CN107974392A - 一种微流控芯片及分离捕获血液中循环肿瘤细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种微流控芯片及分离捕获血液中循环肿瘤细胞的方法，所述微流控芯片包括芯片主体，所述芯片主体包括通道，所述通道设有若干涡旋结构，所述涡旋结构为与通道边缘的边呈10~20度的微通道，或间断性设在通道上的圆形结构或矩形结构，所述圆形结构或矩形结构水平横截面的内径大于通道水平横截面的宽度。采用本发明的技术方案，结构简单，相较目前的CTC捕获方法或微流控芯片，提供了一种制作简单，操作容易的微流控芯片以及分离方法，可在一次操作中实现CTC细胞与血细胞的分离，捕获分离捕获血液中循环肿瘤细胞。

Description

一种微流控芯片及分离捕获血液中循环肿瘤细胞的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种微流控芯片及分离捕获血液中循环肿瘤细胞的方法。
背景技术
癌症的早期筛查是提高癌症治愈率的重要方式，然而目前癌症的早期筛查仍然缺发有效的技术和工具。近几年，通过捕获和检测血液中的循环肿瘤细胞（CTC）来进行癌症早筛引起了业界关注。CTC细胞是指在肿瘤微转移过程中，少数具有转移潜能的肿瘤细胞脱离原发灶，转移到血液、淋巴结、骨髓或远处器官中的细胞，是恶性肿瘤患者出现术后复发或远处转移的重要标志。相较于传统的穿刺提取癌组织样品进行分析的方式而言，检测静脉血中癌细胞的方式可视为无创检测，对患者的创伤很小。然而，平均每毫升血液中仅含1个CTC，且混杂在50亿个血细胞中，捕获CTC细胞犹如大海捞针。
目前CTC检测的金标准方法是采用抗体标记来识别CTC细胞。然而这种方式由于试剂昂贵，且需要复杂的样品前处理过程，难以推广。并且该方法仅能识别出CTC细胞，并不能实现对其的有效捕获和富集。流式细胞术是另外一种高灵敏CTC检测方法，具有快速、准确的优势，但存在仪器昂贵、操作复杂、维护困难等缺点，更无法实现社区或家庭自检的目标。
近年来，利用微流控芯片技术进行CTC细胞检测，分离，富集得到研究者的关注。迄今为止，基于芯片的CTC技术有介电泳分离、机械过滤和流体力学分离几种方式。介电泳分离在选择性（与白细胞相比，通常富集＜100）和通量上（通常小于1ml/h）不具备优势。机械过滤一般通过薄膜或微柱过滤，这种方式细胞容易堵塞孔道，分析通量低，只能用于少量样品的分离。流体力学具有较高的分析通量，但富集效率略低于机械过滤。简言之，当前各种CTC捕获技术各有利弊，仍有较大的发展空间。
发明内容
针对以上技术问题，本发明公开了一种微流控芯片及分离捕获血液中循环肿瘤细胞的方法，通过主动或被动的方式产生涡旋，涡旋的效应相当于传统的离心效应，大的粒子/细胞趋于占据涡旋流中相对狭小的空间，小粒子趋于流向空间较大的位置。因为CTC细胞相较一般细胞大很多，通过在涡旋中的尺寸分离效应及微通道实现捕获大尺寸的CTC细胞。
对此，本发明采用的技术方案为：
一种微流控芯片，其包括芯片主体，所述芯片主体包括通道，所述通道设有若干涡旋结构，所述涡旋结构为与通道边缘的边呈10~20度的微通道，或间断性设在通道上的圆形结构或矩形结构，所述圆形结构或矩形结构水平横截面的内径大于通道水平横截面的宽度。其中，所述通道的宽度为微通道的宽度的5倍以上。
采用本发明的技术方案，在微流控芯片上制作出特定的微通道，通过主动或被动的方式产生涡旋，涡旋的效应相当于传统的离心效应，大的粒子/细胞趋于占据涡旋流中相对狭小的空间，小粒子趋于流向空间较大的位置。因为CTC细胞相较一般细胞大很多，通过在涡旋中的尺寸分离效应及微通道实现捕获大尺寸的CTC细胞。涡旋结构为与通道边缘的边呈10~20度的微通道为主动型涡旋，涡旋结构为间断性设在通道上的圆形结构或矩形结构为被动型涡旋。
作为本发明的进一步改进，所述涡旋结构为矩形结构时，所述矩形结构水平横截面的水平宽度为通道水平横截面宽度的10~20倍，所述矩形结构水平横截面的垂直高度为通道水平横截面宽度的5~10倍。
作为本发明的进一步改进，所述通道水平截面的宽度为40~75μm，所述矩形结构水平横截面的水平宽度为720μm，水平横截面的垂直高度为500μm。
作为本发明的进一步改进，所述涡旋结构为圆形结构时，所述圆形结构水平横截面的直径为通道水平横截面宽度的10~20倍。
作为本发明的进一步改进，所述涡旋结构为与通道边缘的边呈10~20度的微通道时，所述通道的宽为1-3mm，深20-100μm。
作为本发明的进一步改进，所述微通道的截面为矩形。
优选的，所述微通道的流道长度为通道水平截面的宽度的0.01~0.2倍。优选的，所述微通道的流道宽度为通道水平截面的宽度的0.05~0.1倍。
作为本发明的进一步改进，所述微通道与通道边缘的边呈15度。
作为本发明的进一步改进，所述微流控芯片的底部设有压电陶瓷片。
本发明提供了一种采用如上所述的微流控芯片进行分离捕获血液中循环肿瘤细胞的方法，所述涡旋结构为间断性设在通道上的圆形结构或矩形结构，其包括以下步骤：
步骤S1，将混合有癌细胞的血细胞混合液注入芯片中，通过粘贴在在芯片底部的压电陶瓷片产生主动涡旋震荡，通过微通道时产生空气气泡，使得细胞溶液产生涡流，大的细胞被捕获在通道边缘的微通道处；
步骤S2，以0.03~0.4mL/min的速度向通道内加入PBS冲洗通道和细胞溶液，并保持压电陶瓷片处于持续工作状态，PBS逐渐将白细胞和红细胞洗出通道，最后仅有癌细胞被捕获富集在通道内。
采用此技术方案，在芯片底部粘贴压电陶瓷片（PZT）以产生主动涡旋震荡，使得细胞按照尺寸大小得以分离，通道边缘的微通道捕获空气气泡及其内的CTC细胞。通过PBS逐渐将白细胞和红细胞洗出通道，经过一段时间，仅有乳腺癌细胞被捕获富集在通道内。
本发明还提供了一种采用如上所述的微流控芯片进行分离捕获血液中循环肿瘤细胞的方法，所述涡旋结构为与通道边缘的边呈10~20度的微通道，包括以下步骤：
先以0.2~0.5mL/min的流速向芯片通道内泵入癌细胞和血细胞混合液，然后加入PBS缓冲液冲洗通道，在涡旋结构区域留下癌细胞。进一步，所述PBS缓冲液的流速与混合液的流速相同。
采用此技术方案，通过在狭长的通道间断性的设置相对通道而言较大的结构，高速流体由窄处突然进入开阔区域形成流体扰动，产生涡旋。细胞进入涡旋区域后，由于涡旋效应，一段时间后，小的细胞容易流向涡流的边缘，并被带出放大的结构区域，沿狭长通道继续前行，大的细胞，如CTC细胞，趋向待在涡旋的中心，留在涡旋结构中，从而实现CTC细胞的捕获。然后，加入PBS缓冲液冲洗通道，可以洗掉红细胞和白细胞等血细胞，在涡旋结构域留下癌细胞。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
采用本发明的技术方案，结构简单，相较目前的CTC捕获方法或微流控芯片，提供了一种制作简单，操作容易的微流控芯片以及分离方法，可在一次操作中实现CTC细胞与血细胞的分离，捕获分离捕获血液中循环肿瘤细胞。
附图说明
图1是本发明实施例1一种微流控芯片的结构示意图。
图2是本发明实施例1一种微流控芯片与压电陶瓷片的位置结构示意图。
图3是本发明实施例1一种微流控芯片的工作原理图。
图4是本发明实施例1的微通道的通道内的声波涡流照片。图4（a）、4（b）为初始状态还未产生声波涡流放大4倍和放大20倍的照片；4（c）和4（d）分别为通道内产生声波涡流产生声波涡流的照片。
图5是本发明实施例1的声波涡流捕获乳腺癌细胞显微照片。图5（a）和图5（b）为不同区域放大20倍的显微照片。
图6是本发明实施例2一种微流控芯片流道的结构示意图。
图7是本发明实施例2一种微流控芯片的结构示意图。
图8是本发明实施例2一种微流控芯片的工作原理图。图8（A）为通道入口处的细胞混合液的各主要成分的分布示意图，图8（B）为经过狭长通道的细胞混合液的各主要成分的分布示意图，图8（C）为在矩形结构处的细胞混合液的各主要成分的分布示意图。
图9是本发明实施例2被动式涡旋显微照片。图9（a）和图9（b）涡旋结构为矩形结构的流速分别为0.03ml/min和0.1ml/min被动式涡旋显微照片，图9（c）和图9（d）涡旋结构为圆形结构的流速分别为0.3ml/min和0.4ml/min被动式涡旋显微照片。
图10是本发明实施例2捕获乳腺癌细胞显微照片。
附图标记包括：1-芯片主体，2-通道，3-微通道，4-压电陶瓷片，5-矩形结构。
具体实施方式
下面对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明。
实施例1
如图1和图2所示，一种微流控芯片，其包括芯片主体1，所述芯片主体1包括通道2，所述通道2设有若干涡旋结构，所述涡旋结构为与通道边缘的边呈15度的微通道3，所述通道的宽为2mm，深50μm。所述微通道3的截面为矩形。所述芯片主体1的底部设有压电陶瓷片4。优选的，所述微通道的流道宽度为通道水平截面的宽度的0.05~0.1倍。
采用上述的微流控芯片进行分离捕获血液中循环肿瘤细胞的方法，其包括以下步骤：
步骤S1，将混合有癌细胞的血细胞混合液注入芯片中，通过粘贴在在芯片底部的压电陶瓷片产生主动涡旋震荡，通过微通道时产生空气气泡，使得细胞溶液产生涡流，大的细胞被捕获在通道边缘的微通道处；
步骤S2，以0.03mL/min的速度向通道内加入PBS冲洗通道和细胞溶液，并保持压电陶瓷片处于持续工作状态，PBS逐渐将白细胞和红细胞洗出通道，最后仅有癌细胞被捕获富集在通道内。
该微流控芯片为主动型涡旋，工作原理如图3所示，通过在芯片底部粘贴压电陶瓷片（PZT）以产生主动涡旋震荡，使得细胞按照尺寸大小得以分离，通道边缘的微通道捕获空气气泡及其内的CTC细胞。
实测结果如下：
设置PZT工作频率为13.56KHz，以注射泵链接管路将混合有乳腺癌细胞的血细胞混合液注入芯片，PZT产生空气气泡，使得细胞溶液产生涡流见图4。经过一段时间，大的细胞被捕获在通道边缘的微通道处。然后以0.03mL/min的速度向通道内泵入PBS冲洗通道和细胞溶液，并保持PZT处于持续工作状态。PBS逐渐将白细胞和红细胞洗出通道，经过一段时间，仅有乳腺癌细胞被捕获富集在通道内，如图5所示。
实施例2
如图6和图7所示，一种微流控芯片，其包括芯片主体1，所述芯片主体1包括通道2，所述通道2设有若干涡旋结构，所述涡旋结构为间断性设在通道上的矩形结构5，所述矩形结构5水平横截面的内径大于通道2水平横截面的宽度。所述矩形结构5水平横截面的水平宽度为通道2水平横截面宽度的10~20倍，所述矩形结构5水平横截面的垂直高度为通道2水平横截面宽度的5~10倍。进一步的，所述通道2水平截面的宽度为40~75μm，所述矩形结构5水平横截面的水平宽度为720μm，水平横截面的垂直高度为500μm。
采用上述微流控芯片进行分离捕获血液中循环肿瘤细胞的方法，其包括以下步骤：
以0.3mL/min的流速向芯片通道内泵入乳腺癌细胞和血细胞混合液，经过一段时间，以同样的流速烹入PBS缓冲液冲洗通道，可以洗掉红细胞和白细胞等血细胞，在涡旋结构域留下癌细胞。
工作原理如图8所示，通过在狭长的间断性的相对较大的结构，圆形或矩形均可。高速流体由窄处突然进入开阔区域形成流体扰动，产生涡旋。细胞进入涡旋区域后，由于涡旋效应，一段时间后，小的细胞容易流向涡流的边缘，并被带出放大的结构区域，沿狭长通道继续前行，大的细胞，如CTC细胞，趋向待在涡旋的中心，留在放的结构中。从而实现CTC细胞的捕获。涡旋结构为矩形结构的流速分别为0.03ml/min和0.1ml/min被动式涡旋显微照片如图9（a）和图9（b）所示；涡旋结构为圆形结构的流速分别为0.3ml/min和0.4ml/min被动式涡旋显微照片如图9（c）和图9（d）所示，可见，在涡旋结构处形成了涡旋，最后捕获乳腺癌细胞显微照片如图10所示。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种微流控芯片，其特征在于：其包括芯片主体，所述芯片主体包括通道，所述通道设有若干涡旋结构；所述涡旋结构为与通道边缘的边呈10~20度的微通道，或间断性设在通道上的圆形结构或矩形结构，所述圆形结构或矩形结构水平横截面的内径大于通道水平横截面的宽度。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述涡旋结构为矩形结构时，所述矩形结构水平横截面的水平宽度为通道水平横截面宽度的10~20倍，所述矩形结构水平横截面的垂直高度为通道水平横截面宽度的5~10倍。
3.根据权利要求2所述的微流控芯片，其特征在于：所述通道水平截面的宽度为40~75μm，所述矩形结构水平横截面的水平宽度为720μm，水平横截面的垂直高度为500μm。
4.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述涡旋结构为圆形结构时，所述圆形结构水平横截面的直径为通道水平横截面宽度的10~20倍。
5.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述涡旋结构为与通道边缘的边呈10~20度的微通道，所述通道的宽度为微通道的宽度的5倍以上，所述通道的宽为1-3mm，深20-100μm。
6.根据权利要求5所述的微流控芯片，其特征在于：所述微通道的截面为矩形；所述微通道的流道宽度为通道水平截面的宽度的0.01~0.2倍。
7.根据权利要求5所述的微流控芯片，其特征在于：所述微通道与通道边缘的边呈15度。
8.根据权利要求5~7任意一项所述的微流控芯片，其特征在于：所述微流控芯片的底部设有压电陶瓷片。
9.一种采用如权利要求8所述的微流控芯片进行分离捕获血液中循环肿瘤细胞的方法，其包括以下步骤：
步骤S1，将混合有癌细胞的血细胞混合液注入芯片中，通过粘贴在在芯片底部的压电陶瓷片产生主动涡旋震荡，通过微通道时产生空气气泡，使得细胞溶液产生涡流，大的细胞被捕获在通道边缘的微通道处；
步骤S2，以0.03~0.4mL/min的速度向通道内加入PBS冲洗通道和细胞溶液，并保持压电陶瓷片处于持续工作状态，PBS逐渐将白细胞和红细胞洗出通道，最后仅有癌细胞被捕获富集在通道内。
10.一种采用如权利要求2~4任意一项所述的微流控芯片进行分离捕获血液中循环肿瘤细胞的方法，其包括以下步骤：
先以0.2~0.5mL/min的流速向芯片通道内泵入癌细胞和血细胞混合液，然后以同样的流速加入PBS缓冲液冲洗通道，在涡旋结构区域留下癌细胞。
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