JP4556194B2 - 生体試料反応方法 - Google Patents

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Description

本発明は、核酸増幅などの生体試料反応を行うための、生体試料反応用チップおよび生体試料反応方法に関するものである。
ガラス基板等に微細流路が設けられたマイクロ流体チップを使用して、化学分析や化学合成、あるいはバイオ関連の分析などを行う方法が注目されている。マイクロ流体チップは、マイクロTotal Analytical System (マイクロＴＡＳ)や、Lab-on-a-chip等とも呼ばれ、従来の装置に比較して試料や試薬の必要量が少ない、反応時間が短い、廃棄物が少ないなどのメリットがあり、医療診断、環境や食品のオンサイト分析、医薬品や化学品などの生産等、広い分野での利用が期待されている。試薬の量が少なくてよいことから、検査のコストを下げることが可能となり、また、試料および試薬の量が少ないことにより、反応時間も大幅に短縮されて検査の効率化が図れる。特に、医療診断に使用する場合には、試料となる血液など検体を少なくすることができるため、患者の負担を軽減できるというメリットもある。
試料として用いるＤＮＡやＲＮＡなどの遺伝子を増幅する方法として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法がよく知られている。ＰＣＲ法は、ターゲットのＤＮＡと試薬を混合したものをチューブに入れ、サーマルサイクラーという温度制御装置で、例えば５５℃、７２℃、９４℃の３段階の温度変化を数分の周期で繰り返し反応させるもので、ポリメラーゼという酵素の作用により温度サイクル１回あたり、約２倍にターゲットＤＮＡだけを増幅することができる。
近年、特殊な蛍光プローブを用いたリアルタイムＰＣＲという方法が実用化され、増幅反応を行いながらＤＮＡの定量ができるようになった。リアルタイムＰＣＲは、測定の感度、信頼性が高いことから、研究用、臨床検査用に広く使われている。
しかし、従来の装置では、ＰＣＲに必要な反応液の量は数十μｌが標準的であり、また、１つの反応系では基本的に１つの遺伝子の測定しかできないという問題があった。蛍光プローブを複数入れてその色で区別することにより４種類程度の遺伝子を同時に測定する方法もあるが、それ以上の遺伝子を同時に測定するためには反応系の数を増やすしかなかった。検体から抽出されるＤＮＡの量は一般に少量であり、また試薬も高価なため同時に多数の反応系を測定することは困難であった。
特許文献１や２には、回転駆動装置を使用して、ＰＣＲ反応溶液や血液などの液状の検体試料を複数のチャンバに正確に流し込む発明が開示されている。
また、特許文献３には、半導体基板上に集積化されたマイクロウェルを作製して、当該ウェルの中でＰＣＲを行うことにより、微量のサンプルで、多数のＤＮＡ試料を一度に増幅して解析を行う方法が開示されている。
特開２００６−１２６０１０号公報 特開２００６−１２６０１１号公報 特開２０００−２３６８７６号公報
本発明の目的は、微量な反応液での反応処理が可能であり、また一度に多くの検体の処理を効率よく行うことが可能な、生体試料反応用チップおよび生体試料反応方法を得ることである。
本発明に係る生体試料反応用チップは、複数の反応容器と、一端に反応液供給口を備え、他方の端部に排気用開口部を供えた反応液導入用流路と、一端が１つの前記反応容器に接続され、他方の端部が前記反応液導入用流路に接続された反応液定量用流路と、を備え、各々の前記反応容器の内部には、反応に必要な試薬が塗布されていることを特徴とするものである。
本発明によれば、反応液導入用流路から反応液定量用流路を介して反応容器内に反応液を供給することにより、ピペットで定量することが難しい非常に少量の反応液での反応処理が可能となる。反応液の量が少量になると、試薬等のコストを下げることが可能となり、また、反応時間も大幅に短縮されて処理の効率化が図れる。また、一度に多数の反応容器内で処理を行うことができるため、多種類の検査等を効率よく行うことができる。
また、反応液を一旦反応液定量用流路に溜めてから反応容器に導入するようにすることにより、反応容器間でのコンタミネーションを防ぐことができる。
また、各々の前記反応容器には、反応に必要な試薬が塗布されているので、使用者は、反応液を充填するだけで簡易に検査等を行うことができる。
また、前記反応容器の容積が、前記反応液定量用流路の容積よりも小さくなるように形成してもよい。
本発明に係る生体試料反応方法は、上記の生体試料反応用チップを用いた生体試料反応方法であって、前記反応容器、前記反応液定量用流路、及び前記反応液導入用流路の内部を所定の圧力まで減圧する工程と、前記反応液供給口を介して前記反応液導入用流路内に反応液を充填する工程と、前記反応容器、前記反応液定量用流路、及び前記反応液導入用流路の内部をチップ外部の圧力に戻し、前記反応液を前記反応液定量用流路に導入する工程と、前記反応液導入用流路内の前記反応液を除去する工程と、遠心力を用いて、前記反応液定量用流路内の前記反応液を前記反応容器に導入する工程と、生体試料反応処理を実行する工程と、を有する。
本発明によれば、反応液導入用流路から反応液定量用流路を介して反応容器内に反応液を供給することにより、ピペットで定量することが難しい非常に少量の反応液での反応処理が可能となる。反応液の量が少量になると、試薬等のコストを下げることが可能となり、また、反応時間も大幅に短縮されて処理の効率化が図れる。また、一度に多数の反応容器内で処理を行うことができるため、多種類の検査等を効率よく行うことができる。
また、反応液を一旦反応液定量用流路に溜めてから反応容器に導入するようにすることにより、反応容器間でのコンタミネーションを防ぐことができる。
また、前記所定の圧力まで減圧する工程では、チップ外部の圧力の５０％以上かつ前記チップ外部の圧力より小さい圧力まで減圧することが望ましい。
これにより、反応液が反応液定量用流路内に導入された際、反応液が反応容器まで到達してしまうことを避けることができ、予め反応容器内に塗付してある試薬が反応液中に溶け出し、反応液定量用流路及び反応液導入用流路を介して隣接する反応容器とコンタミネーションをおこすのを防ぐことができる。
また、前記生体試料反応処理は核酸増幅を含む処理であり、前記反応液には、ターゲット核酸、核酸を増幅するための酵素、及びヌクレオチドが所定の濃度で含まれており、前記反応容器には、予めプライマーが塗布されていることとすることができる。
また、リアルタイムＰＣＲ処理を行う場合には、反応装置内に予め蛍光プローブを塗布しておいてもよい。
以下、本発明の実施の形態について図面を参照して説明する。
実施の形態１．
図１（Ａ）は、本発明の実施の形態１によるマイクロリアクターアレイ（生体試料反応用チップ）１０の概略構成を示す上面図、図１（Ｂ）は図１のＣ−Ｃ断面図である。図に示すように、マイクロリアクターアレイ１０は、透明基板（第１の基板）１０１、透明基板（第２の基板）１０２、反応容器１０３、反応液定量用流路１０４、反応液導入用流路１０５、反応液供給口１０６、排気用開口部１０７を備えている。
図１に示すように、マイクロリアクターアレイ１０は、透明基板１０１と透明基板１０２を貼り合わせて構成されている。透明基板１０１には、複数の反応容器１０３、反応液定量用流路１０４、及び反応液導入用流路１０５が形成されている。透明基板１０２には、反応液供給口１０６、排気用開口部１０７が形成されている。透明基板１０１，１０２は例えば樹脂基板とすることができる。
反応容器１０３は、例えば直径５００μｍの円形状で、深さ１００μｍに形成されている。反応液定量用流路１０４及び反応液導入用流路１０５は、反応液の流れる方向に垂直な断面が、幅１００μｍ、深さ１００μｍに形成されている。また、反応液定量用流路１０４は、反応液の流れる方向に沿った方向の長さが３ｍｍに形成されている。反応容器１０３の容積は、反応液定量用流路１０４の容積よりも小さく形成されている。なお、反応容器１０３、反応液定量用流路１０４、及び反応液導入用流路１０５は、気泡の吸着を防止するため内壁面が親液性となるように表面処理を施しておくことが望ましい。また、反応容器１０３、反応液定量用流路１０４、及び反応液導入用流路１０５の内壁面にはタンパク質などの生体分子の非特異吸着を抑制する表面処理が施されていることが望ましい。また、透明基板１０１と透明基板１０２の互いに接触する面が撥液性を有するように表面処理を施しておくことが望ましい。これは、反応容器１０３内にＰＣＲ反応に必要なプライマーや蛍光プローブを予め塗付しておく際に、隣接する反応容器１０３間でのコンタミネーションを防ぐためである。
次に、マイクロリアクターアレイ１０に反応液を充填する方法を説明する。
まず、図２に示すように、マイクロリアクターアレイ１０を、圧力計２３を備えた密閉容器２０に入れ、真空ポンプ２１により６０ｋＰａまで減圧する。これにより、マイクロリアクターアレイ１０の内部（反応容器１０３、反応液定量用流路１０４、及び反応液導入用流路１０５の内部）が６０ｋＰａになる。マイクロリアクターアレイ１０の反応液供給口１０６には、反応液充填用のシリンジポンプ２２を接続し、密閉容器２０内を６０ｋＰａに保ったまま、シリンジポンプ２２を用いて反応液導入用流路１０５内に反応液を供給する。
反応液には、ターゲット核酸、ポリメラーゼ、及びヌクレオチド（ｄＮＴＰ）が反応に適した所定の濃度で含まれている。
ターゲット核酸は、例えば血液、尿、唾液、髄液のような生体サンプルから抽出したＤＮＡ、または抽出したＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡなどを用いることができる。
プライマーは反応液に含まれていてもよいが、本実施例のマイクロリアクターアレイでは、各反応容器１０３内に、予め塗付され乾燥状態で収容されている。それぞれの反応容器１０３には、異なるプライマーが塗付されており、同時に多数のＰＣＲが行えるようになっている。
なお、マイクロリアクターアレイ１０内部の減圧は、図２に示すような密閉容器２０を用いず、図３に示すように、排気用開口部１０７に直接真空ポンプ２１を接続して行っても良い。
次に、マイクロリアクターアレイ１０の内部の圧力を大気圧に戻す。図４（Ａ）に示すように、反応液導入用流路１０５内に反応液を供給した段階では、反応液は反応液導入用流路１０５内に留まり、反応液定量用流路１０４へは流入していかない。これは、反応液定量用流路１０４とそれに接続する反応容器１０３の中の気圧と毛管力が均衡するためである。ここでマイクロリアクターアレイ１０内部の圧力を大気圧に戻すと、図４（Ｂ）に示すように、反応液導入用流路１０５から反応液定量用流路１０４内へ一定量Ｖの反応液が浸入する。液量Ｖは、最終的に反応要器１０３に充填される反応液の液量となる。
ここで、初めにマイクロリアクターアレイ１０内部を減圧した際の設定圧力をＰｃ（ここでは６０ｋＰａ）、反応容器１０３の容積をＶ１、反応液定量用流路１０４の容積をＶ２、大気圧（≒１００ｋＰａ）をＰ０、反応液定量用流路１０４内から反応容器１０３に導入する前記反応液の液量をＶとすると、式（１）の関係が成り立つ。
Ｖ／（Ｖ１＋Ｖ２）＝（Ｐ０−Ｐｃ）／Ｐ０・・・（１）
よって、液量Ｖは、以下の式（２）で求めることができる。
Ｖ＝（Ｖ１＋Ｖ２）×（Ｐ０−Ｐｃ）／Ｐ０・・・（２）
ここでは、Ｐｃ＝６０ｋＰａなので、Ｐ０＝１００ｋＰａとすると、反応容器１０３と反応液定量用流路１０４を足した容積（Ｖ１＋Ｖ２）の４０％に相当する反応液が、各々の反応液定量用流路１０４に流入する。
なお、設定圧力Ｐｃは、大気圧Ｐ０の５０％以上かつ大気圧Ｐ０より小さいことが望ましい。
圧力Ｐｃを大気圧Ｐ０の５０％以上かつ大気圧Ｐ０より小さくすることにより、反応液導入用流路１０５から反応液定量用流路１０４内に導入される液量は、反応容器１０３と反応液定量用流路１０４を足した容積（Ｖ１＋Ｖ２）の５０％以下となる。上述したようにＶ１＜Ｖ２とすれば、反応液定量用流路１０４に流れ込む液量がこの範囲であれば反応液が反応容器１０３まで到達してしまうことはない。もし反応液が反応容器１０３まで流入してしまうと、予め反応容器１０３内に塗付してある試薬が反応液中に溶け出し、反応液定量用流路１０４及び反応液導入用流路１０５を介して隣接する反応容器１０３とコンタミネーションをおこす可能性がある。
次に、図４（Ｃ）に示すように、シリンジ等を用いて、反応液導入用流路１０５に残留する反応液を吸引除去する。次に、反応液供給口１０６と排気用開口部１０７を粘着シート等でシールし、マイクロリアクターアレイ１０を図５に示すような遠心装置３０を用いて回転させる。
図５に示すように、遠心装置３０の回転テーブル３１上にマイクロリアクターアレイ１０を固定し、遠心装置３０を回転させることにより、マイクロリアクターアレイ１０には、反応液定量用流路１０４から反応容器１０３に向かう方向に遠心力がかかる。
マイクロリアクターアレイ１０に遠心力がかかることにより、反応液定量用流路１０４内の反応液が反応容器１０３内に移動する。反応容器１０３内の空気は反応液よりも比重が軽いため反応液定量用流路１０４を通って反応液導入用流路１０５内へ押し出され、反応液と入れ替わることにより、反応容器１０３が反応液で満たされる。
以上のような手順でマイクロリアクターアレイ１０に反応液を供給したら、次に、ＰＣＲ処理（生体試料反応処理）を行う。ＰＣＲ処理を行う工程では、透明基板１０２を第２の位置に固定し、マイクロリアクターアレイ１０をサーマルサイクラーに設置してＰＣＲ処理を行う。一般的には、まず、９４℃で２本鎖ＤＮＡを解離させる工程を実行し、次に、プライマーを約５５℃でアニーリングする工程を実行し、次に耐熱性のＤＮＡポリメラーゼを使用して約７２℃で相補鎖の複製を行う工程を含むサイクルを繰り返す。
また、マイクロリアクターアレイ１０を用いてリアルタイムＰＣＲを行う場合には、あらかじめ反応容器１０３の内壁にはＰＣＲ反応に用いるプライマーと蛍光プローブを塗布しておき、１サイクル毎にＣＣＤセンサ等を用いて蛍光強度を測定する。特定の蛍光強度に到達したサイクル数から、初期のターゲット核酸の量を算出測定する。なお、リアルタイムＰＣＲの実施方法は上記のものに限られない。例えば、ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎのような二本鎖結合蛍光色素を用いる場合には、蛍光プローブは不要である。
以上のように、実施の形態１によれば、遠心力を利用して、反応液導入用流路１０４を通して反応容器１０３内に反応液を供給することにより、ピペットで定量することが難しい非常に少量の反応液での反応処理が可能となる。また、一度に多数の反応容器１０３内で処理を行うことができるため、多種類の検査等を効率よく行うことができる。
また、反応液を一旦反応液定量用流路１０４に溜めてから反応容器１０３に導入するようにしたので、反応容器１０３間でのコンタミネーションを防ぐことができる。
なお、実施の形態１では、マイクロリアクターアレイ１０をリアルタイムＰＣＲ反応用の反応装置として用いたが、遺伝子や生体試料を用いた様々な反応に利用することができる。例えば、特定のタンパク質を特異的に捕捉（例えば、吸着、結合等）する抗原、抗体、レセプター、酵素等のタンパク質、ペプチド（オリゴペプチド）等を反応容器１０３内に塗布しておき、反応液からターゲットのタンパク質を検出する処理等に用いることもできる。
図１（Ａ）は、本発明の実施の形態１によるマイクロリアクターアレイの概略構成を示す上面図、図１（Ｂ）は、図１（Ａ）のＣ−Ｃ断面図である。 マイクロリアクターアレイの内部を減圧するための装置の例を示す模式図である。 マイクロリアクターアレイの内部を減圧するための他の方法を示す模式図である。 マイクロリアクターアレイに反応液を充填する方法を説明する模式図である。 マイクロリアクターアレイに遠心力をかけるための遠心装置の概略構成を示す図である。
符号の説明
１０ マイクロリアクターアレイ、１０１，１０２ 透明基板、１０３ 反応容器、１０４ 反応液定量用流路、１０５ 反応液導入用流路、１０６ 反応液供給口、１０７ 排気用開口部、２０ 密閉容器、２１ 真空ポンプ、２２ シリンジポンプ、２３ 圧力計、３０ 遠心装置、３１ 回転テーブル

Claims (4)

  1. 複数の反応容器と、
    一端に反応液供給口を備え、他方の端部に排気用開口部を供えた反応液導入用流路と、
    一端が１つの前記反応容器に接続され、他方の端部が前記反応液導入用流路に接続された反応液定量用流路と、を備え、
    各々の前記反応容器の内部には、反応に必要な試薬が塗布されていることを特徴とする、生体試料反応用チップを用いた生体試料反応方法であって、
    前記反応容器、前記反応液定量用流路、及び前記反応液導入用流路の内部を所定の圧力まで減圧する工程と、
    前記反応液供給口を介して前記反応液導入用流路内に反応液を充填する工程と、
    前記反応容器、前記反応液定量用流路、及び前記反応液導入用流路の内部をチップ外部の圧力に戻し、前記反応液を前記反応液定量用流路に導入する工程と、
    前記反応液導入用流路内の前記反応液を除去する工程と、
    遠心力を用いて、前記反応液定量用流路内の前記反応液を前記反応容器に導入する工程と、
    生体試料反応処理を実行する工程と、を有することを特徴とする生体試料反応方法。
  2. 前記所定の圧力まで減圧する工程では、チップ外部の圧力の５０％以上かつ前記チップ外部の圧力より小さい圧力まで減圧することを特徴とする請求項１に記載の生体試料反応方法。
  3. 前記生体試料反応処理は核酸増幅を含む処理であり、前記反応液には、ターゲット核酸、核酸を増幅するための酵素、及びヌクレオチドが所定の濃度で含まれており、
    前記反応容器には、予めプライマーが塗布されていることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の生体試料反応方法。
  4. 前記反応容器の容積が、前記反応液定量用流路の容積よりも小さいことを特徴とする請求項１から請求項３のいずれかに記載の生体試料反応方法。
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