CN110846386A - 核酸的多重特异性可视化检测方法及装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种核酸多重特异性可视化检测方法及装置。提供核酸多重可视化检测装置，核酸扩增腔室与核酸检测腔室之间通过通道相连通，用密封膜进行密封，核酸扩增腔室内放置核酸扩增反应试剂，核酸检测腔室内放置CRISPR‑Cas系统检测试剂；将核酸扩增腔室进行核酸扩增反应，反应后核酸扩增腔室中的反应液通过通道流入各个核酸检测腔室中进行反应，根据核酸检测腔室是否产生荧光进行核酸多重检测。本发明使核酸扩增反应与CRISPR‑Cas系统检测试剂进行结合用于核酸的多重特异性可视化检测，且整个检测过程都在封闭的装置中进行，可有效防止气溶胶污染。

Description

核酸的多重特异性可视化检测方法及装置

技术领域

本发明属于核酸扩增和检测的领域，其具体内容涉及到用于核酸的多重特异性可视化检测方法及装置。

背景技术

核酸作为生物遗传信息载体，其不同的碱基排列顺序分别代表着生物体或生物间不同的遗传信息。通过对核酸序列进行特异性检测，可以有效的对待测物进行识别。当前许多研究人员已经将核酸检测用于医学诊断、食品安全检测、品系鉴定、疾病防控等领域。在进行核酸检测前，往往需要对核酸进行扩增。传统的核酸扩增方法主要是聚合酶链式反应(PCR)。随着技术的发展，一些无需复杂温度控制的恒温扩增反应也被广泛应用于核酸扩增，如环介导等温扩增(LAMP)，重组酶聚合酶扩增(RPA)，切刻内切酶核酸恒温扩增(NEMA)等。

核酸扩增后，需要对核酸扩增产物进行检测以判断是否有进行特异性扩增。常见的检测方法有琼脂糖凝胶电泳法、DNA荧光染料(SYTO 9，SYBR green，Evagreen等)法、Taqman探针法、分子信标法、核酸试纸条法等；对于恒温扩增反应(如LAMP)，在扩增过程中还会产生一些副产物(焦磷酸)形成肉眼可见沉淀(焦磷酸镁)用于辅助检测。也有一些研究人员利用反应前后体系中pH的变化来进行检测。上述这些方法有的需要使用精密仪器来读取荧光信号变化，有的需要进行复杂的探针或分子信标设计，有的缺乏特异性以及具有较低的灵敏度，有的容易产生假阳性结果。而且更重要的是大部分这些方法不便于对核酸进行多重检测。目前，在核酸多重检测方面主要还是依赖Taqman探针或分子信标等方法，这些检测方法操作比较复杂，需要精密的荧光读取仪器，且不适用于恒温扩增反应。因此建立一种适用于PCR或恒温扩增反应的核酸多重特异性可视化检测方法具有十分重要的意义。

当前，一些研究人员发现CRISPR-Cas系统中(clustered regularly interspacedshort palindromic repeats-CRISPR associated)由RNA引导(该RNA称作gRNA)的Cas12a蛋白能够在gRNA与目标核酸碱基互补配对后产生单链DNA酶活性，进而无差别切割单链DNA(称作反式切割)。Cas13a和Cas12b蛋白也相继被发现具有类似性质。基于这些性质，如果在CRISPR-Cas系统中引入单链DNA荧光探针，只有当gRNA与目标核酸高度匹配才能最终切割单链DNA荧光探针产生荧光信号。根据荧光信号的有无来判断是否含有待检测目标核酸。因此将CRISPR-Cas系统用在核酸检测中具有很高的特异性。目前很少有人将CRISPR-Cas系统用于核酸的多重可视化检测。

因此，开发操作简单、防污染、便携式、成本低的核酸多重检测装置，并将其与基于CRISPR-Cas系统的核酸检测方法结合用于核酸的多重特异性可视化检测具有重要意义。

发明内容

为了解决背景技术中存在的问题，本发明的目的之一是提供一种利用CRISPR-Cas系统进行核酸的多重特异性可视化检测方法，其可在封闭的环境下，进行PCR或进行不同种类的恒温扩增反应，并利用CRISPR-Cas检测系统进行特异性可视化检测。本发明主要是用于核酸的多重特异性可视化检测，能够解决防止开盖检测形成的气溶胶污染等问题。

为此，本发明采用以下技术方案：

一、一种CRISPR-Cas系统进行核酸的多重特异性可视化检测方法，方法包括以下步骤：

提供设置有核酸扩增腔室与核酸检测腔室相连一体的核酸多重可视化检测装置，核酸检测腔室可根据需要设置两个或多个，核酸扩增腔室与核酸检测腔室之间通过通道相连通，且用密封膜将核酸扩增腔室、核酸检测腔室和通道构成的整体进行密封，核酸扩增腔室内放置核酸扩增反应试剂，核酸检测腔室内放置CRISPR-Cas系统检测试剂；

然后将核酸扩增腔室置于指定温度下进行核酸扩增反应，待反应结束后，核酸扩增腔室中的反应液通过通道流入各个核酸检测腔室中进行反应，最后根据核酸检测腔室是否产生荧光进行核酸多重检测。

所述的核酸扩增腔室是由单独的一个腔室构成，或者由一个腔室密封外接反应管共同构成，利用反应管作为核酸扩增容器，在反应管与检测容器相连的状态下进行扩增反应。

所述的反应管中的核酸扩增反应试剂的上层表面进行石蜡油密封。

使用本发明装置过程中，核酸扩增反应后，核酸扩增腔室中的核酸扩增反应试剂液体通过手甩、离心核酸多重可视化检测装置等方式，通过通道平均分配到各个核酸检测腔室中。对于带有反应管的核酸扩增腔室，反应管中的液体首先进入核酸检测容器中连接腔室，进而通过通道平均分配到各个核酸检测腔室中。反应管中的反应液体可先通过颠倒、摇晃、离心等方式流入核酸检测容器中的连接腔室中。

在核酸检测腔室之间具有一定的间隔，保证相互之间不会产生污染。每个检测腔室能够容纳所需的CRISPR-Cas系统检测试剂并剩余一定空间。每个检测腔室可装有用于检测相同或不同目标核酸的CRISPR-Cas系统检测试剂。

本发明能根据实际反应的需要，在核酸检测腔室中分别加入针对检测不同目标物的CRISPR-Cas系统检测试剂，然后在核酸扩增腔室中加入相应的核酸扩增反应试剂。最后用密封膜将反应板密封住，将核酸扩增腔室置于指定的温度下反应。反应结束后，核酸扩增产物通过通道流入核酸检测腔室中进行核酸多重检测。

装置的所有材质都能够耐高温，不影响核酸扩增反应试剂和CRISPR-Cas系统检测试剂的正常工作。整个装置具有良好的密闭性，反应过程中不会有水分蒸发到环境中去，能够进行PCR反应或其他恒温扩增反应。反应结束后，通过手甩、离心、挤压等方式将核酸扩增腔室中的扩增产物进一步通过通道平均分配到各个核酸检测腔室中去。然后利用一定波长的光源照射检测区域，根据检测区域是否产生荧光进行核酸检测。

所述CRISPR-Cas系统检测试剂包含Cas蛋白、缓冲液、引导RNA、单链DNA荧光探针、RNA酶抑制剂、无菌水等。进一步地，引导RNA的碱基序列会随着目标核酸碱基序列的不同而不同。

二、一种核酸多重可视化检测装置：

装置包括反应板和设置在反应板上的一个核酸扩增腔室、至少一个核酸检测腔室、至少一个通道和密封膜，反应板上表面的一侧上开设有至少一个凹槽，每个凹槽作为一个核酸检测腔室，反应板上表面的另一侧设置有核酸扩增腔室，核酸扩增腔室和每个核酸检测腔室之间均通过通道连通，核酸扩增腔室、核酸检测腔室和通道在同一个平面上；密封膜密封吸附在反应板上表面并完整覆盖核酸扩增腔室、核酸检测腔室和通道，使得核酸扩增腔室、核酸检测腔室和通道构成的整体空间被密封，不与外界环境连通。

所述的核酸扩增腔室是由开设反应板上表面上的一个凹槽构成，凹槽中容置核酸扩增反应试剂。

所述的核酸扩增腔室是由开设反应板侧面或者上表面上的一个连接腔室和连接腔室外接的反应管共同构成，反应管中容置核酸扩增反应试剂。

连接腔室和反应管之间是密封的，这样与反应管相连的连接腔室与核酸检测腔室之间相隔一定距离，以保证在进行核酸扩增时不会影响到核酸检测。

所述的连接腔室为开设在反应板侧面的水平通道，水平通道外端贯穿出反应板和反应管密封连接，水平通道内端和通道连通。

所述的连接腔室为开设在反应板上表面的竖直通道，竖直通道下端贯穿出反应板和反应管密封连接，竖直通道上端贯穿反应板且和通道连通。

所述的核酸扩增腔室、核酸检测腔室和通道的深度小于反应板的高度。

所述的通道为设置在反应板表面上的条形槽，条形槽的深度浅于核酸扩增腔室和核酸检测腔室的深度，所述的通道的数量和核酸检测腔室的数量相同。

包括多个核酸检测腔室，多个核酸检测腔室所对应连通的通道在和核酸扩增腔室连通处汇聚在核酸扩增腔室边缘同一点。

所述核酸扩增腔室、核酸检测腔室和通道通过激光雕刻或注塑成型等方式形成。

所述密封膜表面是疏水材料，密封膜和反应板中至少有一个使用透明材质。

进一步地，所述核酸扩增腔室和核酸检测腔室的横截面形状任意，优选为方形和圆形，更优选地为圆形，形成呈柱体、方体、锥体等。核酸扩增腔室的开口直径大小优选地小于等于30mm，大于等于5mm，优选地，其开口直径为小于等于20mm，大于等于10mm，更优选地为15mm；核酸检测腔室的开口直径大小优选地小于等于20mm，大于等于2mm，优选地，其开口直径为小于等于10mm，大于等于5mm，更优选地为7mm。

进一步地，所述通道的宽度优选地小于等于2mm，大于等于0.1mm，优选地其宽度小于等于1mm，大于等于0.2mm，更优选地为0.4mm。

进一步地，所述反应板的材质为玻璃、塑料或者金属等，可以为透明材质，也可以为不透明材质。本实施例中反应板所用材质为聚甲基丙烯酸甲酯。

进一步地，所述反应管的高度优选地，小于等于30mm，大于等于10mm。

本发明装置可以使核酸扩增反应与CRISPR-Cas系统检测试剂进行结合用于核酸的多重特异性可视化检测，且整个检测过程都在封闭的装置中进行，可有效防止气溶胶污染。

与现有技术相比，本发明具有如下特点：

1)本发明将核酸扩增区域和核酸检测区域分开但又能通过通道连通，可以使整个检测过程在一个封闭的环境中进行，有效防止气溶胶污染。

2)本发明装置构造简单、操作方便，能用于PCR反应或不同种类的恒温扩增反应，并且不会影响后续CRISPR-Cas系统检测试剂进行核酸检测。

3)本发明装置结合CRISPR-Cas系统用于核酸的多重特异性可视化检测，具有特异性强、灵敏度高、检测结果易于判断等优点。

附图说明

图1为本发明实施例1中一种实施方式的俯视图和剖视图。

图1(a)为本发明实施例1中一种实施方式的俯视图。

图1(b)为图1(a)中的A-A剖视图。

图2为图1这种实施方式的分解爆炸图。

图3为本发明实施例2中一种实施方式的俯视图和剖视图。

图3(a)为本发明实施例2中一种实施方式的俯视图。

图3(b)为图3(a)中的A-A剖视图。

图4为图3这种实施方式的分解爆炸图。

图5为本发明实施例3中另一种实施方式的俯视图和剖视图。

图5(a)为本发明实施例3中一种实施方式的俯视图。

图5(b)为图5(a)中的A-A剖视图。

图6为图5这种实施方式的分解爆炸图。

图中：核酸扩增腔室(1)、密封膜(2)、反应板(3)、核酸检测腔室(4a、4b、4c)、通道(5a、5b、5c)、连接腔室(1a)、反应管(1b)。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：

如图1和图2所示，包括反应板3，本实施例中反应板3所用材质为聚甲基丙烯酸甲酯亚克力板。反应板3包括能够容纳核酸扩增反应试剂的核酸扩增腔室1、容纳CRISPR-Cas系统检测试剂的核酸检测腔室4a、4b、4c以及使核酸扩增腔室1与核酸检测腔室4a、4b、4c之间能够相互连通的通道5a、5b、5c，具有一个核酸扩增腔室1、三个核酸检测腔室4a、4b、4c、三个通道5a、5b、5c和密封膜2。

反应板3上表面的一侧上开设有至少一个凹槽，每个凹槽作为一个核酸检测腔室4a、4b、4c，反应板3上表面的另一侧设置有核酸扩增腔室1，核酸扩增腔室1是由开设反应板3上表面上的一个凹槽构成，凹槽中容置核酸扩增反应试剂，核酸扩增腔室1和每个核酸检测腔室4a、4b、4c之间均通过通道5a、5b、5c连通，核酸扩增腔室1、核酸检测腔室4a、4b、4c和通道5a、5b、5c在同一个平面上；密封膜2密封吸附在反应板3上表面并完整覆盖核酸扩增腔室1、核酸检测腔室4a、4b、4c和通道5a、5b、5c，使得核酸扩增腔室1、核酸检测腔室4a、4b、4c和通道5a、5b、5c构成的整体空间被密封，不与外界环境连通。密封膜2为耐高温亚克力胶带。

核酸扩增腔室1、核酸检测腔室4a、4b、4c和通道5a、5b、5c的深度小于反应板3的高度。通道5a、5b、5c为设置在反应板3表面上的条形槽，条形槽的深度浅于核酸扩增腔室1和核酸检测腔室4a、4b、4c的深度。

密封膜2能够强力吸附在反应板3上，使核酸扩增腔室1和核酸检测腔室4a、4b、4c中的液体不会扩增到环境中去。密封膜2表面是疏水材料，为透明材质或者不透明材质，密封膜2和反应板3中至少有一个使用透明材质。密封膜2能在高温环境下98℃左右仍然保持与反应板3之间紧密吸附。本实施例中所用密封膜2为耐高温亚克力胶带。

核酸检测腔室4a、4b、4c的形状和深度都是一样的且核酸检测腔室4a与4c对称分布在核酸检测腔室4b的两侧；通道5a、5b、5c的宽度和深度都是一样的且通道5a与5c以通道5b为对称轴分布在其两侧。通道5a、5b、5c能够在核酸反应腔室1的边缘处恰好汇聚成一点，三个核酸检测腔室4a、4b、4c所对应连通的通道5a、5b、5c在和核酸扩增腔室1连通处汇聚在核酸扩增腔室1边缘同一点，使核酸扩增腔室1中的液体最终能够平均分配到三个核酸检测腔室4a、4b、4c中去。

本实施例具体实施中，核酸扩增腔室1与核酸检测腔室4a、4b、4c之间需要保持一定距离，使核酸检测和核酸扩增之间不会相互影响。两者距离优选地小于等于50mm，大于等于30mm。

本实施例中，核酸扩增反应试剂的体积优选地在20μL至150μL之间，更优选地在25μL至100μL之间。CRISPR-Cas系统检测试剂的体积优选地在10μL至30μL之间。

本实施例为核酸扩增区域与核酸检测区域集成于一体的装置，将核酸扩增反应试剂加入核酸扩增区域和CRISPR-Cas系统检测试剂加入核酸检测区域。根据实际反应的需要，在核酸检测腔室中分别加入针对检测不同目标物的CRISPR-Cas系统检测试剂，然后在核酸扩增腔室中加入相应的核酸扩增反应试剂。最后用密封膜将反应板密封住核酸扩增区域和核酸检测区域，将核酸扩增腔室置于指定的温度下反应。

该装置的所有材质都能够耐高温，不影响核酸扩增反应试剂和CRISPR-Cas系统检测试剂的正常工作。整个装置具有良好的密闭性，反应过程中不会有水分蒸发到环境中去，能够进行PCR反应或其他恒温扩增反应。待扩增反应结束后，通过手甩、离心、挤压等方式将核酸扩增腔室中的扩增产物进一步通过通道平均分配到各个核酸检测腔室中去，与CRISPR-Cas系统检测试剂进行反应。然后利用一定波长的光源照射检测区域，根据检测区域是否产生荧光进行核酸检测。

利用上述核酸多重可视化检测装置进行核酸的多种检测，其具体包括如下步骤：

(1)取已加工好的反应板，在其核酸扩增腔室中放入核酸扩增反应液(PCR、LAMP、RPA等)；核酸检测腔室中放入CRISPR-Cas系统检测试剂。

(2)将密封膜牢牢吸附在反应板上，保证反应板中的液体与外界环境完全隔绝开。然后将核酸扩增腔室置于相应的温度下进行核酸扩增反应。该反应既可在精确控温的金属热块上进行，也可在水浴中进行。需要注意的是，在进行扩增反应时，应使核酸检测腔室尽可能远离加热源。从而保证核酸检测腔室没有被加热或者核酸检测腔室中的温度没有超过CRISPR-Cas系统检测试剂的最高工作温度界限。

(3)核酸扩增反应结束后，通过手甩、离心、挤压等方式将核酸扩增腔室的液体通过通道平均流入到各个核酸检测腔室中进行反应。反应结束后，用一定波长的光源照射检测区域，当核酸检测腔室中出现荧光，说明待测物中含有所检测目标物；当检测腔室中没有出现荧光，说明待测物中不含有所检测目标物。

实施例2：

如图3和图4所示，包括反应板3，本实施例中反应板3所用材质为聚甲基丙烯酸甲酯亚克力板。反应板3包括能够容纳核酸扩增反应试剂的核酸扩增腔室1、容纳CRISPR-Cas系统检测试剂的核酸检测腔室4a、4b、4c以及使核酸扩增腔室1与核酸检测腔室4a、4b、4c之间能够相互连通的通道5a、5b、5c，具有一个核酸扩增腔室1、三个核酸检测腔室4a、4b、4c、三个通道5a、5b、5c和密封膜2。

反应板3上表面的一侧上开设有至少一个凹槽，每个凹槽作为一个核酸检测腔室4a、4b、4c，反应板3上表面的另一侧设置有核酸扩增腔室1，核酸扩增腔室1是由开设反应板3侧面或者上表面上的一个连接腔室1a和连接腔室1a外接的反应管1b共同构成，连接腔室1a能与反应管1b连接的结构为被反应管插入或旋入的结构，反应管1b中容置核酸扩增反应试剂，利用反应管1b作为核酸扩增容器与核酸检测容器相连，在反应管1b与连接腔室1a相连的状态下进行扩增反应。

连接腔室1a为开设在反应板3上表面的竖直通道，竖直通道下端贯穿出反应板3通过螺纹或者插扣和反应管1b密封连接，竖直通道上端贯穿反应板3且和通道5a、5b、5c连通。利用密封膜2对整个核酸检测容器进行密封，仅留有连接腔室1a开口用于连接反应管。

核酸扩增腔室1和每个核酸检测腔室4a、4b、4c之间均通过通道5a、5b、5c连通，核酸扩增腔室1、核酸检测腔室4a、4b、4c和通道5a、5b、5c在同一个平面上；密封膜2密封吸附在反应板3上表面并完整覆盖核酸扩增腔室1、核酸检测腔室4a、4b、4c和通道5a、5b、5c，使得核酸扩增腔室1、核酸检测腔室4a、4b、4c和通道5a、5b、5c构成的整体空间被密封，不与外界环境连通。密封膜2为耐高温亚克力胶带。

核酸扩增腔室1、核酸检测腔室4a、4b、4c和通道5a、5b、5c的深度小于反应板3的高度。通道5a、5b、5c为设置在反应板3表面上的条形槽，条形槽的深度浅于核酸扩增腔室1和核酸检测腔室4a、4b、4c的深度。

连接腔室1a的深度要大于反应管1b接入连接腔室1a的深度，以保证核酸扩增产物最终能通过通道5a、5b、5c流入核酸检测腔室4a、4b、4c中。

密封膜2能够强力吸附在反应板3上，使核酸扩增腔室1和核酸检测腔室4a、4b、4c中的液体不会扩增到环境中去。密封膜2表面是疏水材料，为透明材质或者不透明材质，密封膜2和反应板3中至少有一个使用透明材质。密封膜2能在高温环境下98℃左右仍然保持与反应板3之间紧密吸附。本实施例中所用密封膜2为耐高温亚克力胶带。

核酸检测腔室4a、4b、4c的形状和深度都是一样的且核酸检测腔室4a与4c对称分布在核酸检测腔室4b的两侧；通道5a、5b、5c的宽度和深度都是一样的且通道5a与5c以通道5b为对称轴分布在其两侧。通道5a、5b、5c能够在核酸反应腔室1的边缘处恰好汇聚成一点，三个核酸检测腔室4a、4b、4c所对应连通的通道5a、5b、5c在和核酸扩增腔室1连通处汇聚在核酸扩增腔室1边缘同一点，使核酸扩增腔室1中的液体最终能够平均分配到三个核酸检测腔室4a、4b、4c中去。

本实施例具体实施中，核酸扩增腔室1与核酸检测腔室4a、4b、4c之间需要保持一定距离，使核酸检测和核酸扩增之间不会相互影响。两者距离优选地小于等于50mm，大于等于30mm。

连接腔室1a与核酸检测腔室4a、4b、4c之间需要保持一定距离，两者距离优选地小于等于70mm，大于等于30mm。

本实施例中，核酸扩增反应试剂的体积优选地在25μL至200μL之间，更优选地在50μL至100μL之间。CRISPR-Cas系统检测试剂的体积优选地在10μL至30μL之间。

该反应管1b中在核酸扩增反应试剂的上层进行石蜡油密封。石蜡油与核酸扩增反应试剂的体积比例应小于等于3：1，大于等于1：1。

本实施例为核酸检测区域与反应管紧密相连的检测装置，利用反应管作为核酸扩增容器与核酸检测容器相连，在反应管中配置好核酸扩增反应试剂后，或者将配置好的扩增反应试剂加入反应管中，将装有CRISPR-Cas系统检测试剂的容器与装有核酸扩增反应试剂的反应管之间紧密相连，确保整个反应过程在一个封闭的环境中进行。具体是根据实际反应的需要，在核酸检测腔室中分别加入针对检测不同目标物的CRISPR-Cas系统检测试剂，然后用密封膜将反应板密封住，充当反应管的盖子。使用的时候，在反应管中加入相应的核酸扩增反应试剂，上层进行石蜡油密封，与反应板进行紧密连接，将反应管置于指定的温度下反应。反应结束后，核酸扩增产物先流入反应板中的连接腔室，然后通过通道流入核酸检测腔室中进行核酸多重检测。

该装置的所有材质都能够耐高温，不影响核酸扩增反应试剂和CRISPR-Cas系统检测试剂的正常工作。整个装置具有良好的密闭性，反应过程中不会有水分蒸发到环境中去，能够进行PCR反应或其他恒温扩增反应。待扩增反应结束后，通过颠倒、摇晃、震动等方式，将反应管中的核酸扩增产物引入反应板中的连接腔室，然后通过手甩、离心等方式将连接腔室中的扩增产物进一步通过通道平均分配到各个核酸检测腔室中去。然后利用一定波长的光源照射检测区域，根据检测区域是否产生荧光进行核酸检测。

利用上述核酸多重可视化检测装置进行核酸的多种检测，其具体包括如下步骤：

(1)取已加工好的反应板，在其核酸检测腔室中放入相应的CRISPR-Cas系统检测试剂。然后用密封膜牢牢吸附在反应板上，使CRISPR-Cas系统检测试剂与外界环境完全隔绝开。

(2)在反应管中加入核酸扩增反应试剂(PCR、LAMP、RPA等)，并用石蜡油进行密封。取已加入CRISPR-Cas系统检测试剂并用密封膜吸附好的反应板，将其与已加入核酸扩增反应试剂的反应管进行紧密连接。然后将反应管置于相应的温度下进行核酸扩增反应。该反应既可在精确控温的金属热块上进行，也可在水浴中进行。需要注意的是，在进行核酸扩增反应时，要使核酸检测装置的反应管的管口朝上，以保证反应能够顺利进行。同时，应使核酸检测腔室尽可能远离加热源。从而保证核酸检测腔室没有被加热或者核酸检测腔室中的温度没有超过CRISPR-Cas系统检测试剂的最高工作温度界限。

(3)核酸扩增反应结束后，将核酸检测装置反应管管口朝下，通过颠倒、摇晃、震动等方式，使反应管中的核酸扩增产物能够流入到反应板中的连接腔室，再通过手甩、离心等方式将反应板上连接腔室中的液体通过通道平均流入到各个核酸检测腔室中进行反应。反应结束后，用一定波长的光源照射检测区域，当核酸检测腔室中出现荧光，说明待测物中含有所检测目标物；当检测腔室中没有出现荧光，说明待测物中不含有所检测目标物。

实施例3：

如图5和图6所示，包括反应板3，本实施例中反应板3所用材质为聚甲基丙烯酸甲酯亚克力板。反应板3包括能够容纳核酸扩增反应试剂的核酸扩增腔室1、容纳CRISPR-Cas系统检测试剂的核酸检测腔室4a、4b、4c以及使核酸扩增腔室1与核酸检测腔室4a、4b、4c之间能够相互连通的通道5a、5b、5c，具有一个核酸扩增腔室1、三个核酸检测腔室4a、4b、4c、三个通道5a、5b、5c和密封膜2。

反应板3上表面的一侧上开设有至少一个凹槽，每个凹槽作为一个核酸检测腔室4a、4b、4c，反应板3上表面的另一侧设置有核酸扩增腔室1，核酸扩增腔室1是由开设反应板3侧面或者上表面上的一个连接腔室1a和连接腔室1a外接的反应管1b共同构成，连接腔室1a能与反应管1b连接的结构为被反应管插入或旋入的结构，反应管1b中容置核酸扩增反应试剂，利用反应管1b作为核酸扩增容器与核酸检测容器相连，在反应管1b与连接腔室1a相连的状态下进行扩增反应。

连接腔室1a为开设在反应板3侧面的水平通道，水平通道外端贯穿出反应板3通过螺纹或者插扣和反应管1b密封连接，水平通道内端和三个通道5a、5b、5c连通。利用密封膜2对整个核酸检测容器进行密封，仅留有连接腔室1a开口用于连接反应管。

核酸扩增腔室1和每个核酸检测腔室4a、4b、4c之间均通过通道5a、5b、5c连通，核酸扩增腔室1、核酸检测腔室4a、4b、4c和通道5a、5b、5c在同一个平面上；密封膜2密封吸附在反应板3上表面并完整覆盖核酸扩增腔室1、核酸检测腔室4a、4b、4c和通道5a、5b、5c，使得核酸扩增腔室1、核酸检测腔室4a、4b、4c和通道5a、5b、5c构成的整体空间被密封，不与外界环境连通。密封膜2为耐高温亚克力胶带。

核酸扩增腔室1、核酸检测腔室4a、4b、4c和通道5a、5b、5c的深度小于反应板3的高度。通道5a、5b、5c为设置在反应板3表面上的条形槽，条形槽的深度浅于核酸扩增腔室1和核酸检测腔室4a、4b、4c的深度。

通道5a、5b、5c的深度要大于反应板3上表面到连接腔室1a上边缘之间的距离，以保证核酸扩增产物最终能通过通道5a、5b、5c流入核酸检测腔室4a、4b、4c中。

密封膜2能够强力吸附在反应板3上，使核酸扩增腔室1和核酸检测腔室4a、4b、4c中的液体不会扩增到环境中去。密封膜2表面是疏水材料，为透明材质或者不透明材质，密封膜2和反应板3中至少有一个使用透明材质。密封膜2能在高温环境下98℃左右仍然保持与反应板3之间紧密吸附。本实施例中所用密封膜2为耐高温亚克力胶带。

核酸检测腔室4a、4b、4c的形状和深度都是一样的且核酸检测腔室4a与4c对称分布在核酸检测腔室4b的两侧；通道5a、5b、5c的宽度和深度都是一样的且通道5a与5c以通道5b为对称轴分布在其两侧。通道5a、5b、5c能够在核酸反应腔室1的边缘处恰好汇聚成一点，三个核酸检测腔室4a、4b、4c所对应连通的通道5a、5b、5c在和核酸扩增腔室1连通处汇聚在核酸扩增腔室1边缘同一点，使核酸扩增腔室1中的液体最终能够平均分配到三个核酸检测腔室4a、4b、4c中去。

本实施例具体实施中，核酸扩增腔室1与核酸检测腔室4a、4b、4c之间需要保持一定距离，使核酸检测和核酸扩增之间不会相互影响。两者距离优选地小于等于50mm，大于等于30mm。

连接腔室1a与核酸检测腔室4a、4b、4c之间需要保持一定距离，两者距离优选地小于等于70mm，大于等于30mm。

本实施例中，核酸扩增反应试剂的体积优选地在25μL至150μL之间，更优选地在25μL至50μL之间。CRISPR-Cas系统检测试剂的体积优选地在10μL至30μL之间。

该反应管1b中在核酸扩增反应试剂的上层进行石蜡油密封。石蜡油与核酸扩增反应试剂的体积比例应小于等于3：1，大于等于1：1。

本实施例为核酸检测区域与反应管紧密相连的检测装置，利用反应管作为核酸扩增容器与核酸检测容器相连，在反应管中配置好核酸扩增反应试剂后，或者将配置好的扩增反应试剂加入反应管中，将装有CRISPR-Cas系统检测试剂的容器与装有核酸扩增反应试剂的反应管之间紧密相连，确保整个反应过程在一个封闭的环境中进行。具体是根据实际反应的需要，在核酸检测腔室中分别加入针对检测不同目标物的CRISPR-Cas系统检测试剂，然后用密封膜将反应板密封住，充当反应管的盖子。使用的时候，在反应管中加入相应的核酸扩增反应试剂，上层进行石蜡油密封，与反应板进行紧密连接，将反应管置于指定的温度下反应。反应结束后，核酸扩增产物先流入反应板中的连接腔室，然后通过通道流入核酸检测腔室中进行核酸多重检测。

该装置的所有材质都能够耐高温，不影响核酸扩增反应试剂和CRISPR-Cas系统检测试剂的正常工作。整个装置具有良好的密闭性，反应过程中不会有水分蒸发到环境中去，能够进行PCR反应或其他恒温扩增反应。待扩增反应结束后，通过颠倒、摇晃、震动等方式，将反应管中的核酸扩增产物引入反应板中的连接腔室，然后通过手甩、离心等方式将连接腔室中的扩增产物进一步通过通道平均分配到各个核酸检测腔室中去。然后利用一定波长的光源照射检测区域，根据检测区域是否产生荧光进行核酸检测。

利用上述核酸多重可视化检测装置进行核酸的多种检测，其具体包括如下步骤：

(1)取已加工好的反应板，在其核酸检测腔室中放入相应的CRISPR-Cas系统检测试剂。然后用密封膜牢牢吸附在反应板上，使CRISPR-Cas系统检测试剂与外界环境完全隔绝开。

(2)在反应管中加入核酸扩增反应试剂(PCR、LAMP、RPA等)，并用石蜡油进行密封。取已加入CRISPR-Cas系统检测试剂并用密封膜吸附好的反应板，将其与已加入核酸扩增反应试剂的反应管进行紧密连接。然后将反应管置于相应的温度下进行核酸扩增反应。该反应既可在精确控温的金属热块上进行，也可在水浴中进行。需要注意的是，在进行核酸扩增反应时，要使核酸检测装置的反应管的管口朝上，以保证反应能够顺利进行。同时，应使核酸检测腔室尽可能远离加热源。从而保证核酸检测腔室没有被加热或者核酸检测腔室中的温度没有超过CRISPR-Cas系统检测试剂的最高工作温度界限。

(3)核酸扩增反应结束后，将核酸检测装置反应管管口朝下，通过颠倒、摇晃、震动等方式，使反应管中的核酸扩增产物能够流入到反应板中的连接腔室，再通过手甩、离心等方式将反应板上连接腔室中的液体通过通道平均流入到各个核酸检测腔室中进行反应。反应结束后，用一定波长的光源照射检测区域，当核酸检测腔室中出现荧光，说明待测物中含有所检测目标物；当检测腔室中没有出现荧光，说明待测物中不含有所检测目标物。

实施例4：

使用实施例1中核酸扩增区域与核酸检测区域集成于一体的核酸多重可视化检测装置用于LAMP反应结合CRISPR-Cas系统检测试剂同时检测转基因大豆粉中的转基因启动子CaMV35S基因和内源凝集素lectin基因。

将LAMP多重扩增体系试剂置于该反应板3中的核酸扩增腔室1中。然后将CRISPR-Cas系统检测CaMV35S基因和lectin基因的试剂分别置于反应板3中的核酸检测腔室4a和核酸检测腔室4c中。核酸检测腔室4b中放置不含有gRNA的CRISPR-Cas系统检测试剂，作为阴性对照。

然后进行LAMP扩增程序，LAMP反应结束后，将装置中核酸扩增腔室朝向手心，用手轻轻用力朝核酸检测腔室方向甩去，使核酸扩增腔室中的反应液体通过通道平均分配到各个核酸检测腔室中，然后将核酸检测腔室置于37℃，放置5至10分钟。用波长为485nm的LED光源照射核酸检测腔室，结果显示：核酸检测腔室4a和核酸检测腔室4c均产生绿色荧光。核酸检测腔室4b中无绿色荧光产生。

实施例5：

使用实施例2中利用反应管作为核酸扩增容器与核酸检测容器相连的核酸多重可视化检测装置的第一种实施方式用于LAMP反应结合CRISPR-Cas系统检测试剂同时检测转基因大豆粉中的转基因启动子CaMV35S基因和内源凝集素lectin基因。

将LAMP多重扩增体系试剂置于该装置中的反应管1b中，并添加30μL的石蜡油进行密封。然后将CRISPR-Cas系统检测CaMV35S基因和lectin基因的试剂分别置于反应板3中的核酸检测腔室4a和核酸检测腔室4c中。核酸检测腔室4b中放置不含有gRNA的CRISPR-Cas系统检测试剂，作为阴性对照。

然后进行LAMP扩增程序，LAMP反应结束后，将装置进行颠倒震动二至三次，使反应管中的反应液体流入反应板中的连接腔室。进一步将连接腔室朝向手心，用手轻轻用力朝核酸检测腔室方向甩去，使连接腔室中反应液体通过通道平均分配到各个核酸检测腔室中，然后将核酸检测腔室置于37℃，放置5至10分钟。用波长为485nm的LED光源照射核酸检测腔室，结果显示：核酸检测腔室4a和核酸检测腔室4c均产生绿色荧光。核酸检测腔室4b中无绿色荧光产生。

实施例6：

使用实施例2中利用反应管作为核酸扩增容器与核酸检测容器相连的核酸多重可视化检测装置的第二种实施方式用于LAMP反应结合CRISPR-Cas系统检测试剂同时检测转基因大豆粉中的转基因启动子CaMV35S基因和内源凝集素lectin基因。其余步骤同实施例5。

结果显示：核酸检测腔室4a和核酸检测腔室4c均产生绿色荧光。核酸检测腔室4b中无绿色荧光产生。

实施例7：

使用实施例1中核酸扩增区域与核酸检测区域集成于一体的核酸多重可视化检测装置用于PCR反应结合CRISPR-Cas系统检测试剂同时检测转基因大豆粉中的转基因启动子CaMV35S基因和内源凝集素lectin基因。

将PCR多重扩增体系试剂置于该反应板3中的核酸扩增腔室1中。然后将CRISPR-Cas系统检测CaMV35S基因和lectin基因的试剂分别置于反应板3中的核酸检测腔室4a和核酸检测腔室4c中。核酸检测腔室4b中放置不含有gRNA的CRISPR-Cas系统检测试剂，作为阴性对照。

然后进行PCR扩增程序，PCR反应结束后，将装置中核酸扩增腔室朝向手心，用手轻轻用力朝核酸检测腔室方向甩去，使核酸扩增腔室中的反应液体通过通道平均分配到各个核酸检测腔室中，然后将核酸检测腔室置于37℃，放置5至10分钟。用波长为485nm的LED光源照射核酸检测腔室，结果显示：核酸检测腔室4a和核酸检测腔室4c均产生绿色荧光。核酸检测腔室4b中无绿色荧光产生。

实施例8：

使用实施例2中利用反应管作为核酸扩增容器与核酸检测容器相连的核酸多重可视化检测装置的第一种实施方式用于PCR反应结合CRISPR-Cas系统检测试剂同时检测转基因大豆粉中的转基因启动子CaMV35S基因和内源凝集素lectin基因。

将PCR多重扩增体系试剂置于该装置中的反应管1b中，并添加30μL的石蜡油进行密封。然后将CRISPR-Cas系统检测CaMV35S基因和lectin基因的试剂分别置于反应板3中的核酸检测腔室4a和核酸检测腔室4c中。核酸检测腔室4b中放置不含有gRNA的CRISPR-Cas系统检测试剂，作为阴性对照。

然后进行PCR扩增程序，PCR反应结束后，将装置进行颠倒震动二至三次，使反应管中的反应液体流入反应板中的连接腔室，进一步将连接腔室朝向手心，用手轻轻用力朝核酸检测腔室方向甩去，使连接腔室中反应液体通过通道平均分配到各个核酸检测腔室中，然后将核酸检测腔室置于37℃，放置5至10分钟。用波长为485nm的LED光源照射核酸检测腔室，结果显示：核酸检测腔室4a和核酸检测腔室4c均产生绿色荧光。核酸检测腔室4b中无绿色荧光产生。

实施例9：

使用实施例2中利用反应管作为核酸扩增容器与核酸检测容器相连的核酸多重可视化检测装置的第二种实施方式用于PCR反应结合CRISPR-Cas系统检测试剂同时检测转基因大豆粉中的转基因启动子CaMV35S基因和内源凝集素lectin基因。其余步骤同实施例7。

结果显示：核酸检测腔室4a和核酸检测腔室4c均产生绿色荧光。核酸检测腔室4b中无绿色荧光产生。

Claims (10)

1.一种CRISPR-Cas系统进行核酸的多重特异性可视化检测方法，其特征在于，方法包括以下步骤：提供设置有核酸扩增腔室(1)与核酸检测腔室相连一体的核酸多重可视化检测装置，核酸扩增腔室(1)与核酸检测腔室之间通过通道相连通，且用密封膜(2)将核酸扩增腔室(1)、核酸检测腔室和通道构成的整体进行密封，核酸扩增腔室(1)内放置核酸扩增反应试剂，核酸检测腔室内放置CRISPR-Cas系统检测试剂；然后将核酸扩增腔室进行核酸扩增反应，待反应结束后，核酸扩增腔室中的反应液通过通道流入各个核酸检测腔室中进行反应，最后根据核酸检测腔室是否产生荧光进行核酸多重检测。

2.根据权利要求1所述的一种CRISPR-Cas系统进行核酸的多重特异性可视化检测方法，其特征在于：所述的核酸扩增腔室(1)是由单独的一个腔室构成，或者由一个腔室密封外接反应管(1b)共同构成。

3.根据权利要求1所述的一种CRISPR-Cas系统进行核酸的多重特异性可视化检测方法，其特征在于：核酸扩增反应后，核酸扩增腔室(1)中的核酸扩增反应试剂液体通过手甩、离心核酸多重可视化检测装置等方式，通过通道平均分配到各个核酸检测腔室中。

4.一种核酸多重可视化检测装置，其特征在于：包括反应板(3)和设置在反应板(3)上的一个核酸扩增腔室(1)、至少一个核酸检测腔室(4a、4b、4c)、至少一个通道(5a、5b、5c)和密封膜(2)，反应板(3)表面的一侧上开设有至少一个凹槽，每个凹槽作为一个核酸检测腔室(4a、4b、4c)，反应板(3)表面的另一侧设置有核酸扩增腔室(1)，核酸扩增腔室(1)和每个核酸检测腔室(4a、4b、4c)之间均通过通道(5a、5b、5c)连通，核酸扩增腔室(1)、核酸检测腔室(4a、4b、4c)和通道(5a、5b、5c)在同一个平面上；密封膜(2)密封吸附在反应板(3)表面并完整覆盖核酸扩增腔室(1)、核酸检测腔室(4a、4b、4c)和通道(5a、5b、5c)。

5.根据权利要求4所述的一种核酸多重可视化检测装置，其特征在于：

所述的核酸扩增腔室(1)是由开设反应板(3)表面上的一个凹槽构成，凹槽中容置核酸扩增反应试剂。

6.根据权利要求4所述的一种核酸多重可视化检测装置，其特征在于：

所述的核酸扩增腔室(1)是由开设反应板(3)侧面或者表面上的一个连接腔室(1a)和连接腔室(1a)外接的反应管(1b)共同构成，反应管(1b)中容置核酸扩增反应试剂。

7.根据权利要求6所述的一种核酸多重可视化检测装置，其特征在于：

所述的连接腔室(1a)为开设在反应板(3)侧面的水平通道，水平通道外端贯穿出反应板(3)和反应管(1b)密封连接，水平通道内端和通道(5a、5b、5c)连通。

8.根据权利要求6所述的一种核酸多重可视化检测装置，其特征在于：

所述的连接腔室(1a)为开设在反应板(3)表面的竖直通道，竖直通道下端贯穿出反应板(3)和反应管(1b)密封连接，竖直通道上端贯穿反应板(3)且和通道(5a、5b、5c)连通。

9.根据权利要求4所述的一种核酸多重可视化检测装置，其特征在于：

包括多个核酸检测腔室(4a、4b、4c)，多个核酸检测腔室(4a、4b、4c)所对应连通的通道(5a、5b、5c)在和核酸扩增腔室(1)连通处汇聚在核酸扩增腔室(1)边缘同一点。

10.根据权利要求4所述的一种核酸多重可视化检测装置，其特征在于：

所述密封膜(2)表面是疏水材料，密封膜(2)和反应板(3)中至少有一个使用透明材质。

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