CN104130932B - 一种基于琼脂糖微流控芯片的细菌富集装置 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于琼脂糖微流控芯片的细菌富集装置及其制作方法，该装置包括贴合的琼脂糖薄层和亲水性薄层，所述琼脂糖薄层为二分树式通道结构，具有多个开放的溶液通道入口和一个用于细胞收集的封闭的通道末端，该装置的制作方法包括两个步骤：(1)包括制作二分树式通道结构的阳膜来制作出琼脂糖薄层；(2)与亲水性薄层基片贴合并且封装从而制作出微流控装置。通过本发明，解决克服现有细菌富集微流控装置效率不高，装置结构复杂的技术问题。

Description

一种基于琼脂糖微流控芯片的细菌富集装置
技术领域
本发明属于病原菌检测领域，更具体地，涉及一种基于琼脂糖微流控芯片的细菌富集装置。
背景技术
微流控芯片实验室是21世纪开拓的一项重要科学技术，微流控芯片或称芯片实验室将一个生物或化学实验系统微缩到一块只有几平方厘米的芯片上，它通过微通道、微阀和微泵等微机电加工结构对样品进行进样、预处理、混合、反应、检测等一系列实验操作过程进行大规模的集成，这种多功能单元高密度集成的微小芯片系统使得样品处理更为简单有效，检测效果显著提高。目前，微流控芯片系统已经应用于包括理论研究、环境监测、疾病诊断、食品安全等与人们生活息息相关的众多行业之中。
微流控系统的创立使得研究者可以对病原菌检测样品进行预处理，特别是对微量样品的处理有着极其重大的意义，对样品含量要求极少，且所消耗的试剂量也在纳升级别，非常利于对贵重的生物疾病样本进行研究，被认为是病原菌快速诊断的一个有效工具。传统的病原菌检测系统包含对含有病原菌的生物样品的预处理和检测两个部分。传统病原菌检测的预处理过程往往包含生物样品的纯化，富集以及病原菌的延长培养，这些步骤往往花费几个小时甚至几天之久。微流控芯片系统的建立大大缩短了该过程的操作时间，减少了操作的劳动成本，提高了效率。生物样品的富集是样品预处理过程中最重要步骤之一，传统方法对病原菌的富集存在一些局限性。首先，传统离心装置只能对较大量的样品进行富集，而且不具有便携性；其次，来自血液，唾液，尿液，汗液的生物样品往往是微量，对微升甚至是纳升样品的富集往往难以进行；最后，对微量样品的操作很难保证样品不会受到污染。相较于传统方式对生物样品进行富集，微流控系统拥有较好的便携性，样品消耗量低，操作简单，集成式的微流控系统消除了操作步骤之间的死体积，更重要的，微流控的富集效果往往好于传统的病原菌富集方式。
研究者们采用不同的方法在微流控芯片中实现了病原菌的富集，Lapizco-Encinas等人(BlancaH.Lapizco-Encinas,RafaelV.Davalos,BlakeA.Simmons,EricB.Cummings,YolandaFintschenko,(2005)Aninsulator-based(electrodeless)dielectrophoreticconcentratorformicrobesinwater,Journalofmicrobiologicalmethods,62,317–326)采用的介电电泳的方法实现了病原菌的富集，类似的，Podszun等人(SusannPodszun,PaulVulto,HeleneHeinz,SydneyHakenberg,CarstenHermann,ThomasHankemeierbandGeraldA.Urban,YolandaFintschenko,(2012)Enrichmentofviablebacteriainamicro-volumebyfree-flowelectrophoresis,LabonaChip,12,451–457)采用了自由流电泳的方式在芯片上实现的病原菌的富集，在芯片中径向流动的生物样品施加一个垂直于流向的电场，细菌由于表面往往带有负电荷会向正极涌动，最终富集在正极端。Zhang等人(JaneYuqianZhang,JaephilDo,W.RanjithPremasiri,LawrenceD.ZieglerandCatherineM.Klapperich,(2010)Rapidpoint-of-careconcentrationofbacteriainadisposablemicrofluidicdeviceusingmeniscusdraggingeffect,LabonaChip,10,3265–3270)通过在微芯片的微通道外加入另外一个微通道，中间用特氟龙薄膜隔开，通过气体的流动对生物样品进行一个蒸发从而实现细菌样品的富集。Lay等人(ChristopheLay,ChengYongTeo,LiangZhu,XueLiPeh,HongMiaoJi,Bi-RongChew,RamanaMurthy,HanHuaFengandWen-TsoLiu(2008)Enhancedmicrofiltrationdevicesconfiguredwithhydrodynamictrappingandaraindropbypassfilteringarchitectureformicrobialcellsdetection,LabonaChip,8,830–833)建立了一种基于微通道中加工微筛的方式，让样品中的溶液流过，对样品中的病原菌进行捕获从而实现对样品中的富集。
但是上述的方式在应用的过程中，会存在一些问题：电动力学的方法存在一些不足，一方面依赖于不同种类病原菌细胞表面所带的电荷，另一方面，单个细胞个体之间表面电荷的差异性也影响了该方法的效率；而采用微筛的方法往往无法将富集后的细菌完美的释放以用于后续的实验，另一方面，随着对菌捕获的越多，通道的水力阻抗也会越大，流速变慢，对样品进样的压力要求也越大，最后失去对样品细菌富集的功能。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种基于琼脂糖微流控芯片的细菌富集装置，其目的在于提供一种结构简单、加工简易、操作简单、细菌富集高效的微流控装置，由此解决克服现有细菌富集微流控装置效率不高，装置结构复杂的技术问题。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种用于细菌富集的微流控装置，其特征在于，该装置包括贴合的琼脂糖薄层和亲水性薄层，所述琼脂糖薄层为二分树式通道结构，该二分树通道结构为一个通道进行二分，分支出的通道再进行二分支，以此二分支的方式设置，每级分支的通道数为2N，其中N为分支的级数，N为大于等于0的整数；所述二分树通道结构的琼脂糖薄层具有2N个开放的溶液通道入口和一个用于细胞收集的封闭的通道末端。
进一步地，每个分支通道的尺寸为：通道宽度为10-200μm，通道高度10-200μm。
进一步地，所述二分树结构中的最末端的分支通道的间距为100-300μm。
进一步地，二分树结构中的每级分支通道过渡部分为斜通道，即由斜通道将二分的子通道和母通道连接。
另外一方面，本发明还公开了一种用于细菌富集的微流控装置的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)琼脂糖薄层的制备
(1-1)用软光刻技术制光刻胶阳模：将SU-8甩于洗净烘干的基底上，前烘，进行光刻，然后进行后烘，后烘之后经显影液显影后，再进行坚膜，即可得到具有二分树式通道微结构的阳模；
(1-2)制作出阳模后，再用快速成型方法将阳模的微结构复制到琼脂糖上：即将琼脂糖粉末加热溶解在水溶液中，然后将琼脂糖溶液倒于阳模上，冷却固化，将固化后的琼脂糖揭起并切边即可得到含有微通道阵列的琼脂糖薄层；
(2)微流控装置的封装
将亲水性薄层贴合在琼脂糖薄层，微通道阵列一端开口以用作该微流控装置的进样口，微通道阵列的另一端封闭以用作微通道的末端，待琼脂糖薄层与亲水性薄层贴合好后于真空泵中抽真空除气，由此制作出微流控装置。
进一步地，所述琼脂糖溶液的浓度优选为0.5％-10％。
本发明还公开了一种用于细菌富集的琼脂糖薄层，其特征在于，该二分树通道结构为一个通道进行二分，分支出的通道再进行二分支，以此二分支的方式设置，每级分支的通道数为2N，其中N为分支的级数，N为大于等于0的整数。
进一步地，所述二分树式通道中每个分支通道的尺寸为：通道宽度为10-200μm，通道高度10-200μm，所述二分树结构中的最末端的分支通道的间距为100-300μm。
本发明还公开了一种制作如上述的琼脂糖薄层的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)用软光刻技术制作SU-8阳模：将SU-8甩于洗净烘干的硅片上，前烘除去SU-8胶中的溶剂之后，进行光刻，然后进行后烘，之后经显影液显影后，再进行坚膜，即可得到具有二分树式通道微结构的阳模；
(2)制作出阳模后，再用快速成型方法将阳模的微结构复制到琼脂糖上：即将琼脂糖粉末加热溶解在水溶液中，然后将琼脂糖溶液倒于阳模上，冷却固化，将固化后的琼脂糖揭起并切边即可得到含有微通道阵列的琼脂糖薄层。
进一步地，所述琼脂糖溶液的浓度优选为0.5％-10％。
为了引入样品溶液，传统方式一般采取在PDMS薄层上打孔后键合载玻片，再在PDMS打孔处连上钢针和塑料管的方式。这种方式容易产生PDMS碎屑从而阻塞微通道；另一方面这种方法需要外界的动力装置包括压力进样装置，水力进样装置和电力进样装置。为避免上述问题，本发明采取一种新式的被动进样方式，利用毛细现象和琼脂糖的亲水性实现了生物样品的持续进样和富集。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，具有如下优点：
(1)提出了一种基于微通道阵列和琼脂糖材料毛细现象的被动式进样，无须外设压力设备，便携性更好，成本更低，操作更简单；
(2)通过毛细现象的不断进样以及末端闭合通道对细菌的收集实现了细菌的富集，最大有107倍的数量级；
(3)基于琼脂糖的微流控芯片相对于广泛应用的PDMS芯片成本要低，更加经济方便；
(4)由于闭合通道的设计以及琼脂糖对细菌和蛋白没有吸附作用使得对细菌的捕获效率极高，最高达到90％以上；
(5)琼脂糖材质作为多孔材质，毛细现象做为进样动力，使该芯片装置不会有类似微滤膜芯片系统堵塞导致水力阻抗上升无法进样的问题。
综上，本发明的装置为病原菌检测的预富集提供了一种新的途径，在疾病诊断、病原菌检测、环境测评等领域具有广泛的应用前景。
附图说明
图1是按照本发明微通道结构中二分树结构的琼脂糖芯片；
图2(a)为按照本发明的琼脂糖微流控装置的加工制作过程中的SU-8阳膜；
图2(b)为按照本发明的琼脂糖微流控装置加工制作过程中的琼脂糖的固化过程；
图2(c)为按照本发明的琼脂糖微流控装置加工制作过程中的琼脂糖层揭下的过程；
图2(d)为按照本发明的琼脂糖微流控装置加工制作过程中的加工完成的琼脂糖芯片薄层；
图2(e)为按照本发明的琼脂糖微流控装置的组装；
图2(f)为按照本发明组装成的琼脂糖微流控装置；
图3(a)为按照本发明的琼脂糖微流控装置在细菌初始浓度分别是107cells/mL时的富集效果图；
图3(b)为按照本发明的琼脂糖微流控装置在细菌初始浓度分别是104cells/mL时的富集效果图；
图3(c)为按照本发明的琼脂糖微流控装置在不同细菌初始浓度下富集效果结果图；
图4为按照本发明的二分树结构琼脂糖微流控装置对不同初始浓度细菌的富集结果图；
图5(a)为按照本发明的琼脂糖微流控装置在初始细菌浓度为8×104cells/mL的样品富集时随时间的变化富集到的细菌的效果图；
图5(b)为按照本发明的琼脂糖微流控装置在初始细菌浓度分别为8×105cells/mL，8×104cells/mL和8×103cells/mL的样品富集动力学变化过程图；
图6为按照本发明的琼脂糖微流控装置分别富集尿液样品和实验样品的动力学过程结果图。
其中1-阳膜2-琼脂糖薄层3-玻璃片基底薄层4-滤纸块5-PDMS薄层
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
其中如图1所示，高效率细菌富集的琼脂糖微流控装置包括琼脂糖薄层，琼脂糖薄层加工成二分树结构的通道，本发明中所指的二分树通道即是在一个主分道的基础上，进行二分，二分出的通道每个通道再进行二分，以此类推的方式来构建二分树通道，该二分树通道结构为一个通道进行二分，分支出的通道再进行二分支，以此二分支的方式设置，每级分支的通道数为2N，其中N为分支的级数，N为大于等于0的整数；其中本实施例中给出了二分树通道的结构构建为64个溶液入口通道关于1个通道末端细菌收集处对称，每个分支通道的尺寸大小：通道宽度为10-200μm，通道高度10-200μm，其中最末端的做为溶液入口通道分支的平行的通道阵列间距在100-300μm之间。作为优化并且为方便工艺上的加工，多个分支的平行的通道分支的过渡部位为斜通道，即由斜通道将二分的子通道和母通道连接，当然该过渡段采用圆弧连接也可，更多的二分式过渡连接形式都可采用，在此不再赘述，并且两分支的通道之间也不必做到平行，有一定程度的间距即可。琼脂糖薄层与玻璃薄层相贴合形成微流控装置，其中玻璃薄层为亲水性薄层，采用其它的亲水性薄层来与琼脂糖薄层贴合也可。琼脂糖薄层与玻璃薄层相贴合后一端开放用于细胞的进样入口，另一端封闭，用于细胞的收集。这种方式与传统的方式相比，不需要外在的动力设备，操作简单，成本较低。同时，琼脂糖较强的亲水性和基于毛细现象的进样方式，使系统不会受到通道堵塞的影响，随着细菌大量富集在芯片通道底端也不会造成水力阻抗的上升，可以持续高效的对细菌进行富集。
其中如图2所示，为该微流控装置的制作过程，其中给出的琼脂糖薄层的制备方法的具体实施方式如下：
实施例1：
1.琼脂糖薄层的制备：首先用软光刻技术制作SU-8阳模。即将SU-8(1070)甩于洗净烘干的硅片上(700r18s,2500r60s)，其中在烘干硅片的过程中可以选择700r-5000r的转速，转速超过8000后对厚度的影响不大，前烘除去SU-8胶中的溶剂之后(65℃15min,95℃2hour)，前烘的目的是使SU-8阳模与硅片更好地贴合，进行光刻(3.5mJ/cm2)，当然光刻采用的掩膜板是根据阳模的形状来设置的，其中光刻的时间为30s-2分钟，光刻的参数范围为1-8.5mJ/cm2，然后置于热平板上进行后烘(65℃15min,95℃40min)，光刻之后需要反应的时间，使阳模与硅片更加贴合，之后经显影液显影后，再进行坚膜(135℃)，其中坚膜的温度范围为100-160℃，坚膜的时间为一小时以上，达到SU-8与硅片的紧密贴合的效果，即可得如图2(a)所示的具微结构的阳模(根据电镜所拍图片，测定其高度约20μm)，其通道具体结构如图1所示的琼脂糖薄层的通道结构的样式。制作出阳模后，再用快速成型方法将阳模的微结构复制到琼脂糖上。即将琼脂糖粉末加热溶解在水溶液中，其中制作出的琼脂糖的浓度为0.5％，然后将琼脂糖溶液倒于阳模上，于4度冰箱冷却固化10分钟得到如图2(b)所示的结构，将固化后的琼脂糖如图2(c)揭起并切边即可得到含有微通道阵列的琼脂糖薄层如图2(d)所示(厚约1cm)。
2.基片的封装如图2(e)-图2(f)所示，将约1cm琼脂糖薄膜通道开口面朝上，将玻璃片基底薄层2或采用其它的亲水性薄层盖合在琼脂糖薄层3之上，微通道阵列一端开口并放置PDMS薄层4以用作该微流控装置的进样口，微通道阵列的另一端封闭滤纸块1以用作微通道的末端。待琼脂糖薄层与盖玻片基片盖合好后于真空泵中抽真空除气。
实施例2：
1.琼脂糖薄层的制备：首先用软光刻技术制作SU-8阳模。即将SU-8(1070)甩于洗净烘干的硅片上(700r18s,2500r60s)，其中在烘干硅片的过程中可以选择700r-5000r的转速，转速超过8000后对厚度的影响不大，前烘除去SU-8胶中的溶剂之后(65℃15min,95℃2hour)，前烘的目的是使SU-8阳模与硅片更好地贴合，进行光刻(3.5mJ/cm2)，当然光刻采用的掩膜板是根据阳模的形状来设置的，其中光刻的时间为30s-2分钟，光刻的参数范围为1-8.5mJ/cm2，然后置于热平板上进行后烘(65℃15min,95℃40min)，光刻之后需要反应的时间，使阳模与硅片更加贴合，之后经显影液显影后，再进行坚膜(135℃)，其中坚膜的温度范围为100-160℃，坚膜的时间为一小时以上，达到SU-8与硅片的紧密贴合的效果，即可得如图2(a)所示的具微结构的阳模(根据电镜所拍图片，测定其高度约20μm)，其通道具体结构如图1所示的琼脂糖薄层的通道结构的样式。制作出阳模后，再用快速成型方法将阳模的微结构复制到琼脂糖上。即将琼脂糖粉末加热溶解在水溶液中，其中制作出的琼脂糖的浓度范围为10％，然后将琼脂糖溶液倒于阳模上，于4度冰箱冷却固化30分钟得到如图2(b)所示的结构，将固化后的琼脂糖如图2(c)揭起并切边即可得到含有微通道阵列的琼脂糖薄层如图2(d)所示(厚约1cm)。
2.基片的封装如图2(e)-图2(f)所示，将约1cm琼脂糖薄膜通道开口面朝上，将玻璃片基底薄层2或采用其它的亲水性薄层盖合在琼脂糖薄层3之上，微通道阵列一端开口并放置PDMS薄层4以用作该微流控装置的进样口，微通道阵列的另一端封闭滤纸块1以用作微通道的末端。待琼脂糖薄层与盖玻片基片盖合好后于真空泵中抽真空除气。
实施例3：
1.琼脂糖薄层的制备：首先用软光刻技术制作SU-8阳模。即将SU-8(1070)甩于洗净烘干的硅片上(700r18s,2500r60s)，其中在烘干硅片的过程中可以选择700r-5000r的转速，转速超过8000后对厚度的影响不大，前烘除去SU-8胶中的溶剂之后(65℃15min,95℃2hour)，前烘的目的是使SU-8阳模与硅片更好地贴合，进行光刻(3.5mJ/cm2)，当然光刻采用的掩膜板是根据阳模的形状来设置的，其中光刻的时间为30s-2分钟，光刻的参数范围为1-8.5mJ/cm2，然后置于热平板上进行后烘(65℃15min,95℃40min)，光刻之后需要反应的时间，使阳模与硅片更加贴合，之后经显影液显影后，再进行坚膜(135℃)，其中坚膜的温度范围为100-160℃，坚膜的时间为一小时以上，达到SU-8与硅片的紧密贴合的效果，即可得如图2(a)所示的具微结构的阳模(根据电镜所拍图片，测定其高度约20μm)，其通道具体结构如图1所示的琼脂糖薄层的通道结构的样式。制作出阳模后，再用快速成型方法将阳模的微结构复制到琼脂糖上。即将琼脂糖粉末加热溶解在水溶液中，其中制作出的琼脂糖的浓度为2％，然后将琼脂糖溶液倒于阳模上，于4度冰箱冷却固化20分钟得到如图2(b)所示的结构，将固化后的琼脂糖如图2(c)揭起并切边即可得到含有微通道阵列的琼脂糖薄层如图2(d)所示(厚约1cm)。
2.基片的封装如图2(e)-图2(f)所示，将约1cm琼脂糖薄膜通道开口面朝上，将玻璃片基底薄层2或采用其它的亲水性薄层盖合在琼脂糖薄层3之上，微通道阵列一端开口并放置PDMS薄层4以用作该微流控装置的进样口，微通道阵列的另一端封闭滤纸块1以用作微通道的末端。待琼脂糖薄层与盖玻片基片盖合好后于真空泵中抽真空除气。
实施例4：
1.琼脂糖薄层的制备：首先用软光刻技术制作SU-8阳模。即将SU-8(1070)甩于洗净烘干的硅片上(700r18s,2500r60s)，其中在烘干硅片的过程中可以选择700r-5000r的转速，转速超过8000后对厚度的影响不大，前烘除去SU-8胶中的溶剂之后(65℃15min,95℃2hour)，前烘的目的是使SU-8阳模与硅片更好地贴合，进行光刻(3.5mJ/cm2)，当然光刻采用的掩膜板是根据阳模的形状来设置的，其中光刻的时间为30s-2分钟，光刻的参数范围为1-8.5mJ/cm2，然后置于热平板上进行后烘(65℃15min,95℃40min)，光刻之后需要反应的时间，使阳模与硅片更加贴合，之后经显影液显影后，再进行坚膜(135℃)，其中坚膜的温度范围为100-160℃，坚膜的时间为一小时以上，达到SU-8与硅片的紧密贴合的效果，即可得如图2(a)所示的具微结构的阳模(根据电镜所拍图片，测定其高度约20μm)，其通道具体结构如图1所示的琼脂糖薄层的通道结构的样式。制作出阳模后，再用快速成型方法将阳模的微结构复制到琼脂糖上。即将琼脂糖粉末加热溶解在水溶液中，其中制作出的琼脂糖的浓度为4％，然后将琼脂糖溶液倒于阳模上，于4度冰箱冷却固化28分钟得到如图2(b)所示的结构，将固化后的琼脂糖如图2(c)揭起并切边即可得到含有微通道阵列的琼脂糖薄层如图2(d)所示(厚约1cm)。
2.基片的封装如图2(e)-图2(f)所示，将约1cm琼脂糖薄膜通道开口面朝上，将玻璃片基底薄层2或采用其它的亲水性薄层盖合在琼脂糖薄层3之上，微通道阵列一端开口并放置PDMS薄层4以用作该微流控装置的进样口，微通道阵列的另一端封闭滤纸块1以用作微通道的末端。待琼脂糖薄层与盖玻片基片盖合好后于真空泵中抽真空除气。
实施例5：
1.琼脂糖薄层的制备：首先用软光刻技术制作SU-8阳模。即将SU-8(1070)甩于洗净烘干的硅片上(700r18s,2500r60s)，其中在烘干硅片的过程中可以选择700r-5000r的转速，转速超过8000后对厚度的影响不大，前烘除去SU-8胶中的溶剂之后(65℃15min,95℃2hour)，前烘的目的是使SU-8阳模与硅片更好地贴合，进行光刻(3.5mJ/cm2)，当然光刻采用的掩膜板是根据阳模的形状来设置的，其中光刻的时间为30s-2分钟，光刻的参数范围为1-8.5mJ/cm2，然后置于热平板上进行后烘(65℃15min,95℃40min)，光刻之后需要反应的时间，使阳模与硅片更加贴合，之后经显影液显影后，再进行坚膜(135℃)，其中坚膜的温度范围为100-160℃，坚膜的时间为一小时以上，达到SU-8与硅片的紧密贴合的效果，即可得如图2(a)所示的具微结构的阳模(根据电镜所拍图片，测定其高度约20μm)，其通道具体结构如图1所示的琼脂糖薄层的通道结构的样式。制作出阳模后，再用快速成型方法将阳模的微结构复制到琼脂糖上。即将琼脂糖粉末加热溶解在水溶液中，其中制作出的琼脂糖的浓度为8％，然后将琼脂糖溶液倒于阳模上，于4度冰箱冷却固化15分钟得到如图2(b)所示的结构，将固化后的琼脂糖如图2(c)揭起并切边即可得到含有微通道阵列的琼脂糖薄层如图2(d)所示。
2.基片的封装如图2(e)-图2(f)所示，将约1cm琼脂糖薄膜通道开口面朝上，将玻璃片基底薄层2或采用其它的亲水性薄层盖合在琼脂糖薄层3之上，微通道阵列一端开口并放置PDMS薄层4以用作该微流控装置的进样口，微通道阵列的另一端封闭滤纸块1以用作微通道的末端。待琼脂糖薄层与盖玻片基片盖合好后于真空泵中抽真空除气。
琼脂糖微流控装置的细菌富集实验：
高效率细菌富集的琼脂糖微流控装置组装完成后，我们先用带有荧光的大肠杆菌株系E.coliOP-50作为初步评价细菌富集装置细菌富集效果。在不同的细菌密度的样品下，将生物样品滴加在微通道阵列的入口处，以33nL作为最终富集体积，初始体积为100μL，用最终荧光比上初始荧光，得到细菌富集的捕获效率，其捕获效率见图3(a)-图3(b)所示，分别是107cells/mL时的富集效果图与细菌初始浓度分别是104cells/mL时的富集效果图，而其中图3(c)表示在不同细菌初始浓度下富集效果结果图。
为研究高效率细菌富集的琼脂糖微流控装置对细菌富集的倍数，我们将109cells/mL的有荧光的大肠杆菌株系E.coliOP-50分别稀释100倍，10000倍，1000000倍，分别将三种不同浓度细菌悬浮液滴加在琼脂糖微通道阵列入口端，待富集过程完成之后，用100倍油镜观察并计数微通道末端所收集的细菌数目，通过通道末端细菌数目和通道末端体积计算出富集后的细菌浓度，得到结果，目标细菌最大富集了107倍。
为进一步研究细菌高倍数富集下的捕获效率，我们将400μL的103cells/mL的有荧光的大肠杆菌株系E.coliOP-50细菌悬浮液滴加在琼脂糖芯片微通道阵列的入口处，待富集完成后，计算在0.4nL的末端通道收集处的荧光强度，用富集后的荧光强度比上初始荧光强度，得到在106倍富集倍数下的样品细菌捕获效率，其效率如图4所示。
为进一步研究高效率细菌富集的琼脂糖微流控装置细菌富集下的动力学，我们将不同浓度的有荧光的大肠杆菌株系E.coliOP-50细菌悬浮液滴加在琼脂糖芯片微通道阵列的入口处，在整个富集过程中，监控了末端通道收集处的荧光强度变化动力学，其过程如图5(a)结果如图5(b)所示。
为进一步研究高效率细菌富集的琼脂糖微流控装置对尿液样品的富集效果，我们将细菌悬浮液分别用缓冲液和尿液稀释至8*104cell/mL浓度，在整个富集过程中，我们监控的末端通道收集处的荧光强度变化动力学，比较两者之间的差异，其结果如图6所示。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种用于细菌富集的微流控装置，其特征在于，该装置包括贴合的琼脂糖薄层和亲水性薄层，所述琼脂糖薄层为二分树式通道结构，所述二分树式通道结构为一个通道进行二分，分支出的通道再进行二分支，以此二分支的方式设置，每级分支的通道数为2N，其中N为分支的级数，N为大于等于0的整数；所述二分树式通道结构的琼脂糖薄层具有2N个开放的溶液通道入口和一个用于细胞收集的封闭的通道末端，所述二分树式通道结构中的每级分支通道过渡部分为斜通道，即由斜通道将二分的子通道和母通道连接。
2.如权利要求1中所述的用于细菌富集的微流控装置，其特征在于，每个分支通道的尺寸为：通道宽度为10-200μm，通道高度10-200μm。
3.如权利要求1-2中任意一项所述的用于细菌富集的微流控装置，其特征在于，所述二分树式通道结构中的最末端的分支通道的间距为100-300μm。
4.一种用于细菌富集的微流控装置的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)琼脂糖薄层的制备
(1-1)用软光刻技术制光刻胶阳模：将SU-8甩于洗净烘干的基底上，前烘，进行光刻，然后进行后烘，后烘之后经显影液显影后，再进行坚膜，即可得到具有二分树式通道结构的阳模；
(1-2)制作出所述阳模后，再用快速成型方法将所述阳模的结构复制到琼脂糖上：即将琼脂糖粉末加热溶解在水溶液中，然后将琼脂糖溶液倒于所述阳模上，冷却固化，将固化后的琼脂糖揭起并切边即可得到含有所述二分树式通道结构的琼脂糖薄层；
(2)微流控装置的封装
将亲水性薄层贴合在琼脂糖薄层，所述二分树式通道结构一端开口以用作所述微流控装置的进样口，所述二分树式通道结构的另一端封闭以用作所述微流控装置的末端，待琼脂糖薄层与亲水性薄层贴合好后于真空泵中抽真空除气，由此制作出所述微流控装置，其中，所述二分树式通道结构为一个通道进行二分，分支出的通道再进行二分支，以此二分支的方式设置，每级分支的通道数为2N，其中N为分支的级数，N为大于等于0的整数。
5.如权利要求4所述的用于细菌富集的微流控装置的制备方法，其特征在于，所述琼脂糖溶液的浓度为0.5％-10％。
6.一种用于细菌富集的琼脂糖薄层，其特征在于，该薄层为二分树式通道结构，该二分树式通道结构为一个通道进行二分，分支出的通道再进行二分支，以此二分支的方式设置，每级分支的通道数为2N，其中N为分支的级数，N为大于等于0的整数。
7.如权利要求6所述的琼脂糖薄层，其特征在于，所述二分树式通道结构中每个分支通道的尺寸为：通道宽度为10-200μm，通道高度10-200μm，所述二分树式通道结构中的最末端的分支通道的间距为100-300μm。
8.一种制作如权利要求6或7中所述的琼脂糖薄层的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)用软光刻技术制作SU-8阳模：将SU-8甩于洗净烘干的硅片上，前烘除去SU-8胶中的溶剂之后，进行光刻，然后进行后烘，之后经显影液显影后，再进行坚膜，即可得到具有所述二分树式通道结构的阳模；
(2)制作出阳模后，再用快速成型方法将阳模的结构复制到琼脂糖上：即将琼脂糖粉末加热溶解在水溶液中，然后将琼脂糖溶液倒于阳模上，冷却固化，将固化后的琼脂糖揭起并切边即可得到含有所述二分树式通道结构的琼脂糖薄层。
9.如权利要求8所述的琼脂糖薄层的制作方法，其特征在于，所述琼脂糖溶液的浓度为0.5％-10％。
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