CN112076806B - 一种针对低浓度液体样本的离心富集微流控芯片 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种针对低浓度液体样本的离心富集微流控芯片，该微流控芯片包含样品储存腔和样品富集微通道，富集微通道尺寸与显微镜视场相近，样品储存腔与富集微通道相连通，离心时富集微通道与圆心距离大于样品储存腔与圆心距离，这样液体样本中的组分依据密度大小排列富集于富集微通道中。
Description
技术领域
本发明涉及微流控技术领域，具体涉及一种针对低浓度液体样本的离心富集微流控芯片、方法及应用。
背景技术
离心技术被广泛应用于各项理化样本富集前处理中，如环境及临床水样中的细胞、浮游物富集。相较于过滤富集，离心依靠目标分离物与液体分散相的密度差，所以避免了与滤膜接触产生吸附的损失，并且操作方便简单，仪器需求成本低廉。但是由于现有离心方法针对低浓度样本、小体积样本离心效果较差，这主要由于传统离心管无法实现微升级别体积的离心，并且当离心沉淀物量低的时候，特别当离心沉淀物无法肉眼可见时，样本损失率将大大增加，降低离心效率。
例如临床检测中的脑脊液微生物检测，面临样品量少、样品中微生物浓度低的问题，离心方法并不能有效富集发现脑脊液中所有的细胞颗粒物，只能通过涂板培养法进行微生物计数鉴定。而微生物培养过程中必须的数小时至数天的孵化培养时间，将严重延误最佳治疗时机。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种针对低浓度样本的离心富集微流控芯片，可将样本中目标离心沉淀物固定富集并可直接运用显微镜观察计数离心沉淀物。有效解决了临床检测中样品量少、样品中微生物浓度低而导致的离心效率低的问题。
为了实现上述目的，本发明一方面提供了一种微流控芯片，所述微流控芯片包括富集微通道，样品储存腔和通孔，所述富集微通道一端为封闭的尖端，另一端与样品储存腔连通，所述通孔与样品储存腔连通。
所述通孔位于远离富集微通道的一端。
所述富集微通道的尖端容积为1pL～100nL。
在另一优选例中，所述尖端的容积为10pL～10nL。
所述尖端的平面投影为一等腰三角形，三角形底边长为30～100um。
在另一优选例中，所述微流控芯片的材质选自但不限于玻璃、PDMS(聚二甲基硅氧烷)、PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)。
所述富集微通道上下通道壁为透明光学镜面。
所述富集微通道的宽度小于等于500um，高度小于等于100um。
在另一优选例中，所述富集微通道的宽度为200um，高度为50um。
所述富集微通道与样品储存腔之间设有平缓过渡通道。
在另一优选例中，所述平缓过渡通道与样品储存腔连接部位为光滑斜面。
在另一优选例中，所述平缓过渡通道与富集微通道高度相同。
所述平缓过渡通道中还设有过滤阵列，用于过滤阻拦液体样品中的固体杂质进入富集微通道。
在另一优选例中，所述过滤阵列的阵列单元呈菱形，间隔20um。
所述样品储存腔为中空立体结构。
在另一优选例中，所述样品储存腔的容积为1mL。
本发明又一方面提供了一种针对低浓度液体样本的离心富集方法，利用了所述的微流控芯片，包括以下步骤：
①在样品储存腔注入液体样品；
②将所述微流控芯片置于离心机内，其中富集微通道的尖端位于远离离心机圆心的位置放置；
③调节离心速度进行离心，离心产物被离心富集到富集微通道的尖端位置。
本发明又一方面提供了微流控芯片的应用，包括临床样本微生物检测或临床样本微生物耐药性评估。
本发明具有以下技术优势：
1.适用于各尺寸微粒，如数十微米的酵母细胞和1微米左右细菌细胞的富集检测。
2.富集通道尺寸与显微镜视场大小接近，可通过显微镜直接观察到离心产物。
3.实现了小体积样本的富集，上样体积为5微升～1毫升。
4.离心富集效率高，富集通道中的离心沉淀物不易发生扩散和移动。
5.操作简便。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1微流控芯片设计示意图；
图2微流控芯片实物图；
图3离心富集后的样品显微镜图像；
图4临床尿液样品的微生物检测及耐药性分析显微图像。
主要附图标记：富集微通道1，样品储存腔2，通孔3，平缓过渡通道4，过滤阵列5。
具体实施方式
本发明提供的一种针对低浓度样本的离心富集微流控芯片，可用于临床、食品、环境样品的颗粒物离心富集，例如用于真核细胞(如动物细胞、植物细胞、真菌细胞等)、原核细胞(如细菌细胞等)、单细胞生物、病毒颗粒、细胞器、生物大分子形成的颗粒、药物颗粒、药物载体颗粒、脂质体、多聚物粒子、其他天然或人工合成颗粒的离心富集。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1微流控芯片的制备：
①利用SU-8光刻法制作出微流控芯片模板。
②在芯片样品储存腔位置再次滴加一定体积SU-8光刻胶，并施加紫外光照固化，形成膨胀隆起的样品储存腔支撑。
③将PDMS倒入微流控芯片模板上，70摄氏度固化反应2小时。
④将PDMS层从模板上揭下切割，通过氧等离子体清洗机与玻璃载玻片键和，完成微流控芯片制备。
图1和图2分别为所制作微流控芯片设计示意图和实物图。
富集微通道1，样品储存腔2和通孔3三部分为连通结构，其中富集微通道1与样品储存腔2通过平缓过渡通道4连通。平缓过渡通道4具有过滤阵列5，过滤阵列5间距小于液体样品中固体杂质物尺寸。通孔3与样品储存腔2通过过渡通道连接，位于微流控芯片上远离富集微通道1尖端的一侧。富集微通道1尺寸与显微镜400倍视场大小接近，宽度小于500微米，高度小于100微米，富集微通道1上下壁为透明光学镜面。本实施例中，富集微通道1的尖端平面投影为等腰三角形，富集微通道1通道宽度与尖端等腰三角形底边同宽。样品储存腔2为中空立体结构，最大容积为1mL，样品储存腔2与平缓过渡通道4内部联通，并且结合部位为光滑斜面。
实施例2样品离心富集：
利用实施例1所制作的微流控芯片进行样品的离心富集，具体步骤为：
①将液体样品通过注射器穿刺注入样品储存腔内；
②微流控芯片置于离心机中，其中富集微通道的尖端位置远离离心机圆心，通孔位置接近圆心；
③依据离心产物与液体密度的差异成端选择适当离心速度进行旋转离心10分钟至30分钟，使离心产物富集固定于富集通道三角形尖端位置。
如图3所示为在显微镜上观察到的富集芯片上样品的图像，离心产物被富集固定于富集通道三角形尖端位置
实施例3临床尿液样品的微生物检测以及微生物耐药性评估：
①取100微升尿液样品与1毫升2倍肉汤培养基混合，加入32微升1mg/mL氨苄溶液。之后步骤与实施例2中步骤相同进行离心富集。
②将芯片至于显微镜下观察，判断样品中是否感染细菌微生物。
③将离心后的芯片至于37摄氏度培养箱中静置培养，每隔半小时观察细菌在抗生素培养环境中的生长复制情况，评估抗生素耐药性，如图4为每隔半小时观察到的图像，图4A、4B、4C、4D、分别为0小时、0.5小时、1小时、1.5小时观察到的细菌生长情况。
以上结合附图详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种用于对液体样本进行离心富集的微流控芯片，其特征在于：所述微流控芯片包括富集微通道，样品储存腔和通孔，所述富集微通道一端为封闭的尖端，另一端与样品储存腔连通，所述通孔与样品储存腔连通；
其中，
所述富集微通道上下通道壁为透明光学镜面；
所述富集微通道的尖端容积为1pL～100nL；
且所述尖端的平面投影为一等腰三角形，三角形底边长为30～100μm；
所述富集微通道的通道宽度与尖端等腰三角形底边同宽；
所述样品储存腔为中空立体结构；
所述富集微通道与样品储存腔之间设有平缓过渡通道；
所述平缓过渡通道中设有过滤阵列，用于过滤阻拦液体样品中的固体杂质进入富集微通道；
其中，所述平缓过渡通道与样品储存腔连接部位为光滑斜面，并且所述平缓过渡通道与富集微通道高度相同。
2.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述过滤阵列的阵列单元呈菱形，间隔20μm。
3.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述样品储存腔的容积为1mL。
4.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述微流控芯片的材质选自玻璃、聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯。
5.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述富集微通道宽度小于等于500μm，高度小于等于100μm。
6.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述富集微通道的宽度为200μm，高度为50μm。
7.一种针对低浓度液体样本的离心富集方法，其特征在于：包括以下步骤：
①采用了如权利要求1-6中任一项所述的微流控芯片，并在所述微流控芯片的样品储存腔注入液体样品；
②将所述微流控芯片置于离心机内，其中富集微通道的尖端位于远离离心机圆心的位置放置；
③调节离心速度进行离心，离心产物被离心富集到富集微通道的尖端位置；
④将离心后的微流控芯片置于显微镜下观察。
8.根据权利要求1-6中任一项所述微流控芯片的应用，包括临床样本微生物检测或临床样本微生物耐药性评估。
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