폭 및 혼성화를 수행하였다. 그러나, 본 발명은 핵산 증폭 및 핵산 혼성화를 동일 칩에서 수행함으로써 하나의 칩만으로 핵산 증폭 및 핵산 혼성화 반응을 수행할 수 있게 되었다.
본 발명의 방법은 프로브가 고정화된 고체 지지체 표면을 갖는 챔버 내로 핵산 함유 시료와 핵산 증폭 시약을 도입하는 단계를 포함한다. 고체 지지체 표면에는 프로브가 고정화되어 있으며, 상기 프로브는 핵산, 펩티드 핵산(peptide nucleic acid) 등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 방법에서 상기 고체 지지체는 실리콘 웨이퍼, 슬라이드 글라스, 폴리스티렌, 금속판 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는 상기 고체 지지체는 실리콘 웨이퍼이다.
본 발명의 방법에서, 상기 핵산 함유 시료는 혈액, 혈청, 소변, 타액 또는 세포 배양액에 존재하는 박테리아 또는 바이러스의 세포 용해물(cell lysate) 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 핵산을 포함하는 시료는 포유동물, 식물, 박테리아, 또는 효모 유래일 수 있다. 상기 시료는 단일 세포 형태 또는 조직 형태일 수 있으며, 세포 또는 조직은 시험관 내 배양물 유래일 수 있다.
본 발명의 방법에서, 상기 핵산 증폭 시약은 PCR 프라이머, DNA 중합효소, dNTPs, 및 버퍼를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않고 핵산 증폭을 수행하는데 필요한 임의의 시약을 포함할 수 있다. PCR 프라이머는 표적 핵산에 특이적인 서열을 가지며, 정방향 및 역방향 프라이머의 한 세트를 이용할 수 있다. 다중 PCR을 수행하는 경우에는 정방향 및 역방향 프라이머의 여러 세트를 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 바람직하게는, 상기 프라이머의 길이는 약 5-50 뉴클레이티드이다. 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
본 발명에서 있어서, DNA 중합효소는 PCR 프라이머가 주형(template)에 결합한 후, 연장(extension) 반응을 수행하는 효소이다. 이는 내열성 중합효소가 바람직하며, Taq DNA 중합효소 등 시판되는 내열성 중합효소를 이용할 수 있다. 버퍼에는 MgCl2 등의 물질이 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 방법은 증폭 반응을 수행하여 핵산을 증폭하는 단계를 포함한다. 상기 핵산 증폭 반응은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭에 의해 수행될 수 있으나, 바람직하게는 PCR에 의해 수행될 수 있다.
"PCR"이란 중합효소 연쇄반응을 의미하는 것으로, 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다. PCR 혼합물의 조성 및 농도는 이용되는 중합효소에 의존하여 변 한다는 것은 당업자는 이해할 것이다. 또한, PCR 조건은 증폭하고자 하는 PCR 산물의 길이, 주형과 프라이머의 서열 상동성, 프라이머 길이 등에 따라 적절하게 선택할 수 있다.
이러한 PCR 방법에는 한 번에 하나의 표적만을 증폭하는 단일 PCR과 한 번에 복수의 표적을 증폭하는 다중 PCR이 포함된다. 다중 PCR에서는 복수의 프라이머 쌍이 이용된다.
또한, 본 발명의 방법은 상기 증폭된 핵산과 상기 고정화된 프로브를 혼성화시키는 단계를 포함한다. 본 명세서에 있어서, "프로브"란 상보적인 단일가닥 표적 서열과 혼성화하여 이중가닥 분자 (혼성체)를 형성하는 단일가닥 핵산 서열을 말한다.
본 명세서에 있어서, 프로브로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
본 명세서에 있어서, "혼성화"란 핵산의 2개의 상보적 가닥이 조합하여 이중가닥 분자 (혼성체)를 형성하는 과정을 말한다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 방법에 있어서 상기 혼성화는 높은 엄격도 혼성화 조건하에서 수행되는 것인 방법이다. 본 구체예에서, 상기 높은 엄격도 혼성화 조건은 바람직하게는 65℃에서 동일한 몰의 Na2HPO4 및 NaH2PO4, 1mM EDTA 및 0.02% 소듐 도데실 설페이트를 포함하는 0.12 M 포스페이트 버퍼를 포함하는 것이다.
또한, 본 명세서에 있어서, "엄격도 (stringency)"란 혼성화 및 그 후의 처리 단계 동안 존재하는 온도 및 용매 조성을 기술하기 위하여 사용되는 용어이다. 높은 엄격도 조건하에서는 고도로 상동적인 핵산 혼성체가 형성될 것이다. 즉, 충분한 정도의 상보성이 없는 혼성체는 형성되지 않을 것이다. 따라서, 분석 조건의 엄격도는 혼성체를 형성하는 2 핵산 가닥 사이에 필요한 상보성의 양을 결정한다. 엄격도는 표적과 비표적 핵산과 형성된 혼성체 사이의 안정성의 차이를 최대화하기 위하여 선택된다.
본 발명의 방법에서, 상기 고정화된 프로브와 상기 PCR 프라이머는 서로 혼성화되지 않는 것이 바람직하다. 상기 고정화된 프로브와 상기 PCR 프라이머가 서로 혼성화한다면 핵산 증폭을 방해할 수도 있어 핵산 증폭 효율을 감소시킬 수 있기 때문이다.
본 발명의 방법에서, 상기 혼성화 단계 전에 혼성화 버퍼를 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 핵산 증폭이 완료된 후에, 핵산 증폭 버퍼에 포함된 PCR 산물과 고정화된 프로브의 혼성화 반응을 수행할 수도 있다. 그러나, 혼성화 효율을 증가시키기 위해, 혼성화 반응 전에 혼성화 버퍼를 첨가하는 것이 바람직하다. 혼성화 버퍼는 당업계에 알려진 버퍼를 이용할 수 있다. 또한, 혼성화시 엄격도는 표적과 비표적 핵산과 형성된 혼성체 사이의 안정성의 차이를 최대화하기 위하여 선택된다.
본 발명의 방법에서, 상기 증폭된 핵산은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 본 구체예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 형광을 발하는 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다.
본 발명의 방법에서, 상기 혼성화의 검출은 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 프로브가 고정화된 고체 지지체 표면을 갖는 챔버; 및
상기 챔버에 부착되며, 상기 챔버를 가열 및 냉각시키는 가열부 및 냉각부를 포함하는, 핵산 증폭 및 혼성화를 단일 고체 지지체에서 수행하는 장치를 제공한다.
본 발명의 핵산 증폭 및 혼성화 장치는 본질적으로 고체 지지체 표면을 갖는 챔버 및 가열부 및 냉각부로 이루어진다. 본 발명의 장치에서, 상기 고체 지지체는 실리콘 웨이퍼, 슬라이드 글라스, 폴리스티렌, 금속판 등일수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는 상기 고체 지지체는 실리콘 웨이퍼이다.
본 발명의 장치에서, 가열부 및 냉각부는 상기 챔버를 가열 및 냉각시키는 파트로서, PCR 혼합물이 챔버 내로 도입되면, PCR 조건에 따라 챔버의 온도를 가열 및 냉각을 통해 조절하는 것이다.
본 발명의 장치는 상기 챔버와 마이크로채널을 통해 연통되며, 상기 챔버에 핵산 함유 시료를 공급하는 핵산 함유 시료 저장부; 및
상기 챔버와 마이크로채널을 통해 연통되며, 상기 챔버에 핵산 증폭 시약을 공급하는 핵산 증폭 시약 저장부를 추가로 포함할 수 있다.
핵산 함유 시료 저장부는 상기 챔버에 핵산 함유 시료를 공급하는 파트로서, 상기 챔버와 마이크로채널을 통해 연통되어 있다. 또한, 핵산 증폭 시약 저장부는 상기 챔버에 핵산 증폭 시약을 공급하는 파트로서, 상기 챔버와 마이크로채널을 통해 연통되어 있다. 상기 핵산 함유 시료 저장부 및 핵산 증폭 시약 저장부는 별개의 저장부로서 존재할 수도 있지만, 하나의 저장부에서 핵산 함유 시료 및 핵산 증폭 시약을 저장할 수도 있다.
본 발명의 장치는 상기 챔버와 마이크로채널을 통해 연통되며, 상기 챔버에 혼성화 버퍼를 공급하는 혼성화 버퍼 저장부를 추가로 포함할 수 있다. 혼성화 버퍼 저장부는 상기 챔버에 혼성화 버퍼 저장부를 공급하는 파트로서, 상기 챔버와 마이크로채널을 통해 연통되어 있다.
본 발명의 장치는 상기 챔버에 부착되어, 상기 챔버 내에서 증폭된 핵산과 고정화된 프로브의 접촉을 증가시키는 진동기(vibrator)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 진동기는 상기 챔버에 진동 전달부를 통해 연결되며, 상기 챔버 내에서 증폭된 핵산과 프로브의 접촉을 증가시키는 역할을 하는 장치이다. 진동기의 진동 방향은 수직 방향일 수 있다. 상기 진동기는 초음파세척기, 자기장을 이용한 진동기, 전기장을 이용한 진동기, 볼텍스 등 기계적 진동기 또는 압전물질을 포함할 수 있다. 진동기는 진동을 상기 챔버에 전달하는 진동 전달부를 통해 상기 챔버에 부착되어 있으며, 증폭된 핵산 용액을 진동시킬 수 있으면 어느 장치라도 가능하다. 상기 진동기는 휴대폰에 이용되는 진동 모터를 이용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 핵산 증폭 및 혼성화 장치를 포함하는 랩온어칩(lab-on-a-chip)을 제공한다. 본 발명의 핵산 증폭 및 혼성화 장치는 각 기능적 구성요소를 공지된 마이크로플루이딕스 기술 및 MEMS 디바이스를 이용하여 프로세스-온-어-칩(process-on-a-chip)으로 구현하는 것이 가능할 뿐만 아니라, 더 나아가서는 랩-온-어-칩(lab-on-a-chip)으로 구현될 수도 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 본 발명의 단일 칩을 이용한 핵산 증폭 및 혼성화
기존에 사용하던 마이크로어레이 칩을 일정한 크기로 절단하여 PCR 튜브에 넣고 PCR 및 혼성화를 수행하였다. 마이크로어레이 칩은 호흡기 감염 균에 특이적인 프로브를 갖는 칩이다.
(1) 프로브가 고정화된 마이크로어레이의 제조
에탄올 중의 GAPTES (감마-아미노프로필트리에톡시 실란)(γ-aminopropyltriethoxy silane) 용액 (농도 20%(v/v)) 또는 GAPDES (감마-아미노프로필디에톡시 실란) 용액 (농도 20%(v/v))을 스핀 코팅하였다. 스핀 코팅은 CEE 사의 스핀 코터 모델 CEE 70을 이용하였다. 스핀 코팅은 초기 코팅 500 rpm/10 sec과 주코팅 2000 rpm/10 sec에 의하여 수행되었다. 스핀 코팅이 완료된 다음, 기판을 테플론 웨이퍼 캐리어에 고정하여 120 ℃에서 40 분 동안 경화시켰다. 경화된 기판은 물에 10 분 동안 침지시킨 후 15 분 동안 초음파 세척, 다시 물에서 10 분 동안 침지한 후 건조하였다. 건조는 스핀 드라이를 통하여 수행하였다. 모든 실험은 대부분의 먼지 입자들이 충분히 제거된 클린룸-클라스 1000에서 수행하였다.
위와 같이 제조된 아미노 기로 활성화된 기판 상에 프로브 세트를 스폿팅하여, 마이크로어레이를 제작하였다.
각각 사용된 프로브 서열은 하기와 같다:
A02 internal control: 5'-GGGGGTAGAGCACTGTTTCG-3' (서열번호 1)
A07 internal control-1: 5'-CGACAGGACGGAAAGACCC-3' (서열번호 2)
A07 internal control-2: 5'-AGTTTGACTGGGGCGGTCT-3' (서열번호 3)
A02-Hae.influe: 5'-ACCAAAGAGTGATACTCAGGAGA-3' (서열번호 4)
A02-H.inf2-I: 5'-CAAACTACGAATACCAAAGAGT-3' (서열번호 5)
A02-H.inf2-A: 5'-CAAACTGCGAATACCGAAGAGT-3' (서열번호 6)
(2) PCR
주형은 해모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenza) 박테리아의 게놈 DNA를 이용하였다. 프라이머는 말단이 Cy-3로 표지되어 있으며, 해모필루스 인플루엔자 박테리아의 23S rRNA 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열이며, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 서열은 하기와 같다:
A02 정방향 프라이머: 5'-GCGTACCTTTTGTATAATGGGTC-3' (서열번호 7)
A02 역방향 프라이머: 5'-GACCTTAGCTGGCGGTCTG-3' (서열번호 8)
A07 정방향 프라이머: 5'-TGTCGGGTAAGTTCCGACC-3' (서열번호 9)
A07 역방향 프라이머: 5'-CRGAACCACCGGATCACTA-3' (서열번호 10)
PCR 조건은 다음과 같다. MgCl2 2.5mM, dNTP 200 uM, 트리스-HCl (pH 9.0) 10 mM 및 Taq 중합효소 1 유니트, 프라이머 각각 20pmol을 포함하는 혼합액 중에 상기 게놈 DNA 2㎕를 포함하는 50㎕의 반응액을 95℃에서의 변성 5초, 62℃에서의 어닐링 13초 및 72℃에서의 연장 15초를 25회 반복하였다.
PCR이 완료된 후에, PCR 튜브 내의 칩에서 상기 칩에 고정화된 프로브와 증폭된 핵산의 혼성화를 42℃에서 1시간 동안 수행하였다. 세척 버퍼로 세척한 다음, GenePix Scanner (Molecular Device 사, 미국)를 이용하여 형광을 측정하였다. 혼성화는 혼성화 버퍼(18X concentrate SSPE 버퍼 및 0.2% Triton X-100)를 첨가한 경우와 혼성화 버퍼를 첨가하지 않은 경우로 나누어 수행하였다. 도 2는 혼성화 버퍼 첨가 유무에 따른 혼성화 결과를 나타내는 도면이다. 도 2에서, 패널 A는 혼성화 버퍼를 첨가한 경우이며, 패널 B는 혼성화 버퍼를 첨가하지 않은 경우이다. 또한, A02 및 A07 양성 대조군을 함께 이용하였다. 혼성화 버퍼를 첨가한 A 패널의 경우에, Hin 특이적 프로브에 PCR 산물이 잘 혼성화된 것을 알 수 있다. 반면, 혼성화 버퍼를 첨가하지 않은 B 패널의 경우에는 PCR 산물 혼성화 정도가 A 패널에 비해 낮다는 것을 알 수 있다.
따라서, 본 발명의 방법을 이용하여 핵산 증폭 및 혼성화를 단일 칩에서 효율적으로 수행할 수 있음을 알 수 있다.
본 발명에 따르면, 기존에 마이크로어레이 기술 적용시 필요한 실리콘 웨이퍼는 2개의 칩이었는데 본 발명에서는 1개의 칩으로 가능하므로 경제적이며, 별도의 혼성화를 수행하기 위한 수작업이 필요 없으며, 기존의 혼성화를 위한 오븐이 별도로 필요 없다. 또한, 모든 단계들이 동일한 칩 내에서 연속적으로 진행이 되기 때문에 시료와 소모품을 절약할 수 있으며, 처리 및 분석에 소요되는 시간과 노 동량을 줄일 수 있으며, 시료 수송 단계가 제거됨으로써 시료 손실이 없어 민감도를 높일 수 있으며, 교차 오염의 위험도 대폭 낮출 수 있으므로, 완전 자동화 시스템을 구축하기가 용이하다.
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Claims (18)

  1. 프로브가 고정화된 고체 지지체 표면을 갖는 챔버 내로 핵산 함유 시료와 핵산 증폭 시약을 도입하는 단계;
    핵산 증폭 반응을 수행하여 핵산을 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭된 핵산과 상기 고정화된 프로브를 혼성화시키는 단계를 포함하는 핵산 증폭 및 혼성화를 단일 고체 지지체에서 수행하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 혼성화 단계 전에 혼성화 버퍼를 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 고체 지지체는 실리콘 웨이퍼, 슬라이드 글라스, 폴리스티렌, 및 금속판으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 핵산 증폭 반응은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 핵산 증폭 시약은 PCR 프라이머, DNA 중합효소, dNTPs, 및 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 고정화된 프로브와 상기 PCR 프라이머는 서로 혼성화되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 핵산 함유 시료는 혈액, 혈청, 소변, 타액 또는 세포 배양액에 존재하는 박테리아 또는 바이러스의 세포 용해물(cell lysate)인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 증폭된 핵산은 검출가능한 표지 물질로 표지되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 형광을 발하는 물질은 Cy-5 또는 Cy-3인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 혼성화의 검출은 형광 측정, 인광 측정 또는 방사성 측정 방법을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 프로브가 고정화된 고체 지지체 표면을 갖는 챔버; 및
    상기 챔버에 부착되며, 상기 챔버를 가열 및 냉각시키는 가열부 및 냉각부를 포함하는, 핵산 증폭 및 혼성화를 단일 고체 지지체에서 수행하는 장치.
  13. 제12항에 있어서, 상기 고체 지지체는 실리콘 웨이퍼, 슬라이드 글라스, 폴리스티렌, 및 금속판으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 장치.
  14. 제12항에 있어서, 상기 챔버와 마이크로채널을 통해 연통되며, 상기 챔버에 핵산 함유 시료를 공급하는 핵산 함유 시료 저장부; 및
    상기 챔버와 마이크로채널을 통해 연통되며, 상기 챔버에 핵산 증폭 시약을 공급하는 핵산 증폭 시약 저장부를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
  15. 제12항에 있어서, 상기 챔버와 마이크로채널을 통해 연통되며, 상기 챔버에 혼성화 버퍼를 공급하는 혼성화 버퍼 저장부를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
  16. 제12항에 있어서, 상기 챔버에 부착되어, 상기 챔버 내에서 증폭된 핵산과 고정화된 프로브의 접촉을 증가시키는 진동기(vibrator)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
  17. 제16항에 있어서, 상기 진동기는 초음파세척기, 자기장을 이용한 진동기, 전기장을 이용한 진동기, 기계적 진동기 및 압전물질로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 장치.
  18. 제12항의 장치를 포함하는 랩온어칩(lab-on-a-chip).
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