CN103261436B - 利用微流体截留涡流从异质溶液中分离细胞的方法 - Google Patents

利用微流体截留涡流从异质溶液中分离细胞的方法 Download PDF

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Abstract

一种分离细胞的方法，包括提供具有至少一个微流体通道的微流体装置，该至少一个微流体通道连接至入口和出口，该至少一个微流体通道包括沿着其长度设置的至少一个扩展区。该至少一个扩展区是该至少一个微流体通道的横截面尺寸的突然增加，设置该至少一个微流体通道以响应于流体流动在该至少一个扩展区内产生涡流。包含至少其中一些具有≥10μm的直径的细胞群的溶液流入入口。部分细胞被截留在该至少一个扩展区内产生的涡流中。然后，截留细胞可以从扩展区释放。

Description

利用微流体截留涡流从异质溶液中分离细胞的方法
相关申请 
本申请要求于2010年9月14日提交的美国临时专利申请号61/382,840的优先权。根据35U.S.C.§119要求优先权。上述专利申请通过引用合并，如同完全在本文中给出的。 
技术领域
本发明的领域通常涉及用于分离和分选细胞或颗粒的微流体装置。更具体地，本发明的领域涉及微流体装置和方法，其采用微流体截留涡流从异质溶液(heterogeneous solution)中分离细胞或颗粒。 
背景技术
在生命科学实验室中标准台式离心机是最常见的仪器之一，其在细胞生物学研究和医疗诊断中广泛用于样品制备。典型的样品制备过程需要用于细胞标记和洗涤的多个离心步骤，对于诊断和研究而言其可以是耗时、费力、和昂贵的过程。事实上，当测定本身已广泛微型化和自动化的同时，已将这些测定所需要的样品制备确定为未来自动化的关键目标。 
离心机进行以下三个关键的样品制备步骤，其使得它们如此广泛地使用：(i)通过尺寸/密度分离细胞，(ii)细胞浓缩，以及(iii)溶液置换。由于离心机可以进行这样的不同功能，所以在微型化平台中实现这些功能一直充满挑战。微型化微流体方式常成功地实施这些功能中的一种或两种。例如，通过利用物理屏障(obstacle)、外力、或流体力将颗粒引导到在不同出口处用于收集的微通道中的限定位置，已进行了利用尺寸和密度的细胞分离。虽然这些方法可以提供高分辨率的细胞分离，但典型的经收集的液体体积类似于注入的液体体积，即，没有实现显著的浓缩。这种较大的输出体积可以阻碍下游细胞检测平台，其可能需要扫描较大的视场以观测关注的细胞，或如果必须溶解经收集的细胞，导致关注的生物分子的 稀释。因此，必须连同分离系统一起在线使用浓缩方法以减小用于快速检测和分析的液体体积。 
存在各种技术，用于借助于微流体系统在局部区域中浓缩颗粒和细胞。其中，机械截留（mechanical trap）是最常用的方法，其将颗粒和细胞固定至物理结构并且能够多步灌注试剂以在芯片上（on-chip）经由溶液置换来进行细胞检测。然而，通常可以重要的是，根据需要释放颗粒和细胞以供进一步的下游分析。虽然在浓缩和释放方面是成功的，但是当在较高的体积通量下操作时，固定在这些截留和释放（trap-and-release）系统中的细胞可以挤出截留并损坏，从而限制浓缩系数低于浓缩稀有细胞或细胞稀释液所需要的浓缩系数。因此，尚未得到通用的微型化工具，其涵盖常规离心机的所有功能和适用性。 
在微流体结构内涡流的形成已用于聚焦和过滤增强。例如，Park等（Jae-Sung et al.,Continuous focusing of microparticles using inertial lift force and vorticity via multi-orifice multi-orifice microfluidic channels,Lab Chip,9,939-948(2009)）披露了一种在实验中使用的微流体装置，其集中刚性微颗粒，利用一系列突然扩展和收缩的通道。在特定流速下，在扩展通道内形成涡流。如管收缩效应一样，在扩展通道内形成的涡流致使横向颗粒移动。通过沿着微通道的长度，具有一系列这些扩展通道，刚性微颗粒能够逐步移动（即，集中）到微通道的相反侧。然而，重要的是，扩展通道并不捕获颗粒。相反，Park等披露了一种结构，其持续集中通过装置的微颗粒。在Park等中，使小直径（7μm直径）的聚苯乙烯微球通过多孔微通道并且没有观测到这些颗粒的截留。Park等进一步观测到，较大尺寸的颗粒倾向于远离其中形成涡流的扩展通道区。Park等还披露了，在样品中的颗粒应类似于刚性球，以获得惯性升力的最大值，这显然违背了其用于活细胞，基于这些活细胞的性质，它们通常是可变形的。结构上，Park等披露了相当小尺寸的扩展通道，相对于上游收缩通道，其向外扩展约80μm的距离。另外，扩展通道的长度也较小，公开为200μm。 
美国专利申请号2008/0318324（Chiu等）披露了用于癌细胞的高通量筛查的生物芯片。该装置使用流出过滤以从体液样品中分离肿瘤细胞。流出过滤是指过滤结构，其中通过过滤介质或在流动通道内的任何形态特征分散或重新分配流体。在Chiu等中，过滤介质是宽度小于细胞的宽度的侧壁孔。在一种实施方式中，Chiu等披露了一维通道，其具有扩展和收 缩点以放慢或加快流动。Chiu等披露了在高流速下，可以分离流体以形成内部微涡流，其有助于过滤操作（通过改变流体动力学）。然而，微涡流并不捕获通过该装置的细胞。而是，通过防止较大尺寸的细胞从其中通过，将通道分成段（line section）的孔保留较大尺寸细胞。尽管披露了产生用于集中或过滤辅助目的的涡流，但这些结构并没有用于选择性地捕获其中的细胞。 
发明内容
在本发明的一种实施方式中，分离细胞的方法包括提供具有至少一个微流体通道的微流体装置，该至少一个微流体通道连接至入口和出口，该至少一个微流体通道包括沿着其长度设置的至少一个扩展区，该至少一个扩展区包括该至少一个微流体通道的横截面尺寸的突然增加，设置该至少一个微流体通道以响应于流体流动在该至少一个扩展区内产生涡流。使包含细胞群的溶液流入入口。至少一些细胞被截留在该至少一个扩展区内产生的涡流中，该至少一些细胞具有≥10μm的直径。通过降低溶液通过该至少一个微流体通道的流速，使截留细胞从多个扩展区释放。 
在本发明的另一种实施方式中，置换经分离的细胞周围的溶液的方法包括提供具有至少一个微流体通道的微流体装置，该至少一个微流体通道连接至入口和出口，该至少一个微流体通道包括沿着其长度设置的至少一个扩展区，该至少一个扩展区包括该至少一个微流体通道的横截面尺寸的突然增加，设置该至少一个微流体通道以响应于流体流动在该至少一个扩展区内产生涡流。使包含细胞群的第一溶液流入入口。至少部分细胞被截留在该至少一个扩展区内产生的涡流中。然后使不同于第一溶液的一种或多种溶液流入入口，同时持续保持该涡流包含截留细胞。 
在本发明的另一种实施方式中，通过尺寸截留颗粒或细胞的方法包括提供具有至少一个微流体通道的微流体装置，该至少一个微流体通道连接至入口和出口，该至少一个微流体通道包括沿着其长度设置的至少一个扩展区，该至少一个扩展区包括该至少一个微流体通道的横截面尺寸的突然增加，设置该至少一个微流体通道以响应于流体流动在该至少一个扩展区内产生涡流。使包含多种细胞或颗粒的溶液流入入口。至少一些细胞或颗粒被截留在该至少一个扩展区内产生的涡流中，其中尺寸高于阈值的细胞 或颗粒基本截留在涡流内，并且其中尺寸低于阈值的细胞或颗粒基本通过涡流。 
在本发明的另一种实施方式中，微流体装置包括基片（基板，substrate），该基片包括连接至至少一个入口和出口的至少一个微流体通道，该至少一个微流体通道包括沿着该至少一个微流体通道的长度设置的至少一个扩展区，该至少一个扩展区包括至少一个微流体通道的横截面尺寸突然增加至少80μm，设置该至少一个扩展区以响应于流体流动在至少一个扩展区内产生涡流。 
在本发明的另一种实施方式中，微流体系统包括基片，该基片包括连接至至少一个入口和出口的至少一个微流体通道，该至少一个微流体通道包括沿着该至少一个微流体通道的长度设置的至少一个扩展区，该至少一个扩展区包括至少一个微流体通道的横截面尺寸的突然增加，设置该至少一个微流体通道以响应于流体流动在至少一个扩展区内产生涡流。该系统包括至少一个泵，设置以将流体泵送至包含颗粒或细胞的至少一个入口中。计算机可操作地连接至至少一个泵并且设置该计算机以调节流体通过至少一个微流体通道的流速。 
附图说明
图1A示出了根据一种实施方式的用于分离细胞的微流体系统。 
图1B示出了根据另一种实施方式的用于分离细胞的微系统。 
图1C示出了具有单扩展区的微流体通道的示意图。 
图1D-图1G示出了扩展区的各种几何形状。 
图1H示出了具有多个扩展区的微流体通道的平面图。 
图1I示出了沿图1H的直线A-A’获得的剖视图。 
图1J示出了根据本发明的另一方面的具有扩展区的微流体通道的示意图。 
图2示出了用于分离细胞的微流体装置的示意图。还包括在沿着微流体装置的不同点作用于不同细胞大小的力的示意图。 
图3示出了用于分离细胞的具有平行结构的另一种微流体装置。 
图4A示意性地示出了通过部分装置的血细胞和癌细胞，该装置具有截留较大癌细胞的扩展区。在紧下方示出了包含几个扩展区的装置的相应显微图像。 
图4B示意性地示出了通过图4A的装置的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，其示出了血红细胞（RBC）流出而癌细胞保留在扩展区中。在紧下方示出了包括几个扩展区的装置的相应显微图像。 
图4C-图4F示出了在雷诺数（Rc）为270下通过图3的微流体装置掺混有海拉细胞的血液样品。图4C示出了在t=0秒下拍摄的图像。图4D示出了在t=9秒下拍摄的图像。图4E示出了在t=17秒下拍摄的图像。图4F示出了在t=18秒下拍摄的图像。观察到海拉细胞截留在扩展区内产生的涡流中。 
图4G示出了作为细胞浓度的函数的微流体装置捕获效率的比较。 
图5A是示出在不同的血液浓度下由微流体装置达到的富集比（%）的图。 
图5B是示出在不同的血液浓度下由微流体装置达到的纯度（%）的图。 
图5C是示出在不同的血液浓度下由微流体装置达到的捕获效率（%）的图。 
图6A示出了包含MCF7细胞的溶液（溶液A）的示意图，其中细胞被截留在扩展区内产生的涡流中。 
图6B示出了用包含涂有链霉亲和素的微球的溶液B进行的第一溶液置换的示意图。 
图6C示出了MCF7细胞与涂有链霉亲和素的微球反应的示意图。 
图6D示出了使用充当洗液的溶液C（即，PBS）进行的第二溶液置换的示意图。 
图6E示出了对应于图6A的MCF7细胞的显微图像，其中细胞在微流体装置的扩展区内产生的涡流中盘旋（环绕，orbit）。左下图是矩形区域的放大图。右下图是正方形区域的放大图。 
图6F示出了对应于图6B的显微图像。左下图是矩形区域的放大图。右下图是正方形区域的放大图。 
图6G示出了对应于图6C的显微图像。左下图是矩形区域的放大图。右下图是正方形区域的放大图。 
图6H示出了对应于图6D的显微图像。左下图是矩形区域的放大图。右下图是正方形区域的放大图。 
图7示出了根据另一种实施方式的微流体装置，其包括连接至三种不同溶液（细胞样品、标记试剂、和洗液）的三个入口。 
图8A示出了用图7的装置进行的截留、荧光溶液置换、反应、和冲洗的连续步骤。 
图9示出了细胞聚簇（cluster）的荧光图像，其中细胞依次被截留在流体涡流内、用多聚甲醛固定、透化（permeabilized）、以及用抗细胞角蛋白-PE和DAPI标记。 
图10是示出对于微流体装置和标准离心，作为时间函数的每个细胞（覆盖有生物素化抗EpCAM的MCF7细胞）结合涂有链霉亲和素的微珠（bead）的数目的图。 
图11是示出对于微流体装置和标准离心，相对归一化频率作为每个细胞结合微珠的数目的函数的图。 
具体实施方式
图1A示出了用于从包含不同尺寸的细胞12的异质溶液中分离细胞12的流体装置10。虽然在图1A中示出的微流体装置10用于分离细胞12，但可以理解，该微流体装置10也可以连同用于颗粒的分离（未示出）。因此，在本文中术语“细胞”和“多种细胞”的使用应当是可与颗粒或多种颗粒互换的。如在图1A中看出的，微流体装置10包括基片14，其包括连接至入口18和出口20的微流体通道16。微流体通道16的尺寸可以不同。作为实例，微流体通道可以具有50μm的宽度和70μm的高度。微流体通道16的宽度的典型尺寸在20μm至200μm的范围内。微流体通道16的高度的典型尺寸在20μm至500μm的范围内。长度也可以变化但长度通常为几厘米（例如，4.5cm）。可以由用于微流体装置的常规材料形成基片 14。这些材料包括玻璃、硅、或聚二甲硅氧烷（PDMS）。对于PDMS，软光刻技术可以用于产生微流体装置10。在PDMS的实施方式中，对于模具制作，用70μm厚的负性光致抗蚀剂（KMPR1050,Microchem）层旋涂4英寸硅片，通过设计的Cr光掩模暴露于UV光，并显影。在制备的模具上铸塑PDMS（Sylgard184,Dow Corning）并脱气。使固化的PDMS模制品与模具分离并用针钳（针钳系列A，Technical Innovations Inc.）刺穿（punched）入口18和出口20。通过将PDMS和载玻片（slide glass）表面暴露于空气等离子体（Plasma Cleaner,Harrick Plasma）以将刚刺穿的PDMS层结合于载玻片以封闭装置。 
在图1A的实施方式中，入口18实际上包括两个入口：入口18’和入口18’’。第一入口18’用于引入包含异种细胞群12的溶液。第二入口18’’用于引入第二不同溶液。如下文更详细地解释的，第二入口18’’可以用于将洗液、标记物（例如，荧光标记、抗体、核酸染料、荧光底物）、或其它化学试剂（例如，固定剂或透化剂）引入微流体通道16中。 
如在图1A中看出的，入口18’、18’’连接至各自的泵22、24。每个泵22、24可以用于将设定流速的各溶液输送至微流体装置10。结合本发明，本领域技术人员可以使用已知的任何类型的泵。这些泵包括，但不限于，注射泵、用压缩空气操作以泵送流体的泵、蠕动泵或容积式泵。图1A示出了与微流体装置10一起使用的注射泵22、24。例如，Harvard Apparatus,PHD2000注射泵可以用于保持10μl/min至4.5ml/min的总流速。通常，设定泵22、24的设置以产生通过微流体装置10的大于100μl/min的流速。 
图1A示出了计算机40，其可以用作系统100的部分以控制微流体装置10。计算机40中通常包括至少一个处理器42，其执行安装或存储在计算机40中软件。计算机40还可以包括监测器44，其可以用于显示微流体装置10的各种参数。这些参数可以包括，例如，泵22、24的流速、包含在泵22、24中的流体的体积、和其它操作数据。计算机40优选连接于泵22、24，使得计算机40能够调节泵22、24的单独的流速或操作状态。利用存储在计算机40中的预置算法或指令集合，计算机40可以自动控制泵22、24。可替换地，可以利用通常与计算机一起使用的接口器件（例如，键盘、鼠标等）手动调节泵22、24的控制。 
在溶液置换操作期间，计算机40可以确保保持在微流体装置10中的溶液为期望的流量。例如，当放慢或甚至关闭一个泵22时，增加第二泵24的流速以确保保持期望的流速。 
图1B示出了可替换的系统200，其使用压力驱动泵送系统46。连同调节器50一起，泵送系统46使用加压气体48的来源，以将第一流体52（例如，洗液）和第二流体54（例如，血液）泵入装置10。在此系统200中，分别在装置10的输入和输出处提供液体阀56、58。设置计算机40以控制压力驱动泵送系统46和液体阀56、58。例如，阀56可以用于打开或关闭第一流体52或第二流体54至装置10的流动。阀58可以用于在废弃物容器60和收集装置62（作为实例，其可以包括96孔板）之间切换出口流。 
如在图1A中看出的，微流体通道16包括沿着微流体通道16的长度位于选定的点处的多个扩展区30。扩展区30提供微流体通道16的宽度的突然增加，在或高于特定阈值流速下，其产生分离的边界层，该分离的边界层使得在每个扩展区30内形成涡流。正是在扩展区30内产生的涡流从流过微流体装置10的异种细胞12的溶液截留细胞12的亚群。然而，这些涡流不同于在流动方向上产生的涡流，如借助于惯性在弯道流中产生的迪安涡流（Dean vortex）（参见J.Wang et al.,Vortex-assisted DNA Delivery,Lab Chip,2010,10,2057–2061(2010)），或由于非对称结构的微通道产生的涡流（参见Stott et al.,Isolation of Circulating Tumor Cells Using a Microvortex-Generating Herringbone-Chip,Proc Natl.Acad.Sci.107(43):18392-7(2010)）。如下文更详细地解释的，高于特定阈值或截止尺寸（取决于微流体装置10的流速和几何形状）的细胞12进入扩展区30并被捕获或截留在再循环涡流内。低于阈值大小的细胞12不被捕获并在微流体装置10中继续流向下游。通常，对于直径大于15μm的细胞12将产生最有效的截留。在直径小于10μm下，截留是低效率的（例如，5%）。因此，截留细胞12的直径应为≥10μm以发生有意义的截留。扩展区30的几何形状可以不同。例如，扩展区30可以是矩形，如图1A所示，但它还可以包括正方形、三角形、多边形、或半圆形形状，如图1C-图1G所示。对于矩形扩展区30，扩展区30的长边平行于主微流体通道16定向的情况下，截留能力较好。通常，相对于上游微流体通道16的流动方向，扩展区30的引导壁31（图1C中所示）应成45°以上的角。 
图1C示出了连同上游微流体通道16一起的单扩展区30。如上文所述，相对于在图1C中示出为虚线A的流动轴，引导壁31应成45°以上的角。在这方面，与微流体通道16的上游部分的横截面尺寸相比，扩展区30是横截面尺寸（例如，宽度或高度）的突然扩展。在图1C的实施方式中，引导壁31成刚好小于90°的角度，其远高于最低45°的阈值。扩展区30还具有拖尾壁（trailing wall）33。拖尾壁33可以相对于流动方向A成一定角度。通常，拖尾壁33的角度并不重要并且可以是任何角度。例如，在一种实施方式中，拖尾壁33成较小角度，其引起拖尾壁33逐渐减小返回至微流体通道16的宽度。在又一种替代方式中，不存在拖尾壁33并且扩展并不返回微流体通道16的原始尺寸。 
在如图1J所示的另一种实施方式中，扩展区30包括弯曲的引导壁31。在这方面，引导壁31最初开始逐渐偏向远离上游微流体通道16，其沿着引导壁31的长度越来越偏离。在此实施方式中，相对于流动轴A，沿着引导壁31的不同点获得的不同切线将具有显著不同的角度。例如，在引导壁31的开始附近，角度θ1较小且小于45°。然而，在引导壁31的末端附近，角度θ2斜度大且大于45°。在弯曲或不连续扩展区30（如图1J所示）的情况下，平均角度θAVE，其表示相对于流动轴A，沿着引导壁31的整个长度的平均角度应大于45（θAVE>45°）。 
图1H示出乐沿着微流体通道16的长度定位的几个扩展区30的平面图。图1I示出了沿图1H的直线A-A’获得的剖视图。图1H和图1I都示出了微流体通道16和扩展区30的各种尺寸。如前所述，微流体通道16的宽度（w）的典型尺寸在20μm至200μm的范围内。微流体通道16的高度（H）的典型尺寸在20μm至500μm的范围内。扩展区30可以延伸在80μm至800μm的范围内但应至少为80μm的距离（x）。扩展区30可以延伸在200μm至2mm范围内的距离（y）。相邻的扩展区30可以隔开通常大于20μm的距离（z）。在一些实施方式中，可以存在单扩展区30，使得不存在相邻的扩展区30。微流体通道16的横截面形状可以基本为矩形、梯形、或正方形。微细加工工艺可以产生略显梯形的截面或略呈圆形的拐角。通道16还可以具有圆形或半圆形横截面，虽然目前的制造技术并不能产生这些几何形状。本文描述的方法和装置涵盖这些变化。 
再次参照图1A，可以将扩展区30设置在微流体通道16的相反侧。这使得单微流体通道16能够具有更大的捕获能力。另外，如下文更详细 地解释的，当以平行结构排列多个通道16时，这种构造使得能够交错设置扩展区30。也就是说，如在图3中看出的，在相邻的微流体通道16上，由于扩展区30彼此偏移并且与扩展区30交错，可以将相邻的微流体通道16紧密堆叠在一起。还参照图1A，较大尺寸的细胞12被截留在扩展区30内，而较小尺寸的细胞12则没有被截留且继续流下微流体通道16，它们经由出口20离开。较大尺寸的细胞12（在扩展区30中示出的那些细胞）被截留在扩展区30内产生的涡流中。较小尺寸的细胞12，由于它们的尺寸，它们没有被截留在涡流内并且流出扩展区30。因此，较小尺寸的细胞12并没有被扩展区30中的涡流所截留而是在微流体通道16中继续流向下游。 
图2示出了用于从包含不同尺寸的细胞12的异质溶液中分离细胞12的微流体装置10以及在微流体通道16和扩展区30内的相应流动。图2示出了微流体通道16和扩展区30的三个区域的放大图，如由视图A、B、和C确定的。如在视图A中看到的，经由注射泵22、24中的一个将不同尺寸的异种细胞群12泵入装置。其它注射泵可以包含洗液或其它溶液如PBS。最初，如在视图A中看到的，细胞12随机分散在y方向。细胞12经受两种反作用力：剪切梯度升力（FL剪切梯度），其作用于细胞12以将细胞移向微流体通道16的壁，以及壁效应升力（FL壁效应），其迫使细胞12远离微流体通道16的壁。 
通过使用具有矩形横截面的直微流体通道16，流动细胞12的动态平衡位置产生动态横向平衡位置Xeq和均匀的细胞速度，如图2的视图B所示。此处，Xeq定义为在细胞12的中心与微流体通道16的壁之间的距离。随着细胞12进入扩展区30（在图2中存在两个（2）相反扩展区30），经受较大FL剪切梯度的较大细胞12被推向涡流中心并被截留，而较小细胞12被冲出扩展区30并进入通道，此处它们继续向下游流向出口20。通常，FL剪切梯度力与细胞直径（a）的立方成比例，引起较大细胞12经受较大的FL剪切梯度力。在经过分离边界（分界面）之后，尺寸依赖性横向移动驱动细胞12通过流线并朝向涡流核心，此处细胞12保持分离并在涡流中盘旋。这使得能够进行尺寸选择性截留，当低于截止尺寸（size cutoff）时，细胞不以足够的速率移动以通过分界面并保留在集中流中，而是流出出口20。 
图3示出了用于分离细胞12的微流体装置10的另一种实施方式，其包括连接至入口18和出口20的多个通道16。图3示出通常彼此平行设置的8个（8）隔开的通道16。每个微流体通道16具有10个（10）隔开的扩展区30。当然，应当理解，可以使用任何数量的通道16。相对于沿着单微流体通道16的隔开的扩展区30的数量，这同样适用。沿着单微流体通道16的相邻扩展区30之间的间距可以不同，但已发现1mm的间距是可行的。可以添加另外的通道16以产生大规模并行装置10。相对于彼此交错的相邻通道16上的扩展区30，通道16是直的。这种设计使得能够彼此靠近地放置相邻通道16，从而减少微流体装置10的总占用面积（footprint）。虽然图3示出了二维布局的通道16的阵列，但可以理解，还可以以三维布局构造通道16的阵列。三维结构将得到甚至更大的通量。 
在图3的装置中，微流体通道16是宽度为50μm且高度为70μm的矩形高纵横比通道。入口18包括用于包含细胞12的样品的第一入口18’和包含PBS或其它洗液的第二入口18’’。双入口18’、18’’的设置便于在微流体装置10内容易和快速的溶液置换，例如，提供冲洗未截留细胞12和增强收集样品的最终富集比和纯度的手段。微流体装置10的长度为几厘米长。以交替模式放置扩展区30以在给定紧凑空间中放置最大数量的扩展区30。在图3的装置中，扩展区是尺寸为400μmx400μm的正方形。 
在细胞12被截留在扩展区30内之后，可以通过使得涡流减小大小并最终消失以从扩展区30释放细胞12。这可以通过降低输入流速（例如，降低泵22、24的流速）实现。降低的流速会减小涡流的大小，使得截留在其中的细胞12能够释放到微流体通道16的流体中并流出装置的出口20。对于图3的装置，已发现约4ml/min的流速是效果最好的。可替换地，可以将流速迅速降低至基本为零以停止流体通过微流体装置10的流动。在这种可替换的方式中，可以在芯片上而不是在芯片外（off-chip）收集细胞12。 
实施例1—从血液富集稀有癌细胞
图3的微流体装置10适用于从正常人血细胞（直径在2至15微米的范围内）分离和浓缩癌细胞（直径为20微米）以证明以高通量方式进行的基于尺寸的富集和浓缩的效用。对于临床诊断，从血液富集和浓缩癌细胞是特别重要的，因为循环肿瘤细胞（CTC）可以提供关于患者病状和癌 症治疗的监测的实时信息。以快速、有效和无标记的方式，从血液分离活CTC仍然是一项重大的技术挑战：CTC是罕见事件，其比率低至一个细胞/十亿血细胞。虽然现行策略专注于用于诊断的CTC的调查，但对于收集较大的活CTC的样品量以供研究目的存在重大需求。这需要较高通量地处理较大血液量以及富集靶细胞而没有附着于改性基板或磁珠，提供单独选择捕获细胞以供进一步分析或培养的优点。 
借助于大规模并行装置，其以mL/min的范围处理液体体积，通过基于尺寸和密度的分离富集靶细胞，并将捕获的细胞释放到较小的浓缩量，这种装置10解决了对稀有细胞富集的需要。为了证明稀有细胞的富集，以4.4mL/min的速率，将掺混入稀释的人血液中的荧光标记的乳腺癌细胞（MCF-7）注入装置10，其类似于图3所示的装置。在包含DMEM并补充有10%的FBS、1%的牛胰岛素、和1%的青霉素/链霉素的培养基培养MCF7乳腺癌细胞，然后胰蛋白酶化并在使用前重新悬浮。由受过训练的医生，从健康的人志愿者中收集血液并在PBS中稀释至5-20%以用于实验。 
在这些高流速下，在上游涡流储存器中观测到通道变形，然而，截留没有受到显著影响，这是因为在接近环境压力下操作的下游涡流室保持不变形。较高的操作流速而是受限于结合强度。 
掺混的MCF-7细胞包括单细胞和2-4个细胞聚簇，这是因为在临床样品中成簇细胞已显示出以显著水平存在。在注入步骤期间，观测到血液和癌细胞进入涡流并在涡流中盘旋，如在图4A的上图（upper panel）中的单扩展区30的示意图所示。图4A的下图（lower panel）示出了显微图像，其示出连同包含在扩展区30中的血红细胞一起截留的癌细胞。观测到血红细胞进入涡流，即使在用稀释样品进行的实验中类似尺寸的颗粒并不移动进入涡流。很可能，高细胞浓度会诱导在细胞之间的碰撞和流体动力学干扰，其致使横流移动以及进入涡流。 
另外，可以保持每个扩展区30存在最大容量的细胞。在涡流占据整个扩展区30之后，在较高流速范围内，可以保持最多约40个单个MCF7细胞。对于大多数峰值形成（spiking）实验条件，保持远低于该最大值。在完全处理溶液之后，用PBS‘‘洗涤’’涡流截留细胞而没有破坏涡流。这示出于图4B的上图。图4B的下图示出了显微图像，其示出在已引入PBS 洗液以除去较小和较密集的RBC之后仍然截留的癌细胞。有趣的是，观测到最初进入涡流的血细胞没有被稳定截留并迅速流出截留（trap）以及流出系统，仅留下较大的稳定截留的癌细胞盘旋。血红细胞和白细胞都具有较高密度和/或较小的尺寸，因而不能形成稳定的盘旋。将经洗涤的细胞释放到96孔板的一个孔中用于表征和研究（enumeration）。 
当量化用于靶细胞浓缩、富集、和纯度的关键指标时，微流体装置10表现良好。在<3min内，在相对很少血细胞污染的情况下，将掺混有约500个癌细胞的5%v/v血液（即，0.5mL全血或约25亿血细胞）的10mL体积的血液样品（n≥6个样品）浓缩至小于200mL（20倍体积浓度）的最终体积。这对应于3.4百万的富集比（在输出溶液中靶标癌细胞与污染血细胞的比率除以在输入溶液中的相同比率），如在图5A中看出的。这种高水平的富集导致在200mL的最终体积中癌细胞的高纯度：约40%，如在图5B中看出的（平均102±21个癌细胞，以及221±155个血细胞）。用微流体装置10处理没有掺混癌细胞的血液样品（n=3），在孔中收集样品并发现含有772±283个血红细胞和4±1个CD45+白细胞，其类似于利用掺混血液样品在微孔中发现的血细胞污染物的量。达到的富集水平相当于基于分子亲和力和基于过滤的用于靶细胞分离的方法，其已报道了1百万至10百万（1千万）的富集。当相比于报道掺混9.2至14.0%癌细胞的纯度的基于亲和力的方式时，经处理的样品的纯度较高。降低在经处理的样品中血液的稀释度致使细胞处理通量的增加，但也导致降低的掺混细胞的捕获效率。如在图5C中看出的，回收了10至20%的掺混癌细胞，并且捕获效率随血液浓度的增加而降低。较高的血液浓度导致较高的流体粘度，其改变流体涡流尺寸和位置，导致较低的截留效率。 
这种在较高血液浓度下的相对较低捕获效率表明，为了这种技术可用于分离在1-10个细胞/mL下出现的超稀有细胞，必须处理较大体积的血液（10mL以上）。然而，本文描述的微流体装置10的高通量（对于2cm2芯片，约5mL/min的稀释血液）表明，在合理的时间段内（<30分钟）的大量操作是可实现的。 
在微流体装置10中捕获的细胞保持高水平的活力。在通过装置注入细胞以后，没有观测到细胞活力的显著改变（90.1%相对于初始的90.3%），如通过荧光活/死检测确定的。对于一些样品制备应用，活细胞可以是重要的。由微流体装置10捕获和释放的细胞可用于标准分子测定如免疫染色。 为此目的，用微流体装置10富集未标记的掺混血液样品。然后释放癌细胞并在微孔中标记。对于细胞角蛋白-PE和DAPI，癌细胞染色为阳性，而对于CD45癌细胞染色为阴性。这种用一个装置富集但以小体积转移细胞供进一步处理的能力为稀有单细胞分析提供了显著的优势。 
图4C-图4F示出了利用图3的微流体装置10（雷诺数（Rc）为270）进行的掺混有海拉细胞的血液样品的类似富集的结果。在扩展区30中捕获海拉细胞之后，用PBS洗液冲洗微流体装置10。通过降低流速至Rc=5，由扩展区30释放截留的海拉细胞。图4G示出了微流体装置10的捕获效率的比较，其是作为细胞浓度的函数。细胞的数目表示通过微流体装置10处理的掺混海拉细胞的数量。 
实施例2—细胞标记和溶液置换
微流体装置10还用于用特异性分子标记物有效地标记细胞。在常规离心中，通过一系列标记和洗涤步骤，用特异性标记物标记细胞样品。这包括在离心管中用标记试剂温育细胞，用台式离心机将细胞浓缩成颗粒，通过手动吸取除去包含未结合的标记试剂的上层清液，以及将细胞手动再悬浮于新培养基中。在微流体装置10内进行这些操作，通过将细胞截留在流体涡流内，然后将截留的盘旋细胞暴露于标记试剂，随后PBS洗液。然后通过减少流量，以小体积，将标记的细胞释放到收集小瓶中。 
图6A-图6D分别示出了截留（图6A）、第一溶液置换（图6B）、反应（图6C）、和第二溶液置换（图6D）。图6E-图6H分别示出了对应于实际MCF7细胞的图6A-图6D的显微图像，该MCF7细胞与被注入微流体装置10中的生物素化EpCAM一起温育。如在图6E中看出的，细胞被截留在涡流中，经受恒定的旋转和盘旋运动。图6F示出了用涂有链霉亲和素的微球的第一溶液置换。涂有链霉亲和素的微球进入扩展区30。图6G示出了涂有链霉亲和素的微球与MCF7细胞的连续反应。图6H示出了与第二溶液（即，PBS洗液）的溶液置换。PBS洗液除去未结合的微球（箭头A）。在完成洗涤之后，通过降低流过微流体装置10的流速，将细胞从涡流截留中释放，其中将细胞收集到96孔板中用于表征。在图6H中的箭头B指向在2分钟内更紧密结合于细胞的颗粒。 
将细胞稳定地保持在流体涡流内的适当位置的能力使得能够以可自动化的方式进行与标记试剂和洗液的多种溶液的置换。新溶液的每次添加 需要大约100ms以完全置换。对于相同的标记反应，基于常规离心机的方法需要六个（6）离心步骤，其包括三个（3）洗涤步骤，并且需要>30分钟的样品制备时间（这不包括与标记试剂温育的时间）。每次离心和洗涤步骤可以潜在地导致损失小部分细胞并且需要5-10min。 
快速标记得益于在流体涡流中旋转和盘旋的细胞，使得它们暴露于分子标记物的不断更新的环境。换句话说，在涡流中标记试剂的强对流产生在细胞表面附近试剂的非常小的耗尽区，并且强梯度驱动更多试剂到达细胞表面。通过在细胞表面检测涂有链霉亲和素的微球与生物素化抗EpCAM抗体的结合，检测这种快速标记（图6A-图6H）。已发现，在微流体装置10中的细胞在5分钟内积累了与用标准方案制备的细胞在30分钟内积累的相同数量的微珠。另外，在30分钟以后，和标准方法相比，用微流体装置10标记的细胞平均具有两倍的结合的微珠数量/细胞。 
实施例3—连续操作：稀有细胞富集随后标记
利用图7所示的微流体装置10，成功地进行了离心机使得能够进行的多个连续样品制备步骤（例如，截留荧光溶液置换、反应、和洗涤）。在该实施方式中，微流体装置10包括三个入口18’、18’’、和18’’’。将一个入口18’连接至用于输送细胞样品的注射泵22。第二注射泵24用于输送荧光剂。第三注射泵26用于输送洗液（PBS）。在<1小时内，进行基于尺寸的癌细胞从血液中的截留，连续荧光标记，和释放细胞的分析。将掺混有癌细胞的稀释人血液（10mL）注入微流体装置10中，富集癌细胞约3分钟。依次用固定剂（多聚甲醛）和透化剂制备截留细胞并用荧光抗体（抗细胞角蛋白-PE和DAPI）染色20分钟。图8A-图8D示出了截留、第一溶液置换、反应、和第二溶液置换的次序。然后用PBS洗涤细胞<1min，并收集到96孔板中用于表征。收集的细胞对于细胞角蛋白和DAPI，标记呈阳性，这表明连续样品制备的成功，如图9所示，其示出了细胞聚簇的荧光图像，该细胞聚簇依次被截留在流体涡流内，用多聚甲醛固化，透化，并用抗细胞角蛋白-PE和DAPI标记。如在图10A中看出的，在与30分钟之后的标准芯片外方案相同的水平下，覆盖有生物素化抗EpCAM的MCF7细胞在<5分钟内包覆上链霉亲和素结合的微珠。图11A示出了在30分钟之后在细胞群上均匀标记有微珠。另外，微流体装置10（在芯片上的离心机（centrifuge-on-chip））得到较大数量的结合微珠 /细胞。以上结果表明在单个简单平台中细胞分析所需要的所有样品制备过程的自动化的完整途径。 
本文描述的装置10和方法可用于价格低廉和快速循环肿瘤细胞（CTC）分析。对于监测乳腺癌病状和结果，CTC检测和研究是有价值的以及有前景的诊断工具。CTC是来源于肿瘤的细胞，其经由血流扩散并且可以反映肿瘤的侵袭性。CTC是罕见事件，其比率低至一个细胞/十亿细胞。因此，CTC分离是重大的技术挑战。本文描述的装置10和方法可以利用CTC和血细胞之间的细胞尺寸差异（CTC比RBC大2-4倍）以无标记方式从全血中分离活CTC。装置10和方法的其它潜在应用包括产前检查，其涉及母体血细胞与胎儿细胞的分离。可以分离关注的胎儿细胞而不需要标记或外部的较大器械。 
虽然微流体装置10具有用于分离CTC的特定应用，但其它应用包括浓缩获自样品的细胞12。例如，可以捕获具有能够被截留在扩展区30内的尺寸的关注的细胞12，然后以浓缩形式释放到样品中。例如，可以使包含在生物来源的流体（如尿、胸膜液、和腹膜洗液）中的细胞12通过微流体装置10以浓缩其中包含的细胞12。在这方面，微流体装置10非常适合于浓缩细胞12。例如，在体积的基础上，微流体装置10可以将细胞12浓缩十（10）倍或二十（20）倍以上的初始溶液中的细胞12的浓度。 
虽然已示出和描述了实施方式，但可以进行各种改变而不偏离本文披露的本发明的构思的范围。例如，虽然本文已描述了几种实施方式，但是可以理解，各个方面或要素可与其它单独的实施方式互换。因此，本发明仅受限于随附的权利要求以及它们的等价物。 

Claims (18)

1.一种分离细胞的方法，包括：
提供具有至少一个微流体通道的微流体装置，所述至少一个微流体通道连接至入口和出口，所述至少一个微流体通道包括沿着其长度设置的至少一个扩展区，所述至少一个扩展区包括所述至少一个微流体通道的横截面尺寸的突然增加，所述突然增加由相对于所述至少一个微流体通道内的流动轴具有恒定或平均角度为或高于45°的引导壁限定，设置所述至少一个扩展区以响应于流体流动在所述至少一个扩展区内产生涡流；
使包含细胞群的溶液流入所述入口；
在所述至少一个扩展区内产生的所述涡流内截留至少一些所述细胞，所述至少一些所述细胞具有≥10μm的直径；以及
通过降低溶液通过所述至少一个微流体通道的流速从多个扩展区释放所述截留细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，流入所述入口的所述溶液包含同种细胞群。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，流入所述入口的所述溶液包含异种细胞群。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述至少一个扩展区具有多边形、或半圆形的形状。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述至少一个扩展区还包括相对于所述至少一个微流体通道内的所述流动轴成角度的拖尾壁。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述至少一个扩展区包括所述至少一个微流体通道的横截面尺寸没有减小。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述至少一个扩展区包括所述至少一个微流体通道的横截面尺寸的逐渐减小。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述出口处收集所述释放细胞。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，直径大于15μm的细胞被截留在所述涡流内。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述截留细胞包括癌细胞。
11.根据权利要求1所述的方法，其中，释放所述截留细胞包括将通过所述至少一个微流体通道的溶液的流速降低至为零以及开始冲洗溶液的流动。
12.根据权利要求3所述的方法，其中，所述异种细胞群包括含有癌细胞的群，并且其中，所述癌细胞被截留在所述涡流内。
13.根据权利要求1所述的方法，其中，含有异种细胞群的所述溶液包含血液、尿、胸膜液、和腹膜洗液中的一种。
14.根据权利要求1所述的方法，其中，所述微流体装置包括连接至所述入口和所述出口的多个微流体通道。
15.根据权利要求1所述的方法，其中，以二维或三维阵列设置所述多个微流体通道。
16.一种按尺寸截留细胞的方法，包括：
提供具有至少一个微流体通道的微流体装置，所述至少一个微流体通道连接至入口和出口，所述至少一个微流体通道包括沿着其长度设置的至少一个扩展区，所述至少一个扩展区包括所述至少一个微流体通道的横截面尺寸的突然增加，所述突然增加由相对于所述至少一个微流体通道内的流动轴具有恒定或平均角度为或高于45°的引导壁限定，设置所述至少一个扩展区以响应于流体流动在所述至少一个扩展区内产生涡流；
使包含细胞群的溶液流入所述入口；
在所述至少一个扩展区内产生的所述涡流中截留至少一些所述细胞；以及
其中，所述截留细胞包括尺寸高于阈值的细胞，以及其中，尺寸低于所述阈值的细胞通过所述涡流。
17.一种置换经分离的细胞周围的溶液的方法，包括：
提供具有至少一个微流体通道的微流体装置，所述至少一个微流体通道连接至入口和出口，所述至少一个微流体通道包括沿着其长度设置的至少一个扩展区，所述至少一个扩展区包括所述至少一个微流体通道的横截面尺寸的突然增加，所述突然增加由相对于所述至少一个微流体通道内的流动轴具有恒定或平均角度为或高于45°的引导壁限定，设置所述至少一个扩展区以响应于流体流动在所述至少一个扩展区内产生涡流；
使包含细胞群的溶液流入所述入口；
在所述至少一个扩展区内产生的所述涡流中截留至少一些所述细胞；以及
使一种或多种溶液流入所述入口，同时持续地保持所述涡流包含所述截留细胞。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述一种或多种溶液包括标记物、固定剂、透化剂、和洗液中的至少一种。
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