JP4706883B2

JP4706883B2 - 生体試料定量方法

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Publication number: JP4706883B2
Application number: JP2009063967A
Authority: JP
Inventors: 富美男 ▲高▼城
Original assignee: Seiko Epson Corp
Current assignee: Seiko Epson Corp
Priority date: 2009-03-17
Filing date: 2009-03-17
Publication date: 2011-06-22
Anticipated expiration: 2029-03-17
Also published as: JP2010216984A; US20100240048A1

Description

本発明は、核酸増幅などを行うための生体試料反応容器、生体試料充填装置、生体試料定量装置、及び生体試料反応方法に関するものである。

ガラス基板等に微細流路が設けられたマイクロ流体チップを使用して、化学分析や化学合成、あるいはバイオ関連の分析などを行う方法が注目されている。マイクロ流体チップは、マイクロTotal Analytical System (マイクロＴＡＳ)や、Lab-on-a-chip等とも呼ばれ、従来の装置に比較して試料や試薬の必要量が少ない、反応時間が短い、廃棄物が少ないなどのメリットがあり、医療診断、環境や食品のオンサイト分析、医薬品や化学品などの生産等、広い分野での利用が期待されている。試薬の量が少なくてよいことから、検査のコストを下げることが可能となり、また、試料および試薬の量が少ないことにより、反応時間も大幅に短縮されて検査の効率化が図れる。特に、医療診断に使用する場合には、試料となる血液など検体を少なくすることができるため、患者の負担を軽減できるというメリットもある。

試料として用いるＤＮＡやＲＮＡなどの遺伝子を増幅する方法として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法がよく知られている。ＰＣＲ法は、増幅の対象となるターゲットＤＮＡと試薬を混合したものをチューブに入れ、サーマルサイクラーという温度制御装置で、例えば６２℃、７２℃、９５℃の３段階の温度変化を数分の周期で繰り返し反応させるもので、ポリメラーゼという酵素の作用により温度サイクル１回あたり、約２倍にターゲットＤＮＡだけを増幅することができる。

近年、Ｔａｑｍａｎ(登録商標)プローブやＳＹＢＲＧｒｅｅｎ（登録商標）などの特殊な蛍光プローブを用いたリアルタイムＰＣＲという方法が実用化され、増幅反応を行いながらＤＮＡの定量ができるようになった。リアルタイムＰＣＲは、測定の感度、信頼性が高いことから、研究用、臨床検査用に広く使われている。

しかし、リアルタイムＰＣＲ法によりＤＮＡの定量を行う場合、一定の蛍光強度に到達した際のサイクル数と初期の標的核酸の量の関係を示す検量線をつくる必要がある。さらに、検体中に増幅反応を阻害する物質が存在する場合、測定結果が検量線からずれるため、信頼性が低くなる場合がある。

また、従来の装置では、ＰＣＲに必要な反応液の量は数十μｌが標準的であり、また、１つの反応系では基本的に１つの遺伝子の測定しかできないという問題があった。蛍光プローブを複数入れてその色で区別することにより４種類程度の遺伝子を同時に測定する方法もあるが、それ以上の遺伝子を同時に測定するためには反応系の数を増やすしかなかった。検体から抽出されるＤＮＡの量は一般に少量であり、また試薬も高価なため同時に多数の反応系を測定することは困難であった。

反応容器を小型化する方法も提案されているが、検体液の分注精度の低下や、１つの反応容器中に含まれる標的核酸の量が少なくなるといった理由により、定量ばらつきが大きくなるという問題があった。

また、標的核酸の量を測定する他の手段として限界希釈法が知られており、例えば特許文献１にも開示されている。限界希釈法では、検体液を段階的に希釈してＰＣＲを行い、標的核酸の増幅が確認できなくなる濃度を調べることにより、初期の標的核酸濃度を推定する。また、１つの反応容器内に存在する標的核酸の平均値が１以下になるように検体液を希釈して複数の反応容器でＰＣＲを行い、標的核酸が検出できた反応容器の割合を求め、ポアソン分布の式から濃度を推定する方法もある。

特開２００１−２６９１９６号公報

しかし、限界希釈法では、濃度が未知の検体については何段階にも検体液を希釈して多数の増幅反応を行う必要があるので、コストも時間もかかってしまうという問題があった。

そこで、本発明の目的は、微量な反応液で、限界希釈法による核酸の定量を効率よく行うことが可能な、生体試料反応容器、生体試料充填装置、生体試料定量装置、及び生体試料反応方法を得ることである。

本発明に係る生体試料反応容器は、液体の流れる方向に垂直な断面の面積が、下流に向かうに従って段階的に大きくなる流路と、流路内に反応液を導入するための第１の開口部と、流路内に反応液と混和しない液体を導入するための第２の開口部と、を備えたものである。
これにより、流路内に、反応液と混和しない液体によって分離された反応液の液塊を複数形成できる。また、流路の断面の面積が段階的に大きくなるため、体積の異なる反応液の液塊を形成することができるので、限界希釈法による定量を効率よく行うことができる。さらに、比較的体積が大きい液塊を断面の大きい下流の流路に送液することで、形成される液塊の流路断面の直径に対する送液方向の長さが極端に長くなることを防止でき、反応液中のターゲット核酸の分布が均一になり、反応ばらつきを低減することができる。また、ピペット等による反応液の分注作業が必要ないため、ピペット等で定量することが難しい非常に少量の反応液での反応処理が可能となる。

本発明に係る生体試料充填装置は、液体の流れる方向に垂直な断面の面積が、下流に向かうに従って段階的に大きくなる流路と、流路内に反応液を導入するための第１の開口部と、流路内に反応液と混和しない液体を導入するための第２の開口部と、を備えた生体試料反応容器と、生体試料反応容器に、反応液を導入するための第１のポンプと、生体試料反応容器に、反応液と混和しない液体を導入するための第２のポンプと、を備えたものである。
これにより、第１のポンプ及び第２のポンプの少なくとも一方の送液速度を制御して、流路内に、反応液と混和しない液体によって分離された反応液の液塊を複数形成できる。また、流路の断面の面積が段階的に大きくなるため、体積の異なる反応液の液塊を形成することができるので、限界希釈法による定量を効率よく行うことができる。さらに、比較的体積が大きい液塊を断面の大きい下流の流路に送液することで、形成される液塊の流路断面の直径に対する送液方向の長さが極端に長くなることを防止でき、反応液中のターゲット核酸の分布が均一になり、反応ばらつきを低減することができる。また、ピペット等による反応液の分注作業が必要ないため、ピペット等で定量することが難しい非常に少量の反応液での反応処理が可能となる。

さらに、本発明に係る生体試料充填装置は、第１のポンプ及び第２のポンプの少なくとも一方の送液速度を制御するポンプ制御部を備えることが望ましい。
これにより、流路内に、任意の体積の液塊を正確に形成することができる。

本発明に係る生体試料定量装置は、液体の流れる方向に垂直な断面の面積が、下流に向かうに従って段階的に大きくなる流路と、流路内に反応液を導入するための第１の開口部と、流路内に反応液と混和しない液体を導入するための第２の開口部と、を備えた生体試料反応容器と、生体試料反応容器に、反応液を導入するための第１のポンプと、生体試料反応容器に、反応液と混和しない液体を導入するための第２のポンプと、生体試料反応を行うための生体試料反応部と、生体試料反応処理の結果を測定する検出部と、を備えたものである。
これにより、第１のポンプ及び第２のポンプの少なくとも一方の送液速度を制御して、流路内に、反応液と混和しない液体によって分離された反応液の液塊を複数形成できる。また、流路の断面の面積が段階的に大きくなるため、体積の異なる反応液の液塊を形成することができるので、反応容器ごと生体試料反応を行った後に結果を測定することにより、限界希釈法による定量を効率よく行うことができる。さらに、比較的体積が大きい液塊を断面の大きい下流の流路に送液することで、形成される液塊の流路断面の直径に対する送液方向の長さが極端に長くなることを防止でき、反応液中のターゲット核酸の分布が均一になり、反応ばらつきを低減することができる。また、ピペット等による反応液の分注作業が必要ないため、ピペット等で定量することが難しい非常に少量の反応液での反応処理が可能となる。

本発明に係る生体試料定量方法は、液体の流れる方向に垂直な断面の面積が、下流に向かうに従って段階的に大きくなる流路を有する生体試料反応容器に、ターゲット核酸と核酸増幅反応用の試薬が含まれる反応液と前記反応液と混和しない液体を導入することにより、前記反応液と混和しない液体によって分離された前記反応液の液塊を複数形成し、前記反応液及び前記反応液と混和しない液体の少なくとも一方の導入速度を制御して、前記流路内に形成される前記液塊の大きさを段階的に小さくしていくことにより、体積の異なる複数の液塊群を形成する生体試料充填工程と、核酸増幅反応を行う反応工程と、核酸増幅反応処理の結果を測定する検出工程と、体積の異なる複数の前記液塊群のうち、前記反応の検出される液塊と検出されない液塊の両方が含まれる液塊群における前記反応の検出されない液塊の割合に基づいて、前記反応液中のターゲット核酸の濃度を算出する定量工程と、を有するものである。
これにより、反応容器内で生体試料反応を行った後に結果を測定することにより、限界希釈法による定量を効率よく行うことができる。さらに、比較的体積が大きい液塊を断面の大きい下流の流路に送液することで、形成される液塊の流路断面の直径に対する送液方向の長さが極端に長くなることを防止でき、反応液中のターゲット核酸の分布が均一になり、反応ばらつきを低減することができる。また、ピペット等による反応液の分注作業が必要ないため、ピペット等で定量することが難しい非常に少量の反応液での反応処理が可能となる。

本発明の実施の形態による、生体試料反応用チップを用いた生体試料定量装置の概略構成を示す模式図である。図２（Ａ）は、本発明の実施の形態による生体試料反応用チップの概略構成を示す斜視図、図２（Ｂ）は、図２（Ａ）のＢ−Ｂ断面図である。本発明の実施の形態による、反応液及びミネラルオイルを生体試料反応用チップに充填する様子を示す図である。本発明の実施の形態による、反応液及びミネラルオイルを生体試料反応用チップに充填する様子を示す図である。本発明による生体試料反応用チップの他の例を示す図である。

以下、本発明の実施の形態について図面を参照して説明する。
図１は、本発明の実施の形態による、生体試料反応用チップ（生体試料反応容器）１０を用いた生体試料定量装置２０の概略構成を示す模式図である。生体試料定量装置２０は、シリンジポンプ（第１のポンプ、第２のポンプ）２０１，２０２、温度調節用のヒートブロック（生体試料反応部）２０３、光学検出機（検出部）２０４、反応液収容部２０５、バルブ２０６，２０７、ポンプ制御部２０８を備えている。

シリンジポンプ２０１，２０２は、ポンプ制御部２０８に接続されており、ポンプ毎に任意の送液速度で駆動することができる。
ヒートブロック２０３は、ＰＣＲ処理（生体試料反応処理）を行う際、生体試料反応用チップ１０を所定の温度に保つための装置であり、ＰＣＲ処理の温度サイクルに合わせて設定温度と時間を制御することが可能な制御装置（図示せず）に接続されている。

光学検出機２０４は、ＣＣＤカメラ等を用いることができる。
反応液収容部２０５は、反応液等を充填した容器３０１，３０２を収納できるように構成されており、各々の容器３０１，３０２は、シリコンチューブ等を介してバルブ２０６，２０７、シリンジポンプ２０１，２０２に接続されている。

図２（Ａ）は、本発明の実施例による生体試料反応用チップ１０の概略構成を示す斜視図、図２（Ｂ）は、図２（Ａ）のＢ−Ｂ断面図である。図に示すように、生体試料反応用チップ１０は、透明基板１０１，１０２、第１の流路１０３、第２の流路１０４、第１の開口部１０５、第２の開口部１０６、第３の開口部１０７を備えている。

図２に示すように、生体試料反応用チップ１０は、２枚の透明基板１０１，１０２を貼り合わせて構成されている。透明基板１０１，１０２それぞれに、流路１０３の一部となる溝が形成されており、透明基板１０１，１０２を貼り合わせることによって、立体的な流路１０３が形成される。また、透明基板１０１，１０２それぞれに、流路１０４の一部となる溝が形成されており、透明基板１０１，１０２を貼り合わせることによって、立体的な流路１０４が形成される。第２の流路１０４は、第１の流路１０３に直交している。なお、透明基板１０１，１０２は例えばポリカーボネートなどの自家蛍光の少ない透明樹脂を用いて、射出成型により形成することができる。なお、流路１０３，１０４は、透明基板１０１または透明基板１０２のどちらか一方の基板にのみ形成された溝から構成されていてもよい。

流路１０３は、送液方向（図中矢印Ｆの方向）に垂直な断面の形状が円形に形成されており、断面積が異なる３つの部分１０３ａ，１０３ｂ，１０３ｃを有する。流路１０３ａ，１０３ｂ，１０３ｃのそれぞれの断面の直径は、ここでは１００μｍ、３００μｍ、９００μｍであり、下流に向かうに従って断面積が大きく形成されている。なお、断面の形状は、楕円形など円形以外の形状であってもよい。流路１０３は、直線部分と折り返し部分を有しており、この折り返し部分で断面積が変化するが、各々の直線部分では変化しない。

第１の開口部１０５は、第２の流路１０４の上流端に連なっており、シリコンチューブ等を介してバルブ２０６及びシリンジポンプ２０１に接続されている。第２の開口部１０６は、第１の流路１０３の上流端に連なっており、シリコンチューブ等を介してバルブ２０７及びシリンジポンプ２０２に接続されている。第３の開口部１０７は、流路１０３の下流端に連なっており、流路１０３を液体が流れる際の空気の逃げ道となっている。

次に、生体試料反応用チップ１０への反応液の充填方法について説明する。
反応液には、ターゲット核酸とＰＣＲ反応用の試薬が含まれる。試薬には、プライマー、ポリメラーゼ、及びヌクレオチド（ｄＮＴＰ）、蛍光色素のＳＹＢＲＧｒｅｅｎ（登録商標）が後述する生体試料反応に適した所定の濃度で含まれている。
ターゲット核酸は、例えば血液、尿、唾液、髄液のような生体サンプルから抽出したＤＮＡ、または抽出したＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡなどを用いることができる。

まず、図１に示すように、生体試料定量装置２０の反応液収容部２０５に、反応液を充填した容器３０１と、ミネラルオイル（反応液と混和しない液体）を充填した容器３０２をセットする。次に、バルブ２０６を操作してシリンジポンプ２０１と容器３０１が繋がる状態にし、バルブ２０７を操作してシリンジポンプ２０２と容器３０２が繋がる状態にする。次に、シリンジポンプ２０１，２０２を駆動して、容器３０１内から反応液をシリンジポンプ２０１内に吸引すると共に、容器３０２内からとミネラルオイルをシリンジポンプ２０２内に吸引する。

次に、バルブ２０６を操作してシリンジポンプ２０１と第１の開口部１０５が繋がるようにし、バルブ２０７を操作してシリンジポンプ２０２と第２の開口部１０６が繋がるようにする。そして、シリンジポンプ２０１，２０２を駆動して、反応液を第１の開口部１０５から第１の流路１０３内へ供給すると共に、ミネラルオイルを第２の開口部１０６から第１の流路１０３内へ供給する。

図３は、反応液及びミネラルオイルを生体試料反応用チップ１０に充填する様子を示す図である。ポンプ制御部２０８によってシリンジポンプ２０１，２０２の送液速度を制御することにより、図３に示すように、第１の流路１０３内に、ミネラルオイルで分離された反応液の液塊４００を形成することができる。液塊４００は、第１の流路１０３の内壁面の全周に接するように形成される。最初に、断面積が最も小さい流路１０３ａ内に形成された液塊４００は送液方向に細長い形状であるが、第１の流路１０３の下流へ行くに従って流路１０３の断面積が段階的に大きくなるため、次第に液塊４００の断面の直径に対する送液方向の長さの比が小さくなっていく。

液塊４００の送液方向の長さと液塊４００同士の間隔は、送液速度によって制御することができる。反応液の送液速度をｘ、ミネラルオイルの送液速度をｙとして、反応液とミネラルオイルを同時に送液すると、送液速度比ｘ／ｙに対応して、液塊４００の送液方向の長さと液塊４００同士の間隔が決定される。反応液とミネラルオイルの送液速度比を変化させることにより、液塊４００の送液方向の長さと液塊４００同士の間隔を制御することができる。

また、反応液とミネラルオイルのどちらか一方を一定速度で送液し、他方の送液の開始と休止を繰り返すようにしてもよい。他方の液体の送液の開始、休止のタイミングを変化させることにより、液塊４００の送液方向の長さと液塊４００同士の間隔を制御することができる。例えば、ミネラルオイルを一定速度で送液し、反応液の送液の開始、休止のタイミングを変化させる場合には、反応液の送液タイミングによって液塊４００同士の間隔を制御することができる。また、反応液の送液速度によって液塊４００の送液方向の長さを制御することができる。液塊４００の送液方向の長さは、反応液の送液速度が速いほど長くなる。

本実施形態では、図４に示すように、第１の流路１０３の各領域１０３ａ，１０３ｂ，１０３ｃそれぞれの領域に、送液方向に垂直な断面の直径に対する送液方向の長さの比がほぼ１：１である液塊群４００ａ，４００ｂ，４００ｃを形成する。シリンジポンプ２０１，２０２の送液速度を制御して、第１の流路１０３内で形成される液塊４００の大きさをしだいに小さくしていくことにより、図４に示すように体積の異なる液塊群４００ａ，４００ｂ，４００ｃを形成することができる。液塊群４００ａ，４００ｂ，４００ｃそれぞれの体積は等しく、ここでは、液塊群４００ｃに対し、液塊群４００ｂに含まれる液塊の体積は１／１０、液塊４００ａに含まれる液塊の体積は１／１００に形成されている。

このように、第１の流路１０３内に体積が３種類の反応液の液塊４００を多数形成することができるので、３種類の体積の複数の反応容器に反応液を充填するのと同等の作業を、シリンジポンプ２０１，２０２の操作のみで行うことができる。

なお、液塊４００の送液方向に垂直な断面の直径と送液方向の長さの比は１：１であることが望ましい。断面の直径に対して極端に送液方向の長さが長くなると、反応液中のターゲット核酸の分布が不均一になりやすく、反応にばらつきが生じやすくなる。

以上の手順で生体試料反応用チップ１０に反応液を供給したら、次にＰＣＲ処理（生体試料反応処理）を行う。第１の開口部１０５、第２の開口部１０６、及び第３の開口部１０７をシールし、生体試料定量装置２０内でＰＣＲ処理を行う。生体試料反応用チップ１０はヒートブロック２０３の上に設置されており、所定の温度を数分の周期で繰り返して反応させる。一般的には、まず、９５℃で２本鎖ＤＮＡを解離させる工程を実行し、次に、プライマーを約６２℃でアニーリングする工程を実行し、次に耐熱性のＤＮＡポリメラーゼを使用して約７２℃で相補鎖の複製を行う工程を含むサイクルを５０回繰り返す。

なお、各々の液塊４００の間に挟まれたミネラルオイルは、反応液の蒸発と液塊４００間のコンタミネーションを防止する効果がある。

ＰＣＲ処理の後、光学検出機２０４を用いて、第１の流路１０３内の個々の液塊４００の蛍光強度を測定する。一定値以上の蛍光強度が観察された液塊４００ではターゲット核酸の増幅処理が行われたことを示しており、すなわち反応液中に１つ以上のターゲット核酸が存在したことを示している。体積の異なる液塊群４００ａ，４００ｂ，４００ｃの中で、増幅の観察される液塊と増幅の観察されない液塊の両方が含まれる液塊群を選択し、その中で増幅の観察されない液塊４００の数を計数することにより、ターゲット核酸が存在しなかった液塊４００の割合を求める。

次に、上記の結果に基づいて反応液中のターゲット核酸の濃度を算出する。濃度の算出にはポアソン分布を利用する。
ポアソン分布によれば、確率ｐで発生する事象がｎ回の試行のうちｘ回だけ起こる確率は、
ｆ（ｘ）＝ｅ^-μμ^x／ｘ！・・・（１）
となる。μは平均値であり、μ＝ｎｐである。１つの反応容器内のターゲット核酸の数の平均値をμとすると、反応容器内のターゲット核酸がゼロになる確率は、式（１）から、
ｆ（０）＝ｅ^-μ ・・・（２）
となる。

ｆ（０）は上記の計数結果から求められた、ターゲット核酸が存在しなかった液塊４００の割合に当る。よって、式（２）よりμが求められ、シリンジポンプ２０１，２０２の駆動条件から各々の液塊の体積を求められるので、反応液中のターゲット核酸の濃度が算出できる。

以上のように、本実施形態によれば、シリンジポンプ２０１，２０２の送液速度を制御して、生体試料反応用チップ１０の第１の流路１０３内に体積の異なる反応液の液塊群４００ａ，４００ｂ，４００ｃを形成し、生体試料反応用チップ１０ごとＰＣＲ処理を行うため、限界希釈法による核酸の定量を効率よく行うことができる。本実施形態では、液塊群４００ｂ，４００ａの体積が、それぞれ液塊群４００ｃの体積の１／１０、１／１００に設定されているため、反応液を１０倍、１００倍に希釈してＰＣＲ反応を行った場合に相当する測定ができる。このように、反応液の希釈の手間を省くことが出来る。また、液塊群の体積の組み合わせを任意に変更することにより、任意の希釈倍率に相当する反応系を得ることができる。また、液塊の数を増やすことにより統計的な信頼度を上げることができる。さらに、比較的体積の大きい液塊群４００ｂおよび４００ｃを第１の流路１０３の下流である１０３ｂおよび１０３ｃに形成することによって、形成される各液塊における流路断面の直径に対する送液方向の長さが極端に長くなることを防止できる。従って、反応液中のターゲット核酸の分布が均一になり、反応ばらつきを低減することができる。

また、ピペットによる反応液の分注作業が必要ないため、ピペットで定量することが難しい非常に少量の反応液での反応処理が可能となる。

また、第１の流路１０３の形状は、図１に示すものに限られず、図５に示すように断面積が異なる複数の領域を有するものであればよい。なお、断面積は、下流に行くに従って段階的に大きくなっていくことが望ましい。上流の方の断面積を大きくした場合、断面積の小さい領域に合わせた小さな液塊が、断面積の大きな流路内を流れていくことになり、流路内で、液塊の追い越しが起こる可能性がある。

１０生体試料反応用チップ、１０１，１０２透明基板、１０３第１の流路、１０４第２の流路、１０５第１の開口部、１０６第２の開口部、１０７第３の開口部、２０生体試料定量装置、２０１，２０２シリンジポンプ、２０３ヒートブロック、２０４光学検出機、２０５反応液収容部、２０６，２０７バルブ、２０８ポンプ制御部、３０１，３０２容器、４００液塊

Claims

液体の流れる方向に垂直な断面の面積が、下流に向かうに従って段階的に大きくなる流路を有する生体試料反応容器に、ターゲット核酸と核酸増幅反応用の試薬が含まれる反応液と前記反応液と混和しない液体を導入することにより、前記反応液と混和しない液体によって分離された前記反応液の液塊を複数形成し、前記反応液及び前記反応液と混和しない液体の少なくとも一方の導入速度を制御して、前記流路内に形成される前記液塊の大きさを段階的に小さくしていくことにより、体積の異なる複数の液塊群を形成する生体試料充填工程と、
核酸増幅反応を行う反応工程と、
核酸増幅反応処理の結果を測定する検出工程と、
体積の異なる複数の前記液塊群のうち、前記反応の検出される液塊と検出されない液塊の両方が含まれる液塊群における前記反応の検出されない液塊の割合に基づいて、前記反応液中のターゲット核酸の濃度を算出する定量工程と、を有する生体試料定量方法。