CN113462543A - 定量检测血液中癌细胞的微流控芯片 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种定量检测血液中癌细胞的微流控芯片，包括：细胞封装模块，用于生成并排出包裹不同细胞的各类液滴；混合模块，用于将各类液滴中所包含的溶液成分分别进行混合；孵化模块，用于孵化混合后的各类液滴；“T形”夹流液滴生成模块，用于生成包含检测混合试剂的液滴；液滴融合模块，用于将“T形”夹流液滴生成模块和孵化模块的液滴融合成大液滴；液滴捕获模块，用于捕获融合后的大液滴。本发明将细胞封装、混合、孵化、“T形”夹流液滴生成、液滴融合和液滴捕获等功能集成在一片微流控芯片上，一体化结构设计可简化检测操作、提高检测效率。
Description
技术领域
本发明涉及微流控芯片技术领域，尤其是一种定量检测血液中癌细胞的微流控芯片。
背景技术
循环肿瘤细胞(Circulatingtumorcells，CTCs)是存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称，在临床上被认为是肿瘤发生转移的早期征兆，检测血液中循环肿瘤细胞CTCs的数量对癌症病情的早期诊断及分期具有重要意义。准确高效的定量检测血液中癌细胞的一大挑战是血液中CTCs数量极其稀少，通常1ml血液中只存在1-100个CTCs，存在1010量级的红细胞以及104量级的白细胞，即使经过微流控芯片富集后的CTCs溶液中也会存在大量的白细胞。目前用于检测富集后的CTCs方法主要有免疫检测和分子检测，免疫检测通过抗原与抗体的特异性结合对CTCs进行检测，主要包含免疫组织化学技术、上皮细胞免疫斑点技术和流式细胞术，分子检测主要是通过基因表达来对CTCs进行检测，使用较为广泛的技术是RT-PCR技术以及LAMP技术。上述方法存在操作复杂，需要专业人员操作，检测成本高的问题。
液滴微流控技术可以高效的提供大量纳升甚至是飞升级别的单分散液滴作为独立的反应容器，在单细胞分析、酶动力学、蛋白质合成及高通量筛选等研究领域展现出了强大的潜力。通过将液滴微流控技术与CTCs分子检测方法结合，可以显著提高其检测效率、精度和通量，减少样品与试剂的消耗。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明提供一种定量检测血液中癌细胞的微流控芯片，目的是简化肿瘤细胞检测流程、对肿瘤细胞数量进行精确检测。
本发明采用的技术方案如下：
一种定量检测血液中癌细胞的微流控芯片，包括：
细胞封装模块，包括层流流道、第一氟化油流道和出流流道，所述层流流道供样品溶液及细胞裂解液分层流动，所述第一氟化油流道出口及层流流道出口同时和所述出流流道入口连接；
混合模块，包括连续折弯的混合流道，所述混合流道入口与所述出流流道出口连接；
孵化模块，包括抽油流道和第一主流道，所述抽油流道用于使第一氟化油排出，所述第一主流道入口与所述混合流道的出口连接；
液滴融合模块，包括沿流动方向依次设置的前段流道、中段流道和后段流道，所述前段流道入口与所述第一主流道出口连接，所述前段流道、后段流道的宽度小于所述中段流道的宽度；
“T形”夹流液滴生成模块，包括混合试剂流道和第二氟化油流道，所述混合试剂流道和第二氟化油流道出口通过同一出流管与所述前段流道的入口连接；
液滴捕获模块，包括连续折弯的第二主流道，所述第二主流道中沿流动方向设有若干用于捕获液滴的捕获结构。
其进一步技术方案为：
所述细胞封装模块的结构还包括样品溶液流道、细胞裂解液流道，所述样品溶液流道的一端设有样品溶液入口、所述细胞裂解液流道的一端设有细胞裂解液入口；所述样品溶液流道、细胞裂解液流道的另一端出口交叉汇合，并与所述层流流道的入口连接；
所述第一氟化油流道呈对称结构，且具有第一氟化油入口、两个180°相向设置的出口，所述层流流道的出口垂直对接于所述第一氟化油流道的两出口之间，并同时与所述出流流道入口连接。
所述混合流道为“S”形布置的弯曲流道，其宽度b1小于由所述出流流道排出的单个液滴直径。
所述第一主流道为“S”形布置的弯曲流道，其宽度b3大于等于由所述出流流道排出的单个液滴直径的3倍。
抽油流道与第一主流道之间设有筛选流道，所述筛选流道用于连通抽油流道与第一主流道；位于同一横截面上的所述筛选流道与其两侧的抽油流道和第一主流道构成“凹”字形结构，所述筛选流道的宽度b2大于等于由所述出流流道排出的单个液滴直径的两倍，所述筛选流道的高度h1小于等于由所述出流流道排出的单个液滴直径的1/2。
所述抽油流道一端连接抽油泵接口。
所述前段流道的宽度b4、所述后段流道的宽度b6均小于由所述出流流道排出的单个液滴直径，所述中段流道的宽度b5为所述出流流道排出的单个液滴直径的1.5-2倍；所述前段流道与所述中段流道之间、所述中段流道与所述后段流道之间顺滑过渡。
所述捕获结构包括槽体，所述槽体形成于所述第二主流道侧壁上，所述槽体的开口端为紧缩部，所述槽体的底面上设有连通部，所述连通部贯穿于第二主流道的侧壁。
所述第二主流道为“S”形布置的弯曲流道，其末端设有废液出口；所述第二主流道的宽度b7小于由所述出流流道排出的单个液滴直径；
所述紧缩部的宽度b8等于由所述出流流道排出的单个液滴直径的0.8倍；
所述槽体的宽度b9大于由所述出流流道排出的单个液滴直径；
所述连通部的宽度b10小于由所述出流流道排出的单个液滴直径的0.2倍。
所述“T形”夹流液滴生成模块的结构还包括混合试剂入口和第二氟化油入口，所述混合试剂流道和第二氟化油流道分别与所述出流管垂直设置，所述出流管出口与所述前段流道的入口垂直连接，所述第一主流道出口与所述前段流道入口沿直线对接。
本发明的有益效果如下：
本发明将细胞封装、混合、孵化、“T形”夹流液滴生成、液滴融合和液滴捕获等功能集成在一片微流控芯片上，一体化结构设计可简化检测操作、提高检测效率。
本发明将液滴微流控技术应用于LAMP检测技术，利用液滴微流控技术实现对细胞和LAMP混合试剂的共封装，可应用于对产生荧光的液滴进行计数，实现对血液中癌细胞的定量检测，可以提高检测精度，减少样本和试剂的消耗。具有成本低、操作简单、易于集成、微型化等特点，可广泛应用于临床诊断、生物学研究、生化分析等领域，尤其适用于血液中循环肿瘤细胞的定量检测，基因表达分析等方面。
本发明可与微流控分选芯片串联，直接用于定量检测血液中癌细胞。
本发明混合模块、孵化模块和捕获模块的流道的“S”形布置可节省幅面。
附图说明
图1为本发明的仰视结构示意图。
图2为本发明细胞封装模块的结构及工作原理示意图。
图3为本发明混合模块的结构及工作原理示意图。
图4为本发明孵化模块的结构及工作原理示意图。
图5为图4中A-A截面剖视图沿水平轴的镜像视图。
图6为图4中B-B截面剖视图顺时针旋转90度视图。
图7为本发明“T形”夹流液滴生成模块的结构及工作原理示意图。
图8为本发明液滴融合模块的结构及工作原理示意图。
图9为本发明液滴捕获模块的结构及工作原理示意图。
图10为本发明液滴捕获模块的捕获模块的结构示意图。
图中：1、细胞封装模块；2、混合模块；3、孵化模块；4、液滴捕获模块；5、液滴融合模块；6、“T形”夹流液滴生成模块；7、第一氟化油入口；8、左支流道；9、样品溶液入口；10、肿瘤细胞；11、白细胞；12、出流流道；13、层流流道；14、细胞裂解液入口；15、右支流道；16、混合流道；17、抽油流道；18、筛选流道；19、抽油泵接口；20、第一主流道；21、前段流道；22、中段流道；23、后段流道；24、捕获结构；241、槽体；242、紧缩部；243、连通部；25、第二主流道；26、废液出口；27、混合试剂入口；28、第二氟化油入口；29、第一类液滴；30、第二类液滴；31、空液滴；32、上凸弯道；33、下凹弯道；34、孵化后液滴；35、夹流液滴；36、新液滴；37、样品溶液流道；38、细胞裂解液流道；39、挡板；391、凸块；61、混合试剂流道；62、第二氟化油流道；63、出流管。
具体实施方式
以下结合附图说明本发明的具体实施方式。
如图1所示，本实施例的定量检测血液中癌细胞的微流控芯片，包括：
细胞封装模块1，如图2所示，包括层流流道13、第一氟化油流道和出流流道12，层流流道13供样品溶液及细胞裂解液分层流动，第一氟化油流道出口及层流流道13出口同时和出流流道12入口连接；
混合模块2，如图3所示，包括连续折弯的混合流道16，混合流道16入口与出流流道12出口连接；
孵化模块3，如图4所示，包括抽油流道17和第一主流道20，抽油流道17用于使第一氟化油排出，第一主流道20入口与混合流道16的出口连接；
液滴融合模块5，如图8所示，包括沿流动方向依次设置的前段流道21、中段流道22和后段流道23，前段流道21入口与第一主流道20出口连接，前段流道21、后段流道23的宽度小于中段流道22的宽度；
“T形”夹流液滴生成模块6，如图7所示，包括混合试剂流道61和第二氟化油流道62，混合试剂流道61和第二氟化油流道62出口通过同一出流管63与前段流道21的入口连接；
液滴捕获模块4，如图9所示，包括连续折弯的第二主流道25，第二主流道25中沿流动方向设有若干用于捕获液滴的捕获结构24。
上述细胞封装模块1、混合模块2、孵化模块3、“T形”夹流液滴生成模块6、液滴融合模块5和液滴捕获模块4均可采用聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane，PDMS)材料通过光刻技术进行多次曝光制作，然后与同一块玻璃底板键合。
上述细胞封装模块1用于生成并排出包裹有不同细胞(CTCs和WBCs)的各类液滴；混合模块2，用于将各类液滴中所包含的溶液成分分别进行混合；孵化模块3，用于孵化混合后的各类液滴；“T形”夹流液滴生成模块6，用于生成包含检测混合试剂的液滴；液滴融合模块5，用于将“T形”夹流液滴生成模块6和孵化模块3的液滴融合成大液滴；液滴捕获模块4用于捕获融合后的大液滴。
如图2所示，细胞封装模块1的结构还包括样品溶液流道37、细胞裂解液流道38，样品溶液流道37的一端设有样品溶液入口9、细胞裂解液流道38的一端设有细胞裂解液入口14；样品溶液流道37、细胞裂解液流道38另一端的出口交叉汇合，并与层流流道13的入口连接；
第一氟化油流道呈对称结构，且具有第一氟化油入口7、两个180°相向设置的出口，层流流道13的出口垂直对接于第一氟化油流道的两出口之间，并同时与出流流道12入口连接。
第一氟化油流道的结构具体包括左支流道8、右支流道15，左支流道8、右支流道15的出口汇合，使层流流道13的出口沿垂直方向对接于其中，形成“十字”夹流从而生成液滴从下方的出流流道12排出。左支流道8、右支流道15和层流流道13末端存在收缩段，可以生成均一性更好的液滴。
细胞封装模块1的工作原理如下：
自样品溶液入口9以一定流速引入样品，样品溶液为经过微流控分选芯片处理过的包含循环肿瘤细胞10和白细胞11的溶液，自细胞裂解液入口14以一定流速引入细胞裂解液，第一氟化油入口7以特定流速引入生物兼容性较好的HFE-7500氟化油并分散至左支流道8、右支流道15，样品溶液与细胞裂解液以层流状态交汇至层流流道13，并受到来自左支流道8、右支流道15中HFE-7500氟化油的剪切力，在出流流道12中形成包裹肿瘤细胞10的第一类液滴29、包裹白细胞的第二类液滴30以及未包裹任何细胞的空液滴31，调节第一氟化油入口7、样品液入口9以及细胞裂解液入口14的流速，可生成直径约为100μm的液滴。根据泊松分布原理，由于肿瘤细胞的数量与生成的液滴数量比值＞1∶10000，所以每个第一类液滴29中只包含一个肿瘤细胞10。生成的各类细胞进入混合模块2的混合流道16。
如图3所示，混合流道16为“S”形布置的弯曲流道，其宽度b1小于由出流流道12排出的单个液滴直径。从而可以利用更小的空间使液滴内的两种溶液获得更好的混合效果。
混合模块2的工作原理如下：
在上述各类液滴在进入混合模块2之前，液滴内部的样品溶液和细胞裂解液的流动是对称的，即样品溶液与细胞裂解液间的混合是十分缓慢的，当各类液滴进入到混合流道16的上凸弯道32处时，液滴内部两种液体的对称流动变为不对称流动，加速两种溶液之间的混合，当当各类液滴进入到混合流道16的下凹弯道33时，各类内的两种液体的不对称流动发生一次翻转，即每经过半个周期，不对称流动发生一次翻转。从而使得液滴内部的溶液形成较好的混合作用。内部溶液混合后的各类液滴由第一主流道20进入孵化模块3。
如图4所示，孵化模块3的第一主流道20为“S”形布置的弯曲流道，其宽度b3大于等于由出流流道12排出的单个液滴直径的3倍。抽油流道17与第一主流道20之间设有筛选流道18，筛选流道18用于连通抽油流道17与第一主流道20；如图5所示，位于同一横截面上的筛选流道18与其两侧的抽油流道17和第一主流道20构成“凹”字形结构，筛选流道18为长方体结构，其高度h1小于等于由出流流道12排出的单个液滴直径的1/2。如图6所示，筛选流道18的宽度b2大于等于由出流流道12排出的单个液滴直径的两倍。
具体地，在抽油流道17和第一主流道20平行设置，两者之间形成有分隔用的挡板39，挡板39底面上沿长度方向间隔设有凸块391，凸块391与上述的封装用的玻璃底板连接，使得相邻两凸块391之间形成上述筛选流道18。
抽油流道17一端连接抽油泵接口19。
具体地，筛选流道18通过沿第一主流道20流动方向设置的方波形结构件形成。
如图7所示，“T形”夹流液滴生成模块6的结构还包括混合试剂入口27和第二氟化油入口28，混合试剂流道61和第二氟化油流道62分别与出流管63垂直设置，出流管63出口与前段流道21的入口垂直连接，第一主流道20出口与前段流道21入口沿直线对接。
孵化模块3及“T形”夹流液滴生成模块6的工作原理如下：
孵化模块3设置有一个抽油泵接口19，会给左侧的抽油流道17提供一个负压，右侧的第一主流道20中的HFE-7500氟化油和孵化后液滴34代表上述各类液滴在流经筛选流道18附近时会受到负压的作用，这时HFE-7500会经筛选流道18流入到左侧的抽油流道17并经过抽油泵接口19排出，由于筛选流道18的高度h1≤0.5个液滴的直径(此处指由出流流道12排出的单个液滴直径，下同)，孵化后液滴34无法经由筛选流道18进入左侧的抽油流道17，会在后面液滴的推力作用下沿第一主流道20继续流动，由于筛选流道18的宽度b2≥2个液滴的直径，可以有效的避免孵化后液滴34将筛选流道18堵塞。孵化模块3将HFE-7500氟化油经由抽油泵接口19排出，将液滴在油相中的非周期性流动变为了周期性流动，由此可以很好的控制孵化后液滴34从孵化模块3进入液滴融合模块5的速率。
如图7所示，“T形”夹流液滴生成模块设置有两个入口，即混合试剂入口27和第二氟化油入口28，带有荧光染料LAMP混合试剂以一定流速自混合试剂入口27流入混合试剂流道61，自第二氟化油入口28以一定流速引入在LAMP检测中热稳定性较好的FC-40氟化油到第二氟化油流道62，LAMP混合试剂受到FC-40氟化油的剪切力作用，形成夹流液滴35。
上述的孵化模块3控制孵化后液滴34从孵化模块3进入液滴融合模块5的速率。使得夹流液滴35和孵化后液滴34依次进入液滴融合模块5，确保在液滴融合模块5中每次只有一个来自孵化模块3的液滴34与一个来自“T形”夹流液滴生成模块6的夹流液滴35融合。
如图8所示，液滴融合模块5的前段流道21的宽度b4、后段流道23的宽度b6均小于由出流流道12排出的单个液滴直径，中段流道22的宽度b5为出流流道12排出的单个液滴直径的1.5-2倍；前段流道21与中段流道22之间、中段流道22与后段流道23之间顺滑过渡。
可参考图8，液滴融合模块5的液滴的融合原理如下：
前段流道21的宽度b4＜1个液滴直径，孵化后液滴34与夹流液滴35被压缩拉伸，而中段流道22的宽度b5介于1.5-2个液滴直径，所以液滴34进入中段流道22时速度下降并变为球形，此时液滴34的速度大于液滴35，所以液滴34会追及液滴35，两个液滴接触但是没有足够的力使他们融合为一个液滴，由于后段流道23的宽度b6＜1个液滴直径，所以液滴35在进入后段流道23时会受到左的阻力F1，速度下降，此时液滴34的速度保持不变，且受到FC-40氟化油向右的推力F2，在阻力F1和推力F2的共同作用下，来自孵化模块3的孵化后滴34与来自“T形”夹流液滴生成模块6的夹流液滴35发生融合形成新液滴36。
如图9和图10所示，液滴捕获模块4的捕获结构24包括槽体241，槽体241形成于第二主流道25侧壁上，槽体241的开口端为紧缩部242，槽体241的底面上设有连通部243，连通部243贯穿于第二主流道25的侧壁。图9中新液滴36被捕获结构24所捕获。
第二主流道25为“S”形布置的弯曲流道，其末端设有废液出口26；第二主流道25的宽度b7小于由出流流道12排出的单个液滴直径；
紧缩部242的宽度b8等于由出流流道12排出的单个液滴直径的0.8倍；
槽体241的宽度b9大于由出流流道12排出的单个液滴直径；
连通部243的宽度b10小于由出流流道12排出的单个液滴直径的0.2倍。
液滴捕获模块4的工作原理如下：
由于第二主流道25的宽度b7＜1个液滴的直径，新液滴36在第二主流道25中被压缩拉伸贴壁流动，这样有利于其进入捕获结构24。捕获结构24的紧缩部242宽度b8≈0.8个液滴直径，在保证新液滴36可以进入槽体241的同时也可以防止在LAMP加热过程中，液滴受热膨胀从槽体241中逃逸出来；捕获结构24的连通部243的宽度b10＜0.2个液滴直径，可以很好的将新液滴36限制在液滴捕获结构24的槽体241内。连通部243的宽度b10很小，可防止新液滴36逃逸，同时可使得FC-40氟化油通过，FC-40氟化油最终经废液出口26排出后被收集。
本申请将液滴微流控技术与LAMP检测技术结合，并将细胞封装、混合、孵化、“T形”夹流液滴生成、液滴融合和液滴捕获功能集成在一片微流控芯片上，可以直接与微流控分选芯片串联，借助荧光显微镜可直接用于定量检测血液中癌细胞，简化了检测操作，提高了检测效率和检测精度。
Claims (10)
1.一种定量检测血液中癌细胞的微流控芯片，其特征在于，包括：
细胞封装模块(1)，包括层流流道(13)、第一氟化油流道和出流流道(12)，所述层流流道(13)供样品溶液及细胞裂解液分层流动，所述第一氟化油流道出口及层流流道(13)出口同时和所述出流流道(12)入口连接；
混合模块(2)，包括连续折弯的混合流道(16)，所述混合流道(16)入口与所述出流流道(12)出口连接；
孵化模块(3)，包括抽油流道(17)和第一主流道(20)，所述抽油流道(17)用于使第一氟化油排出，所述第一主流道(20)入口与所述混合流道(16)的出口连接；
液滴融合模块(5)，包括沿流动方向依次设置的前段流道(21)、中段流道(22)和后段流道(23)，所述前段流道(21)入口与所述第一主流道(20)出口连接，所述前段流道(21)、后段流道(23)的宽度小于所述中段流道(22)的宽度；
“T形”夹流液滴生成模块(6)，包括检测混合试剂流道(61)和第二氟化油流道(62)，所述混合试剂流道(61)和第二氟化油流道(62)出口通过同一出流管(63)与所述前段流道(21)的入口连接；
液滴捕获模块(4)，包括连续折弯的第二主流道(25)，所述第二主流道(25)中沿流动方向设有若干用于捕获液滴的捕获结构(24)。
2.根据权利要求1所述的定量检测血液中癌细胞的微流控芯片，其特征在于，所述细胞封装模块(1)的结构还包括样品溶液流道(37)、细胞裂解液流道(38)，所述样品溶液流道(37)的一端设有样品溶液入口(9)、所述细胞裂解液流道(38)的一端设有细胞裂解液入口(14)；所述样品溶液流道(37)、细胞裂解液流道(38)的另一端出口交叉汇合，并与所述层流流道(13)的入口连接；
所述第一氟化油流道呈对称结构，且具有第一氟化油入口(7)、两个180°相向设置的出口，所述层流流道(13)的出口垂直对接于所述第一氟化油流道的两出口之间，并同时与所述出流流道(12)入口连接。
3.根据权利要求1所述的定量检测血液中癌细胞的微流控芯片，其特征在于，所述混合流道(16)为“S”形布置的弯曲流道，其宽度b1小于由所述出流流道(12)排出的单个液滴直径。
4.根据权利要求1所述的定量检测血液中癌细胞的微流控芯片，其特征在于，所述第一主流道(20)为“S”形布置的弯曲流道，其宽度b3大于等于由所述出流流道(12)排出的单个液滴直径的3倍。
5.根据权利要求1所述的定量检测血液中癌细胞的微流控芯片，其特征在于，抽油流道(17)与第一主流道(20)之间设有筛选流道(18)，所述筛选流道(18)用于连通抽油流道(17)与第一主流道(20)；位于同一横截面上的所述筛选流道(18)与其两侧的抽油流道(17)和第一主流道(20)构成“凹”字形结构，所述筛选流道(18)的宽度b2大于等于由所述出流流道(12)排出的单个液滴直径的两倍，所述筛选流道(18)的高度h1小于等于由所述出流流道(12)排出的单个液滴直径的1/2。
6.根据权利要求5所述的定量检测血液中癌细胞的微流控芯片，其特征在于，所述抽油流道(17)一端连接抽油泵接口(19)。
7.根据权利要求1所述的定量检测血液中癌细胞的微流控芯片，其特征在于，所述前段流道(21)的宽度b4、所述后段流道(23)的宽度b6均小于由所述出流流道(12)排出的单个液滴直径，所述中段流道(22)的宽度b5为所述出流流道(12)排出的单个液滴直径的1.5-2倍；所述前段流道(21)与所述中段流道(22)之间、所述中段流道(22)与所述后段流道(23)之间顺滑过渡。
8.根据权利要求1所述的定量检测血液中癌细胞的微流控芯片，其特征在于，所述捕获结构(24)包括槽体(241)，所述槽体(241)形成于所述第二主流道(25)侧壁上，所述槽体(241)的开口端为紧缩部(242)，所述槽体(241)的底面上设有连通部(243)，所述连通部(243)贯穿于第二主流道(25)的侧壁。
9.根据权利要求8所述的定量检测血液中癌细胞的微流控芯片，其特征在于，所述第二主流道(25)为“S”形布置的弯曲流道，其末端设有废液出口(26)；所述第二主流道(25)的宽度b7小于由所述出流流道(12)排出的单个液滴直径；
所述紧缩部(242)的宽度b8等于由所述出流流道(12)排出的单个液滴直径的0.8倍；
所述槽体(241)的宽度b9大于由所述出流流道(12)排出的单个液滴直径；
所述连通部(243)的宽度b10小于由所述出流流道(12)排出的单个液滴直径的0.2倍。
10.根据权利要求1所述的定量检测血液中癌细胞的微流控芯片，其特征在于，所述“T形”夹流液滴生成模块(6)的结构还包括混合试剂入口(27)和第二氟化油入口(28)，所述混合试剂流道(61)和第二氟化油流道(62)分别与所述出流管(63)垂直设置，所述出流管(63)出口与所述前段流道(21)的入口垂直连接，所述第一主流道(20)出口与所述前段流道(21)入口沿直线对接。
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