CN113881563A - 用于分离t细胞与扩增一体化凝胶孵育液滴的一体化微流控芯片装置和方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于分离T细胞与扩增一体化凝胶孵育液滴的一体化微流控芯片装置和方法，所述装置包括：芯片本体，以及设置在所述芯片本体内的分离管路，包括缓冲液入口、血液入口、螺旋通道、第一分离管路、第二分离管路、T细胞管路、第一废液收集孔和第二废液收集孔，所述缓冲液入口和血液入口分别与螺旋通道的始端相连通，所述第一分离管路、第二分离管路和T细胞管路分别与螺旋通道的末端相连通；分装管路，包括油相入口、油相通道、汇合连接通道、第一蛇形通道和凝胶孵育液滴收集孔；所述汇合连接通道的一端与T细胞管路相连通，另一端与油相通道的末端相垂直连通形成倒T形结构。本发明可分离T细胞在快速增殖的同时保持低分化和高效力。

Description

用于分离T细胞与扩增一体化凝胶孵育液滴的一体化微流控 芯片装置和方法

技术领域

本发明涉及微流控技术与癌症免疫治疗学的交叉技术领域，特别涉及一种用于分离T细胞与扩增一体化凝胶孵育液滴的一体化微流控芯片装置和方法。

背景技术

近年来，免疫疗法已成为治疗各种类型癌症和复发性病毒疾病的一种强有力和潜在的治疗方法。过继细胞疗法(adoptive cell transfer,，ACT)是一种免疫疗法，包括体外分离和扩增抗原特异性T细胞，然后过继转移回患者。越来越多的证据表明，抗原特异性CD8⁺T细胞的过继转移可能是对抗慢性病毒感染和恶性肿瘤(如黑色素瘤)的一种有效策略。最近Rosenberg SA的研究表明：外周血中循环的PD-1⁺CD8⁺T细胞能够特异性识别黑色素瘤抗原，并且与肿瘤局部表达PD-1的肿瘤侵润的特异性CD8⁺T具有相似的T细胞抗原受体(Tcell receptor,TCR)，因此PD-1可以作为从外周血获取肿瘤特异性T细胞的一个生物标记。那么，从血液中分离带有抗原特异性的T细胞，增殖回输患者，这提供了新的非侵入性策略，并为发展个性化的治疗提供新的方法。

然而，从宿主自身高效的获得抗原特异性CD8⁺T细胞步骤繁琐低效，而且为了产生足够数量的效应CD8⁺T细胞用于ACT，需要大量的CD8⁺T细胞体外扩增。众所周知，低分化“年轻”的CD8⁺T细胞在过继转移时，表现出更好的持久性和随后的抗肿瘤活性。然而扩增通常是以牺牲CD8⁺T细胞的分化和效力为代价的。因此现有技术存在：难以快速分离T细胞，分离的T细胞活性较低，CD8⁺T细胞的分化力过高和效力不高。

因此，如何急需开发一种用于分离T细胞与扩增一体化凝胶孵育液滴的一体化微流控芯片装置和方法，以解决上述技术问题。

发明内容

本发明目的是提供一种用于分离T细胞与扩增一体化凝胶孵育液滴的一体化微流控芯片装置和方法，可以快速分离T细胞，并使其保持活性，在快速增殖的同时保持低分化和高效力。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

在本发明的第一方面，提供了一种用于分离T细胞与扩增一体化凝胶孵育液滴的一体化微流控芯片装置，包括：芯片本体，以及设置在所述芯片本体内的流道；所述流道包括：

分离管路，包括缓冲液入口、血液入口、螺旋通道、第一分离管路、第二分离管路、T细胞管路、第一废液收集孔和第二废液收集孔，所述缓冲液入口和所述血液入口分别与所述螺旋通道的始端相连通，所述第一分离管路、所述第二分离管路和所述T细胞管路分别与所述螺旋通道的末端相连通，所述第一分离管路的末端设有所述第一废液收集孔，所述第二分离管路的末端设有所述第二废液收集孔；

分装管路，包括油相入口、油相通道、汇合连接通道、第一蛇形通道和凝胶孵育液滴收集孔；所述汇合连接通道的一端与所述T细胞管路相连通，另一端与所述油相通道的末端相垂直连通形成倒T形结构；所述油相通道的始端与所述油相入口相连通；所述第一蛇形通道的一端与所述油相通道相连通，另一端与所述凝胶孵育液滴收集孔相连通。

进一步地，所述汇合连接通道包括第二蛇形通道和垂直连接通道；

所述第二蛇形通道的一端与所述T细胞管路相连通，另一端与所述垂直连接通道靠近所述分离管路的一端相垂直连通；

所述油相通道的一端与所述油相入口相连通，另一端所述垂直连接通道远离所述分离管路的一端相垂直连通。

进一步地，所述垂直连接通道的高度为90-110μm，宽度为50-100μm。

进一步地，所述芯片本体包括基片和盖片，所述基片上或所述盖片内凹刻有凹槽或凹台，所述基片和所述盖片封装为一体以形成所述流道。

进一步地，所述螺旋通道的末端从靠近所述螺旋通道的螺旋中心到远离所述螺旋通道的螺旋中心方向依次分别与所述第一分离管路、所述T细胞管路和所述第二分离管路相连通。

进一步地，所述螺旋通道的尺寸为：高度为80-120μm，宽度为490-510μm，总长为12-15cm；所述螺旋通道的末端宽度为900-1100μm，分成三个出口，所述第一分离管路、所述T细胞管路和所述第二分离管路的宽度依次为230-270μm、380-420μm、330-370μm。

进一步地，所述第二蛇形通道和所述第一蛇形通道的高度均为90-110μm，宽度均为90-110μm。

进一步地，所述装置还包括：驱动模块，所述驱动模块分别与所述缓冲液入口、所述血液入口和所述油相入口相连通，所述驱动模块驱动缓冲液和血液输送至所述螺旋通道内，所述血液中的不同细胞在所述螺旋通道的离心力作用下于所述螺旋通道的另一端进行分离，分别进入所述第一分离管路、所述第二分离管路和所述T细胞管路。

在本发明的第二方面，提供了采用所述芯片装置从血液中制备T细胞凝胶孵育液滴的方法，所述方法包括：

将缓冲液和血液分别从所述缓冲液入口和所述血液入口通入所述螺旋通道，将油相从所述油相入口通入所述油相通道，于所述凝胶孵育液滴收集孔中形成微米级油包水液滴；

将乙酸加入所述凝胶孵育液滴收集孔中以使所述微米级油包水液滴凝胶化，获得海藻酸盐凝胶液滴；

将所述海藻酸盐凝胶液滴转移至全氟辛醇的水相中，离心弃去油相，获得T细胞凝胶孵育液滴。

进一步地，所述乙酸的终浓度为0.05-0.1(V/V)％。

进一步地，所述的血液采自宿主；所述的油相为有机氟化物；所述缓冲溶液包括含40-50mM海藻酸盐、佐剂和40-50mM Ca-EDTA络合物的磷酸盐缓冲液混合物，所述佐剂包括TLR1/2激动剂、细胞因子IL-21、抗人CD3抗体和抗人CD28抗体。

本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

本发明提供的一种用于分离T细胞与扩增一体化凝胶孵育液滴的一体化微流控芯片装置和方法，从血液中高效便捷的分离血液中的T细胞，并将其包裹在凝胶液滴中，配合佐剂的使用，提升CD8⁺T细胞及其PD-1⁺CD8⁺T细胞亚群的扩增效率、特别是有效扩增功能性CD8⁺T细胞的能力。为快速高效的分离扩增CD8⁺T细胞及其功能亚群并回输至患者体内，提供安全有效的方法，在保障技术安全性的同时，进一步提升肿瘤治疗的有效性；具体地：

(1)本发明提供的一种用于分离T细胞与扩增一体化凝胶孵育液滴的一体化微流控芯片装置，将缓冲液和血液分别从所述缓冲液入口和所述血液入口通入所述螺旋通道，所述血液中的不同细胞通过所述螺旋通道的离心力作用在所述螺旋通道的末端进行分离，获得载有T细胞的缓冲液并通过T细胞管路进入所述分装管路；分离原理：根据目标细胞的直径大小不同，在螺旋通道中受到的合力不同，导致在通道中偏移位置的不同，进而将不同的直径的细胞分离，本发明中设计的载有T细胞的缓冲液可以通过T细胞管路分离出来，因此，可以直接从宿主血液中分离T细胞；

将油相从所述油相入口通入所述油相通道，所述油相与所述载有T细胞的缓冲液于所述分装管路内混合，由于所述汇合连接通道另一端与所述油相通道的末端相垂直连通形成倒T形结构通道，在流体剪切力和表面张力之间的相互作用下将连续的流体分割成离散的微米级油包水液滴。由于所得凝胶液滴中封装了T细胞和佐剂，且佐剂中含有TLRs激动剂、重组细胞因子IL-21、抗人CD3抗体和抗人CD 28抗体，因此可以将T细胞封装在含有TLRs激动剂、重组细胞因子IL-21、抗人CD3抗体和抗人CD 28抗体的凝胶液滴中。T细胞可在海藻酸盐凝胶液滴结构中长期保持活性；T细胞在佐剂的刺激下，不仅提升CD8⁺T细胞及其PD-1⁺CD 8⁺T细胞亚群的扩增效率，而且增殖的CD 8⁺T的分化程度低，表达共刺激分子CD27和CD28水平更高，端粒更长，即“年轻”低分化的CD8⁺T细胞。

(2)本发明提供的从血液中制备T细胞凝胶孵育液滴的方法，具有操作简便、成本低、扩增效率高额优点，可在癌症的个性化免疫治疗领域得到应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为本发明实施例1提供的一种用于分离T细胞与扩增一体化凝胶孵育液滴的一体化微流控芯片装置的结构示意图，其中图1A为微流控芯片示意图；图1B为芯片结构图；图1C、图1D、图1E为芯片局部放大图；图1F为T细胞凝胶孵育液滴荧光显微图片；

图1中，附图标记为：1-芯片本体、11-基片、12-盖片；2-分离管路、21-缓冲液入口、22-血液入口、23-螺旋通道、24-第一分离管路、25-第二分离管路、26-T细胞管路、27-第一废液收集孔、28-第二废液收集孔；3-分装管路；31-油相入口、32-油相通道、33-汇合连接通道、331-第二蛇形通道、332-垂直连接通道、34-第一蛇形通道、35-凝胶孵育液滴收集孔；

图2为本发明实施例2中分离的T细胞凝胶孵育液滴在培养箱中孵育7天后，通过倒置荧光显微镜观察制备好的T细胞凝胶孵育液滴结果；其中，图2A为T细胞凝胶孵育液滴荧光显微图片；图2B为七天后T细胞凝胶孵育液滴荧光场图；图2C为不同时间T细胞在液滴中和培养瓶中增殖的数量比较图；图2D为不同时间T细胞在液滴中增殖图；

图3为实施例3-5的结果图，其中，图3A为7天后，在液滴增殖、在培养瓶增殖和在培养瓶增殖但缺少佐剂IL-21中表型为CD 27⁺CD 28⁺T细胞的百分数；图3B为7天后，在液滴增殖、在培养瓶增殖和在培养瓶增殖但缺少佐剂TLR1/2中表型为CD 8⁺PD-1⁺T细胞的百分数；图3C为7天后，在液滴增殖和在培养瓶增殖中分泌颗粒酶的T细胞的百分数；图3D为7天后，在液滴增殖和在培养瓶增殖中分泌穿孔素的T细胞的百分数；图3E为7天后，在液滴增殖和在培养瓶增殖中分泌IFN-γ的浓度；图3F为7天后，在液滴增殖和在培养瓶增殖中分泌TNF-α的浓度；

图4为本发明实施例提供的从血液中制备T细胞凝胶孵育液滴的方法的流程图。

具体实施方式

下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。

需要说明的是，当元件被称为“固定于”或“设于”另一个元件上，它可以直接在另一个元件上或者间接设在另一个元件上；当一个元件被称为是“连接于”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或间接连接至另一个元件上。

需要理解的是，术语“长度”、“宽度”、“上”、下”、“前”、“后”、“第一”、“第二”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本申请和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本申请的限制。

此外，在本申请的描述中，多个”、“若干个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。

本申请的技术方案总体思路如下：

根据本发明的一种典型的实施方式，提供一种肝脏类器官培养芯片，如图1所示，包括：芯片本体1，以及设置在所述芯片本体内的流道；所述流道包括：

分离管路2，包括缓冲液入口21、血液入口22、螺旋通道23、第一分离管路24、第二分离管路25、T细胞管路26、第一废液收集孔27和第二废液收集孔28，所述缓冲液入口21和所述血液入口22分别与所述螺旋通道23的始端相连通，所述第一分离管路24、所述第二分离管路25和所述T细胞管路26分别与所述螺旋通道23的末端相连通，所述第一分离管路24的末端设有所述第一废液收集孔27，所述第二分离管路25的末端设有所述第二废液收集孔28；

分装管路3，包括油相入口31、油相通道32、汇合连接通道33、第一蛇形通道34和凝胶孵育液滴收集孔35；所述汇合连接通道33的一端与所述T细胞管路26相连通，另一端与所述油相通道32的末端相垂直连通形成倒T形结构；所述油相通道32的始端与所述油相入口31相连通；所述第一蛇形通道34的一端与所述油相通道32相连通，另一端与所述凝胶孵育液滴收集孔35相连通。

上述技术方案中，本发明将缓冲液和血液分别从所述缓冲液入口21和所述血液入口22通入所述螺旋通道23，所述血液中的不同细胞通过所述螺旋通道22的离心力作用在所述螺旋通道23的末端进行分离，获得载有T细胞的缓冲液并通过T细胞管路26进入所述分装管路；分离原理：根据目标细胞的直径大小不同，在螺旋通道中受到的合力不同，导致在通道中偏移位置的不同，进而将不同的直径的细胞分离，本发明中设计的载有T细胞的缓冲液可以通过T细胞管路26分离出来，因此，可以直接从宿主血液中分离T细胞；

将油相从所述油相入口31通入所述油相通道32，所述油相与所述载有T细胞的缓冲液于所述分装管路3内混合，由于所述汇合连接通道33另一端与所述油相通道32的末端相垂直连通形成倒T形结构通道，在流体剪切力和表面张力之间的相互作用下将连续的流体分割成离散的微米级油包水液滴。由于所得凝胶液滴中封装了T细胞和佐剂，且佐剂中含有TLRs激动剂、重组细胞因子IL-21、抗人CD3抗体和抗人CD 28抗体，因此可以将T细胞封装在含有TLRs激动剂、重组细胞因子IL-21、抗人CD3抗体和抗人CD 28抗体的凝胶液滴中。T细胞可在海藻酸盐凝胶液滴结构中长期保持活性；T细胞在佐剂的刺激下，不仅提升CD 8⁺T细胞及其PD-1⁺CD 8⁺T细胞亚群的扩增效率，而且增殖的CD 8⁺T的分化程度低，表达共刺激分子CD27和CD 28水平更高，端粒更长，即“年轻”低分化的CD8⁺T细胞。

上述技术方案中，T形结构通道，在流体剪切力和表面张力之间的相互作用下将连续的流体分割成离散的微米级油包水液滴后，过所述第一蛇形通道与凝胶孵育液滴收集孔相连通，即所述第一蛇形通道的作用为：让形成的液滴稳定的流动，如果通道太宽液滴之间会相互作用，甚至会融合成大液滴。

作为一种优选的实施方式，所述汇合连接通道33包括第二蛇形通道331和垂直连接通道332；

所述第二蛇形通道331的一端与所述T细胞管路26相连通，另一端与所述垂直连接通道332靠近所述分离管路2的一端相垂直连通；

所述油相通道32的一端与所述油相入口31相连通，另一端所述垂直连接通道332远离所述分离管路2的一端相垂直连通。

所述第二蛇形通道331的作用为让通道内流体稳定，有利于后续形成液滴。随后经过垂直连接通道332，由于垂直连接通道332所述油相通道32的末端相垂直连通形成倒T形结构，在流体剪切力和表面张力之间的相互作用下将连续的流体分割成离散的微米级油包水液滴。

作为一种可选的实施方式，所述第一蛇形通道和所述第二蛇形通道的高度均为90-110μm，宽度均为90-110μm。所述第一蛇形通道和所述第二蛇形通道设计成所述尺寸，可以使层流更稳定。

作为一种可选的实施方式，所述垂直连接通道332的尺寸为：高度为90-110μm，宽度为40-60μm；所述垂直连接通道即为所述倒T形结构中的竖直结构，而所述倒T形结构中的水平结构(即为油相通道32的水平段)的尺寸为：高度为90-110μm，宽度为90-110μm；所述垂直连接通道332和油相通道32的水平段的尺寸若过大，需要更大的流速来形成液滴，流速的过大影响分离效果。尺寸若过小，形成的液滴太小，对影响封装在液滴中的T细胞增殖。

作为一种可选的实施方式，所述芯片本体1包括基片11和盖片12，所述基片11上或所述盖片12内凹刻有凹槽或凹台，所述基片11和所述盖片12封装为一体以形成所述流道。作为一种具体的实施方式，所述芯片本体1中所述盖片12具体尺寸如下：芯片长35mm，宽25mm。

作为一种可选的实施方式，所述螺旋通道的末端从靠近所述螺旋通道的螺旋中心到远离所述螺旋通道的螺旋中心方向依次分别与所述第一分离管路、所述T细胞管路和所述第二分离管路相连通。本发明实施例根据血液中目标T细胞的直径大小，设计分离区域中螺旋惯性微通道的高度、宽度和长度。调节不同流速，载有T细胞的缓冲液可以通过T细胞管路26分离出来，且提高目标细胞的分离效率和纯度。高纯度的目标细胞进入封装区域，血液中其他细胞移动进入废液收集区；

鉴于不同质量的物体在进行离心运动时的惯性不同，在同一运动体系中，不同质量大小的物体在进行离心运动时的运动路径或者半径不同，质量与体积较大的细胞会在所述螺旋通道中会沿着壁靠近所述螺旋通道的螺旋中心一侧的侧壁运动，并通过所述第一分离管路分离，质量与体积较小的细胞会在所述螺旋通道中会沿着壁远离所述螺旋通道的螺旋中心一侧的侧壁运动，并通过所述第二分离管路分离，载有T细胞的缓冲液通过中间的T细胞管路26分离出来；

作为一种具体的实施方式，螺旋通道的截面可以是矩形、梯形或圆形，在此不做限定，螺旋通道的截面是矩形或者梯形时，螺旋通道的横截面的高度为80-120μm，宽度为490-510μm，总长为12-15cm。一般的，可以理解，螺旋通道横截面的宽度以及高度的取值应当大于循环肿瘤细胞的最大直径，如此，以便于含有循环肿瘤细胞的样本液体在螺旋通道中运动。所述螺旋通道的尺寸设计在所述范围内的原因：所述螺旋通道的高度和宽度过小或过大都会影响分离效率和分离纯度，经过试验设计本发明的所述范围能够使得分离效率和分离纯度保持效率在70％-76％，分离纯度83％-87％；更为优选地，螺旋通道的横截面的高为100μm，宽为500μm，总长为13.5cm；

所述螺旋通道的末端宽度为900-1100μm，分成三个出口，所述第一分离管路、所述T细胞管路和所述第二分离管路的宽度依次为230-270μm、380-420μm、330-370μm。更为优选地，所述第一分离管路、所述T细胞管路和所述第二分离管路的宽度依次为250μm、400μm、350μm；

所述第一分离管路、所述T细胞管路和所述第二分离管路的宽度不同的原因：本申请发明人根据在出口处，细胞由于直径大小不同，离着外壁的距离不同，设计不同宽度更好的分离细胞提高分离纯度，本发明的尺寸能将分离纯度控制在83％-87％。

所述螺旋通道的螺旋数理论上越多越好，但是受芯片大小限制，一般可设计为2-4圈；

作为一种优选的实施方式，所述装置还包括：驱动模块，所述驱动模块分别与所述缓冲液入口、所述血液入口和所述油相入口相连通，所述驱动模块驱动缓冲液和血液输送至所述螺旋通道内，所述血液中的不同细胞在所述螺旋通道的离心力作用下于所述螺旋通道的另一端进行分离，分别进入所述第一分离管路、所述第二分离管路和所述T细胞管路；作为一种具体的实施方式，所述驱动模块可以为动力泵；

根据本发明实施例另一种典型的实施方式，提供采用所述芯片装置从血液中制备T细胞凝胶孵育液滴的方法，如图4所示，所述方法包括：

步骤S1、将缓冲液和血液分别从所述缓冲液入口和所述血液入口通入所述螺旋通道，将油相从所述油相入口通入所述油相通道，于所述凝胶孵育液滴收集孔中形成微米级油包水液滴；

所述的血液采自宿主；

所述缓冲溶液包括含40-50mM海藻酸盐、佐剂和40-50mM Ca-EDTA络合物的磷酸盐缓冲液混合物，所述佐剂包括TLR1/2激动剂、细胞因子IL-21、抗人CD3抗体和抗人CD28抗体。具体地，以磷酸盐缓冲液混合物为溶剂，溶解了TLR1/2激动剂(1g/mL)、细胞因子IL-21(10ng/mL)、抗人CD 3抗体(1g/mL)和抗人CD 28抗体(1g/mL)；

所述的油相为有机氟化物；

步骤S2、将乙酸加入所述凝胶孵育液滴收集孔中以使所述微米级油包水液滴凝胶化，获得海藻酸盐凝胶液滴；

所述乙酸的终浓度为0.05-0.1(V/V)％；乙酸的终浓度若过低有无法生成凝胶液滴，若过高容易使液滴中细胞死亡；乙酸的添加量是根据凝胶孵育液滴收集孔中以使所述微米级油包水液滴的体积决定的，用流速确定微米级油包水液滴的体积，Qv2(缓冲液)＝200μL/min，理论上5min收集处的体积为1mL，此时加入适量乙酸即可。

上述技术方案中，加入适量乙酸使液滴凝胶化，最终得到海藻酸盐凝胶液滴。所得凝胶液滴中封装了T细胞和佐剂；

步骤S3、将所述海藻酸盐凝胶液滴转移至全氟辛醇的水相中，离心弃去油相，获得T细胞凝胶孵育液滴。

上述技术方案中，所述全氟辛醇的水相中水相溶剂为PBS缓冲液，全氟辛醇(PFO)的浓度为15-25％(V/V)；全氟辛醇(PFO)的浓度小于15％，无法除去凝胶液滴表面活性剂，大于25％容易对细胞有损伤；

海藻酸盐凝胶液滴加入到含全氟辛醇(PFO)的水相中，PFO通过分离表面活性剂降低了油水界面的稳定性，一旦油水界面失稳，微凝胶就会立即从油相转移到水相，离心弃去油相，得到T细胞凝胶孵育液滴，重新分散到培养基中，置于含5％CO₂、37℃培养箱中培养。

下面将结合附图对本申请的一种用于分离T细胞与扩增一体化凝胶孵育液滴的一体化微流控芯片装置和方法进行详细说明。

实施例1、一种用于分离T细胞与扩增一体化凝胶孵育液滴的一体化微流控芯片装置及其制备方法

一、一种用于分离T细胞与扩增一体化凝胶孵育液滴的一体化微流控芯片装置，如图1所示，包括：

芯片本体1，包括基片11和盖片12，所述芯片本体长35mm，宽25mm；

以及设置在所述芯片本体内的流道；所述流道包括：

分离管路2，包括缓冲液入口21、血液入口22、螺旋通道23、第一分离管路24、第二分离管路25、T细胞管路26、第一废液收集孔27和第二废液收集孔28，所述缓冲液入口21和所述血液入口22分别与所述螺旋通道23的始端相连通，所述第一分离管路24、所述第二分离管路25和所述T细胞管路26分别与所述螺旋通道23的末端相连通，所述第一分离管路24的末端设有所述第一废液收集孔27，所述第二分离管路25的末端设有所述第二废液收集孔28；螺旋通道23：高100μm，宽500μm，总长为13.5cm。螺旋通道23末端宽度变为1mm，分成三个出口，第一分离管路24、T细胞管路26、第二分离管路25的宽度依次为250μm、400μm、350μm。

分装管路3，包括油相入口31、油相通道32、汇合连接通道33、第一蛇形通道34和凝胶孵育液滴收集孔35；所述汇合连接通道33的一端与所述T细胞管路26相连通，另一端与所述油相通道32的末端相垂直连通形成倒T形结构；所述油相通道32的始端与所述油相入口31相连通；所述第一蛇形通道34的一端与所述油相通道32相连通，另一端与所述凝胶孵育液滴收集孔35相连通。

进一步地，所述汇合连接通道33包括第二蛇形通道331和垂直连接通道332；

所述第二蛇形通道331的一端与所述T细胞管路26相连通，另一端与所述垂直连接通道332靠近所述分离管路2的一端相垂直连通；

所述油相通道32的一端与所述油相入口31相连通，另一端所述垂直连接通道332远离所述分离管路2的一端相垂直连通。

T型接口通道尺寸为100μm×50μm，第二蛇形通道尺寸为100μm×100μm。

二、所述用于分离T细胞与扩增一体化凝胶孵育液滴的一体化微流控芯片装置的制备方法

可通过3D打印技术在所述基片上或所述盖片内凹刻有凹槽或凹台，所述基片和所述盖片封装为一体以形成所述流道。

实施例2、利用芯片制备T细胞凝胶孵育液滴

将实施例1所述的芯片装置通过照紫外杀菌备用，在制备细胞疫苗之前，将1％的BSA溶液通入芯片，以减少细胞和通道成分的粘附。小鼠眼眶静脉丛取血，血液被储存在一个血液收集管中，预先加入肝素钠作为抗凝剂。缓冲液为含50mM海藻酸盐、50mM Ca-EDTA络合物、TLR1/2激动剂(1g/mL)、细胞因子IL-21(10ng/mL)、抗人CD 3抗体(1g/mL)和抗人CD28抗体(1g/mL)的PBS缓冲液。

如图1(A)所示，将缓冲溶液入口21和血液入口22分别连接到注射泵，以恒定的流量同时驱动样品。流速分别为Qv1(血液)＝20μL/min，Qv2(缓冲液)＝200μL/min，待分离部分稳定(约5min左右)，之后油相入口31同样利用注射泵驱动，以产生液滴。油相氟代烃油(HFE7500,Novec 7500Engineered Fluid)流速为20μL/min。稳定产生液滴后，在凝胶孵育液滴收集孔35，加入体积比为0.1％乙酸，凝胶化2分钟，立即转移至含有20％全氟辛醇的水相中，离心(1000rpm、1min)，弃去油相，用1×PBS冲洗2-3次，将T细胞凝胶孵育液滴重新分散到培养基中，置于含5％CO₂、37℃培养箱中培养，见图2A。

在培养箱中孵育7天后，通过倒置荧光显微镜观察制备好的T细胞凝胶孵育液滴，见图2B：在凝胶中的T细胞增殖。图2C可以看出T细胞在凝胶孵育液滴中增殖的速度更快。图2D可以清楚的看到T细胞的分裂增殖。

实施例3、凝胶孵育液滴和普通培养瓶中T细胞增殖后分化程度的比较

根据实施例2制备得到的T细胞凝胶孵育液滴，置于含5％CO₂、37℃培养箱中培养。期间每天更换一次培养基，培养基中还有TLR1/2激动剂(1g/mL)、细胞因子IL-21(10ng/mL)、抗人CD3抗体(1g/mL)和抗人CD28抗体(1g/mL)。7天之后，加入50M的柠檬酸钠将液滴溶解，用1×PBS冲洗，离心，取10⁶个/mL细胞用抗CD 4-FITC、抗CD 8-AP C、抗CD28-PE和抗CD27-Cy5各5L染色15min，用1×PBS冲洗，用流式细胞仪测量。

如图3A所示，在液滴中表型为CD27⁺CD28⁺的T细胞大约为77％左右，而在培养瓶中培养的T细胞表型为CD27⁺CD28⁺的为50％左右，说明在液滴中培养的T细胞分化程度低，变现的更为“年轻”。

实施例4、凝胶孵育液滴和普通培养瓶中T细胞增殖后抗原特异性PD-1⁺CD 8⁺T细胞亚群的扩增效率比较

根据实施例2制备得到的T细胞凝胶孵育液滴，置于含5％CO₂、37℃培养箱中培养。期间每天更换一次培养基，培养基中还有TLR1/2激动剂(1g/mL)、细胞因子IL-21(10ng/mL)、抗人CD3抗体(1g/mL)和抗人CD28抗体(1g/mL)。7天之后，加入50M的柠檬酸钠将液滴溶解，用1PBS冲洗，离心，取10⁶个/mL细胞用抗CD 4-FITC、抗CD 8-APC和抗PD-1-PE各5L染色15min，用1PBS冲洗，用流式细胞仪测量。

如图3B所示，在液滴中孵育的T细胞其PD-1⁺CD 8⁺T细胞亚群为8％左右，大约是培养瓶中PD-1⁺CD8⁺T细胞的两倍。说明在液滴中可以更好的保持并扩增PD-1⁺CD8⁺T细胞亚群，为下一步过继细胞疗法治疗肿瘤提供具有高度靶向性的效应T细胞。

实施例5、凝胶孵育液滴和普通培养瓶中T细胞增殖后细胞效力的比较

1、根据实施例2制备得到的T细胞凝胶孵育液滴，置于含5％CO₂、37℃培养箱中培养。期间每天更换一次培养基，培养基中还有TLR1/2激动剂(1g/mL)、细胞因子IL-21(10ng/mL)、抗人CD3抗体(1g/mL)和抗人CD28抗体(1g/mL)。7天之后，加入50M的柠檬酸钠将液滴溶解，用1PBS冲洗，离心后备用。

2、取10⁶个/mL细胞用抗CD 4-FITC、抗CD 8-APC、Granzyme B-PE和Perforin-PE各5L染色15min，用1PBS冲洗，用流式细胞仪测量。

3、取10⁶个/mL细胞分别用TNF-酶联免疫试剂盒和IFN-酶联免疫试剂盒测量细胞分泌的TNF-和IFN-。

结果如图3C和3D所示，在液滴中分泌颗粒酶B和穿孔素的细胞比例都高于在普通培养瓶中培养的T细胞，同时图3E和3F也表明在液滴中的T细胞会分泌更多的TNF-和IFN-，这些都表明在液滴中培养的T细胞有着更好的细胞效力。

最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (10)

1.一种用于分离T细胞与扩增一体化凝胶孵育液滴的一体化微流控芯片装置，其特征在于，包括：芯片本体，以及设置在所述芯片本体内的流道；所述流道包括：

分离管路，包括缓冲液入口、血液入口、螺旋通道、第一分离管路、第二分离管路、T细胞管路、第一废液收集孔和第二废液收集孔，所述缓冲液入口和所述血液入口分别与所述螺旋通道的始端相连通，所述第一分离管路、所述第二分离管路和所述T细胞管路分别与所述螺旋通道的末端相连通，所述第一分离管路的末端设有所述第一废液收集孔，所述第二分离管路的末端设有所述第二废液收集孔；

分装管路，包括油相入口、油相通道、汇合连接通道、第一蛇形通道和凝胶孵育液滴收集孔；所述汇合连接通道的一端与所述T细胞管路相连通，另一端与所述油相通道的末端相垂直连通形成倒T形结构；所述油相通道的始端与所述油相入口相连通；所述第一蛇形通道的一端与所述油相通道相连通，另一端与所述凝胶孵育液滴收集孔相连通。

2.根据权利要求1所述的一种用于分离T细胞与扩增一体化凝胶孵育液滴的一体化微流控芯片装置，其特征在于，所述汇合连接通道包括第二蛇形通道和垂直连接通道；

所述第二蛇形通道的一端与所述T细胞管路相连通，另一端与所述垂直连接通道靠近所述分离管路的一端相垂直连通；

所述油相通道的一端与所述油相入口相连通，另一端所述垂直连接通道远离所述分离管路的一端相垂直连通。

3.根据权利要求2所述的一种用于分离T细胞与扩增一体化凝胶孵育液滴的一体化微流控芯片装置，其特征在于，所述垂直连接通道的高度为90-110μm，宽度为50-100μm。

4.根据权利要求1所述的一种用于分离T细胞与扩增一体化凝胶孵育液滴的一体化微流控芯片装置，其特征在于，所述芯片本体包括基片和盖片，所述基片上或所述盖片内凹刻有凹槽或凹台，所述基片和所述盖片封装为一体以形成所述流道。

5.根据权利要求1所述的一种用于分离T细胞与扩增一体化凝胶孵育液滴的一体化微流控芯片装置，其特征在于，所述螺旋通道的末端从靠近所述螺旋通道的螺旋中心到远离所述螺旋通道的螺旋中心方向依次分别与所述第一分离管路、所述T细胞管路和所述第二分离管路相连通。

6.根据权利要求1或5所述的一种用于分离T细胞与扩增一体化凝胶孵育液滴的一体化微流控芯片装置，其特征在于，所述螺旋通道的尺寸为：高度为80-120μm，宽度为490-510μm，总长为12-15cm；所述螺旋通道的末端宽度为900-1100μm，分成三个出口，所述第一分离管路、所述T细胞管路和所述第二分离管路的宽度依次为230-270μm、380-420μm、330-370μm。

7.根据权利要求1所述的一种用于分离T细胞与扩增一体化凝胶孵育液滴的一体化微流控芯片装置，其特征在于，所述第二蛇形通道和所述第一蛇形通道的高度均为90-110μm，宽度均为90-110μm。

8.根据权利要求1所述的一种用于分离T细胞与扩增一体化凝胶孵育液滴的一体化微流控芯片装置，其特征在于，所述装置还包括：驱动模块，所述驱动模块分别与所述缓冲液入口、所述血液入口和所述油相入口相连通，所述驱动模块驱动缓冲液和血液输送至所述螺旋通道内，所述血液中的不同细胞在所述螺旋通道的离心力作用下于所述螺旋通道的另一端进行分离，分别进入所述第一分离管路、所述第二分离管路和所述T细胞管路。

9.一种采用权利要求1-8任一所述芯片装置从血液中制备T细胞凝胶孵育液滴的方法，其特征在于，所述方法包括：

将缓冲液和血液分别从所述缓冲液入口和所述血液入口通入所述螺旋通道，将油相从所述油相入口通入所述油相通道，于所述凝胶孵育液滴收集孔中形成微米级油包水液滴；

将乙酸加入所述凝胶孵育液滴收集孔中以使所述微米级油包水液滴凝胶化，获得海藻酸盐凝胶液滴；

将所述海藻酸盐凝胶液滴转移至全氟辛醇的水相中，离心弃去油相，获得T细胞凝胶孵育液滴。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述乙酸的终浓度为0.05-0.1(V/V)％；所述的血液采自宿主；所述的油相为有机氟化物；所述缓冲溶液包括含40-50mM海藻酸盐、佐剂和40-50mM Ca-EDTA络合物的磷酸盐缓冲液混合物，所述佐剂包括TLR1/2激动剂、细胞因子IL-21、抗人CD3抗体和抗人CD28抗体。

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