JP2014196938A - 容器兼キャップ及び反応用基材 - Google Patents

Abstract

【課題】第一の反応と第二の反応との間で反応容器を開放したり、第一の反応の反応物や第二の反応の試薬を外部に飛散させたりせずに、第一、第二の反応を実施できる容器兼キャップ及び反応用基材を提供すること。【解決手段】容器兼キャップ１１は、第一の反応のため反応容器１３を密封可能であって、かつ、第二の反応のための試薬Ａを収納する試薬室１６を備え、試薬室１６は、第二の反応のための試薬Ａを第一の反応の間において第一の反応の領域に対して隔離する隔板１７を有し、隔板１７は、試薬室１６の内部と試薬室１６の外部とが連通するように破壊可能であり、第一の反応の後に隔板１７を反応容器１３内に連通させることにより第二の反応のための試薬Ａを反応容器１３に添加する。【選択図】図１７

Description

本発明は、生化学の分野で用いる容器兼キャップ及び反応用基材に関する。

核酸増幅反応は、多くの研究、医療、食品および農業分野で欠かせない技術である。典型的な例としては、目的とする核酸断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅し、増幅された核酸断片の配列をジデオキシシークエンシング法を用いて決定する方法がある。これらの方法においては、核酸増幅した反応液を取り出して、次の反応を行う必要がある。この場合、一度増幅した核酸断片が、別の核酸増幅反応に混入する場合がある。これら核酸増幅反応を利用する方法の検出感度は非常に高く、一度増幅した核酸断片が別の核酸増幅反応に混入した場合、誤った結果を導くキャリオーバーコンタミネーションといわれる問題を引き起こすことがある。このキャリオーバーコンタミネーションを防ぐためには実験設備あるいは実験操作を厳密に管理する必要があり、核酸増幅反応を実施するひとつの障壁となっている（例えば、非特許文献１参照）。

キャリオーバーコンタミネーションを防ぐための種々の方法が開発され、実際の検査や診断法として使用されている。例えば、核酸増幅反応において天然のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）には含まれないデオキシウリジンを使用して増幅された核酸断片にデオキシウリジンを導入する。そして、デオキシウリジンを含む核酸を選択的に分解する酵素（ウラシル−ＤＮＡ−グリコシラーゼ）を利用して試料となる天然の核酸に対して選択的に増幅された核酸のみを分解する方法がある（例えば、非特許文献２参照）。

また、核酸増幅反応と増幅された核酸断片の変異を検出する反応を同時に行う方法が提案されている（例えば、非特許文献３参照）。

癌治療における分子標的薬の効果を予測するには、がん細胞がもつ体細胞変異を検出しなければならない。そのような検出においては、正常細胞とがん細胞の混ざった試料から変異を検出しなければならず、感度の高い変異検出が要求される（例えば、非特許文献４参照）。

また、ゲノムの特定部分の配列の個数の変化（コピー数多型）が病気と関連している場合もあり、その場合は特定の配列のコピー数を検出する必要がある（例えば、非特許文献５参照）。

さらに、ゲノム上の核酸配列のみならず、シトシンがメチル化されているかどうかを検出する必要がある場合もある（例えば、非特許文献６参照）。

またさらに、検出する対象がＲＮＡである場合、最初に逆転写酵素でＤＮＡを合成し、次にＰＣＲで核酸断片を増幅して元のＲＮＡの核酸配列を調べる方法がある（例えば、非特許文献７参照）。

加えて、極微量の核酸断片を増幅するために、ＰＣＲを２段階に分けて行うネステッドＰＣＲがある。（例えば、非特許文献８参照）。さらに、ＦＲＥＴ−ＰＨＦＡ （Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ−ｂａｓｅｄ ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｈｏｍｏｄｕｐｌｅｘ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）（非特許文献９）のように、試料となる遺伝子増幅反応産物における塩基の違いをＦＲＥＴによる蛍光の検出をすることで解析することも知られている。

キャリオーバーコンタミネーションを防ぐ方法として、蓋の開閉をせずに反応の途中で試薬を添加することが考えられる。（例えば、特許文献１、特許文献２参照）。

一方、反応中長時間にわたって試薬を反応領域と分離した状態で維持できる方法が記載されている(例えば、特許文献３参照)。特許文献３の方法は、特許文献１や特許文献２に記載の方法と類似の方法で、ワックスなどを用いて反応容器内で試薬を分離し、ワックス部分をＰＣＲ反応とは別の温度制御する。そして、ＰＣＲの途中でもその試薬を分離し続けることができるようにしたものである。

さらに、ネステッドＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲなどに利用する目的の容器のキャップが開示されている（例えば、特許文献４参照）。特許文献４に記載されたキャップを用いた方法では、キャップ部に反応容器と隔離した状態で試薬を封入し、キャップに付帯した構造物を利用して、反応容器とキャップを隔てる部分を物理的に破壊する。そして、隔離してあった試薬を最初の反応液と混ぜる。この方法においては、キャップは巧妙に設計されてはいるものの、その構造は複雑で製造は高コストとなる。さらに、構造が複雑でキャップ部の厚みが増し、汎用的に使用されるＰＣＲ用の容器と、汎用されるＰＣＲ用装置をそのまま利用することができない。また、ＰＣＲ反応などでよく利用される、反応容器が連結したもの（８連チューブ、１２連チューブ、９６ウェルチューブ）などに応用することが困難である。

特許第３５３２８２６号公報 特開平６−２２７９６号公報 特開２００９−１０６２２１号公報 特表２００８−５２４９８７号公報

Ｄｉｆｆｅｎｂａｃｈ ら、 Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ３， Ｓ２−Ｓ７ （１９９３） Ｐｒｕｖｏｓｔら、 Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３８， ５６９−５７５ （２００５） Ｐａｍｅｌａら、 Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８８， ７２７６−７２８０ （１９９１） Ｈａｒｉｓｍｅｎｄｙら、 Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ． １２， Ｒ１２４ （２０１１） Ｋｏｉｋｅら、 ＢＭＣ Ｇｅｎｅｔ． １２，２９ （２０１１） Ｈｅｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９３， ９８２１−９８２６（１９９６） Ｂｕｓｔｉｎら、Ｊ． Ｍｏｌｅｃ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎ． ３４， ５９７−６０１ （２００５） Ｚｈａｎｇら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｊ． ７， ２３ （２０１０） Ｋｉｔａｎｏら、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ４０８， １９７−２０５ （２０１１）

このように、ＰＣＲ反応などにおいて、汎用される反応容器や反応装置を用いて、ＰＣＲ反応の所望のタイミングまたはＰＣＲ反応が簡潔した後に別の試薬を容器の蓋を開閉せずに添加することは困難であった。

本発明は、上記の問題を鑑みてなされたもので、第一の反応と第二の反応との間で反応容器を開放したり、第一の反応の反応物や第二の反応の試薬を外部に飛散させたりせずに、第一、第二の反応を実施できる容器兼キャップ及び反応用基材を提供することを目的とする。

上記課題を解決するために、この発明は以下の手段を提案している。
本発明の一態様は、第一の反応のため反応容器を密封可能であって、かつ、第二の反応のための試薬を収納する試薬室を備え、前記試薬室は、前記第二の反応のための試薬を前記第一の反応の間において前記第一の反応の領域に対して隔離する隔板を有し、前記隔板は、前記試薬室の内部と前記試薬室の外部とが連通するように破壊可能であり、前記第一の反応の後に前記隔板を貫通して前記試薬室を前記反応容器内に連通させることにより前記第二の反応のための試薬を前記反応容器に添加することを特徴とする容器兼キャップである。

前記試薬室は、前記反応容器の外部からの押圧の際に前記反応容器の密封状態を維持する伸縮性を有する天板を有し、前記隔板は、前記天板に接し前記天板を介して前記隔板を押圧することにより破壊可能であってもよい。

前記天板は前記反応容器の内部と外部とを隔て、且つ光透過性を有し、前記天板を介して前記反応容器内における前記第二の反応が光学的に検出可能であってもよい。

前記第一の反応が遺伝子増幅反応であり、前記第二の反応が、前記第一の反応で得られた遺伝子増幅物に対する生化学反応であり、前記試薬室内には、前記遺伝子増幅産物に対して前記第二の反応を生じさせる試薬が気密状態で封入されていてもよい。

前記第一の反応が、少なくとも前記第一の反応のために前記反応容器内に収容された物質を加熱する目的で前記反応容器の底部を加熱する工程を含み、前記試薬室は、前記反応容器において前記反応容器の前記底部から離間した位置に配されていてもよい。

本発明の別の態様は、上記態様の容器兼キャップと、前記容器兼キャップの前記隔板を前記反応容器内に連通させ且つ前記反応容器を密閉可能な第２のキャップとを備えることを特徴とする反応用基材である。

前記第２のキャップは、前記容器兼キャップの隔板を破壊するための筒状の周板と、前記周板の一端であり尖った形状を有する刃部と、前記周板の他端に形成され前記周板の他端を封止する光透過性の天板と、を有していてもよい。

前記刃部は、前記周板による筒の中心軸線に対して傾斜する断面で前記周板を切断することにより生じる形状の斜面を有し、前記刃部は、前記第２のキャップが前記隔板に挿入されることにより前記周板の一端における外形形状に倣って前記隔板上の周の一部を切断し且つ前記隔板における前記周のうち前記斜面において最も前記他端に近い位置に対応する前記周の一部を未切断で残すことにより、前記周板の一部をフラップ状に前記反応容器内へ押し込んでもよい。

本発明によれば、第一の反応と第二の反応との間で反応容器を開放したり、第一の反応の反応物や第二の反応の試薬を外部に飛散させたりせずに、第一、第二の反応を実施できる容器兼キャップ及び反応用基材を提供できる。

本発明の第一実施形態の反応用基材における容器兼キャップの正面図である。 同容器兼キャップの背面図である。 同容器兼キャップの右側面図である。 同容器兼キャップの左側面図である。 同容器兼キャップの平面図である。 同容器兼キャップの底面図である。 本発明の第一実施形態の反応用基材におけるキャップの正面図である。 同キャップの背面図である。 同キャップの右側面図である。 同キャップの左側面図である。 同キャップの平面図である。 同キャップの底面図である。 本発明の第一実施形態の反応用基材における反応容器の正面図である。 同反応容器の平面図である。 本発明の第一実施形態の反応用基材の使用状態の外観斜視図である。 （ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）は、同反応用基材による反応試験のそれぞれ模式工程図である。 同反応用基材による反応試験の一工程の縦断面図である。 同反応用基材による反応試験の第一の反応時の縦断面図である。 同反応用基材による反応試験の第二の反応時の縦断面図である。 本発明の第二実施形態の反応用基材における反応試験の一工程の縦断面図である。 （ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）は、本発明の第二実施形態の反応用基材による反応試験のそれぞれ模式工程図である。 同反応用基材による反応試験の第一の反応時の縦断面図である。 同反応用基材による反応試験の第二の反応時の縦断面図である。

(第一実施形態)
以下、本発明に係る容器兼キャップ及び反応用基材の第一実施形態を、図１から図１９を参照しながら説明する。図１は、本発明の第一実施形態の容器兼キャップの正面図である。図２は、容器兼キャップの背面図である。図３は、容器兼キャップの右側面図である。図４は、容器兼キャップの左側面図である。図５は、容器兼キャップの平面図である。図６は、容器兼キャップの底面図である。

図１から図１９において、反応用基材１０(図１７参照)は、容器兼キャップ１１(以下、試薬チャンバと言う。)、キャップ１２(図７参照)(以下、ピアッサーと言う。)、反応容器１３(図１３参照)を備える。図１、図２、図３、図４に示すように、試薬チャンバ１１は、天板１４と、周板１５と、隔板１７とを備えており、天板１４と周板１５と隔板１７との内側に、第二の反応試薬（図１７参照）Ａを収納するための試薬室１６を有する。

図５、図６に示すように、天板１４は、四角形の板状に形成されている。周板１５は、内径Ｄ１で外径Ｄ２の円筒形の外形形状を有する。周板１５は、反応容器１３に設けられた後述する開口部（図１４参照）１８に嵌入される。天板１４は、ＰＣＲ反応などの加熱反応で圧力が高まる場合でも、密封性を維持する機能を有する。

天板１４は、試薬室１６の上部を封止するとともに、外部からの圧力により隔板１７を破壊する工程（後述）において破壊される部材である。
また、天板１４は、光に対して透過性を有しても不透過性を有してもよいが、反応容器１３の垂直方向（反応容器１３の開口部から底部へ向かう方向）から測定する場合は、光透過性が高いことが好ましい。

天板１４の材質としては、柔軟性があり、かつ、反応容器１３内の試薬反応に阻害を生じない材質であることが好ましい。例えば、天板１４の材料は、ポリプロピレンやポリエチレン、シリコーン、ＰＴＦＥ、ポリカーボネート、アクリルなどの樹脂が好ましい。

さらに、試薬チャンバ１１の天板１４は、反応容器１３に装着した状態で蛍光測定可能なＰＣＲ装置等における反応及び測定をすることができるように、天板１４の厚さが設定されている。例えば、天板１４の厚さは、１０マイクロメートル（μｍ）から５ミリメートル（ｍｍ）程度に設定されてよい。なお、天板１４の厚さ寸法の許容度は、測定装置に応じて異なる。
天板１４の材質において蛍光測定可能なＰＣＲ装置に好適に適用可能な材質は、シリコーン、エラストマー、ＰＴＦＥ、ポリエステル、ナイロン、及びポリイミドなどが挙げられる。

周板１５は、反応容器１３の開口部の内面に周板１５の外面が摩擦等により係合する係合部材である。周板１５の形状としては、周板１５の周囲にリング状に膨らみやリング状の溝が設けられていたり、細かな凹凸が設けられていたりしてよい。これらの膨らみ、溝、あるいは細かな凹凸は、反応容器１３の内面に対する係合力を高める効果を奏する。また、周板１５の外面に形成される膨らみや溝や凹凸は、複数、多数あってもよい。また、周板１５の外面は、反応容器１３の開口部の内面に対して、当該開口部の周方向に一周連続する線状の領域で密着するようになっている。これにより、試薬チャンバ１１によって反応容器１３を密閉することができる。なお、反応容器１３の密閉性を維持する目的で、周板１５の外面における微細な表面粗さは、小さいことが好ましい。なお、反応容器１３の開口部の内面の微細な表面粗さも同様に小さいことが好ましい。

なお、試薬チャンバ１１は、反応容器１３の開口部の内面に対する密閉性を維持しているとともに、反応容器１３から浮き上がるのを防ぐための構造を有していてもよい。例えば、小さな返し形状の引っかかりが試薬チャンバ１１に形成されていてもよい。

隔板１７は、試薬チャンバ１１が反応容器１３に取り付けられた状態において、試薬室１６と反応容器１３とを隔離するための部材である。図１に示すように、隔板１７の下面１９は、反応容器１３の内部空間に露出される面であり、隔板１７において下面１９と反対側に位置する上面２０は、第二の反応に必要な第二の反応試薬Ａと直接接触する面である。

隔板１７は、光に対して透過性を有しても不透過性を有してもよい。さらに、隔板１７の第二の反応試薬Ａと直接接触する上面２０は、第二の反応試薬Ａと反応しにくく、また、第二の反応試薬Ａを吸着しにくい材質であることが好ましい。さらにまた、隔板１７は、第一の反応が高温で実施された場合でも変形しにくい材質であることが好ましい。

なお、隔板１７の好ましい耐熱温度としては、例えば、ＰＣＲにおいてＤＮＡの変性のために行なわれる加熱温度、具体的には６０℃程度から１０５℃程度までの範囲において形状を好適に維持できる耐熱温度とすることができる。本実施形態において、試薬チャンバ１１が反応容器１３に取り付けられた状態で試薬チャンバ１１と反応容器１３との組み合わせ体がＰＣＲ反応に供される場合、一般的に、反応容器１３の底部に溜まった試薬等を所定の温度サイクルで加熱及び冷却するために、反応容器１３の底部が特に加熱及び冷却される。そして、隔板１７は、反応容器１３の底部から離間した位置にあり、反応容器１３の底部と比較してＰＣＲ反応における加熱や冷却の影響が少ない。このような場合、隔板１７の耐熱温度は、上述の６０℃程度から１０５℃の範囲よりも低くても構わない。

さらに、隔板１７は、外部からの圧力によって比較的容易に破壊可能な材質である。“比較的容易”とは、ＰＣＲ反応において反応容器１３内の液体や気体が膨張することによる内圧の増加では隔板１７が破壊されず、後に詳述するピアッサー１２に形成された刃部２３を用いて隔板１７が破壊可能であることを指す。

隔板１７の材質は、ポリプロピレン、ポリエチレン、シリコン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリスチロール、ポリアセタール、ナイロン、ＰＶＡやアクリルなどの樹脂が挙げられる。また、要件に適合するものとしては、アルミニウム、金フィルム、銀フィルム等の金属フィルムが挙げられる。さらに、薄手の板状素材であれば、ガラスやケイ素化合物、炭素化合物やセラミックも隔板１７の材料として使用可能である。

また、数種類の材質のものを層状に重ね合わせたり、第二の反応試薬Ａとの接触面に第二の反応試薬Ａとの反応や第二の反応試薬Ａの吸着，阻害を防ぐための別材料を第二の反応試薬Ａとの接触面にコーティングしたり蒸着したりすることで、第二の反応試薬Ａとの反応や第二の反応試薬Ａの吸着，阻害を防ぎつつ、ピアッサー１２を用いた破壊が容易となる材料を使用することが可能である。

なお、周板１５と隔板１７とは一体成型であってもよいし、それぞれ別体の部材を貼り付けてもよい。周板１５と隔板１７とを貼り付ける方法としては、接着剤による方法や、材料同士を超音波や熱、圧力等で直接貼り付ける方法がある。
周板１５と天板１４との接合は、第二の反応試薬Ａを試薬室１６に充填した後に行われる。周板１５と天板１４との接合は、接着剤を用いて周板１５と天板１４とを接着するか、あるいは、周板１５と天板１４とを超音波、熱、圧力等で接着する。

図７は、本発明の第一実施形態の反応用基材におけるピアッサーの正面図である。図８は、ピアッサーの背面図である。図９は、ピアッサーの右側面図である。図１０は、ピアッサーの左側面図である。図１１は、ピアッサーの平面図である。図１２は、ピアッサーの底面図である。
図７、図８、図９、図１０に示すように、ピアッサー１２は、四角形に形成された天板２１と、天板２１と一体に形成された周板２２を備える。ピアッサー１２は、試薬チャンバ１１の天板１４及び隔板１７を破壊し、さらに反応容器１３に蓋をする機能を有する。そのため、周板２２は、試薬チャンバ１１に対して押し込んだ後、反応容器１３の密封性を維持するものであることが望ましい。

図１１、図１２に示すように、周板２２は、天板１４及び隔板１７を突き破るために、先端に尖った刃部２３を有する。この刃部２３としては、周板２２による筒の中心軸線に対して傾斜した断面に沿った端面を有するパイプ形状や、ギザギザとした断面、肉厚が十分に薄いパイプ形状が挙げられる。周板２２は、外径Ｄ３の円筒形の外形を有する。ここで、周板２２の外径Ｄ３は、試薬チャンバ１１の周板１５の内径Ｄ１よりもわずかに小さい。そのため、ピアッサー１２を試薬チャンバ１１に向けて押圧させることにより、ピアッサー１２の周板２２は試薬チャンバ１１の周板１５に嵌入される。周板２２は、反応容器１３の垂直方向から光学的測定を行うために、光透過性を有することが必要である。また、周板２２は、光路を確保するために、光路をさえぎらない構造がよく、円筒型であることが好ましい。

周板２２は、外径Ｄ３が、少なくとも、１ミリメートル、好ましくは３ミリメートルを越える値である。周板２２の内部は、試薬室内の第二の反応試薬Ａが通る流路となってもよい。また、周板２２の内部を第二の反応試薬Ａが流れる流路として機能させる場合には、周板２２の内外を連通する貫通孔が周板２２の外周面に開口されていてもよい。
天板２１と周板２２とは、異なる材質であっても、或いは、同じ材質でもよい。異なる材質である場合は、両者を貼り付けて作製し、同じ材質の場合は一体成型で作製することが可能である。

ピアッサー１２は、反応容器１３に装着した試薬チャンバ１１にピアッサー１２が装着した状態において、市販の蛍光測定可能なＰＣＲ装置での反応および測定を可能にするために、試薬チャンバ１１にピアッサー１２を装着した際の天板２１の厚さが１ミリメートルから５ミリメートル程度が好ましい。なお、この厚さ寸法の許容度は、蛍光測定可能なＰＣＲ装置によって異なる。

図１３は、本発明の第一実施形態の反応用基材における反応容器の正面図である。図１４は、反応容器の平面図である。図１３に示すように、反応容器１３は、円筒形状に形成された筒部２４と、筒部２４に接続された底部２５とを有する。

図１４に示すように、筒部２４には、所定の内径Ｄ４を有する開口部１８が形成されている。筒部２４の内径Ｄ４は、試薬チャンバ１１の周板１５の外径Ｄ２よりもわずかに大きい。そのため、開口部１８に対して試薬チャンバ１１の周板１５を押圧させることにより、試薬チャンバ１１の周板１５が筒部２４に嵌入されて、筒部２４の内面と試薬チャンバ１１の周板１５とが密着する。
底部２５は、試薬その他の液体が収容される部分であり、本実施形態における第一の反応及び第二の反応は底部２５の内部で行なわれる。本実施形態では、底部２５は、光透過性を有しており、底部２５を介して反応容器１３の外部から反応状態を観察したり、反応を光学的に測定したりすることができる。

図１５は、反応用基材１０の使用状態の一例を示す外観斜視図である。図１５に示すように、反応用基材１０は、試験装置５０に適用されてもよい。試験装置５０は、８つのマイクロチューブが一列に並んだ状態で互いに連結されてなる８連チューブ構造を有している。試験装置５０は、８個の試薬チャンバ１１を一列に配列して保持するためのチャンバ保持部材５１と、試薬チャンバ１１と同数のピアッサー１２を一列に配列して保持するためのピアッサー保持部材５２とを備える。さらに、試験装置５０は、試薬チャンバ１１と同数の反応容器１３を一列に配列して保持するための容器保持部材５３を備える。チャンバ保持部材５１と、ピアッサー保持部材５２と、容器保持部材５３とは、試薬チャンバ１１、ピアッサー１２、反応容器１３を位置決めして不図示の制御装置により駆動される。

次に、第一実施形態の反応試験の工程について説明する。図１６（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）は、本発明の第一実施形態の反応用基材１０による反応試験のそれぞれ模式工程図である。図１７は、反応試験の一工程の縦断面図である。図１８は、反応試験の第一の反応時の縦断面図である。図１９は、反応試験の第二の反応時の縦断面図である。

図１６（ａ）、図１７に示すように、第一工程において、反応容器１３に検体Ｂおよび第一の反応試薬Ｃを添加する。第一工程の後に第二工程を行う。

図１６（ｂ）に示すように、第二工程においては、あらかじめ第二の反応試薬Ａを封入した試薬チャンバ１１を用意する。第二工程の後に、第三工程を行う。

図１６（ｃ）、図１８に示すように、第三工程においては、第二の反応試薬Ａを封入した試薬チャンバ１１を反応容器１３に嵌入する。試薬チャンバ１１の嵌入により反応容器１３は密封され、検体Ｂおよび第一の反応試薬Ｃによる第一の反応を実施する。このとき、反応容器１３は、試薬チャンバ１１によって密封状態を保持されるために、薬剤の外部への漏れを防止して第一の反応を行う。第三工程の後に、第四工程を行う。

図１６（ｄ）に示すように、第四工程においては、ピアッサー１２を用意する。第四工程の後に、第五工程を行う。

図１６（ｅ）、図１９に示すように、第五工程においては、ピアッサー１２を試薬チャンバ１１に対して押圧させることにより、ピアッサー１２の周板２２の刃部２３によって、試薬チャンバ１１の天板１４が破られるとともに、試薬チャンバ１１の隔板１７が破られ、試薬室１６が反応容器１３内に連通接続される。これにより、試薬チャンバ１１の試薬室１６内の第二の反応試薬Ａが反応容器１３内に滴下されることにより第二の反応を行う。ピアッサー１２によって隔板１７が破られた部分は、ピアッサー１２の周板２２の外形形状に沿った周の一部において繋がったフラップ状となっている。このため、ピアッサー１２を用いて試薬室１６と反応容器１３とを連通させた状態であっても、隔板１７の断片は底部２５へは脱落しない。このため、後述する第二の反応の測定において隔板１７の断片は測定の邪魔にならない。
また、ピアッサー１２の試薬チャンバ１１への嵌合に伴い、反応容器１３は、密封状態を保持し続ける。これにより、試薬チャンバ１１内の第二の反応試薬Ａが外部へ漏れるのが防止されつつ、第二の反応が反応容器１３内で始まる。なお、第二の反応試薬Ａが検体Ｂ及び第一の反応試薬Ｃの位置まで到達しない場合、遠心法などの方法を用いて第二の反応試薬Ａを反応容器１３の底部２５まで誘導することもできる。また、必要に応じて、反応容器１３に対して外部から振動を与えて第二の反応試薬Ａと検体Ｂ及び第一の反応試薬Ｃとを混合してもよい。また、ピアッサー１２の周板２２は、試薬チャンバ１１の天板１４に密着したままになって反応容器１３を密閉状態に保持する。第五工程の後に、第六工程を行う。

図１６（ｆ）に示すように、第六工程においては、ピアッサー１２の天板２１から、破られた試薬チャンバ１１の天板１４を通じて、反応結果を測定する。すなわち、第二の反応中あるいは第二の反応後に、反応容器１３の外部から光学的手法により反応を測定することができる。本実施形態では、反応容器１３の垂直方向においては、ピアッサー１２の周板２２の内部を通じて、天板２１を介して光学的な測定をすることができる。また、本実施形態では、反応容器１３の底部２５を介して例えば水平方向に光学的な測定をすることもできる。

このように、反応用基材１０は、一つの反応容器１３内で、第一の反応と、第二の反応とを、蓋等を開閉することなく行い、２段階目の反応を反応容器１３の外部から検知するプロセスを提供する。第一の反応のための反応溶液には、第一の反応のための試薬Ｃや検体Ｂが含まれており、それを第二の反応のための試薬Ａを入れた試薬チャンバ１１で封止して第一の反応を実施する。
試薬チャンバ１１は、反応容器１３と嵌合する部分、反応容器１３と隔てる部分である隔板１７、及び外部と隔てる部分である天板１４を有している。

本実施形態は、例えば、ネステッドＰＣＲや逆転写とポリメラーゼ連鎖反応を連続して行う（ＲＴ−ＰＣＲ）などの多段階反応の実施に有用である。さらに、ＦＲＥＴ−ＰＨＦＡのように、ＰＣＲにより得られた増幅物を検査する工程を閉鎖系で行うことができる。

本実施形態に用いられる「ネステッドＰＣＲ」、「逆転写とポリメラーゼ連鎖反応」あるいは「ＦＲＥＴ−ＰＨＦＡ」はいずれもポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用する方法である。
ポリメラーゼ連鎖反応は、二つのプライマーとＤＮＡポリメラーゼを用いて目的とするＤＮＡ断片を指数関数的に増幅する方法で、分子生物学的手法を用いる研究や、核酸検出をする診断薬などで広く利用されている。

「ネステッドＰＣＲ」は、ＰＣＲによる核酸断片の増幅において、感度ならびに特異性をさらに高めるために用いられる方法である。例えば、通常のＰＣＲにおいては、検出対象の試料に二つのプライマーに類似の配列が存在する場合、目的以外の増幅物が得られることがある。その場合、目的以外の増幅物が得られるのみならず、目的の増幅物の収量が不十分となることもある。

それらの問題を解決するために、「ネステッドＰＣＲ」では、二組のプライマーペアが使用される。まず始めに、増幅しようとする核酸断片より長い鎖長の核酸断片が得られるようなプライマーの組み合わせで増幅反応が行われる。この場合、一組目のプライマーペアと類似配列が存在する場合は目的としない増幅物も得られる。しかし、二組目のプライマーペアは最初の増幅物のうち目的とする増幅物のみを特異的に増幅するプライマーペアであり、最初の増幅物のうち目的としない増幅物は増幅しない。

すなわち、「ネステッドＰＣＲ」によれば、２段階のＰＣＲによって特異性を高め、目的とする核酸断片の増幅効率を高めることができる。「ネステッドＰＣＲ」における２段階の反応を行うには、一組目のプライマーペアによる最初の増幅反応の後に、二組目のプライマーペアを加える必要がある。
一般的に、「ネステッドＰＣＲ」では、最初の増幅反応の後に蓋を開け、二組目のプライマーペアを加え、その後、二組目のプライマーによる遺伝子増幅反応を開始する。
その場合、最初の増幅物が反応容器の外に飛散し、キャリオーバーコンタミネーションの原因となることが多い。従って、一組目のプライマーペアによる増幅反応と、二組目の増幅反応を反応容器を開閉せずに実施することはキャリオーバーコンタミネーションを防ぐための重要な方法となる。なお、キャリオーバーコンタミネーションとは、ＰＣＲにおいて一度増幅された核酸断片が飛散し、別の反応に混入する現象をいい、ＰＣＲを用いた試験では、キャリオーバーコンタミネーションを防ぐためにいろいろな手段が講じられている。従って、ネステッドＰＣＲの結果も二組目のプライマーペアによる増幅の後に蓋を開けないで調べることが好ましい。

一方、「ＲＴ−ＰＣＲ」は、増幅しようとする核酸がＲＮＡであり、最初に１種類のプライマーと逆転写酵素（リバーストランスクリプターゼ）でＲＮＡに相補的なＤＮＡを合成する必要がある。次に、得られたＤＮＡ鎖を試料としてＰＣＲを実施することになり、ＲＴ−ＰＣＲも二段階の反応が必要である。ＲＴ−ＰＣＲにおいても、最初の反応に得られた生成物が飛散した場合にキャリオーバーコンタミネーションの原因となることがあり、２段階の反応を蓋を開けることなく実施することが望ましい。

さらに、ＦＲＥＴ−ＰＨＦＡはＰＣＲによる増幅物と同じ長さの標識した２本鎖ＤＮＡを用いて鎖置換反応を行い、わずかな割合しか存在しない変異を検出するすぐれた方法である。この方法は操作は簡便であるものの、ＰＣＲ反応の後に、増幅物と標識した２本鎖ＤＮＡを混合する過程が必要である。ＦＲＥＴ−ＰＨＦＡにおいては、ＰＣＲの増幅物のみならず、標識した２本鎖ＤＮＡもキャリオーバーコンタミネーションの原因となる可能性があり、蓋を開けないでＦＲＥＴ−ＰＨＦＡを実施することは、キャリオーバーコンタミネーションの原因となりうる各要因をともに排除することができる。
なお、ＦＲＥＴ−ＰＣＲの反応は、蛍光検出を行うことで測定可能である。

以上説明したように、第一実施形態の試薬チャンバ１１によれば、第一の反応と第二の反応との間で反応容器１３を開放したり、第一の反応の反応物や第二の反応の試薬Ａを外部に飛散させたりせずに、第一、第二の反応を実施できる。

また、第一実施形態の試薬チャンバ１１によれば、隔板１７が、伸縮性を有し、反応容器１３の外部からの押圧の際に、反応容器１３の密封状態を維持するために、薬剤の漏洩を防止することができる。

そして、第一実施形態の試薬チャンバ１１によれば、反応容器１３の上端からの厚さが１ミリメートルから５ミリメートルに設定されているために取り扱い性に優れる。

さらに、第一実施形態の試薬チャンバ１１によれば、天板１４が光透過性を有するために、測定時に有効な視界を確保できる。

そしてまた、第一実施形態の試薬チャンバ１１によれば、天板１４が伸縮性を有するために、天板１４は、ピアッサー１２の周板２２によって破られた後に周板２２に密着して反応容器１３を密閉状態に保持できる。

さらにまた、第一実施形態の試薬チャンバ１１によれば、第一の反応により、遺伝子増幅反応を行うことができる。

加えて、第一実施形態の試薬チャンバ１１によれば、第二の反応において、第一の反応で得られた遺伝子増幅物の塩基配列を検査するための反応を行うことができる。

また、第一実施形態の試薬チャンバ１１によれば、第二の反応のために添加される試薬が溶液または乾燥状態であるために、取り扱い性を良好にできる。

そして、第一実施形態の反応用基材１０によれば、第一の反応と第二の反応との間で反応容器１３を開放したり、第一の反応の反応物や第二の反応の試薬Ａを外部に飛散させたりせずに、第一、第二の反応を実施できる。

さらに、第一実施形態の反応用基材１０によれば、試薬チャンバ１１の隔板１７を反応容器１３内に連通させて反応容器１３を密閉可能なピアッサー１２を備えることにより、反応試験を容易に行うことができる。

なお、本実施形態では、天板１４はピアッサー１２によって破壊される例が示されたが、天板１４は、ピアッサー１２によって破壊されずに伸び、隔板１７が天板１４を介してピアッサー１２により押圧されるようになっていてもよい。この場合、天板１４が十分に伸縮性を有していれば、ピアッサー１２が反応容器１３の開口部から引き抜かれたときに、天板１４は、ピアッサー１２が反応容器１３内に差し込まれる前と同様の形状まで復元する。

（第二実施形態）
次に、本発明の第二実施形態について図２０から図２３を参照しながら説明するが、第一実施形態と同一の部位には同一の符号を付してその説明は省略し、異なる点についてのみ説明する。図２０は、本発明に係る第二実施形態の反応用基材における反応試験の一工程の縦断面図である。
図２０に示すように、反応用基材３０は、第一実施形態で用いたピアッサーに代えて治具３１を備える。
また、天板１４は、伸縮性の高い材質からなり、外部から押し込むことで、反応容器１３と試薬チャンバ１１を隔てる部分を破壊し、試薬チャンバ１１に収納された第二の反応のための試薬Ａを第一の反応の反応試薬Ｃ及び検体Ｂに添加することが可能になる。ただし、外部と隔てる部分は、伸縮性を有するために、反応容器１３と試薬チャンバ１１とを隔てる部分を破壊して第二の反応のための試薬Ａを添加した後は元の形に復元し、第二の反応の外部と隔てる機能を維持できる。第二の反応を反応容器１３の外部から検知するためには、反応容器１３の水平方向から光学的手法で行うことが可能である。また、反応容器１３の垂直方向すなわち、試薬チャンバ１１の方向から検知する場合もある。その場合には、試薬チャンバ１１の伸縮性のある外部と隔てる部分は光透過性である必要がある。

図２１（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）は、反応用基材３０による反応試験のそれぞれ模式工程図である。図２２は、反応用基材３０による反応試験の第一の反応時の縦断面図である。図２３は、反応用基材３０による反応試験の第二の反応時の縦断面図である。

図２１（ａ）に示すように、第一工程において、反応容器１３に検体Ｂおよび第一の反応試薬Ｃを添加する。第一工程の後に第二工程を行う。

図２１（ｂ）に示すように、第二工程においては、あらかじめ第二の反応試薬Ａを封入した試薬チャンバ１１を用意する。第二工程の後に、第三工程を行う。

図２１（ｃ）、図２２に示すように、第三工程においては、第二の反応試薬Ａを封入した試薬チャンバ１１を反応容器１３に嵌入する。試薬チャンバ１１の嵌入により反応容器１３は密封され、検体Ｂおよび第一の反応試薬Ｃによる第一の反応を実施する。このとき、反応容器１３は、試薬チャンバ１１によって密封状態を保持されるために、薬剤の外部への漏れを防止して第一の反応を行う。第三工程の後に、第四工程を行う。

図２１（ｄ）に示すように、第四工程においては、治具３１を用意する。治具３１は、針形の細い形状に形成されている。第四工程の後に、第五工程を行う。

図２１（ｅ）、図２３に示すように、第五工程においては、治具３１を試薬チャンバ１１に対して押圧させることにより、治具３１によって、試薬チャンバ１１の天板１４が伸び、試薬チャンバ１１の隔板１７が破られ、試薬室１６が反応容器１３内に連通接続される。これにより、試薬チャンバ１１の試薬室１６内の第二の反応試薬Ａが反応容器１３内に滴下されることにより第二の反応を行う。その後、治具３１は、試薬チャンバ１１から抜き取られる。そして、試薬チャンバ１１の天板１４は弾性復元するために、反応容器１３内は密閉状態に保持される。このとき、第二の反応試薬Ａが検体Ｂ及び第一の反応試薬Ｃの位置まで到達しない場合、遠心法などの方法を用いて第二の反応試薬Ａを反応容器１３の底部２５まで誘導することもできる。また、必要に応じて、反応容器１３に対して外部から振動を与えて第二の反応試薬Ａと検体Ｂ及び第一の反応試薬Ｃとを混合してもよい。第五工程の後に、第六工程を行う。

図２１（ｆ）に示すように、第六工程においては、試薬チャンバ１１の天板１４を介して、反応結果を測定する。第二の反応中あるいは第二の反応後における反応容器１３内の状態は、反応容器１３の外部から光学的手法により測定することができる。このように、測定は、反応容器１３の垂直方向あるいは水平方向のいずれから行ってもよい。

第二実施形態の反応用基材３０によれば、第一の反応と第二の反応との間で反応容器１３を開放したり、第一の反応の反応物や第二の反応の試薬Ａを外部に飛散させたりせずに、第一、第二の反応を実施できる。

以上、本発明の各実施形態について図面を参照して詳述したが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。

１０、３０ 反応用基材
１１ 容器兼キャップ、試薬チャンバ
１２ キャップ、ピアッサー
１３ 反応容器
１４、２１ 天板
１５、２２ 周板
１６ 試薬室
１７ 隔板
１８ 開口部
１９ 下面
２０ 上面
２３ 刃部
２４ 筒部
２５ 底部
３１ 治具
５０ 試験装置
５１ チャンバ保持部材
５２ ピアッサー保持部材
５３ 容器保持部材
Ａ 第二の反応試薬
Ｂ 検体
Ｃ 第一の反応試薬

Claims (8)

1. 第一の反応のため反応容器を密封可能であって、かつ、第二の反応のための試薬を収納する試薬室を備え、
   前記試薬室は、前記第二の反応のための試薬を前記第一の反応の間において前記第一の反応の領域に対して隔離する隔板を有し、
   前記隔板は、前記試薬室の内部と前記試薬室の外部とが連通するように破壊可能であり、前記第一の反応の後に前記隔板を貫通して前記試薬室を前記反応容器内に連通させることにより前記第二の反応のための試薬を前記反応容器に添加する
   ことを特徴とする容器兼キャップ。
2. 前記試薬室は、前記反応容器の外部からの押圧の際に前記反応容器の密封状態を維持する伸縮性を有する天板を有し、
   前記隔板は、前記天板に接し前記天板を介して前記隔板を押圧することにより破壊可能である
   ことを特徴とする請求項１に記載の容器兼キャップ。
3. 前記天板は前記反応容器の内部と外部とを隔て、且つ光透過性を有し、前記天板を介して前記反応容器内における前記第二の反応が光学的に検出可能であることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の容器兼キャップ。
4. 前記第一の反応が遺伝子増幅反応であり、
   前記第二の反応が、前記第一の反応で得られた遺伝子増幅物に対する生化学反応であり、
   前記試薬室内には、前記遺伝子増幅産物に対して前記第二の反応を生じさせる試薬が気密状態で封入されている
   ことを特徴とする請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の容器兼キャップ。
5. 前記第一の反応が、少なくとも前記第一の反応のために前記反応容器内に収容された物質を加熱する目的で前記反応容器の底部を加熱する工程を含み、
   前記試薬室は、前記反応容器において前記反応容器の前記底部から離間した位置に配されている
   ことを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の容器兼キャップ。
6. 請求項１から請求項５のいずれか一項に記載の容器兼キャップと、
   前記容器兼キャップの前記隔板を前記反応容器内に連通させ且つ前記反応容器を密閉可能な第２のキャップとを備えることを特徴とする反応用基材。
7. 前記第２のキャップは、
   前記容器兼キャップの隔板を破壊するための筒状の周板と、
   前記周板の一端であり尖った形状を有する刃部と、
   前記周板の他端に形成され前記周板の他端を封止する光透過性の天板と、
   を有することを特徴とする請求項６に記載の反応用基材。
8. 前記刃部は、前記周板による筒の中心軸線に対して傾斜する断面で前記周板を切断することにより生じる形状の斜面を有し、
   前記刃部は、前記第２のキャップが前記隔板に挿入されることにより前記周板の一端における外形形状に倣って前記隔板上の周の一部を切断し且つ前記隔板における前記周のうち前記斜面において最も前記他端に近い位置に対応する前記周の一部を未切断で残すことにより、前記周板の一部をフラップ状に前記反応容器内へ押し込む
   ことを特徴とする請求項７に記載の反応用基材。

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