JP5967611B2 - 熱対流生成用チップ及び熱対流生成装置 - Google Patents

Description

本発明は、熱対流ＰＣＲ等に用いられる熱対流生成用チップ及び熱対流生成装置に関する。

遺伝子増幅方法として、ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Reaction、以下「ＰＣＲ」と称する。）が知られている。ＰＣＲは、極めて微量のＤＮＡサンプルから特定のＤＮＡ断片を短時間に大量に増幅できる方法であり、その操作の簡便さから、現在では基礎研究のみならず、臨床遺伝子診断から食品衛生検査、犯罪捜査に至るまで、幅広い分野に応用されている。

特許文献１には、シリンダ状の容器内で、容器底部側から供給する熱により熱対流を発生させてＰＣＲを行う熱対流ＰＣＲ装置が開示されている。この熱対流ＰＣＲ装置は、対流による溶液駆動を行うものであり、外部ポンプを使用せずにＰＣＲ溶液の送液が可能という利点がある。

また、特許文献２には、液体を加熱すると同時に液体に遠心力を付与して熱対流を促進するようにした熱対流ＰＣＲ装置が開示されている。

WO2002/072267 WO2011/086497

しかしながら、特許文献２に開示の装置では、液体の流路が回転軸方向に対して傾斜した面に沿って形成されているため、液体が流路を流れる間に液体に作用する回転軸方向の合力が変化する。すなわち、液体が流路内を上向きに流れる場合と下向きに流れる場合とでは液体に作用する回転軸方向の合力が異なるので、液体がスムーズに流れにくく、熱対流が安定しないという問題がある。

なお、ＰＣＲ以外の分野においても、コンパクトで、かつ安定した熱対流を生じさせることができる熱対流生成装置が求められている。

上記課題を解決するために、本発明の熱対流生成用チップは、液体を加熱又は冷却すると同時に液体に遠心力を付与することにより液体の熱対流を生じさせる熱対流生成装置に用いられる熱対流生成用チップであって、
ディスク状基板と、
ディスク状基板における軸線と直交する面内に形成された少なくとも一つの熱対流用流路と、
を含み、
ディスク状基板の軸線周りに回転させることにより熱対流用流路内の液体に遠心力を付与するようにしたことを特徴とする。

また、熱対流用流路内に液体を供給するための液体供給路を設け、この液体供給路を、熱対流用流路に対してディスク状基板の軸線の側に配置すると、液体供給路内の液体が遠心力により熱対流用流路の方向に移動するので、液体供給路内の液体を確実に熱対流用流路内に進入させることができる。

また、熱対流用流路内の液体中に含まれるガスを受け入れるガス排出路を設けると、液体中に含まれるガスを除去できるので、熱対流をスムーズに行うことができる。

また、熱対流用流路の一部を加熱又は冷却する熱源を設けることができる。

この場合、熱源は、例えば、熱対流用流路の流れ方向に沿って二箇所に配置される一対のヒータを含み、一方のヒータの温度は２本の１本鎖ＤＮＡを結合させるのに適した温度であり、他方のヒータの温度は２本鎖ＤＮＡを分離させるのに適した温度のものとすることができる。

また、一方のヒータを冷却する放熱手段を設けるようにすると、安価な製造コストで熱対流ＰＣＲの精度が向上するので、好ましい。

なお、熱対流用流路を真円状にすると、流路長を最短にできるので、液体の処理効率が向上する。

また、ディスク状基板の軸線に対して対称的に配置された複数の熱対流用流路を備えるようにすると、複数の液体を同時に処理できるので、処理効率が向上する。

本発明の熱対流生成用チップの適用分野は特に限定されないが、例えば熱対流ＰＣＲに用いることができる。

また、本発明の熱対流生成装置は、液体を加熱又は冷却すると同時に液体に遠心力を付与することにより液体の熱対流を生じさせる熱対流生成装置であって、
ディスク状基板と、ディスク状基板における軸線と直交する面内に形成された少なくとも一つの熱対流用流路とを含み、ディスク状基板の軸線周りに回転させることにより熱対流用流路内の液体に遠心力を付与するようにした熱対流生成用チップを装脱可能なチップ装着部と、
熱対流生成用チップの熱対流用流路の一部を加熱又は冷却する熱源と、
熱対流生成用チップを軸線周りに回転駆動する駆動手段とを含むことを特徴とする。

なお、この熱対流生成装置は、熱源による熱対流用流路の加熱温度又は冷却温度、駆動手段による熱対流生成用チップの回転駆動速度及び回転駆動時間を制御する制御手段を備えるものとすることができる。

また、熱源は、例えば、熱対流用流路の流れ方向に沿って二箇所に配置される一対のヒータを含み、一方のヒータの温度は２本の１本鎖ＤＮＡを結合させるのに適した温度であり、他方のヒータの温度は２本鎖ＤＮＡを分離させるのに適した温度のものとすることができる。

この場合、一方のヒータを冷却する放熱手段を設けるようにすると、安価な製造コストで熱対流ＰＣＲの精度が向上するので、好ましい。

本発明の熱対流生成装置の適用分野は特に限定されないが、例えば熱対流ＰＣＲに用いることができる。

この場合、熱対流用流路内の液体に含まれる蛍光色素を励起する励起光を熱対流用流路内の液体に照射する励起光光源と、蛍光色素に励起光を照射することにより蛍光色素によって放出される蛍光を検出する蛍光検出器と、蛍光検出器によって検出された蛍光に基づいてＤＮＡの増幅量を算出する演算制御部とを含むようにすると、リアルタイムＰＣＲを実行できるようになるので、鋳型ＤＮＡの定量を迅速に行うことができる。

本発明によれば、外部ポンプを必要としないためコンパクトで、かつ安定した熱対流を生じさせる熱対流生成装置を提供できる。

本発明の第１実施形態の熱対流生成装置の側面図である。 第１実施形態の熱対流生成装置の分解斜視図である。 第１実施形態の熱対流生成用チップの拡大斜視図である。 第１実施形態の熱対流用流路、液体供給路及びガス排出路の拡大図である。 第１実施形態の制御系のブロック図である。 本発明の効果を確認するための実験方法の説明図である。 本発明の第２実施形態の熱対流用流路及び液体供給路の拡大図である。 モータの電源の電圧とモータの回転数との関係を示すグラフである。 相対重力加速度とモータの電源の電圧との関係を示すグラフである。 本発明の第３実施形態の熱対流生成装置の側面図である。 第３実施形態の熱対流用流路及び液体供給路の拡大図である。 第３実施形態の制御系のブロック図である。

以下、図面を参照して本発明の実施形態を説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されない。

本発明の第１実施形態の熱対流生成装置１は熱対流ＰＣＲを行うための装置であって、図１、２に示すように、熱対流生成用チップ１０を装脱可能なチップ装着部としてのステージ２０と、熱源３０と、モータ４０と、制御手段５０とを備えている。

図３に示すように、熱対流生成用チップ１０は、例えばシクロオレフィンポリマーやポリカーボネート等の合成樹脂から成る透明な円盤状のディスク状基板１１を備えており、このディスク状基板１１は、基板本体１２と、その下面に積層された蓋体１３とから成っている。

基板本体１２の下面周縁部には複数の熱対流用流路１４が設けられている。これらの熱対流用流路１４は、ディスク状基板１１の軸線ＡＸ周りに等角度間隔をおいて設けられ、軸線ＡＸに対して対称的に配置されている。

熱対流用流路１４の数、加工方法、形状及び寸法等は特に限定されないが、本実施形態では、直径４０mmの基板本体１２に微細加工技術により４つの同形同大の熱対流用流路１４が形成され、各熱対流用流路１４は直径５mmの真円状の溝から成り、溝の幅は５００μm、深さは３００μmとなっている。

なお、熱対流用流路１４は真円状であるため、流路長を最短にでき、熱対流ＰＣＲを短時間で効率良く行うことができる。また、熱対流生成用チップ１０は複数の熱対流用流路１４を備えているため、複数の液体を同時に処理できるので、処理効率が向上する。

熱対流用流路１４における軸線ＡＸに最も近い部位には、二股状に分岐した液体供給路１５とガス排出路１６とが連通接続されている。

液体供給路１５とガス排出路１６との加工方法、形状及び寸法等は特に限定されないが、本実施形態では、微細加工技術により形成された溝から成る左右対称状の流路である。

図４に示すように、液体供給路１５は、熱対流用流路１４から最も離れた部位から順に、ディスク状基板１１の径方向に延びる細長い伸延部１５ａと、その一端に連通接続された涙滴状の液溜り部１５ｂと、その先端部と熱対流用流路１４とを連通接続する幅狭の連通部１５ｃとを有している。なお、液溜り部１５ｂの容量は熱対流用流路１４の容量よりも大きくされている。

ガス排出路１６は、熱対流用流路１４から最も離れた部位から順に、ディスク状基板１１の径方向に延びる細長い伸延部１６ａと、その一端に連通接続された涙滴状のガス溜り部１６ｂと、その先端部と熱対流用流路１４とを連通接続する幅狭の連通部１６ｃとを有している。

ガス排出路１６を設けたことで、熱対流用流路１４内の液体が熱対流する際に生じるガスや液体供給路１５に液体を注入する際に生じるガスが遠心力によりガス排出路１６内に進入し、液体からガスを除去できるので、液体の熱対流をスムーズに行うことができる。

蓋体１３（図３参照）は、基板本体１２とほぼ同径で、かつ基板本体１２よりも薄い円盤により形成され、基板本体１２の下面に積層された状態で、適宜の固定手段により基板本体１２と着脱可能に固定される。

ステージ２０（図２参照）は、熱源３０を支持するとともにモータ４０の回転力を熱対流生成用チップ１０に伝達するためのものであって、合成樹脂や金属等から成る円盤により形成される。

ステージ２０は、その上方に配置される熱対流生成用チップ１０をステージ２０に対して同心状に位置決めするとともに熱対流生成用チップ１０を相対回転不能に連結する連結手段を備えている。そのような連結手段の構造は特に限定されないが、例えば、熱対流生成用チップ１０における中心軸に対して偏心した位置に形成された凹部又は凸部を、ステージ２０における中心軸に対して偏心した位置に形成された凸部又は凹部と嵌合させる構造とすることができる。

ステージ２０には、熱源３０を挿入装着するための４つの円弧状のヒータ装着孔２１が設けられている。これらのヒータ装着孔２１は軸線ＡＸ周りに９０°の角度間隔をおいて設けられ、軸線ＡＸに対して対称的に配置されている。

また、ステージ２０には、後述する第１ヒータ３１を固定するためのねじの軸部を挿通する一対の第１ねじ挿通孔２２と、後述する第２ヒータ３２を固定するためのねじの軸部を挿通する一対の第２ねじ挿通孔２３とが設けられている。

熱源３０は、リング状の第１ヒータ３１と、その内側に同心状に配置されるリング状の第２ヒータ３２とから成っている。

第１ヒータ３１は、リング状の連結部３１ａと、その周方向に等間隔をおいて設けられた４つの横断面Ｌ字形の柱状の加熱部３１ｂとを備えている。

連結部３１ａには一対のねじ孔３１ｃが軸線ＡＸ周りに１８０°の角度間隔をおいて設けられている。これらのねじ孔３１ｃには、ステージ２０の第１ねじ挿通孔２２を貫通したねじの軸部が螺合する。

第１ヒータ３１をステージ２０に装着した状態で、第１ヒータ３２の各加熱部３１ｂの上端部がステージ２０の上方に突出した状態となる（図１参照）。

第２ヒータ３２は、リング状の連結部３２ａと、その周方向に等間隔をおいて設けられた４つの縦断面Ｌ字形の柱状の加熱部３２ｂとを備えている。

連結部３２ａには一対のねじ孔３２ｃが軸線ＡＸ周りに１８０°の角度間隔をおいて設けられている。これらの貫通孔３２ｃには、ステージ２０の第２ねじ挿通孔２３を貫通したねじの軸部が螺合する。

第２ヒータ３２をステージ２０に装着した状態で、第２ヒータ３２の各加熱部３２ｂの上端部がステージ２０の上方に突出した状態となる（図１参照）。

図４に示すように、第１ヒータ３１の加熱部３１ｂは、その上面が熱対流用流路１４の半周程度に対向するように形成されている。加熱部３１ｂの加熱温度は約６０℃である。

一方、第２ヒータ３２の加熱部３２ｂは、その上面が熱対流用流路１４の１／４周程度に対向するように形成されている。加熱部３２ｂの加熱温度は約９５℃である。

図２に示す熱対流生成用チップ１０、ステージ２０、第１ヒータ３１及び第２ヒータ３２が積層された状態で、モータ４０のシャフト４１がステージ２０の中心孔２４及び熱対流生成用チップ１０の中心孔１７に挿通される。モータ４０のシャフト４１とステージ２０は適宜の手段により固定される。

熱対流生成装置１を制御する制御手段５０は、図５に示すように、演算制御部５１、表示部５２及び入力部５３を備えている。

演算制御部５１は、ＣＰＵ、ＲＯＭ及びＲＡＭ等を含むマイクロコンピュータにより構成され、ＣＰＵは、入力部５３から入力される情報とＲＯＭに格納されたプログラムとに従って第１ヒータ３１、第２ヒータ３２及びモータ４０を制御する。表示部５２は液晶表示装置を備え、入力部５３は、キーボード、マウスを備える。

なお、図２の左側に仮想線で示すように、第１ヒータ３１で発生する熱を放熱して第１ヒータ３１を冷却するヒートシンク６０を設けるようにしてもよい。この場合、安価な製造コストで余分な熱を除去でき、熱対流ＰＣＲの精度を向上することができる。

次に、熱対流生成装置１を用いて熱対流ＰＣＲを行う手順を説明する。

基板本体１２における蓋体１３と反対側の面に形成された注入口（図示せず）に反応試薬溶液を注入すると、この反応試薬溶液は、毛細管現象により液体供給路１５の伸延部１５ａを通過して液溜り部１５ｂに流入する。

次に、前記注入口に唾液や血液等の検体液を注入すると、この検体液は毛細管現象により液体供給路１５の伸延部１５ａを通過して液溜り部１５ｂに流入する。

なお、本実施形態では、反応試薬溶液や検体液は毛細管現象により伸延部１５ａを通過して液溜り部１５ｂに流入するが、ピペッター等を使用して反応試薬溶液や検体液を液溜り部１５ｂ内に押し込むようにしてもよい。

液溜り部１５ｂに流入した反応試薬溶液や検体液は、熱対流生成用チップ１０が停止している間は液溜り部１５ｂ内に滞留しているが、熱対流生成用チップ１０が回転すると、遠心力により連通部１５ｃを通過して熱対流用流路１４内に進入する。

なお、基板本体１２と蓋体１３との間に気密性及び液密性を有する薄い樹脂製シートを挟み込んで、熱対流用流路１４、液体供給路１５及びガス排出路１６を封閉するようにしてもよい。

また、液体供給路１５にＰＣＲを阻害しないオイルを注入してもよい。この場合、熱対流生成用チップ１０が回転すると、比重が軽いオイルは液溜り部１５ｂに滞留し、熱対流用流路１４内の液体が連通部１５ｃから液溜り部１５ｂに流入するのを防ぐ蓋として機能するとともに、熱対流用流路１４内の液体が蒸発するのを防止する。

次に、熱対流生成用チップ１０、第１ヒータ３１及び第２ヒータ３２をステージ２０に装着固定し、モータ４０のシャフト４１をステージ２０の中心孔２４及び熱対流生成用チップ１０の中心孔１７に挿入してステージ２０をシャフト４１に固定する。

ユーザが制御手段５０の入力部５３を操作してモータ４０を起動すると、ステージ２０及び熱対流生成用チップ１０が回転する。また、第１ヒータ３１及び第２ヒータ３２に通電されて各熱対流用流路１４内の液体が加熱される。

液体供給路１５は熱対流用流路１４に対してディスク状基板１１の軸線ＡＸの側に配置されているため、熱対流生成用チップ１０が回転すると、液体供給路１５内の反応試薬溶液と検体液は遠心力により熱対流用流路１４の方向に移動するので、熱対流用流路１４内に進入する。

各熱対流用流路１４内の反応試薬溶液と検体液とは、加熱されるとともに遠心力が付与されることにより、熱対流して両液が混合する。

なお、反応試薬溶液と検体液とを液体供給路１５に注入する前に、あらかじめ反応試薬溶液と検体液との混合液を作製し、この混合液を液体供給路１５に注入し、熱対流用流路１４で熱対流させるようにしてもよい。

なお、熱対流用流路１４内の混合液中にガスが含まれている場合には、そのガスは遠心力により軸線ＡＸの方向に移動してガス排出路１６内に流入するので、混合液中のガスを除去できる。これによって、混合液がスムーズに熱対流することができる。

混合液は第２ヒータ３２の加熱部３２ｂを通過する際に加熱部３２ｂ（約９５℃）と熱交換して加熱される。これにより、混合液中の２本鎖ＤＮＡが分離して２本の１本鎖ＤＮＡとなる。なお、本実施形態では、熱対流する混合液の加熱部３２ｂの通過時間は約１５秒に設定されている。

また、混合液は第１ヒータ３１の加熱部３１ｂを通過する際に加熱部３１ｂ（約６０℃）と熱交換して冷却される。これにより、混合液中の２本の１本鎖ＤＮＡが結合して２本鎖ＤＮＡとなる。なお、本実施形態では、熱対流する混合液の加熱部３１ｂの通過時間は約４５秒に設定されている。

なお、熱対流する混合液が第１ヒータ３１の加熱部３１ｂを通過する時間と第２ヒータ３２の加熱部３２ｂを通過する時間とは、熱対流生成用チップ１０の回転数や混合液の熱対流速度等を制御することで、短縮可能である。

モータ４０の駆動時間は、第２ヒータ３２による加熱と第１ヒータ３１による冷却とがそれぞれ所定回数ずつ行われるように設定されている。

なお、第１ヒータ３１及び第２ヒータ３２の温度及びモータ４０による熱対流生成用チップ１０の回転駆動速度は、制御手段５０の入力部５３を介して調整可能となっている。

本発明の熱対流生成装置１は、液体を熱対流させるようにしているため、外部ポンプを必要とせず、装置がコンパクトである。また、液体を加熱すると同時に遠心力を付与するようにしているため、液体を確実に熱対流させることができる。

さらに、熱対流用流路１４がディスク状基板１１における軸線と直交する面内に形成されているので、液体が熱対流用流路１４内を循環する間に液体に作用する回転軸方向の合力が変化しないので、液体の流れが安定する。したがって、安定した熱対流を確実に生成することができるので、信頼性が高い。

また、熱対流用流路１４が真円状であるため、流路長を最短にすることができるのに加えて、熱対流用流路１４が複数設けられているため、液体の処理を短時間で効率良く行うことができる。

本発明の効果を確認するために、以下の実験を実施した。

熱対流生成用チップ１０の液体供給路１５内に着色していない水と食紅等で着色した水とを注入し、最初に熱源３０に通電していない状態で熱対流用流路１４内の様子をハイスピードカメラによって観察した。その結果、熱対流生成用チップ１０の回転前と回転後の熱対流用流路１４内の液体の濃淡の変化は見られず、熱対流生成用チップ１０の回転のみでは着色していない水と着色した水との混合が生じないことが確認された。なお、モータ４０の駆動時間は２０秒、駆動速度は１０００ｒｐｍ、電流値は１．４Ａである。

次に、熱源３０の温度を５０℃とし、熱対流生成用チップ１０の回転前と回転後の熱対流用流路１４内の様子をハイスピードカメラによって観察した。その結果、熱対流用流路１４内に熱対流が生じ、着色していない水と着色した水とが混合してゆく様子が確認された。

また、熱対流用流路１４の温度を測定するために、熱対流生成用チップ１０の下面と第１ヒータ３１の加熱部３１ｂの上面との間、及び熱対流生成用チップ１０の下面と第２ヒータ３２の加熱部３２ｂの上面との間に、図６に示すように、３種類のサーモシール７１（６０℃）、サーモシール７２（９５℃）及びサーモシール７３（１００℃）を貼り付けた。サーモシール７１〜７３は、温度が上昇するにしたがって、黒、茶、緑、青、紫と順に温度が変化してゆく。

第２ヒータ３２に接続されている電源の温度設定を１１５℃とし、モータ４０のＤＣ電源の電圧を０．５Ｖに設定し、熱対流生成用チップ１０を１０分間回転駆動した。なお、第１ヒータ３１には通電していない。熱対流生成用チップ１０の回転前と回転後のサーモシール７２の色を比較すると、サーモシール７２の色に変化は見られないため、熱対流生成用チップ１０の回転による空冷の影響はないと考えられる。なお、サーモシール７２の色から、熱対流用流路１４におけるサーモシール７２に対向する部位の温度は９５℃〜９７℃であることが判明した。

一方、サーモシール７１の色は紫であり、熱対流用流路１４におけるサーモシール７１に対向する部位の温度は６０℃を遥かに越えていることを示している。そこで、第１ヒータ３１を冷却するべく、水の循環による水冷とヒートシンク６０による放熱との比較検討を行った。

水冷による冷却方法では、ステージ２０のヒータ装着孔２１にシリコンチューブを通し、ぺリスタポンプを使用することで水（常温）を循環させて冷却した。第２ヒータ３２に接続されている電源の温度設定を１２５℃としたところ、熱対流用流路１４における第２ヒータ３２の加熱部３２ｂに対向する部位の温度は９５〜９７℃となったが、熱対流用流路１４における第１ヒータ３１の加熱部３１ｂに対向する部位の温度は５７．２５℃以下となった。

一方、ヒートシンク６０による冷却方法では、第２ヒータ３２に接続されている電源の温度設定を１２５℃とし、１２個の放熱体からなるヒートシンク６０を第１ヒータ３１に取り付けたところ、熱対流用流路１４における第２ヒータ３２の加熱部３２ｂに対向する部位の温度は９５〜９７℃となり、また、熱対流用流路１４における第１ヒータ３１の加熱部３１ｂに対向する部位の温度は約６０℃となり、理想の温度分布が得られた。そして、モータ４０のＤＣ電源の電圧を０．５Ｖに設定して熱対流生成用チップ１０を１０分間回転させたが、温度分布に変化は見られなかった。

次に、本発明の第２実施形態を説明する。図７は本発明の第２実施形態の熱対流用流路及び液体供給路の拡大図である。なお、先に説明した第１実施形態と対応する部位には同一の符号を付してあり、重複する説明は省略する。

本実施形態では、熱対流用流路１４と液体供給路１５を有する基板本体１２（図３参照）が、ポリジメチルシロキサン（以下「ＰＤＭＳ」と称する。）とガラスとの複合体を材料としてフォトリソグラフィー技術により作製されている。

本実施形態の熱対流用流路１４は、外側の直径が６mmの真円状の溝から成り、溝の幅は５００μm、深さは４００μmである。

液体供給路１５の液溜り部１５ｂの熱対流用流路１４と反対側の端部は半円形状に形成され、液溜り部１５ｂの熱対流用流路１４の側の端部は逆三角形状に形成され、液溜り部１５ｂの中間部は直方体状に形成されている。また、液溜り部１５ｂに液体を導入する伸延部１５ａがＬ字形に形成されるとともに、その一端が液溜り部１５ｂの逆三角形状の端部に連通接続されている。

本実施形態のその他の構成は先に説明した実施形態と同じである。

先に説明した実験方法と同じ方法で第１ヒータ３１の加熱部３１ｂ、第２ヒータ３２の加熱部３２ｂ上にそれぞれサーモシールを配置して温度測定を行い、各機器の設定を行った。

第２ヒータ３２の電源の温度を１４０℃に設定し、冷却水の温度を５０℃に設定したところ、熱対流用流路１４における第２ヒータ３２の加熱部３２ｂに対向する部位の温度と、熱対流用流路１４における第１ヒータ３１の加熱部３１ｂに対向する部位の温度は目標とする温度となった。なお、ヒートシンクは用いなかった。

熱対流用流路１４中に食紅液を充填して気泡発生の有無の確認を行った。ＰＤＭＳはガス透過性が高いため、高温時に気泡が発生することがある。この気泡は液体の対流を妨げるため、ＰＣＲの熱交換ができなくなってしまう。

そこで、あらかじめミネラルオイルを熱対流用流路１４に満たし、ＰＤＭＳが十分にミネラルオイルを吸収した状態で食紅液を熱対流用流路１４に充填した。そして、熱対流用流路１４を３０分間加熱したが、気泡は発生しなかった。これは、ミネラルオイルがＰＤＭＳのガス透過性を低下させ、気泡の発生を防いだと考えられる。また、ミネラルオイルは、連通部１５ｃを塞ぐ蓋としての役割を果たし、液体の蒸発を防ぐこともできる。

図８はモータ４０（図２参照）の電源の電圧とモータ４０の回転数との関係を示すグラフ、図９は相対重力加速度とモータ４０の電源の電圧との関係を示すグラフである。

図９は速度と遠心力との関係式（Ｆ＝ｍｖ²/ｒ、ｇ＝（２πＮ）²ｒ）より相対重力加速度とモータ４０の回転数との関係を求め、さらに電圧と相対重力加速度との関係を求めることにより作成したものである。

熱対流用流路１４に食紅液と水を充填し、第１ヒータ３１と第２ヒータ３２とに通電した状態で１Ｇ相当の電圧（図９より２．１２Ｖ）でモータ４０を回転させたところ、熱対流用流路１４内の液体が３０秒間でおおよそ半周した。この結果をＰＣＲの熱サイクルに置き換えると、１分間で１サイクルすることになる。

本実施形態では、熱対流用流路１４内の液体の第２ヒータ３２の加熱部３２ｂの通過時間は約１５秒、第１ヒータ３１の加熱部３１ｂの通過時間は約４５秒である。なお、熱対流生成用チップ１０の回転数を制御して熱対流速度を制御することで、液体の加熱部３２ｂ及び加熱部３１ｂの通過時間をより短くすることも可能である。

β−Action遺伝子を指標に蛍光ＰＣＲを試みた。アンプリコンをテンプレートＤＮＡとして使用し、ＰＣＲ液を熱対流用流路１４に充填後、モータ４０を２．１２Ｖで３０分間回転させた。これは、熱対流用流路１４が１Ｇで回転すると、熱対流用流路１４内の熱対流が１分で１周することから、ＰＣＲを３０サイクル行ったことに相当する。

３０分の回転終了後に熱対流生成用チップ１０の蛍光観察を行ったところ、熱対流用流路１４中にＤＮＡ増幅に伴う蛍光を観察することができた。また、熱対流用流路１４から反応溶液を取り出して電気泳動により増幅産物（ＤＮＡ長：２８９ｂｐ）の確認を行ったところ、目的の長さのＤＮＡが確認された。

以上、本発明の熱対流生成装置１及び熱対流生成用チップ１０を用いて熱対流ＰＣＲを行う場合について説明したが、本発明の熱対流生成装置１及び熱対流生成用チップ１０を用いて逆転写ＰＣＲを行うこともできる。

生物は、ゲノムＤＮＡから、その遺伝配列情報をＲＮＡに転写し、ＲＮＡからその遺伝情報をもとにタンパク質を合成する。ＰＣＲは、ＤＮＡ分子からＤＮＡ分子を増幅させる技術であるが、逆転写ＰＣＲは、逆転写酵素の働きによりＲＮＡからＤＮＡを合成し、そのＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行う技術である。例えば、インフルエンザウイルスなどの一部のウイルスはＤＮＡをもたず、ＲＮＡしかもっていない。このようなウイルスの感染を証明する場合、逆転写ＰＣＲを用いることになる。

本発明の熱対流生成装置１及び熱対流生成用チップ１０を用いて逆転写ＰＣＲを行う手順を以下に説明する。

逆転写ＰＣＲには、逆転写反応とＰＣＲとを別々に行う方法（２ステップＲＴ−ＰＣＲ）と、逆転写反応とＰＣＲとを1液で連続的に行う方法（１ステップＲＴ−ＰＣＲ）とがあり、本実施形態では、１ステップＲＴ−ＰＣＲにより逆転写ＰＣＲを行う手順について説明する。

反応試薬溶液としては、例えば、ライフテクノロジーズジャパン株式会社製のSuperScriptIII OneStep RT-PCR SystemやGeneAmp EZ rTth RNA PCR Kit（いずれも商品名）、タカラバイオ株式会社製のPrimeScriptII High Fidelity One Step RT-PCR KitやPrimescript High Fidelity RT-PCR Kit（いずれも商品名）等を用いることができる。

検体としては、例えば、インフルエンザウィルスやノロウィルス、その他感染症ウィルス全般、細胞等からの発現ＲＮＡの抽出液等が用いられる。インフルエンザウィルスなら、例えば鼻汁等を緩衝液や水等の適当な溶液に懸濁したものが用いられる。また、ノロウィルスなら、例えば嘔吐物等を緩衝液や水等の適当な溶液に懸濁したものが用いられる。

なお、本発明の熱対流生成装置１及び熱対流生成用チップ１０を用いて逆転写ＰＣＲを行う場合、以下の（ａ）、（ｂ）の２つの方法が考えられる。以下、図１〜図４を参照して（ａ）、（ｂ）の２つの方法を説明する。

（ａ）あらかじめ反応試薬溶液と検体液とを混合し、混合溶液を生成する。次に、熱対流生成用チップ１０の液体供給路１５内に混合溶液を注入し、熱対流生成用チップ１０を回転させて混合溶液を熱対流用流路１４内に進入させる。その後、熱対流生成用チップ１０の回転を停止させ、第１ヒータ３１と第２ヒータ３２とを同じ温度（例えば、４０〜６０℃）にして、熱対流用流路１４内の混合溶液を一定時間（例えば、６０秒）加熱して逆転写反応させる。

（ｂ）先ず、熱対流生成用チップ１０の熱対流用流路１４内に反応試薬溶液を充填しておき、その後に液体供給路１５に検体液を注入し、熱対流生成用チップ１０を回転させて液体供給路１５内の検体液を熱対流用流路１４に進入させる。そして、第１ヒータ３１の温度と第２ヒータ３２の温度とを異なる温度にして熱対流用流路１４内の液体を熱対流させて反応試薬溶液と検体液とを混合し、混合溶液を生成する。その後、熱対流生成用チップ１０の回転を停止させ、第１ヒータ３１と第２ヒータ３２とを同じ温度（例えば、４０〜６０℃）にして、熱対流用流路１４内の混合溶液を一定時間（例えば、６０秒）加熱して逆転写反応させる。

上記の（ａ）および（ｂ）のいずれかの方法により、ＲＮＡから逆転写反応により鋳型ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成する。そして、第１ヒータ３１と第２ヒータ３２とをＰＣＲに適した温度（例えば、第１ヒータ３１の温度を６０℃、第２ヒータ３２の温度を９５℃）に設定して熱対流ＰＣＲ反応を生じさせる。

次に、本発明の第３実施形態を説明する。図１０は熱対流生成装置８１の側面図、図１１は第３実施形態の熱対流用流路１４及び液体供給路１５の拡大図、図１２は第３実施形態の制御系のブロック図である。なお、先に説明した第１実施形態と対応する部位には同一の符号を付してあり、重複する説明は省略する。

熱対流生成装置８１は、リアルタイムＰＣＲを実施できるように構成されている。リアルタイムＰＣＲは、鋳型となるＤＮＡの定量を迅速に行うことができる手法である。リアルタイムＰＣＲは、ＰＣＲや逆転写ＰＣＲによるＤＮＡの増幅分をＰＣＲサイクル中にリアルタイムで測定する。

リアルタイムＰＣＲでは、ＰＣＲ増幅産物を蛍光により検出する。蛍光の検出方法には、インターカレーター法とハイブリダイゼーション法とがある。インターカレーター法では、二本鎖ＤＮＡに特異的に挿入して蛍光を発する蛍光色素 (SYBR green I) を用いる。一方、ハイブリダイゼーション法はTagManプローブ法が最も一般的であり、ＤＮＡ配列に特異的なオリゴヌクレオチドに蛍光色素を結合させたプローブを用いる。TagManプローブ法に用いる蛍光色素としては、例えば、ＦＡＭ（Carboxyfluorescein）を挙げることができる。

図１０に示すように、熱対流生成装置８１は、励起光光源９１と、蛍光検出器９２と、検知光光源９３と、検知光検出器９４とを備える。そして、図１１に示すように、本実施形態の熱対流用流路１４の近傍には、検知光光源９３が射出する検知光を反射または散乱させる被検知部９５が設けられている。

図１０に示すように、励起光光源９１は、回転する熱対流生成用チップ１０の熱対流用流路１４に向けて光Ｌ１を照射する。光Ｌ１は熱対流生成用チップ１０の熱対流用流路１４（図１１参照）内の液体に含まれる蛍光色素を励起する光である。励起光光源９１としては、例えば、レーザー光源を用いることができるが、青色発光ダイオード（ＬＥＤ）や白色光源等を用いると、装置コストが安価になるので、好ましい。

蛍光検出器９２は蛍光を検出する。蛍光は熱対流用流路１４内の液体に含まれる蛍光色素に励起光光源９１の光を照射することにより蛍光色素によって放出される。蛍光検出器９２は、例えば、フォトマル検出器、集光レンズ及び蛍光フィルタ等を含んで構成される。

検知光光源９３は、熱対流生成用チップ１０上の検知ポイントＰ１に向けて検知光Ｌ２（例えば、レーザー光）を照射する。検知ポイントＰ１は、熱対流生成用チップ１０が回転することにより被検知部９５（図１１参照）によって形成される回転軌跡上に設定された固定点である。被検知部９５は、検知光光源９３から検知光が照射されると、その検知光を反射または散乱させるように構成されている。検知光検出器９４は、被検知部９５から反射または散乱された光を検出する。検知光検出器９４は、例えば、フォトマル検出器、集光レンズ及びバンドパスフィルタ等を含んで構成される。

図１２は熱対流生成装置８１を制御する制御手段１００のブロック図である。この制御手段１００の演算制御部９６は、第１実施形態の制御手段５０の演算制御部５１が実行する処理に加えて、後で詳述するように、入力部５３、蛍光検出器９２及び検知光検出器９４から入力される情報に基づいて、励起光光源９１及び検知光光源９３を制御する。

次に、熱対流生成装置８１を用いてリアルタイムＰＣＲを行う手順を図１０を参照して説明する。

制御手段１００（図１２参照）の入力部５３を介してリアルタイムＰＣＲの開始を指示する情報を演算制御部９６に入力すると、モータ４０が駆動されるとともに、第１ヒータ３１と第２ヒータ３２とに通電される。これによって、熱対流生成用チップ１０が回転するとともに熱対流用流路１４（図１１参照）内の液体が加熱され、熱対流用流路１４内の液体が熱対流し始めてＰＣＲが開始する。

熱対流生成用チップ１０の回転が開始すると同時に、検知光光源９３から検知光が検知ポイントＰ１に照射される。熱対流生成用チップ１０の熱対流用流路１４に設けた被検知部９５（図１１参照）が検知ポイントＰ１を通過する際に被検知部９５が検知光光源９３の検知光を反射または散乱させる。

被検知部９５によって反射または散乱された検知光が検知光検出器９４によって検出されると、励起光光源９１から励起光が検知ポイントＰ１近傍の熱対流用流路１４に照射される。当該励起光は熱対流用流路１４内の混合溶液に照射され、当該混合溶液中の蛍光分子から発せられる蛍光が蛍光検出器９２によって検出される。

演算制御部９６は、蛍光検出器９２が検出した蛍光に基づいてＤＮＡの増幅量を算出する。そして、この増幅量に基づいて鋳型となるＤＮＡの定量が行われる。このようなリアルタイムＰＣＲが熱対流生成用チップ１０の全ての熱対流用流路１４に対して行われる。

以上、本発明の具体的な実施形態を説明したが、本発明は上記実施形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲で上記実施形態に改変を施すことができる。

例えば、上記実施形態では、熱対流生成用チップ１０とは別に熱源３０を設けるようにしているが、熱対流生成用チップ１０に熱源３０を設けるようにしてもよい。その場合、熱源としては、例えば、占有スペースが小さくて軽量の線状発熱体等を用いることができる。

また、本発明は、熱対流ＰＣＲや逆転写ＰＣＲ以外の処理を行う装置にも適用可能である。

その他にも、本発明の要旨を逸脱しない範囲で上記実施形態に種々の改変を施すことができる。

１ 熱対流生成装置
１０ 熱対流生成用チップ
１４ 熱対流用流路
１５ 液体供給路
１６ ガス排出路
２０ ステージ（チップ装着部）
３０ 熱源
３１ 第１ヒータ
３２ 第２ヒータ
４０ モータ（駆動手段）
５０ 制御手段
６０ ヒートシンク（放熱手段）
９１ 励起光光源
９２ 蛍光検出器
９３ 検知光光源
９４ 検知光検出器
９６ 演算制御部
１００ 制御手段

Claims (12)

1. 液体を加熱又は冷却すると同時に前記液体に遠心力を付与することにより前記液体の熱対流を生じさせる熱対流生成装置に用いられる熱対流生成用チップであって、
   ディスク状基板と、
   前記ディスク状基板における軸線と直交する面内に形成された少なくとも一つの環状の熱対流用流路と、
   を含み、
   前記軸線周りに回転させることにより前記熱対流用流路内の液体に遠心力を付与するようにしたことを特徴とする熱対流生成用チップ。
2. 前記熱対流用流路内に液体を供給するための液体供給路を設け、前記液体供給路は、前記熱対流用流路に対して前記軸線の側に配置されていることを特徴とする請求項１に記載の熱対流生成用チップ。
3. 前記熱対流用流路内の液体中に含まれるガスを受け入れるガス排出路を設けたことを特徴とする請求項１または２に記載の熱対流生成用チップ。
4. 前記熱対流用流路が真円状であることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の熱対流生成用チップ。
5. 前記軸線に対して対称的に配置された複数の前記熱対流用流路を備えることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の熱対流生成用チップ。
6. 熱対流ＰＣＲを行うものであることを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載の熱対流生成用チップ。
7. 液体を加熱又は冷却すると同時に前記液体に遠心力を付与することにより前記液体の熱対流を生じさせる熱対流生成装置であって、
   ディスク状基板と、前記ディスク状基板における軸線と直交する面内に形成された少なくとも一つの環状の熱対流用流路とを含み、前記軸線周りに回転させることにより前記熱対流用流路内の液体に遠心力を付与するようにした熱対流生成用チップを装脱可能なチップ装着部と、
   前記熱対流生成用チップの熱対流用流路の一部を加熱又は冷却する熱源と、
   前記熱対流生成用チップを軸線周りに回転駆動する駆動手段とを含むことを特徴とする熱対流生成装置。
8. 前記熱源による前記熱対流用流路の加熱温度又は冷却温度、前記駆動手段による前記熱対流生成用チップの回転駆動速度及び回転駆動時間を制御する制御手段を備えることを特徴とする請求項７に記載の熱対流生成装置。
9. 前記熱源は、前記熱対流用流路の環状の流れ方向に沿って二箇所に配置される一対のヒータを含み、一方のヒータの温度は２本の１本鎖ＤＮＡを結合させるのに適した温度であり、他方のヒータの温度は２本鎖ＤＮＡを分離させるのに適した温度であることを特徴とする請求項７又は８に記載の熱対流生成装置。
10. 前記一方のヒータを冷却する放熱手段を設けたことを特徴とする請求項９に記載の熱対流生成装置。
11. 熱対流ＰＣＲを行うものであることを特徴とする請求項７から１０のいずれか１項に記載の熱対流生成装置。
12. 前記熱対流用流路内の前記液体に含まれる蛍光色素を励起する励起光を前記熱対流用流路内の前記液体に照射する励起光光源と、
    前記蛍光色素に前記励起光を照射することにより前記蛍光色素によって放出される蛍光を検出する蛍光検出器と、
    前記蛍光検出器によって検出された蛍光に基づいてＤＮＡの増幅量を算出する演算制御部と、
    を含むことを特徴とする請求項１１に記載の熱対流生成装置。
    

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