JP3699721B1

JP3699721B1 - 検体試料の遠心分注方法及び遠心分注装置

Info

Publication number: JP3699721B1
Application number: JP2004314645A
Authority: JP
Inventors: 正昭小林; 央市川; 栄一民谷
Original assignee: 株式会社石川製作所; 栄一民谷
Priority date: 2004-10-28
Filing date: 2004-10-28
Publication date: 2005-09-28
Anticipated expiration: 2024-10-28
Also published as: US20060091085A1; JP2006126010A

Abstract

【課題】血液やＰＣＲ反応溶液などの液状の検体試料を注入する箇所が一箇所でありながらこれを複数のチャンバに短時間で正確に流し込むことができるようにする。
【解決手段】検体試料用マイクロチップ１Ａの中心部に液状の検体試料を注入する溶液滴下部Ｃを一つ有し、この一つの溶液滴下部Ｃ外周に検出用チャンバＴ１，Ｔ２が配置されている。検体試料用マイクロチップ１Ａが搭載される回転盤１３Ａ，１３Ｂを自転させると共に公転させることにより、溶液滴下部Ｃに注入した液状の検体試料を検出用チャンバＴ１，Ｔ２に分離注入（分注）させる。
【選択図】図１

Description

本発明は、化学反応・生化学反応や血液検査などを微量の反応液や検体試料により効率良く行う検体試料の遠心分注方法及び遠心分注装置に関する。

例えば、極微量の試料から標的とする遺伝子（ＤＮＡ）などを検出・診断する場合などに使用される検体試料用マイクロチップは、内部に検査目的に応じた特定形状の微少断面積の流路（チャンネルパターン）を有し、例えば、フロー形状の入力ポート部より被検体をチャンネルパターン内に送液し、遺伝子増幅反応などによって所定の医学的評価を行い、あるいは、チャンネルパターンに検体試料を充填して電圧を印可したときに生じる検体試料の反応によって所定の評価を行う際に使用される。検体試料用マイクロチップは、ポリマー基板に微細な金型を用いてのホットエンボス加工や射出成形等によってチャンネルパターンを形成し、チャンネルパターンを形成したポリマー基板に対し、シート状または板状のポリマー被覆基板を貼着することによってチャンネルパターンを内部に封入する構造のものや、チャンネルパターンを形成したポリマーシートを一対のポリマー被覆基板で挟み込む構造のものなどがある。
特開平８−６２２２５号公報特開２００２−３４０９１１号公報特表２００３−１８５６２７号公報特開２００３−１６６９７５号公報

特許文献１には、検体試料を受け入れる試料チャンバや廃物チャンバなどを有し、所定の流路を形成した検体試料用マイクロチップ（試験ユニット）が開示されると共に、試料チャンバから廃物チャンバへの方向に向けて検体試料に遠心力が加わるように軸線を中心に回転させて検定を行う方法と、遠心力を加えるための装置が開示されている（その図１や図２を参照）。特許文献２には、複数枚の可撓性シートを積層させた積層体の内部に検体を入れるなどの第１から第３の空隙部を有する検体試料用マイクロチップが開示されると共に、この検体試料用マイクロチップの検体に遠心力を加える回転駆動手段と、遠心分離した検体を移動させる移動手段などが開示されている。特許文献３には、分離用チャンネルと、導入用チャンネルとを有する電気泳動用検体試料用マイクロチップと、先端に複数本のピペッタチップ７０が装着された多連ピペッタ機構と、これをＸＹ方向などに稼動させることが可能な電気泳動装置が開示されている（その図２や図４を参照）。特許文献４は、長方形状のチップにおいて、一側面側から対向する他側面側に向かって複数の流路となるチャンネルパターンが形成されている。

しかしながら、上記検体試料用マイクロチップは所定のチャンネルパターンが複数の流路として形成されているが、上記のような回転装置では、検体試料用マイクロチップを遠心分注装置の搭載位置に正確に配置させる必要があり、その位置が若干ずれると所定の位置（廃棄チャンバなど）までに検体試料を流し込むことができず、偏りやときには逆流が生じる問題を有していた。特に、チャンネルパターンの数が増加することにより流路の幅が狭くなると所定の位置（廃棄チャンバなど）までに検体試料を流し込むことは一層困難になる。特許文献１の検体試料用マイクロチップ（試験ユニット）は、複数のチャンネルパターンに一つ一つＰＣＲ反応溶液などの検体試料を注入させる必要があると共に、試料チャンバや廃棄チャンバの大きさや流路などの設定を細かく設定する必要もあり、更に、これを回転装置で回転させても所定の位置（廃棄チャンバなど）までに検体試料を流し込むことができない場合が生じている。すなわち、放射状の複数のチャンネルパターンがその中心から僅かにずれて形成されている場合、上記のように検体試料用マイクロチップを遠心分注装置の搭載位置に正確に配置されていない場合や、回転駆動手段であるモータの軸のブレなどにより検体試料を均一に流し込むことができない場合が生じている。また、従来の検体試料用マイクロチップを使用して検定するためには、大型で高価なスポッタ装置（上記多連ピペッタ機構）を必要とするとともに、これをＸＹ方向などに精密に移動させる機構が必要であり、場所と設備が大掛かりとなり、高価である問題を有していた。

そこで本発明の目的は、血液やＰＣＲ反応溶液などの液状の検体試料を注入する箇所が一箇所でありながらこれを複数のチャンバに短時間で正確に流し込むことができ、従来の大型で高価なスポッタ装置を必要としなくなる検体試料の遠心分注方法及び遠心分注装置を提供することにある。

本発明の請求項１記載の検体試料の遠心分注方法は、液状の検体試料の流路となるチャンネルパターンが形成された検体試料用マイクロチップであり、このマイクロチップの中心部に液状の検体試料を注入する溶液滴下部を一つ有し、この一つの溶液滴下部を中心に外方に向かって伸びるチャンネルパターンが形成され、各チャンネルパターンに検体試料を検査する部分となる検出用チャンバが形成されている検体試料用マイクロチップに液状の検体試料を注入して検査するために使用される検体試料の遠心分注方法であって、検体試料用マイクロチップが搭載される回転盤を自転させると共に公転させることにより、検体試料用マイクロチップの溶液滴下部に注入した液状の検体試料を検出用チャンバに遠心分注させることを特徴とする。

本発明によれば、回転盤に搭載される検体試料用マイクロチップの溶液滴下部に液状の検体試料を充填して、回転盤に公転と自転の回転を与える遊星回転により、検体試料用マイクロチップの液状の検体試料は、自転に対する遠心力と公転に対する遠心力の両方の力を受けて、例えば、放射状の複数のチャンネルパターンがその中心から僅かにずれて形成されている場合、上記のように検体試料用マイクロチップを遠心分注装置の搭載位置に正確に配置されていない場合や、回転駆動手段であるモータの軸のブレなどがあったとしても、各チャンネルパターンの各検出用チャンバに均一に液状の検体試料が分離注入されることとなる。

本発明の請求項２記載の検体試料の遠心分注装置は、液状の検体試料の流路となるチャンネルパターンが形成された検体試料用マイクロチップであり、このマイクロチップの中心部に液状の検体試料を注入する溶液滴下部を一つ有し、この一つの溶液滴下部を中心に外方に向かって伸びるチャンネルパターンが形成され、各チャンネルパターンに検体試料を検査する部分となる検出用チャンバが形成されている検体試料用マイクロチップを使用して液状の検体試料を検査する検体試料の遠心分注装置であって、検体試料用マイクロチップを搭載する回転盤をある中心を軸として公転運動させる手段と、回転盤をその中心を軸として自転運動させる手段とを備えることを特徴とする。ここで、公転運動させる駆動手段と自転運動させる駆動手段は同じ駆動手段であっても別々の駆動手段であってもよい。

本発明によれば、回転盤に搭載される検体試料用マイクロチップの溶液滴下部に液状の検体試料を充填して、検体試料用マイクロチップを搭載する回転盤をある中心を軸として公転運動させる手段により公転運動させるとともに、自転運動させる手段により回転盤をその中心を軸として自転運動させると、この遊星回転により、円周上の各検出用チャンバに均一に液状の検体試料が分離注入されることとなる。

本発明の請求項３記載の検体試料の遠心分注装置は、前記公転運動させる手段は、駆動手段により回転するアーム部と、このアーム部に取り付けられ検体試料用マイクロチップを搭載する回転盤とからなり、前記自転運動させる手段は、回転盤の外周に形成された一方のギヤと、この一方のギヤと歯合する他方のギヤであって前記アームの中心位置に吊り下げられるように配されるか、又は、前記公転運動する外周側に配されるとともに、上記アーム部の回転を利用して、上記回転盤に搭載される検体試料用マイクロチップをアームの回転により公転運動すると共に、この公転運動により回転盤の一方のギヤと他方のギヤとが歯合することにより回転盤の中心を軸として自転運動することを特徴とする。

本発明によれば、上記の駆動により、一つの駆動手段により中央のギヤを中心とする公転運動と回転盤の中心を軸とする自転運動の両方の回転をさせることができる。また、他方のギヤであって前記アーム部の中心位置に吊り下げられるように配されることにより、中央のギヤの位置が駆動手段の軸と一致することにより遊星回転の安定化が図られるとともに、小型化が図られる利点を有する。

本発明の検体試料の遠心分注方法と遠心分注装置により、液状の検体試料を注入した検体試料用マイクロチップが搭載された回転盤を自転させると共に公転させることで、外周上の検出用チャンバに偏りや逆流を生じさせることなく、均一に液状の検体試料を分離注入させることが短時間で可能になる。また、放射状の複数のチャンネルパターンがその中心から僅かにずれて形成されている場合、検体試料用マイクロチップが回転盤に正確に配置されず若干ずれている場合や、回転駆動手段であるモータの軸のブレなどがあっても均等に配置される。そして、本発明の検体試料の遠心分注装置は、駆動手段により回転するアーム部と、このアーム部を回転させる回転盤であって外周に一方のギヤが形成された回転盤と、この回転盤の一方のギヤと歯合する他方のギヤを備えるという比較的簡単な構造で、従来の大型で高価なスポッタ装置を必要としなくなり、更に一つの駆動手段により上記公転運動と自転運動を行うことが可能であるなどの利点がある。

以下、本発明を適用した最良の実施形態について、図面を参照して詳細に説明する。

本実施の形態の検体試料用マイクロチップは、外形が円形又は正方形であり、その中心部に液状の検体試料を注入する溶液滴下部Ｃを一つ有し、この溶液滴下部Ｃから外方に向かって放射状に伸びる液状の検体試料の流路およびチャンバとなるチャンネルパターンＣｐが形成されている（図１ないし図４）。これらの中央には検体試料を注入する入り口となる入力ポートＱか又は入力ポートＳ１が形成されている。

図１から図４に示す検体試料用マイクロチップ１Ａ〜１ＤのチャンネルパターンＣｐの数は、図１と図２のものが１８チャンネルであり、図３のものが７２チャンネルであり、図４のものが１２０チャンネルであり、各チャンネルパターンＣｐ内に第１の検出用チャンバＴ１が同じ数形成され、図１と図４の検体試料用マイクロチップ１Ａ，１Ｄでは、検出用のチャンバＴａは一つであるが、図２の検体試料用マイクロチップ１Ｂでは、第１の検出用チャンバＴ１の外側に第２の検出用チャンバＴ２が同じ数形成されている。また、チップの中央の溶液滴下部Ｃと各チャンネルパターンＣｐとの連結部Ｃｄは、その形状がほぼ扇形に形成され、各チャンネルパターンＣｐから第１と第２の検出用チャンバＴ１，Ｔ２に検体試料を送り込み易く形成されている。図３の検体試料用マイクロチップ１Ｃは、中央の一つの溶液滴下部Ｃがドーナツ型に形成され、中央に島となる凸部が設けられ、対向するように入力ポートＳ１が形成されている。図２の検体試料用マイクロチップ１Ｂでは、連結部Ｃｄと第１の検出用チャンバＴ１との間に第１の流路ｐ１と、第１の検出用チャンバＴ１と第２の検出用チャンバＴ２との間に第２の流路ｐ２が形成されるが、第１の流路ｐ１よりも第２の流路ｐ２の方が狭くなっている。図４の検体試料用マイクロチップ１Ｄは、各チャンネルパターンＣｐを最も多くすることを追求した形で、チャンネルパターンＣｐが外周において凹凸上に形成する、凹状の部分を検出用のチャンバＴａとするものである。なお、図１３に示すチップ１Ｅは、図１に示すチップ１Ａと検出用のチャンバＴａや流路ｐ２などの形状が異なるのみで実質同じ構造である。

本実施の形態の検体試料用マイクロチップ１Ａ〜１Ｄは、ホットエンボシング装置を使用し、安価なポリマー基材や、或いは金属やガラスなどにそれらの表面の微細な流路形状に加工された凹凸を熱転写させて作製することができる。また、マスクなどを使用する半導体リソグラフィー技術を用いて作製するＰＤＭＳ（Polydimethylsiloxane）にて微細な流路形状を持った検体試料用マイクロチップを作製することもできる。さらに、その他の手法として、例えば、ＲＩＥ（Reactive ion etching）、レーザー、ＮＣ加工機などを使用して作製することができる。ここでは、ＲａｐｉｄＰｒｏｔｏｔｙｐｉｎｇを用いて、圧膜フォトレジスト（ＳＵ−８）による鋳型をＳｉ基板上に作成し、これをＰＤＭＳに転写し、流路となるチャンネルパターンＣｐなどが形成された一方側のポリマー基材（上方側のチップ）を作成し、他方、Ｓｉ基板を下部とし、Ｏ_２プラズマにより貼り合わせて検体試料用マイクロチップ１を作成した。作成した検体試料用マイクロチップ１は、正方形のものは、外形が約４０ｍｍ×約４０ｍｍであり、厚さが約３ｍｍである。また、円形のものは、直径が約４０ｍｍであり、厚さが約３ｍｍである。流路深さを１２０μｍ(マイクロメートル)に設計し、チップに必要な試料の分量（１８チャンネル分）を約８μl（マイクロリットル）とした。ポリマー基材としては、ＰＤＭＳの他にも、アクリル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、シクロオレフィンポリマー、ポリカーボネイト等の汎用樹脂材料は、いずれも本発明に使用することができる。

（遠心分注装置）
検体試料用マイクロチップ１Ａ〜１Ｄを使用した検体試料の遠心分注装置１１は、図５ないし図８に示すように、鋼鉄製の筒状ケースとして構成され、このケース内に、駆動手段Ｍにより回転するアーム部１２と、このアーム部１２上に配され検体試料用マイクロチップ１を搭載する回転盤１３Ａ，１３Ｂと、回転盤１３Ａ，１３Ｂの外周のギヤＧ１と歯合する中心のギヤＧ２などが備えられている。ケースの直径は約２０ｃｍ程度で、上方に蓋をする等して簡単に持ち運べる大きさである。上記ケースは、上方側がモータＭが内蔵される下方側よりもやや広い外周縁１１Ｆが形成されている（図７）。

アーム部１２は、駆動手段Ｍであるモータの軸Ｍａとその中央で連結されるとともに、その左右両側において回転盤１３Ａ，１３Ｂと連結されている。アーム部１２の連結位置には回転盤１３Ａ，１３Ｂの軸を回転自在に保持するベアリングが取り付けられて、アーム部１２に対する回転盤１３Ａ，１３Ｂの回転が許容されている。したがって、駆動手段Ｍによりアーム部１２を回転させると２個の回転盤１３Ａ，１３ＢがモータＭの軸Ｍａを中心に回転する。ここで、駆動手段Ｍにより回転するアーム部１２と、アーム部１２に取り付けられる回転盤１３Ａ，１３Ｂが特許請求の範囲の「公転運動させる手段」となり、「自転運動させる手段」は、この公転運動させる手段を利用することのほか、独自の回転駆動手段によっても実現できる（図１１（ｂ））。

回転盤１３Ａ，１３Ｂは、第１の回転盤１３Ａと第２の回転盤１３Ｂの二つがアーム部１３に連結され、これら回転盤１３Ａ，１３Ｂは、各々の鋼鉄製の基台１３ｄと、この基台１３ｄ上に配されるプレート板１３ｐとから構成されて、プレート板１３ｐに、位置合わせ用の孔１３ｃが放射状に形成され、この所定位置の孔１３ｃにピン及び固定用治具、バインダなどを差し込んで位置合わせすることが可能になっている（図７，図８）。回転盤１３に検体試料用マイクロチップ１を搭載し易くするために、位置決めの印や溝などを形成することは実施に応じて可能である。なお、これらを使用せずに両面テープなどを使用して回転盤１３に検体試料用マイクロチップ１を搭載することも可能である。回転盤１３Ａ，１３Ｂの基台１３ｄの外周には、外周ギヤＧ１が一方のギヤとして形成されている。

筒状ケースの上方には、掛け渡すように吊り下げ用部材１６が配されている。吊り下げ用部材１６は、筒状ケースの中央、つまりモータＭの軸Ｍａ上に位置するように中央のギヤＧ２（軸Ｊ３の外周にギヤＧ２が形成されている）を吊り下げるために配されている。この中央のギヤＧ２は、第１の回転盤１３Ａと第２の回転盤１３Ｂの外周に形成された外周ギヤＧ１と歯合して、第１と第２の回転盤１３Ａ，１３Ｂをその第１の軸Ｊ１と第２の軸Ｊ２を中心に回転させるために形成され、この中央のギヤＧ２は固定されている。ここで、上記のようにモータＭの軸Ｍａと中央のギヤＧ２との中心は一致する。また、中央のギヤＧ２の直径は１０ｍｍであり、第１と第２の回転盤１３Ａ，１３Ｂの直径は８０ｍｍである。さらに、第１と第２の回転盤１３Ａ，１３Ｂの直径は、筒状ケースの内周側の直径の約１／２よりもやや小さくなっている。このため、中央のギヤＧ１を中心に第１と第２の回転盤１３Ａ，１３Ｂが公転運動を１回転すると、第１と第２の回転盤１３Ａ，１３Ｂは第１と第２の軸Ｊ１，Ｊ２を中心に１／８回転の自転運動する構造となっている。

ここで、上記遠心分注装置１１としては、図１１，図１２に示すように、上記アーム部１２を駆動させる駆動手段Ｍとは別に回転盤１３Ａ，１３Ｂを各々自転運動させる駆動手段Ｍ１，Ｍ２を配置することによっても上記遊星回転が可能になる。また、本実施の形態では中央のギヤ（他方のギヤ）Ｇ２と回転盤の外周ギヤ（一方のギヤ）Ｇ１とが歯合する構造であるが、上記アーム部１２からの回転駆動を自転する回転盤１３Ａ，１３Ｂに連結させる伝動手段としてベルトプーリやチェーンベルト等を使用することも考えられ、これらも本発明の範囲に含まれる。

したがって、駆動手段Ｍによるアーム部１２の回転により、アーム部１２はモータＭの軸Ｍａを中心に回転するが、その回転は中央のギヤＧ２を中心にした公転運動となり（図７中の矢印Ａ）、この公転運動Ａが生じると、中央のギヤ（他方のギヤ）Ｇ２と回転盤の外周ギヤ（一方のギヤ）Ｇ１とが歯合するために、第１の回転盤１３Ａはその中央の第１の軸Ｊ１を中心に回転する自転運動となり（図７中の矢印Ｂ）、第２の回転盤１３Ｂはその中央の第２の軸Ｊ２を中心に回転する自転運動となる（図７中の矢印Ｂ）。このような自転させながら公転させることは「遊星回転」と呼ばれているが、このような遊星回転を一つの駆動手段により行う構造としては、上記中央のギヤＧ２に変えて筒状ケースの内周にギヤを形成して（図１１参照）、回転盤１３Ａ，１３Ｂの外周ギヤＧ１と歯合させることでも可能である。また、上記内周ギヤと上記中央のギヤＧ２の両方を設けることも可能である。ただし、筒状ケースの内周にギヤを形成する場合よりも上記中央のギヤＧ２を配する方が遊星回転の構造として小型化が図られると共に、中央のギヤＧ２の位置がモータＭの軸Ｍａの位置と一致することにより遊星回転の安定化が図られ、モータ軸Ｍａのブレが抑制されるなど利点がある。なお、上記両方に設けると構造が複雑で必ずしも円滑な動作とならない。

次に、上記実施の形態のうちの検体試料用マイクロチップ１Ｂ（図２）を上記検体試料の遠心分注装置１１の回転盤１３Ａ，１３Ｂに搭載して、検体試料用マイクロチップ１Ｂが各々の軸Ｊ１，Ｊ２の位置から若干ズレて配置された場合などにおいても第１の検出用チャンバＴ１に均等に分離注入することができるかを検討した。ここでは、検体試料用マイクロチップ１Ｂに検体試料を20μl滴下し、１５００rpmでチップを回転させ、外周に位置する第２の検出用チャンバＴ２に検体試料を分注した。上記モータＭを駆動させると、アーム部１２はモータＭの軸Ｍａを中心に回転するが、その回転は中央のギヤＧ２を中心にした公転運動となり（図７中の矢印Ａ）、この公転運動Ａが生じると、固定配置の中央のギヤＧ２と回転盤１３Ａ，１３Ｂの外周ギヤＧ１とが歯合するために、第１と第２の回転盤１３Ａ，１３Ｂは第１と第２の軸Ｊ１，Ｊ２を中心に各々回転する自転運動となり（図７中の矢印Ｂ）、これらの両方の遠心力により、検体試料は検出用チャンバＴ２に均等に配置される。また、予めミネラルオイルを溶液滴下部Ｃに注入し、回転駆動を与えることで、ミネラルオイルを検出用チャンバＴ２に配置しておき、その後、検体試料を溶液滴下部Ｃに再度注入し同様の操作を行った場合、オイルと検体試料の比重の違いから２液が置換され、Ｔ２に検体試料、Ｔ１にミネラルオイルの順に溶液を分注することもできる。このことから、遺伝子増幅法（ＰＣＲなど）を利用した遺伝子検査などへの応用が可能である。

ここで、検体試料が分離注入（分注）できる原理を説明する。検体試料用マイクロチップ１Ａは自転しているために、検体試料はその遠心力によって外周方向に引っ張られるようになるが、この自転のみでは微細な流路に溶液が入る抵抗（流路抵抗）があるなどの理由ですべての検出用チャンバＴ１，Ｔ２に均一に検体試料を配置させることはできない。しかし、更に検体試料用マイクロチップ１Ａは、公転の遠心力も受ける（この公転の遠心力の方が大きな遠心力となるように自転と公転の回転速度を調節する。）ことから、検出用チャンバＴ１，Ｔ２は常に変化し、全ての検出用チャンバＴ１，Ｔ２に均一にＰＣＲ反応溶液などを配置させることができる。なお、検体試料用マイクロチップ１を遠心分注装置の回転盤１３Ａ，１３Ｂの中心に正確に搭載できない場合の他にも、放射状の複数のチャンネルパターンＣｐがその中心から僅かにずれて形成されている場合や、駆動手段であるモータＭの軸Ｍａのブレなどが生じる場合であっても、上記遊星回転により検体試料を均一に流し込むことができる。そして、チャンネルパターンＣｐの数が増加することにより流路の幅が狭くなるとともに、その正確な形成も困難になるが（ずれて形成されることがあっても）、本実施の形態の形態によれば、全ての検出用チャンバＴ１，Ｔ２に均一に検体試料を流し込む確率は高くなると考えられる。なお、自転のみでは均一に検体試料を配置させることができず、公転のみでもチップ１Ａ内の検体試料に公転中心からの一方向にしか遠心力が働かないために均一に溶液を配置させることができない。

次に、ＰＣＲ反応溶液を使用した場合の実施例を比較例と比較して説明する。

実施例１
まず、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）反応とは、ポリメラーゼ連鎖反応とも呼ばれ、特定の遺伝子の配列をもとにその遺伝子を短時間に１００万倍に複製する技術である。生物工学的な分野での利用以外にも、最近では血液及び髄液などから遺伝的な疾患やウイルス・病原菌などを診断・検出するために利用される。この生成過程を解析する事により、そのＤＮＡの含有量そのものを定量する事が可能であり、ＰＣＲ反応の手順としては、次の（１）〜（６）などの手順により行われる。（１）ＤＮＡを抽出、（２）二重螺旋の形態をとるＤＮＡを加熱し、１本鎖の状態にする。（３）４つの塩基により構成されている遺伝子は特定の塩基と結合する。（４）この塩基の配列が遺伝子配列であり、標的とする遺伝子を対象とする配列をもとに作成し、これと対となる遺伝子の断片（プライマー）を加える。（５）プライマーは、目的とする遺伝子配列と結合する。（６）熱耐性酵素(Ｔａｑ酵素)は、プライマーが１本鎖遺伝子と結合している場合、その結合部位から、もとの２重螺旋ＤＮＡを再生する。

これらの過程にて、１本の二重螺旋ＤＮＡから２本の同一二重螺旋ＤＮＡが生成される。これを再び、加熱し、二重螺旋をほどいた上で一連の過程でプライマーとの結合、ＤＮＡの再生を行う。この結果、２本の二重螺旋ＤＮＡが４本の二重螺旋ＤＮＡとなる。この繰り返しにより、生成されるＤＮＡは、指数的に増加する。これらの一連の過程は、サーマルサークラーと呼ばれる装置にて、正確に温度制御を行い、連続して繰り返される。

以上のような技術をもとに、ＰＣＲ反応を用いた従来の反応検出は、検出ポイント（検査用チャンバなど）へスポッタ装置などを用いて何種類かのプライマーを配置させた後、スポッタ装置などを用いてＰＣＲ反応溶液を滴下させてから基板を貼り合わせて、ヒータにて正確に温度制御して増幅させて反応結果を検出する。検出ポイントへのスポッタ装置は微量、定量が望まれナノリットル、ピコリットル単位で吐出され、チャンバに異なるプライマーが配置されるときは、ＰＣＲ反応溶液は各チャンバ間で非接触でなければならない（分離注入させる必要がある）。なお、プライマーとＰＣＲ反応溶液との反応の際、ＰＣＲ反応では所定の温度まで温度上昇させる場合もある。

実施例１では、図９と図１０に示す検体試料用マイクロチップ１Ａ，１Ｂを使用して、第１の検出用チャンバＴ１へ均等に配置させたＰＣＲ反応溶液Ｒを、第２の検出用チャンバＴ２へと移動させることにより、異なるプライマーの固定された隣の検出用チャンバとＰＣＲ溶液が接触することがなくなり（非接触）、第２の検出チャンバＴ２には定量で均等にＰＣＲ反応溶液Ｒが配置される（図９（ｃ）、図１０（ｄ））。そして、溶液滴下部ＣへＰＣＲ反応溶液Ｒの蓋となるオイルを注入し、遠心分注装置１１にかけると、回転盤１３Ａ，１３Ｂに搭載された検体試料用マイクロチップ１Ａは、公転と自転の回転という遊星回転し（図７）、そこでの液状の検体試料は、自転に対する遠心力と公転に対する遠心力の両方の力を受けることにより、ＰＣＲ反応溶液の内側には均一にオイルの膜ができ、ＰＣＲ反応溶液と空気の接触もなくなり蓋をした状態となる。すなわち、図９に示すように、溶液滴下部ＣへＰＣＲ反応溶液Ｒを入力ポートＱから注入して（図９（ｂ））、上記遠心分注装置１１にかけると、ミネラルオイルとＰＣＲ溶液はその比重の違いから、Ｔ１にオイル、Ｔ２にＰＣＲ溶液Ｒの配置となる（図９（ｃ）、図１０（ｄ）の左側の図）。また、溶液滴下部Ｃへミネラルオイルを注入し、遠心分注装置１１にかけた後に、ＰＣＲ反応溶液Ｒを溶液滴下部Ｃへ注入し、遠心分注装置１１にかけた場合でもミネラルオイルとＰＣＲ溶液Ｒはその比重の違いから置換され、Ｔ１にオイル、Ｔ２にＰＣＲ反応溶液Ｒの配置となる（図９（ｃ）、図１０（ｄ）の右側の図）。なお、検体試料Ｒは切り離されるように各検出用チャンバＴ２に注入されることから、本明細書中ではこれを「分注」と定義して使用している。最後は、検体試料用マイクロチップ１を遠心分注装置の回転盤より取り外し、正確な温度制御を行うヒータテーブルに設置し、ＰＣＲ増幅法による温度制御を実施する。ＰＣＲ反応終了後、若しくはリアルタイム検出にて、円周上の各検出用チャンバＴ２を蛍光検出し、反応結果を診断する。

実施例１では、ヒトゲノムＤＮＡからのＳＲＹ遺伝子（ヒト性判定遺伝子）の検出を行った。まず、ＰＣＲ溶液（dNTP mixture：5μl、10×Buffer:5μl、25mM MgCl₂ : 8μl、Amplitaq Gold DNA polymerase : 1μl、TaqMan primer:5μl、Forward primer：5μl、Reverse primer：5μl、H₂O:10μl、2.5% PVP: 5μl、Human Male DNA: 1μl）を調整し、回転駆動を与えることでＰＣＲ溶液を検体試料用マイクロチップのチャンバに配置した。次にマイクロチップをサーマルサイクラに置き、温度条件 95℃:5分の加熱後、95℃: 15秒−60℃: 60秒の加熱を45サイクル行い、DNAを増幅させた。その後、蛍光顕微鏡を用いて、各チャンバ(合計１２チャンバ)の蛍光強度変化（ex460-490、em510-550）を測定したところ、ヒトゲノムＤＮＡを含むチャンバの蛍光強度(合計6チャンバ)は、含まないチャンバの蛍光強度(合計6チャンバ)に比べ、平均で1.84倍上昇していた。この結果は、図１５に示されるが、従来法であるリアルタイムＰＣＲ法の蛍光検出法と同様の結果であり、検体試料用マイクロチップを用いて標的とする遺伝子の検出が可能であることが分かった。図１５は、ＳＲＹ遺伝子の検出結果をグラフ化して説明する図であり、Human Male DNAを含んでいるもの（鋳型あり）が左側に示され、Human Male DNAを含んでいないもの（鋳型なし）が右側に示されている。

実施例２
次に、図１３に示す検体試料用マイクロチップ１Ｅを使用してその中央の溶液注入口Ｑに２５μｌの青色色素（ブロモフェノールブルー）溶液を添加し、遊星回転を与え、全ての検出用チャンバＴ１に溶液が満たされたときの回転速度（rpm）を調べた。作製したチップ１Ｅは、図１３に示すように、PDMS（ポリジメチルシロキサン）を４０ｍｍ平方に切断したシリコンウェハに酸素プラズマ接着したもので、流路ｐ２の長さＭ５が２ｍｍであるが、流路ｐ２の幅Ｍ６が1000μｍ、750μｍ、500μｍ、250μｍの４種類を作製した。この４種類のチップ１Ｅの流路ｐ２の深さは全て120μｍである。また、チップ１ＥのＭ１の長さが３０．５ｍｍであり、Ｍ２の長さが１９．３ｍｍであり、検出用のチャンバＴ１の流さＭ３の長さが３ｍｍであり、その幅Ｍ４の長さが２ｍｍである。

上記４種類のチップ１Ｅを用いて上記遠心分注装置１１にかけて実験した結果は、流路ｐ２の幅Ｍ６が１０００μｍのチップを用いた場合は、９５０rpmで、流路ｐ２の幅Ｍ６が７５０μｍのチップを用いた場合は、１０５０ rpmで、流路ｐ２の幅Ｍ６が５００μｍのチップを用いた場合は、１５２０ rpmで、流路ｐ２の幅Ｍ６が２５０μｍのチップを用いた場合は、１８５０rpmで、検出用のチャンバＴ１の全てに溶液が均一に満たされた。

比較例１
比較例１として、上記本実施の形態の検体試料用マイクロチップ１Ａを使用してスピンコータにて自転のみを与える回転実験（回転軸からチャネルパターンＣｐまでの距離：８mm）を行った。中央の溶液滴下部Ｃに入力ポートＱよりＰＣＲ反応溶液を注入し、スピンコータにて回転させるが、スピンコータの中心軸から若干ずれた位置に検体試料用マイクロチップ１Ａを配置した。その結果、ＰＣＲ反応溶液は各チャンネルパターンＣｐで偏る結果となった（図１４参照）。この図１４中矢印Ｆを付した向きは、この矢印の方向にチップの中心が偏っており、この方向に最も強く遠心力を受けたことからこの方向に溶液が集まったことを示している。なお、図１４中に「分注されていない」箇所と「半分だけ分注」された箇所を説明した。なお、８０００ｒｐｍ程度では検出用チャンバには溶液が配置されずチャンネルパターンの流路ｐ２で留まってしまい、第１の検出用チャンバまでは一部の箇所にしか送り込むことができなかった。これは、回転盤への配置の偏りによる影響と自転のみの遠心力によりＰＣＲ反応溶液が外方向へ向かう力より、微細な流路にＰＣＲ反応溶液が入る抵抗（流路抵抗）の方が大きいためと考えられる。

比較例２
比較例２として、上記検体試料用マイクロチップ１Ｂを使用してスピンコータにて回転させる自転のみを与える回転実験（回転軸からチャネルパターンＣｐまでの距離：８mm）を行った。中央の溶液滴下部Ｃに入力ポートＱよりＰＣＲ反応溶液を注入し、スピンコータにて回転させるが、スピンコータの中心軸から若干ずれた位置に検体試料用マイクロチップ１Ｂを配置した。回転数を１５０００ｒｐｍ以上にして試験したところ、ＰＣＲ反応溶液が一方側の検出用チャンバＴ１，Ｔ２には（左右の一方側半分）、配置されるようになった。しかし、中心軸から偏っている分、ＰＣＲ反応溶液が配置された検出用チャンバと対角の検出用チャンバにはＰＣＲ反応溶液は配置されず、一定量を注入するため偏りをみせた。すなわち、遠心力のかかる方向では検出用チャンバ部Ｔ１，Ｔ２のいずれにも配置されたが、遠心力がかからない方向では検出用チャンバ部Ｔ１，Ｔ２の一方のみの配置や、いずれに配置されない場合があった。検出用チャンバ部Ｔ１，Ｔ２はＰＣＲ反応溶液と接触し、少ない方では全く配置されないか若しくは必要量を配置できない状態となり、中心軸から若干でもずれると、ＰＣＲ溶液を均等に配置できなかった。

以上から、比較例１，２のように、単に自転運動としての回転を与えるだけでは、回転盤１３Ａ，１３Ｂに正確に配されず若干ずれて配されるような場合に、偏ったりしてすべての検出用チャンバＴ１，Ｔ２に検体試料を均一に送り込むことはできないが、実施例１、２のように、本実施の形態の検体試料用マイクロチップ１Ａ〜１Ｅについては、上記実施の形態の方法と装置によれば、すべての検出用チャンバＴ１，Ｔ２に検体試料を均一に分離注入（分注）することができることが分かる。

本発明の検体試料用マイクロチップの一例を示す平面図である。本発明の検体試料用マイクロチップの一例を示す平面図である。本発明の検体試料用マイクロチップの一例を示す平面図である。本発明の検体試料用マイクロチップの一例を示す平面図である。本発明の遠心分注装置を示す斜視図である。上記遠心分注装置の内部構造を説明する平面図である。上記遠心分注装置の平面図である。上記遠心分注装置の断面図である。本発明の検体試料の分離注入過程を説明する図である。本発明の検体試料の分離注入過程を説明する図である。上記遠心分注装置の他の例を示す図であり、（ａ）がその平面図であり、（ｂ）がその断面図である。上記遠心分注装置の他の例を示す図であり、（ａ）がその平面図であり、（ｂ）がその断面図である。本発明の検体試料用マイクロチップの大きさの一例を説明する図である。比較例２の実験結果を表した図である。ＳＲＹ遺伝子の検出結果をグラフ化して説明する図である。

符号の説明

１Ａ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｄ，１Ｅ検体試料用マイクロチップ、
１１遠心分注装置、
１２アーム部、
１３，１３Ａ，１３Ｂ回転盤、
Ｊ３吊り下げ用部材、
Ａ公転の方向、
Ｂ自転の方向、
Ｃ溶液滴下部、
Ｃｐチャンネルパターン、ｐ１，ｐ２流路、
Ｇ１外周ギヤ、Ｇ２中央のギヤ、
Ｊ１第１の軸、Ｊ２第２の軸、
Ｍ駆動手段（モータ）、Ｍａモータ軸、
Ｔ１，Ｔ２，Ｔａ検出用のチャンバ

Claims

液状の検体試料の流路となるチャンネルパターンが形成された検体試料用マイクロチップであり、このマイクロチップの中心部に液状の検体試料を注入する溶液滴下部を一つ有し、この一つの溶液滴下部を中心に外方に向かって伸びるチャンネルパターンが形成され、各チャンネルパターンに検体試料を検査する部分となる検出用チャンバが形成されている検体試料用マイクロチップを使用して、液状の検体試料を検査する検体試料の遠心分注方法であって、検体試料用マイクロチップが搭載される回転盤を自転させると共に公転させることにより、検体試料用マイクロチップの溶液滴下部に注入した液状の検体試料を検出用チャンバに遠心分注させることを特徴とする検体試料の遠心分注方法。
液状の検体試料の流路となるチャンネルパターンが形成された検体試料用マイクロチップであり、このマイクロチップの中心部に液状の検体試料を注入する溶液滴下部を一つ有し、この一つの溶液滴下部を中心に外方に向かって伸びるチャンネルパターンが形成され、各チャンネルパターンに検体試料を検査する部分となる検出用チャンバが形成されている検体試料用マイクロチップを使用して、液状の検体試料を検査する検体試料の遠心分注装置であって、検体試料用マイクロチップを搭載する回転盤をある中心を軸として公転運動させる手段と、回転盤をその中心を軸として自転運動させる手段とを備えることを特徴とする検体試料の遠心分注装置。
前記公転運動させる手段は、駆動手段により回転するアーム部と、このアーム部に取り付けられ検体試料用マイクロチップを搭載する回転盤とからなり、前記自転運動させる手段は、回転盤の外周に形成された一方のギヤと、この一方のギヤと歯合する他方のギヤであって前記アーム部の中心位置に吊り下げられように配されるか、又は、前記公転運動する外周側に配されるとともに、上記アーム部の回転を利用して、上記回転盤に搭載される検体試料用マイクロチップをアームの回転により公転運動すると共に、この公転運動により回転盤の一方のギヤと他方のギヤとが歯合することにより回転盤の中心を軸として自転運動することを特徴とする請求項２記載の検体試料の遠心分注装置。