CN110496655A - 一种基于微流控技术的肿瘤细胞检测芯片 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于微流控技术的癌症早期检测芯片，包括循环肿瘤细胞快速分选模块、检测样本均匀混合模块、混合试剂定量包裹模块和离散液滴荧光检测模块，四个模块依次连接；利用循环肿瘤细胞携带肿瘤信息的特征，结合惯性微流控细胞分选技术、混沌式微通道混合技术、液滴定量包裹技术，一套集循环肿瘤细胞快速分选、检测样本均匀混合、混合试剂定量包裹和离散液滴荧光检测四大模块为一体的肿瘤细胞检测芯片，实现从外周血内快速检测循环肿瘤细胞的有无，完成对肿瘤细胞的检测。

Description

一种基于微流控技术的肿瘤细胞检测芯片
技术领域
本发明涉及一种基于微流控技术的肿瘤细胞检测方法及芯片，具有精准、经济、快捷的优势。本发明属于微流控技术在医学领域应用及肿瘤细胞检测领域。
背景技术
在癌症发病过程中，肿瘤细胞转移是导致肿瘤治疗失败、癌症患者死亡的主要原因。肿瘤细胞从原发实体肿瘤灶转移至其它位置形成继发肿瘤的主要途径为通过外周血液循环，针对血液中循环肿瘤细胞(CTCs)进行临床检测对评估患癌风险和监控治疗效果具有重要意义。欧美国家率先踏入循环肿瘤细胞检测领域，在机理性探究和实验验证方面取得了突破性进展，但仍处于发展阶段。
随着近年来微流控技术的高速发展，其精确操控、微量快速的技术优势为新型循环肿瘤细胞(CTCs)快速检测技术的革新提供了新途径。微流控(Microfluidics)技术又称芯片实验室(lab on a chip)技术，将生物、化学等宏观检测实验功能集成到一枚数厘米尺寸的生物芯片上，利用微通道(微米级)操控处理微小流体(纳升到微升)，具有精准、微型、可集成等颠覆性优势，被应用于新一代医疗诊断、药品检测、化学分析等领域。
目前常用的肿瘤细胞检测方法有流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)两大类，基于微流控的肿瘤细胞检测方法目前还处于起步阶段。
一、流式细胞术肿瘤细胞检测方法
流式细胞术检测方法是集流体动力学、电子物理学和细胞免疫学等方法为一体的细胞分析技术。该检测方法利用肿瘤细胞单抗结合荧光物质特异性特点，完成对特定肿瘤细胞的染色标定，通过流式细胞仪完成检测分析。采用流式细胞术方法具有可定量检测循环肿瘤细胞(CTCs)的优势，但针对于快速和肿瘤普查检测来说，流式细胞术检测手段存在相关不足：①检测费用昂贵，难以推广。流式细胞仪的设备价格在50-100万范围内，单次检测费用在3000元左右，较高的成本在一定程度上限制了流式细胞仪的应用和推广；②检测周期长。流式检测过程中待检细胞需在流式细胞仪中依次排列前进，且需要对每个细胞进行荧光检测，需要对全血样本中数以万计细胞进行逐一检测需要花费较长检测时间。
二、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)肿瘤细胞检测方法
逆转录聚合酶链反应检测CTCs是基于组织或肿瘤特异性mRNA的表达或某些基因改变后DNA水平的异常实现的，从外周血中检测到特异mRNA可以间接反映CTCs的存在。目前，RT-PCR的灵敏度已经很高，在晚期癌症患者的外周血中，RT-PCR技术可实现从每毫升血液中检测到单个肿瘤细胞。但同样存在不足：①检测不稳定，容易受干扰。由于mRNA的不稳定性、取样时上皮细胞的污染、肿瘤标志物在外周血的非正常表达及假基因干扰等多种因素都可造成检测结果的假阳性。②检测成本昂贵。由于RT-PCR技术属于基因检测技术，发展尚不完善，检测成本较高，单次个体检测成本在8000-10000元/次，制约了该技术的推广与应用。③无法实现定量检测。该方法无法实现形态学观察以及肿瘤细胞的定量检测。
目前传统的循环肿瘤细胞检测技术如流式细胞术和逆转录聚合酶链反应法都存在检测周期长、成本高的问题，无法满足癌症早期大范围快速普查的需求。
三、基于微流控技术的肿瘤细胞检测方法
目前国内外利用微流控技术实现肿瘤细胞检测的设备大多处于研究阶段，实际应用到市场中的较少。多数仪器采用需要电场、磁场等外加能量场输入的主动式微流控技术，实现对全血样本中肿瘤细胞的快速检测，相比于被动式主动式的检测速率更快，但是外界能量的输入会对血液样本中细胞产生破坏，生物兼容性较差，最终在一定程度上影响着检测精度。
本发明利用精准、微量的微流控技术优势，克服现有检测方法中肿瘤细胞捕获困难、特异标记欠缺、混杂成分干扰等不足，满足新一代高效癌症普查需求，为癌症疾病的早期排查、疗效检测、预后复诊提供便携高效的初步检测手段。
发明内容
本发明利用循环肿瘤细胞携带肿瘤信息的特征，结合惯性微流控细胞分选技术、混沌式微通道混合技术、液滴定量包裹技术，一套集循环肿瘤细胞快速分选、检测样本均匀混合、混合试剂定量包裹和离散液滴荧光检测四大模块为一体的肿瘤细胞检测芯片，实现从外周血内快速检测循环肿瘤细胞的有无，完成对肿瘤细胞的检测。
在循环肿瘤细胞检测的整个过程中具有三大原创核心技术，分别为循环肿瘤细胞的惯性分选技术、样本与标记物的快速混合技术和检测溶液的稳定包裹技术；本发明将三大技术结合，最终实现肿瘤细胞的检测。
基于微流控的肿瘤细胞检测芯片主要分为四个模块，分别为循环肿瘤细胞快速分选模块(1)、检测样本均匀混合模块(2)、混合试剂定量包裹模块(3)和离散液滴荧光检测模块(4)，四个模块依次连接，共同集成在一片微流控芯片上，实现肿瘤细胞的检测。
在循环肿瘤细胞快速分选模块(1)中，样本溶液入口(5)和PBS缓冲液入口(6)与多行阵列的凹槽形捕获腔通道(7)连接，多行阵列的凹槽形捕获腔通道(7)由直通道(8)和矩形捕获腔(9)共同组成，而多行阵列的凹槽形捕获腔通道(7)一端与出口(10)和检测样本均匀混合模块(2)连接。
在检测样本均匀混合模块(2)中，循环肿瘤细胞快速分选模块(1)与入口(11)汇聚，与带有扩展腔的方波通道(12)连接，带有扩展腔的方波通道(12)由方波通道(13)和扩展腔(14)共同组成。带有扩展腔的方波通道(12)与嵌入障碍物式混合腔通道(15)连接，嵌入障碍物式混合腔通道(15)有六边形混合腔(16)和矩形挡板(17)组成。嵌入障碍物式混合腔通道(15)与混合试剂定量包裹模块(3)连接。
在混合试剂定量包裹模块(3)中，两个十字形通道的入口(18)和(19)分别于主通道(20)相连，主通道末端为渐扩结构(21)，渐扩结构(21)与离散液滴荧光检测模块(4)连接。
离散液滴荧光检测模块(4)由检测通道(22)和出口(23)组成。
循环肿瘤细胞快速分选模块(1)采用循环肿瘤细胞的惯性分选技术。循环肿瘤细胞的惯性分选技术利用微凹槽捕获通道结构将目标细胞从非均一溶液分选出来的新一代分选方法，具有通量高、分离纯度高、易集成等优势。本发明利用该技术可以对全血中含量低的循环肿瘤细胞(CTCs)进行浓缩分选，排除血细胞等非检测目标细胞的检测干扰，提高芯片检测精度。
循环肿瘤细胞的惯性分选技术原理主要依靠细胞的偏移捕获。微凹槽细胞捕获过程分为三个阶段：细胞进入捕获腔前的惯性聚焦阶段，细胞被微腔捕获的捕获阶段及细胞进入捕获腔后的运动阶段。细胞在进入捕获腔之前通道内会由“偏移理论”聚焦在平衡位置，“偏移理论”指细胞在微通道随着流体运动时会受到流体惯性升力的作用，惯性升力是一对平衡力，由剪切梯度升力和壁面诱导升力组成，达到平衡位置的细胞保持平衡状态稳定规则的向前运动。细胞由直通道平衡位置进入捕获腔时，细胞距离通道壁面距离突然增大，导致由壁面作用产生在细胞上的壁面诱导升力急剧减小，原来细胞所受平衡状态被打破，细胞主要在剪切梯度升力单个作用力的作用下向捕获腔内侧偏移，最终被捕获腔内形成的独立涡胞所捕获，即为微腔细胞偏移捕获技术。
检测样本均匀混合模块(2)采用样本与标记物的快速混合技术。样本与标记物的快速混合技术利用被动式微混合器完成分选出的细胞与标记物溶液充分混合，实现对循环肿瘤细胞(CTCs)的染色与标记。该方法具有通量高、易集成、混合效率高和稳定等优势。本发明利用该技术使循环肿瘤细胞与标记性抗体特异性结合为后期液滴包裹和荧光检测提供基础，提高芯片检测精度。
样本与标记物的快速混合技术的原理是利用流体在微通道中形成的旋涡和二次流产生的对流效应促进循环肿瘤细胞与标记性抗体特异性结合。该技术的关键为微通道结构的设计，本发明将带有扩展腔的方波型微通道与嵌入障碍物式的微混合器进行结合，实现样本与标记物的快速混合功能。带有扩展腔的方波型微混合器在通道转弯处会形成两个上下对称的旋涡，同时扩展腔的引入也促进了旋涡的产生，嵌入障碍物式的微混合器会在障碍物前后各形成两个上下对称的旋涡。旋涡的产生延长两种流体的交界面，产生对流效应，打破流体分层流动的状态，同时通道结构也会使流体产生拉伸、折叠、分离、重组和变形，共同促进了样本与标记物的快速混合。
混合试剂定量包裹模块(3)采用检测溶液的稳定包裹技术。检测溶液的稳定包裹技术是利用十字形通道结构将细胞与标记物特异性结合后的溶液进行包裹，离散成微小液滴，避免了外界溶液对细胞的二次污染，提高荧光检测的对比度。具有通量高、结构简单和稳定性高的优势。本发明利用该技术对筛选出的循环肿瘤细胞连续的浓缩液进行离散液滴包裹，包裹后的液滴规则单层的排布可实现快速荧光扫描检测，同时包裹后的细胞可以形成相对封闭的环境，避免交叉污染，提高检测速率。
检测溶液的稳定包裹技术的原理是通过流动聚焦型液滴生成方法将细胞溶液离散成大小均一的微液滴。在液滴包裹过程中，液滴的尺寸、稳定性和生成频率受到两相流量、粘度和界面张力的共同影响，确定适合的物性参数和选取特定的流量范围是生成液滴大小均一且稳定的关键。本发明利用十字形微通道结构在剪切力、粘性力、惯性力、界面张力的共同作用下将细胞与标记物的混合溶液在外相氟油的剪切下离散成大小均一的微液滴，渐扩的微通道结构也保证了液滴的稳定生成。使得荧光检测的效率和精度大大提升。
本产品中微流控芯片的制作选择PDMS材质，具有工艺简便、成本低廉、良好的化学惰性、易满足微小通道尺寸精度要求等优势。采用SU-8负性光刻技术进行凸模刻蚀，铬板掩膜板进行掩膜曝光，通道加工具体操作步骤如下：
a)清理硅片。先以质量分数比为3:1的浓硫酸和双氧水混合溶液清洗厚度均匀的硅片，清洗后的硅片表面亲水性增强进而容易挂胶。再用无水乙醇、丙酮、超纯水对硅片进行冲洗并烤制晾干备用。
b)旋涂光刻胶。将均匀铺满SU-8光刻胶的硅片放入甩胶机进行甩胶，调节不同转速以控制甩胶厚度。若胶层厚度不够，将已甩制的光刻胶烘干后再次甩胶直至达到要求。
c)硅片曝光。将掩膜板覆盖在旋涂的光刻胶上夹紧固定，用紫外线曝光机进行曝光。通道区域光刻胶在紫外线照射下发生固化反应，固化的光刻胶不溶于显影液。通道以外区域未被紫外线照射，不发生固化反应，可溶于显影液。
d)显影洗涤。将曝光后的胶板置于显影液内，溶解未固化的光刻胶。显影2至3次，直至通道完全显现出来，且通道周围未固化的光刻胶被完全洗掉。
e)PDMS浇注和热固。显影洗涤后的硅片放置于培养皿中，将质量分数为10:1的PDMS的预置剂(A胶)和凝固剂(B胶)搅拌后倒入培养皿。待气泡消失后将培养皿置于80℃的烘箱内烤制20分钟，PDMS便可固化成型。
f)芯片打孔。用直径为0.75mm的打孔器从通道一侧储液池处垂直打孔。将孔内残留碎屑清理干净，防止堵塞通道。
g)芯片键合。使用等离子键合机对通道和底板氧化处理，增强接触面间的粘附性。将通道和底板对正轻轻按压完成键合。将键合后的通道放入65℃的烘箱内加热4小时以提高其键合强度。
h)芯片切割。将键合后的芯片按照观测要求切割成规则形状以完成微流控芯片所有加工步骤。
整体的检测过程第一步为循环肿瘤细胞的快速分选。采用PBS缓冲液对待检测的全血样本进行5-10倍稀释，采用驱动泵分别将稀释后的样本溶液和PBS缓冲液分别从入口(5)和入口(6)通入检测芯片中，通过多行阵列的矩形捕获腔通道(7)，利用惯性微流控原理实现直径较大的球形循环肿瘤细胞进入捕获腔内，其它尺寸较小非检测血细胞(红细胞、血小板等)无法进入捕获腔，随主通道流体流走，并从芯片侧出口(10)排出。待检测液通入完毕后，缓慢降低流速，使捕获腔内的流场结构由分离流演变为附着流，进而实现捕获腔内被捕获的肿瘤细胞的释放，沿主通道进入下一混合通道(12)和(15)内。本过程可去除95％非检测细胞的影响，提高了肿瘤细胞的浓度，加快了检测速率。
第二步为检测样本的均匀混合。从入口(11)流入的具有特异性荧光抗体标记物的缓冲盐溶液，与浓缩后的肿瘤细胞溶液，先后经过带有扩展腔的方波式(12)和嵌入障碍物式(15)微混合器通道内，利用通道回转、分离、聚合等结构诱导产生对流和旋涡，打破两种流体间的层流状态，使流体间的接触面积增大，实现细胞与标记物充分接触黏附，完成目标肿瘤细胞的荧光标记。染色后的检测液沿主通道流入液滴包裹通道中。
第三步为混合试剂的定量包裹。肿瘤细胞和荧光染色剂混合溶液作为包裹液滴的内相流体，将生物兼容性较好的氟油作为外相流体，从入口(18)通入芯片中通过十字交叉通道实现液滴包裹，形成单分散性好的油包水即“O/W”类型的液滴，该结构也允许不包含肿瘤细胞的空液滴存在。同时向通道入口(19)中通入PBS缓冲液，扩大生成液滴之间的间距，避免生成的液滴在通道中发生融合。
第四步为离散液滴的荧光检测。离散后包裹的液滴以圆形结构规则的排布在检测腔(22)内，用荧光检测仪进行扫描检测。由于检测液滴的单层规则排列，如果检测样本存在目标肿瘤细胞，此处荧光检测视野内就会出现高亮的包裹液滴，可以快速判断患者有极大可能具有患癌风险，达到初步检测目的。检测溶液最终从出口(23)排出并进行收集处理，完成所有的检测过程。
本发明采用上述技术方案后具有下列优势：
一、微量检测
微流控技术的自身优势使本作品需要的检测样本较少(数毫升患者全血)，芯片通道结构为微米级别尺度，通道整体体积为微升级，检测过程中所消耗检测试剂较少，成本消耗低。同时，废液收集更为方便，便于在大范围内推广癌症普查这一初期检测手段。
二、高精度检测
通过微流控技术将包含肿瘤细胞的样本溶液快速包裹成微液滴，大量的微液滴在微流控芯片中呈规则单层的排列方式分布。通过荧光扫描检测技术可实现肿瘤细胞的快速、高效检测，以微液滴为单位的形式使得肿瘤细胞更容易被检测到，可显著提升检测精度。
三、快速检测
肿瘤细胞的分选可以大幅度精简非目标细胞，去除95％非检测细胞。被动式微混合器结构可实现“随通入随混合”，且混合效率达到92％以上。采用液滴快速包裹方法单通道最快可实现6000个/分钟的高效液滴包裹，经过荧光检测后可直接获得检测结果。
四、多种类检测
不同类型的肿瘤细胞大小尺寸和特异性均不相同，本发明可根据不同肿瘤细胞特征利用被动式微流控技术和生物特异性标记相结合的方法，通过设计不同的通道结构和更换不同的标记物实现肺癌、宫颈癌、乳腺癌等多种癌症的早期检测。
附图说明
图1为基于微流控技术的癌症早期检测芯片模块图。
图2为循环肿瘤细胞快速分选模块结构图。
图3为检测样本均匀混合模块结构图。
图4为混合试剂定量包裹模块结构图。
图5为离散液滴荧光检测模块结构图。
图6为及与微流控技术的肿瘤细胞检测芯片结构图。
注释：
1.循环肿瘤细胞快速分选模块 2.检测样本均匀混合模块 3.混合试剂定量包裹模块 4.离散液滴荧光检测模块 5.样本溶液入口 6.PBS缓冲液入口 7.多行阵列的矩形捕获腔通道 8.捕获通道 9.捕获腔 10.非检测细胞排出出口 11.荧光抗体标记物溶液入口12.带有扩展腔的方波式混合通道 13.方波通道 14.扩展腔 15.嵌入障碍物式混合通道16.六边形混合腔 17.矩形挡板 18.氟油入口 19.PBS缓冲液入口 20.液滴包裹主通道21.渐扩结构 22.检测通道 23.检测溶液出口
具体实施方式
1.加工方法
本发明为一款能够实现样本中目标肿瘤细胞分选和检测的微流控芯片，由于芯片结构尺度较小(微米级)，采用高精度硅晶片SU-8光刻加工工艺、聚二甲基硅氧烷(PDMS)浇铸的方法完成芯片制作，检测芯片满足设计精度和通道内流体压力变形精度要求。
2.工作过程
检测样本通入芯片后，利用被动式矩形捕获腔通道结构完成肿瘤细胞高效分选，利用带有扩展腔的方波式和嵌入障碍物式微混合器通道完成肿瘤细胞与生物标记物均匀混合，利用十字形通道结构将检测样本离散成微小液滴单层规则排布在检测通道中，最终通过荧光扫描检测实现肿瘤细胞的快速检测，从而完成癌症的早期检测。

Claims (7)

1.一种基于微流控技术的肿瘤细胞检测芯片，其特征在于：该检测芯片分为四个模块，分别为循环肿瘤细胞快速分选模块(1)、检测样本均匀混合模块(2)、混合试剂定量包裹模块(3)和离散液滴荧光检测模块(4)，四个模块依次连接，共同集成在一片微流控芯片上，实现肿瘤细胞的检测；
在循环肿瘤细胞快速分选模块(1)中，样本溶液入口(5)和PBS缓冲液入口(6)与多行阵列的凹槽形捕获腔通道(7)连接，多行阵列的凹槽形捕获腔通道(7)由直通道(8)和矩形捕获腔(9)共同组成，而多行阵列的凹槽形捕获腔通道(7)一端与出口(10)和检测样本均匀混合模块(2)连接；
在检测样本均匀混合模块(2)中，循环肿瘤细胞快速分选模块(1)与入口(11)汇聚，与带有扩展腔的方波通道(12)连接，带有扩展腔的方波通道(12)由方波通道(13)和扩展腔(14)共同组成；带有扩展腔的方波通道(12)与嵌入障碍物式混合腔通道(15)连接，嵌入障碍物式混合腔通道(15)有六边形混合腔(16)和矩形挡板(17)组成；嵌入障碍物式混合腔通道(15)与混合试剂定量包裹模块(3)连接；
在混合试剂定量包裹模块(3)中，两个十字形通道的入口(18)和(19)分别于主通道(20)相连，主通道末端为渐扩结构(21)，渐扩结构(21)与离散液滴荧光检测模块(4)连接；
离散液滴荧光检测模块(4)由检测通道(22)和出口(23)组成。
2.根据权利要求1所述的一种基于微流控技术的肿瘤细胞检测芯片，其特征在于：循环肿瘤细胞快速分选模块(1)采用循环肿瘤细胞的惯性分选技术，利用微凹槽捕获通道结构将目标细胞从非均一溶液分选出来；
循环肿瘤细胞的惯性分选技术依靠细胞的偏移捕获；微凹槽细胞捕获过程分为三个阶段：细胞进入捕获腔前的惯性聚焦阶段，细胞被微腔捕获的捕获阶段及细胞进入捕获腔后的运动阶段；细胞在进入捕获腔之前通道内会由“偏移理论”聚焦在平衡位置，“偏移理论”指细胞在微通道随着流体运动时会受到流体惯性升力的作用，惯性升力是一对平衡力，由剪切梯度升力和壁面诱导升力组成，达到平衡位置的细胞保持平衡状态稳定规则的向前运动；细胞由直通道平衡位置进入捕获腔时，细胞距离通道壁面距离突然增大，导致由壁面作用产生在细胞上的壁面诱导升力急剧减小，原来细胞所受平衡状态被打破，细胞在剪切梯度升力单个作用力的作用下向捕获腔内侧偏移，最终被捕获腔内形成的独立涡胞所捕获。
3.根据权利要求1所述的一种基于微流控技术的肿瘤细胞检测芯片，其特征在于：检测样本均匀混合模块(2)采用样本与标记物的快速混合技术，利用被动式微混合器完成分选出的细胞与标记物溶液充分混合，实现对循环肿瘤细胞的染色与标记；
样本与标记物的快速混合技术的原理是利用流体在微通道中形成的旋涡和二次流产生的对流效应促进循环肿瘤细胞与标记性抗体特异性结合；将带有扩展腔的方波型微通道与嵌入障碍物式的微混合器进行结合，实现样本与标记物的快速混合功能；带有扩展腔的方波型微混合器在通道转弯处会形成两个上下对称的旋涡，同时扩展腔的引入也促进了旋涡的产生，嵌入障碍物式的微混合器会在障碍物前后各形成两个上下对称的旋涡；旋涡的产生延长两种流体的交界面，产生对流效应，打破流体分层流动的状态，同时通道结构也会使流体产生拉伸、折叠、分离、重组和变形，共同促进了样本与标记物的快速混合。
4.根据权利要求1所述的一种基于微流控技术的肿瘤细胞检测芯片，其特征在于：混合试剂定量包裹模块(3)采用检测溶液的稳定包裹技术，利用十字形通道结构将细胞与标记物特异性结合后的溶液进行包裹，离散成微小液滴，避免了外界溶液对细胞的二次污染，提高荧光检测的对比度；对筛选出的循环肿瘤细胞连续的浓缩液进行离散液滴包裹，包裹后的液滴规则单层的排布实现快速荧光扫描检测，同时包裹后的细胞形成相对封闭的环境；
检测溶液的稳定包裹技术的原理是通过流动聚焦型液滴生成方法将细胞溶液离散成大小均一的微液滴；在液滴包裹过程中，液滴的尺寸、稳定性和生成频率受到两相流量、粘度和界面张力的共同影响，确定适合的物性参数和选取特定的流量范围是生成液滴大小均一且稳定的关键；利用十字形微通道结构在剪切力、粘性力、惯性力、界面张力的共同作用下将细胞与标记物的混合溶液在外相氟油的剪切下离散成大小均一的微液滴，渐扩的微通道结构也保证了液滴的稳定生成。
5.根据权利要求1所述的一种基于微流控技术的肿瘤细胞检测芯片，其特征在于：微流控芯片的制作选择PDMS材质；采用SU-8负性光刻技术进行凸模刻蚀，铬板掩膜板进行掩膜曝光。
6.根据权利要求1所述的一种基于微流控技术的肿瘤细胞检测芯片，其特征在于：加工具体操作步骤如下，
a)清理硅片；先以质量分数比为3:1的浓硫酸和双氧水混合溶液清洗厚度均匀的硅片，清洗后的硅片表面亲水性增强进而容易挂胶；再用无水乙醇、丙酮、超纯水对硅片进行冲洗并烤制晾干备用；
b)旋涂光刻胶；将均匀铺满SU-8光刻胶的硅片放入甩胶机进行甩胶，调节不同转速以控制甩胶厚度；若胶层厚度不够，将已甩制的光刻胶烘干后再次甩胶直至达到要求；
c)硅片曝光；将掩膜板覆盖在旋涂的光刻胶上夹紧固定，用紫外线曝光机进行曝光；通道区域光刻胶在紫外线照射下发生固化反应，固化的光刻胶不溶于显影液；通道以外区域未被紫外线照射，不发生固化反应，溶于显影液；
d)显影洗涤；将曝光后的胶板置于显影液内，溶解未固化的光刻胶；显影2至3次，直至通道完全显现出来，且通道周围未固化的光刻胶被完全洗掉；
e)PDMS浇注和热固；显影洗涤后的硅片放置于培养皿中，将质量分数为10:1的PDMS的预置剂A胶和凝固剂B胶搅拌后倒入培养皿；待气泡消失后将培养皿置于80℃的烘箱内烤制20分钟，PDMS便固化成型；
f)芯片打孔；用直径为0.75mm的打孔器从通道一侧储液池处垂直打孔；将孔内残留碎屑清理干净，防止堵塞通道；
g)芯片键合；使用等离子键合机对通道和底板氧化处理，增强接触面间的粘附性；将通道和底板对正轻轻按压完成键合；将键合后的通道放入65℃的烘箱内加热4小时以提高其键合强度；
h)芯片切割；将键合后的芯片按照观测要求切割成规则形状以完成微流控芯片加工。
7.根据权利要求1所述的一种基于微流控技术的肿瘤细胞检测芯片，其特征在于：整体的检测过程第一步为循环肿瘤细胞的快速分选；采用PBS缓冲液对待检测的全血样本进行5-10倍稀释，采用驱动泵分别将稀释后的样本溶液和PBS缓冲液分别从入口(5)和入口(6)通入检测芯片中，通过多行阵列的矩形捕获腔通道(7)，利用惯性微流控原理实现直径较大的球形循环肿瘤细胞进入捕获腔内，其它尺寸较小非检测血细胞无法进入捕获腔，随主通道流体流走，并从芯片侧出口(10)排出；待检测液通入完毕后，缓慢降低流速，使捕获腔内的流场结构由分离流演变为附着流，进而实现捕获腔内被捕获的肿瘤细胞的释放，沿主通道进入下一混合通道带有扩展腔的方波式(12)和嵌入障碍物式(15)内；去除95％非检测细胞的影响；
第二步为检测样本的均匀混合；从入口(11)流入的具有特异性荧光抗体标记物的缓冲盐溶液，与浓缩后的肿瘤细胞溶液，先后经过带有扩展腔的方波式(12)和嵌入障碍物式(15)微混合器通道内，利用通道回转、分离、聚合结构诱导产生对流和旋涡，打破两种流体间的层流状态，使流体间的接触面积增大，实现细胞与标记物充分接触黏附，完成目标肿瘤细胞的荧光标记；染色后的检测液沿主通道流入液滴包裹通道中；
第三步为混合试剂的定量包裹；肿瘤细胞和荧光染色剂混合溶液作为包裹液滴的内相流体，将生物兼容性较好的氟油作为外相流体，从入口(18)通入芯片中通过十字交叉通道实现液滴包裹，形成单分散性好的油包水即“O/W”类型的液滴；同时向通道入口(19)中通入PBS缓冲液，扩大生成液滴之间的间距，避免生成的液滴在通道中发生融合；
第四步为离散液滴的荧光检测；离散后包裹的液滴以圆形结构规则的排布在检测腔(22)内，用荧光检测仪进行扫描检测；由于检测液滴的单层规则排列，如果检测样本存在目标肿瘤细胞，此处荧光检测视野内就会出现高亮的包裹液滴；检测溶液最终从出口(23)排出并进行收集处理，完成所有的检测过程。
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