CN107674820B - 一种分选细胞的微流控器件及其使用方法 - Google Patents

一种分选细胞的微流控器件及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种分选细胞的微流控器件及其使用方法,该器件在流路内设置波形延伸的预聚焦流道,通过微流体粘弹性效应和惯性效应的作用,将样品溶液中的细胞微粒逐渐汇集至流路中心,再经过圆弧形分岔流道和样品分选流道,使细胞微粒受到壁面诱导惯性升力和粘弹性流体诱导的弹性力的共同作用而被推离壁面,不同尺寸的细胞受到的推力不同,从而使不同尺寸的细胞在样品分选流道中迁移时累计产生足够的距离差,最终达到分离收集的效果。该器件采用的微流控管路体积小、成本低,无需外场发生装置,分选精度高且对细胞不会产生损伤。其使用方法仅需样品溶液以特定的初始流量注入样品入口即可实现不同尺寸细胞的分选,操作简单,使用方便。

Description

一种分选细胞的微流控器件及其使用方法
技术领域
本发明涉及一种细胞分选器件,具体的说,涉及一种利用微流控技术实现不同尺寸细胞精确、被动分选的器件。
背景技术
对不同细胞进行精确分选是目前医学、生化实验室中非常重要的样品预处理步骤。例如,血液中稀有循环肿瘤细胞的精确分选可为癌症转移机制的研究及癌症微转移的临床监测提供重要液体活检标本。传统的细胞分选方法包括:基于密度差异的密度梯度离心法;基于尺寸和变形性差异的微孔隙过滤及基于特异性抗体的免疫捕捉法。密度梯度离心法利用在高速离心状态下沉降速率差异来实现不同细胞的分层悬浮,但高速离心对于硬件设备和技术人员的操作水平具有较高要求,且会对细胞产生不可逆的损伤。微孔隙过滤利用特定尺寸微孔膜阻隔尺寸大于孔径的细胞或者相同尺寸但变形性较小的细胞通过,从而实现阀值尺寸之上和阀值尺寸之下细胞的分离,但不可避免的存在因堵塞而造成的分离效率降低问题。免疫捕获技术可根据特异性抗体来捕获表达不同标记物的细胞,但此方法试剂成本高、操作复杂且较难回收获得活体细胞样本。
微流控技术作为近年来新出现的微纳尺度操控方法,因其所需样品量少、操控精确性高等众多优点而被广泛用于细胞的排列、捕捉、输运、混合、分选及检测等功能。对于微流控分选器件,按其实现原理可分为主动式和被动式两大类。主动式采用电、声、磁及光等外场作用力根据介电特性、尺寸及磁性来实现不同特性细胞的精确分选,此类技术具有较高的细胞分选精度,但需要借助耗能的外场发生装置阻碍该类技术推广应用于未来微型化医疗仪器。被动分选方法利用特殊结构微通道诱导产生的微流体效应或细胞与微结构之间的相互作用来实现细胞分选,分选的依据往往是细胞的尺寸和变形性。该类方法一般不需要外部辅助单元即可实现细胞高通量分选,但分选精度较主动式低。因此,开发具有较高分选精度的被动微流控器件在细胞分选应用领域具有非常重要的意义。
发明内容
发明目的:为克服现有技术的缺陷,本发明提供一种分选细胞的微流控器件,该器件依据细胞尺寸的差异实现对细胞的高精度、被动分选。
本发明的另一目的在于提供一种分选细胞的微流控器件的使用方法,以方便使用该分选细胞的微流控器件。
技术方案:本发明所述的一种分选细胞的微流控器件,包括供样品溶液依序流过的预聚焦流道、圆弧形分岔流道以及两条样品分选收集流道;所述预聚焦流道沿周期性波形延伸;所述圆弧形分岔流道的进液口位于圆弧外侧,位于圆弧两端的出液口分别与所述两条样品分选收集流道一一对应连接;所述样品分选收集流道为一进二出的Y型结构,包括样品分选流道、第一收集岔道和第二收集岔道;所述样品分选流道与对应连接的圆弧形分岔流道的出液口同向延伸,用于将样品溶液中不同尺寸的细胞微粒分离;所述第一收集岔道和第二收集岔道分别用于收集分离后的不同尺寸的细胞微粒。
其中,该分选细胞的微流控器件还设有样品入口、若干第一样品出口和若干第二样品出口;所述样品入口连接所述预聚焦流道,第一样品出口连接第一收集岔道,第二样品出口连接第二收集岔道。样品入口用于注入样品溶液,第一样品出口和第二样品出口用于导出分选后的细胞样品。
对应于上述设备,本发明同样提供了一种分选细胞的微流控器件的使用方法的技术方案,以能够实现对上述设备的使用,如下:
首先在待分选细胞样品液中添加粘弹性增强剂配制成样品溶液,然后将配制的样品溶液以稳定的流量导入样品入口,样品溶液流经预聚焦流道、圆弧形分岔流道以及两条样品分选收集流道后,再分别通过第一样品出口以及第二样品出口导出分离后的不同尺寸细胞微粒样品。
本发明工作原理:将样品溶液由样品入口以特定的流量导入,在预聚焦流道中大小尺寸细胞都将受到微流体粘弹性效应和惯性效应的作用,其中,惯性力在相对较高流速下存在,在纯粘弹性效应主导下位于流道截面四壁的细胞也会在惯性力作用下被推至中心位置,在靠近预聚焦流道末端被聚焦至流道中心的单个平衡位置。样品溶液进入圆弧形分岔流道,细胞撞击位于流道圆弧顶点的内圆弧壁面并分成两束,因为该段流道为圆弧形,细胞会紧贴着内圆弧壁面继续迁移。进入两条样品分选收集流道中,在样品分选流道中初始非常靠近壁面的细胞将在壁面诱导惯性升力FW和粘弹性流体诱导的弹性力FE作用下被推离壁面。而细胞受到的这两个作用力均正比于细胞尺寸。因此,大细胞具有较大的离开壁面速率,并在通过两条样品分选流道时累计产生足够的距离差,从而使得大小尺寸细胞得到有效分离。然后再通过末端的分岔结构来实现不同尺寸细胞的分流,离壁面近的小尺寸细胞将经位于中间的两条第一收集岔道,并从第一样品出口汇合导出;离壁面远的大尺寸细胞将分别由靠外侧的两条第二收集岔道和第二样品出口导出收集。
有益效果:本发明所述的分选细胞的微流控器件,通过设置在微流控流路内的预聚焦流道将细胞微粒汇聚至流道中心的平衡位置,再通过圆弧形分岔流道将细胞微粒分成两束,在样品分选收集流道中经过壁面诱导惯性升力FW和粘弹性流体诱导的弹性力FE作用,实现了不同尺寸的细胞微粒的被动分流并导出收集。该器件采用微流控管路体积小、成本低,无需任何外场发生装置,分选精度高且对细胞微粒不会产生损伤。所述的使用方法,仅需提供样品溶液以特定的初始流量注入样品入口即可实现不同尺寸细胞的分选,操作简单,使用方便。
附图说明
图1是流道单元为正反半圆弧形结构的分选细胞的微流控器件结构示意图;
图2是流道单元为方波形结构的分选细胞的微流控器件结构示意图;
图3是不同尺寸细胞的分选原理示意图;
图4是流路内10μm和20μm的细胞微粒的明场堆叠聚焦图谱;
图5是方波形预聚焦流道在不同流量下的明场堆叠聚焦图谱;
图6是样品出口区域流路内10μm和20μm的细胞微粒在不同流速下的分布图谱。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的可实现方式做进一步详细说明。
为了能够在无需外场介入的情况下,实现对细胞的高精度、被动式分选,本发明提出了一种分选细胞的微流控器件的技术方案。
如图1,该器件包括样品入口1、与样品入口1连通的预聚焦流道2、与预聚焦流道2连通的圆弧形分岔流道3、分别连通在圆弧形分岔流道3的两端出液口的两条样品分选收集流道4、第一样品出口5以及两个第二样品出口6。其中,预聚焦流道2用于将样品溶液中的细胞微粒逐渐汇聚到流路中心,细胞微粒在流道中受到微流体粘弹性效应和惯性效应的双重作用,会逐渐向流路中心偏移,在预聚焦流道2的末端汇聚到流路中心的单一平衡位置。而为了达到这一效果,预聚焦流道2整体以周期性波形结构延伸,预聚焦流道2包括依次连接的若干个流道单元21,流道单元21为单个周期的波形曲线结构,实施时,流道单元21可以为S型结构,由正反两个半圆弧形流道连接形成。流道单元21可以为一个或者多个,其数量决定了整个预聚焦流道2到的长度,可以根据不同的样品溶液确定整条预聚焦流道2需要多少个流道单元21。
如图2,另一种实施方式,预聚焦流道2呈方波形延伸,同样也能实现样品溶液中的细胞微粒向流路中心汇聚的效果。另外,在实施时,根据其原理还可以将预聚焦流道2制作成正弦波形、三角波形延伸的流道结构,亦或者,预聚焦流道2的每个流道单元21采用不同的结构组合。只要能满足在周期性波形结构的流道中微粒受到的微流体粘弹性效应和惯性效应,亦即受到Dean拽力和惯性升力来实现细胞的聚焦排列,使细胞逐渐移动到受力平衡的流道中心的位置,即可。
如图3,预聚焦流道2末端与圆弧形分岔流道3连通,其连接点位于圆弧形分岔流道3的圆弧外侧,使细胞微粒碰触圆弧壁面后分成两束,并紧贴圆弧壁面向两侧移动。为了使细胞微粒尽可能贴近圆弧内侧壁面,圆弧形分岔流道3可设置成半圆弧形结构的分岔流道,而预聚焦流道2与圆弧形分岔流道的连接点位于其半圆弧顶点处。实施时,可以选择将预聚焦流道2和圆弧形分岔流道3之间连通一小段直流道,使整条流路设置在长度方向延伸,从而缩小该器件的宽度。
经过预聚焦流道2的作用后,细胞微粒已汇聚到流路中心,细胞会撞击圆弧形分岔流道3的内圆弧壁面分成两束,并且紧贴着内圆弧壁面迁移至两条样品分选收集流道4。样品分选收集流道4为Y型的一进二出式分岔结构,包括样品分选流道41、第一收集岔道42和第二收集岔道43;而两条样品分选流道41与圆弧形分岔流道3两端的两个出液口同向延伸,从而使初始非常靠近壁面的细胞进入样品分选流道41后,在壁面诱导惯性升力FW和粘弹性流体诱导的弹性力FE作用下被推离壁面,而细胞受到的这两个作用力均正比于细胞尺寸,所以尺寸更大的细胞离开壁面的速率更大,从而使大尺寸细胞与小尺寸细胞在两条样品分选流道41中会逐渐产生足够的距离差。因为,随着样品溶液的流动,不同尺寸的细胞距离逐渐增大,所以实施时,可以将进液流道41设置成直流道411和渐扩流道412两段,渐扩流道412沿样品溶液的流动方向逐渐扩大,样品溶液中的细胞微粒经过直流道412逐渐分离,细胞间距离逐渐扩大,进入渐扩流道412后进一步增大距离差,然后再通过位于渐扩流道412末端的分岔结构来实现不同尺寸细胞的分流。两条第一收集岔道42设置于两条第二收集岔道43之间,即为分岔结构的内侧,根据其工作原理,不同尺寸的细胞微粒在Y型分岔流道4的分岔口会分别流向不同的流道,从而第一收集岔道42会收集尺寸相对较小的细胞,第二收集岔道43会收集大尺寸细胞,第一收集岔道42和第二收集岔道43的分叉比例可以等分也可以非等分,可以根据待分选细胞的尺寸情况进行选择。最后,靠内侧的两条第一收集岔道42汇合后连通第一样品出口5,通过第一样品出口5导出小尺寸细胞样品,靠外侧的两条第二收集岔道43分别连通靠外侧的两个第二样品出口6,通过第二样品出口6导出大尺寸细胞微粒。
对应于上述设备,本发明同样提供了一种分选细胞的微流控器件的使用方法的技术方案,以能够实现对上述设备的使用,如下:
首先在待分选细胞样品液中添加粘弹性增强剂配制成样品溶液,其中,添加的粘弹性增强剂为高分子类的聚乙烯吡咯烷酮、聚环氧乙烷、λ-DNA以及透明质酸纳等粘弹性增强剂中的一种或多种,上述粘弹性增强剂均为生物兼容性材料,不会对细胞活性产生影响,且均为容易联想到的常见粘弹性增强剂,同时,控制粘弹性增强剂占样品溶液的质量百分比浓度≤30%;然后通过医用注射泵、微型样品进样装置或者手推注射器等工具将配制的样品溶液以稳定的流量导入样品入口1,样品溶液流经预聚焦流道2、圆弧形分岔流道3以及两条样品分选收集流道4后,通过第一样品出口5导出小尺寸细胞样品,通过第二样品出口6导出大尺寸细胞样品。
采用上述操作方法对本发明所述的分选细胞的微流控器件进行测试,如图4,当注入流量为50μL/min时,在圆弧形分岔流道3区域10微米和20微米聚苯乙烯粒子的明场堆叠聚焦图谱,本例中为100张以上实验照片垂直堆叠形成的复合图谱,粘弹性溶液选为0.1%质量比的透明质酸纳水溶液。测试结果表明两种不同尺寸聚苯乙烯粒子均被聚焦于流道中心位置形成规则粒子排列束。
如图5,对方波形预聚焦流道的测试结果,粘弹性溶液选为8%质量比的聚乙烯吡咯烷酮水溶液。分别采用注入流量10μL/min、30μL/min、50μL/min和70μL/min,测试结果表明四种情况下,不同尺寸的聚苯乙烯粒子同样均被聚焦于流道中心位置形成规则粒子排列束。
另外,采用聚乙烯吡咯烷酮和λ-DNA作为粘弹性增强剂,控制质量百分比浓度为30%,配置样品溶液。如图6,分别采用注入流量50μL/min、100μL/min、150μL/min和200μL/min四种情况下10微米和20微米粒子聚焦分布图谱。该测试结果表明两种尺寸粒子在50μL/min时具有最佳的分选效果,能够获得粒子的纯度接近100%,在其他三种流量下粒子的分选获得粒子的纯度也均大于90%。

Claims (6)

1.一种分选细胞的微流控器件,其特征在于:包括供样品溶液依序流过的预聚焦流道(2)、圆弧形分岔流道(3)以及两条样品分选收集流道(4);所述预聚焦流道(2)沿正弦波形、方波形、三角波形中的任一周期性波形延伸;所述圆弧形分岔流道(3)的进液口位于圆弧外侧,位于圆弧两端的出液口分别与所述两条样品分选收集流道(4)一一对应连接;所述样品分选收集流道(4)为一进二出的Y型结构,包括样品分选流道(41)、第一收集岔道(42)和第二收集岔道(43);所述样品分选流道(41)与对应连接的圆弧形分岔流道(3)的出液口同向延伸,用于将样品溶液中不同尺寸的细胞微粒分离;所述第一收集岔道(42)和第二收集岔道(43)分别用于收集分离后的不同尺寸的细胞微粒;
所述样品分选流道(41)包括依次连接的直流道(411)和渐扩流道(412),所述渐扩流道(412)沿样品溶液流动方向逐渐扩大。
2.根据权利要求1所述的分选细胞的微流控器件,其特征在于:所述圆弧形分岔流道(3)为半圆弧形结构,圆弧形分岔流道(3)的进液口位于半圆弧的顶点处。
3.根据权利要求1所述的分选细胞的微流控器件,其特征在于:还设有样品入口(1)、若干第一样品出口(5)和若干第二样品出口(6);所述样品入口(1)连接所述预聚焦流道(2),第一样品出口(5)连接第一收集岔道(42),第二样品出口(6)连接第二收集岔道(43)。
4.一种根据权利要求1~3任一项所述的分选细胞的微流控器件的使用方法,其特征在于:首先在待分选细胞样品液中添加粘弹性增强剂配制成样品溶液,然后将配制的样品溶液以稳定的流量导入样品入口(1),样品溶液流经预聚焦流道(2)、圆弧形分岔流道(3)以及两条样品分选收集流道(4)后,再分别通过第一样品出口(5)以及第二样品出口(6)导出分离后的不同尺寸细胞微粒样品。
5.根据权利要求4所述的分选细胞的微流控器件的使用方法,其特征在于:所述粘弹性增强剂为聚乙烯吡咯烷酮、聚环氧乙烷、λ-DNA和透明质酸纳中的一种或多种。
6.根据权利要求4所述的分选细胞的微流控器件的使用方法,其特征在于:添加的粘弹性增强剂占样品溶液的质量百分比浓度≤30%。
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