CN111763606A - 从血液中无标记分离循环肿瘤细胞的惯性聚焦微流控芯片 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种从血液中无标记分离循环肿瘤细胞的惯性聚焦微流控芯片，惯性聚焦微流控芯片包括输入端、之字形通道、多个具有自放大功能的直通道和输出端，输入端位于之字形通道的入口，之字形通道与具有自放大功能的直通道无缝连接，输出端位于具有自放大功能的直通道的出口，之字形通道的直径为0.03～0.05mm，具有自放大功能的直通道的直径为0.8～1.65mm。样品不需要复杂处理，通量高、速度快、分离率高，不需要外加工作场，不需要对细胞进行修饰(如孵育免疫磁珠)，而且流过芯片后的细胞活性不受影响，可以得到完整的细胞，分离后，细胞的活性不受影响，可以得到完整的细胞，为后期的研究提供有利的手段。

Description

从血液中无标记分离循环肿瘤细胞的惯性聚焦微流控芯片
技术领域
本发明涉及从红细胞裂解的血样中中分离循环肿瘤细胞和白细胞领域，尤其涉及一种从血液中无标记分离循环肿瘤细胞的惯性聚焦微流控芯片。
背景技术
癌症转移是癌症相关死亡率的主要原因，这与循环肿瘤细胞(CTC)相关。CTC是存在于血流中的极少数细胞(1-10CTC/mL)，从原发性或转移性肿瘤中脱落并流入外周血流。血液中CTC的数量有助于预测癌症的进展，可以用作癌症监测，预后和诊断的“液体活检”。尽管可以很容易地在外周血中以微创的方式获得CTC，但由于血细胞中的低含量，很难获得高纯度的CTC，而纯CTC对于进一步地生物学研究(例如癌细胞蛋白质分析)是必需的。因此，迫切需要能够有效，准确地分离CTC的方法，以促进癌症的诊断，预后和治疗。
随着微流体技术的不断涌现和广泛使用，许多研究人员投入了大量精力来开发更有效，更可靠的CTC分离系统，从使用免疫磁珠(例如CellSearch系统)到基于尺寸的微流体设备(例如，
Figure BDA0002545307490000011
FX1系统)。用于分离CTC的方法主要基于生物学特性，例如特异性抗原表达和受体，或物理特性，例如肿瘤细胞的大小和可变形性。基于尺寸和可变形性的方法包括惯性聚焦，声学，微流体滤波器，确定性侧向位移(DLD)，光学和介电电泳(DEP)。尽管基于CTC大小的进行分离地方法具有以无标记地方式实现分离的能力，但声学，光学和介电电泳(DEP)只能在额外的力场下运行，并且需要更长的处理时间，而堵塞问题阻碍了DLD和微过滤技术在临床重的广泛应用。近来，包括整合多个基于细胞尺寸进行分离地芯片的微流体通道或将生物学特性和物理特性组合在芯片上以实现更好的分离效率的方法正在成为一种新趋势，然而这使得操作过程变得复杂。对于要在临床中使用的设备，需要考虑包括高捕获效率，高细胞纯度，高细胞生存力和短处理时间的参数。惯性聚焦微流体利用了微观尺度的水动力学现象，由于在微流通道内不同大小的细胞、颗粒所受的惯性升力和DeanDrag力之间的力平衡，不同尺寸的细胞/颗粒可以彼此分离。因此，惯性聚焦微流体是实现CTCs连续，快速且无标记分离的有效且有吸引力的方法。
因此，本领域的技术人员致力于开发一种新的SAIF微流控芯片，该芯片能够实现基于大小，高通量，无标记的CTCs从血细胞分离。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是如何在不需要外加工作场的情况下快速、高通量的分离出循环肿瘤细胞。
为实现上述目的，本发明提供了一种惯性聚焦微流控芯片，包括输入端、之字形通道、具有自放大功能的直通道和输出端，输入端位于之字形通道的入口，之字形通道与具有自放大功能的直通道的入口无缝连接，输出端位于具有自放大功能的直通道的出口，之字形通道的直径为0.03～0.05mm，具有自放大功能的直通道的直径为0.8～1.65mm。
进一步地，多个具有自放大功能的直通道至少为两个，第一直通道的直径为0.8～0.85mm，第二直通道的直径为1.60～1.65mm，第二直通道接近输出端，第一直通道接近输入端。
进一步地，输入端有1个输入管道，输出端含有3个输出管道，第一输出管道与直通道位于同一水平线上，第二输出管道和第三输出管道分别与第一输出管道有夹角。
进一步地，惯性聚焦微流控芯片所用的制作材料为聚二甲基硅氧烷。
本发明还提供一种惯性聚焦微流控芯片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)分别称取聚二甲基硅氧烷和聚二甲基硅氧烷固化剂，聚二甲基硅氧烷和聚二甲基硅氧烷固化剂的质量比为10:1，并且混匀得到混合胶体，
(2)将混合胶体放到连接双级旋片式真空泵的真空干燥皿内，抽真空以确保混合胶体中没有气泡，
(3)把抽完真空的混合胶体导入到放置有目标图案的硅片的培养皿内，使混合胶体覆盖硅片表面，继续抽真空，使硅片与培养皿底部之间没有气泡，
(4)将步骤(3)中的培养皿放到电热恒温干燥箱内，烘干，
(5)将步骤(4)的培养皿从电热恒温干燥箱内取出来，分离聚二甲基硅氧烷和硅片，并且将聚二甲基硅氧烷的有图案的部分切成方形，用针头在输入端和输出端处打孔，
(6)清理聚二甲基硅氧烷芯片和载玻片的表面，确保两者表面干净之后，先将聚二甲基硅氧烷芯片和载玻片一并放到等离子清洗机内，
(7)打开等离子清洗机，时间设为50s，开始抽真空，观察等离子清洗机所显示的腔内压强值，当压强降到200pa时，停止继续抽真空，开辉光强度最高的开关，真空腔内出现偏紫色的辉光时，开始计时，取出聚二甲基硅氧烷芯片和载玻片之后，将二者粘在一起，
(8)将外径为0.8mm的四氟乙烯管插入到入口和出口，为了避免在实验过程中入口和出口会有液体漏出的现象，用聚二甲基硅氧烷混合液对输入端和输出端处进行封口，再继续烘0.5h。
进一步地，步骤(1)中聚二甲基硅氧烷和聚二甲基硅氧烷固化剂的称取量分别为25g和2.5g。
进一步地，步骤(3)的抽真空时间为10～15min。
进一步地，步骤(4)的电热恒温干燥箱内的温度为75℃，烘干45-60min。
进一步地，步骤(7)中为了更好的粘合聚二甲基硅氧烷芯片和载玻片，可把芯片放到烘箱内，可把芯片放到烘箱内，75℃下烘0.5h。
本发明还提供一种分离循环肿瘤细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)将血液样品进行常规的红细胞裂解、离心和去除上清液，得到实验品，
(b)将实验品从上述的惯性聚焦微流控芯片的输入端进入惯性聚焦微流控芯片，实验品依次经过之字形通道和两个具有自放大功能的直通道，流速为0.4mL/min，分离时间为30～40min，
(c)循环肿瘤细胞从位于惯性聚焦微流控芯片的输出端的第二输出管道和第三输出管道输出并收集，白细胞从与具有自放大功能的直通道处于同一水平线的第一输出管道输出。
技术效果
现有的技术如免疫磁珠法等，需要对样品进行免疫磁珠孵育，周期长，费用高，不同细胞表达的特异性抗原量不同，分离时可能丢失一些目标细胞，且影响对细胞进行后期分析研究；通量低，耗时，需要额外的工作场(电场、磁场)，分离率不高；现有的之字形通道只能实现细胞或颗粒的聚焦，不能在之字形区域实现分离；专一性较强，只适用于大小特定的细胞。
与现有技术相比，本发明的设计只利用流体力学来实现细胞在(惯性聚焦微流控芯片)SAIF芯片内连续并同时分离，并且可以实现多种细胞的分离；
样品不需要复杂处理，通量高、速度快、分离率高，不需要外加工作场，不需要对细胞进行修饰(如孵育免疫磁珠)，而且流过芯片后的细胞活性不受影响，可以得到完整的细胞，分离后，细胞的活性不受影响，可以得到完整的细胞，为后期的研究提供有利的手段；
利用细胞在微流控芯片内的受力不同而分离不同的细胞，因此分离不同细胞时，仅需要通过改变流速来实现分离，而不需要换芯片设计；
此发明中样品只需要进行红细胞裂解、常规的离心和去除上清液。跟其他现有的技术相比，减少了用免疫磁珠孵育细胞的时间。通量高，样品的流速为0.4mL/min，分离率大于75％，1mL的血可以在30min内处理完。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是本发明的一个较佳实施例的惯性聚焦微流控芯片设计和芯片中细胞分布的示意图；
图2是本发明的一个较佳实施例的惯性聚焦微流控芯片的尺寸与原理图；A.通道的结构图B.通道的尺寸图C.芯片入口流速为0.4mL/min时的流速模拟D.在通道中颗粒的受力分析；
图3是本发明的一个较佳实施例的最佳分离效果参数的优化结果图；(A)10μm和24μm颗粒的流速与从颗粒平衡位置到通道内壁的距离之间的关系(n＝50，数据来自3个独立试验)，对于24μm的颗粒，仅测量到内壁附近的距离；(B)在0.4mL/min的流速下，各个出口中颗粒的纯度；(C)以0.4mL/min的流速在通道中四个不同位置的10μm和24μm颗粒分布；(D)来自流式细胞仪的散点图；
图4是本发明的一个较佳实施例的芯片性能的评估图；(A)芯片对乳腺癌细胞系(MCF-7)和白细胞(WBC)分离后在各个出口中的纯度；(B)不同种类癌症细胞分离后的回收率；(C)白细胞和细胞系的大小分布；(D)细胞分离后在三个不同时间点的活性。
具体实施方式
以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
本文提及的SAIF chip是指惯性聚焦微流控芯片，CTCS为循环肿瘤细胞，WBC为白细胞，FD为Dean拽力，FL为惯性升力，FSG为剪切引起的惯性力，FWL为壁效应力。
本发明的原理是利用了流体在微米尺度下的性质，实现了不同大小细胞的连续分离。在微米尺度下，流体形成层流，不同大小的颗粒在层流中因惯性升力和Dean拽力的平衡，占有各自不同的平衡位置。在本发明中用一种由极细之字形通道和具有自放大功能的直通道组成的惯性聚焦微流控芯片(SAIF chip)，其中极细之字形通道的尺寸为40×50μm，循环肿瘤细胞(人乳腺癌细胞MCF-7、人肺癌细胞A549或者人宫颈癌细胞Hela)占据靠近通道外侧的平衡位置，而白细胞占据通道中心线附近的平衡位置。从进入到第一个变宽区，MCF-7、A549或者Hela由于突然消失的通道壁效应力，流向通道两侧，而白细胞保持原有的平衡位置，几乎处在通道的中心线上。并在第二个变宽区域，循环肿瘤细胞和白细胞之间的平衡位置再次被放大，从而在出口中所有的白细胞流向中间的出口，循环肿瘤细胞流向两个外侧的出口。如图1所示。
如图2所示，本发明的一种惯性聚焦微流控芯片，包括输入端1、之字形通道2、多个具有自放大功能的直通道3和输出端4，输入端1位于之字形通道2的入口，之字形通道2与具有自放大功能的直通道3无缝连接，输出端4位于具有自放大功能的直通道3的出口，之字形通道2的直径为0.04mm，具有自放大功能的直通道的第一放大径宽为0.84mm，第二放大径款为1.64mm。输入端1有1个输入管道，输出端4含有3个输出管道，第一输出管道41与直通道位于同一水平线上，第二输出管道42和第三输出管道43分别与第一输出管道41有夹角。
如图3所示，为了优化芯片分参数，首先用直径为10μm的聚苯乙烯球代替白细胞，用直径为24μm的聚苯乙烯球代替循环肿瘤细胞来进行优化。第一步是优化流速，由图3-A可知，随着流速的不一样，颗粒在通道内的平衡位置不一样，当流速为0.4mL/min时，10μm颗粒和24μm颗粒之间的距离最远，从而实现分离。图3-B是，当流速为0.4mL/min时，各个出口中颗粒的纯度，图3-C是颗粒在0.4mL/min流速下在通道内的分布情况，图3-D是在流速为0.4mL/min时从各个出口中收集的颗粒进行流式分析的结果。从以上结果可知，当流速为0.4mL/min时，10μm和24μm的颗粒可实现很好的分离。
如图4所示，以乳腺癌细胞系MCF-7细胞模拟乳腺癌患者体内的循环肿瘤细胞，将MCF-7、A549或Hela细胞掺入正常人血液中模拟从乳腺癌患者体内采集到的血液样本，来验证该芯片的功能。在优化完芯片最佳流速后，验证芯片对循环肿瘤细胞的分选。分别将1500个A549，MCF-7和Hela分别加入到不同的健康志愿者贡献的血液中，对红细胞进行裂解，使细胞悬浮液的最终体积为3mL，使肿瘤细胞系的浓度为500个/mL。为了方便对分离后的肿瘤细胞进行计数，在加入到血液前需要对细胞系用DiI进行染色。分离后在各个出口中MCF-7的纯度如图4-A所示，A549，MCF-7和Hela的回收率如图4-B所示。回收率没能实现100％。主要是因为有部分肿瘤细胞的大小与白细胞较接近，从而从白细胞的出口流失，白细胞和细胞系的大小分布如图4-C所示。考虑到后期可能需要对分离后的癌症细胞进行培养，需要分离出仍然有活性的细胞，因此用MCF-7验证了芯片对细胞活性不会产生很大的影响。细胞在三个不同时间点的活性如图4-D所示。
制备芯片：
1.取出一个纸杯，放到天平，使天平清零，缓慢倒25g的聚二甲基硅氧烷(PDMS))到纸杯，再次使天平清零，用1mL的移液枪缓慢加2.5g的聚二甲基硅氧烷固化剂使聚二甲基硅氧烷原液和聚二甲基硅氧烷固化剂的比例为10:1。
2.用搅拌玻璃棒将聚二甲基硅氧烷(PDMS)和聚二甲基硅氧烷(PDMS)固化剂充分搅拌混匀，放到连接双级旋片式真空泵的真空干燥皿内，抽10min真空，确保混合胶体中没有气泡。在抽真空的过程中注意及时放气，以免混合物溢出来。
3.把抽完真空的混合胶体导入到放置有目标图案的硅片的培养皿内，使混合胶体覆盖硅片表面，继续抽10min真空，使硅片与培养皿底部之间没有气泡。
4.培养皿放到温度为75℃的电热恒温干燥箱内，烘干45min。烘箱内的架子必须是水平的，否则烘干后的PDMS不平，一定程度上影响实验结果。
5.将培养皿取出来，用美工刀缓慢将PDMS从硅片表面撕下来，并把有图案的部分切成方形，用针头在入口和出口处打孔。此步骤需要注意三点：首先，在将PDMS撕下来的过程中，手术刀不能碰到硅片，否则会导致硅片碰碎。其次，打孔时一定要对准通道的对应入口和出口，并保证打孔器垂直插到PDMS上。最后，打完孔，需要用细导线戳一戳入口和出口，确保没有多余的PDMS留在入口和出口处。
6.用透明胶清理PDMS芯片和载玻片的表面，确保两者表面干净之后，先将PDMS芯片和玻璃片一并放到等离子清洗机内，PDMS有图案的面朝上。
7.打开等离子清洗机，时间设为50s，并开始抽真空，观察等离子清洗机所显示的腔内压强值，当压强降到200pa左右时，停止继续抽真空，开辉光强度最高的开关，真空腔内出现偏紫色的辉光时，开始计时。取出PDMS和载玻片之后，将迅速将二者粘在一起。为了进一步强化键合，可把芯片放到烘箱内，可把芯片放到烘箱内，75℃下烘0.5h。
8.烘完之后将外径为0.8mm的四氟乙烯管插入到入口和出口，并用的四氟乙烯管插入到入口和出口，为了避免在实验过程中入口和出口会有液体漏出的现象，用PDMS混合液对入口和出口处进行封口，再继续烘0.5h。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种惯性聚焦微流控芯片，其特征在于，所述惯性聚焦微流控芯片包括输入端、之字形通道、具有自放大功能的直通道和输出端，所述输入端位于所述之字形通道的入口，所述之字形通道与所述具有自放大功能的直通道的入口无缝连接，所述输出端位于所述具有自放大功能的直通道的出口，所述之字形通道的直径为0.03～0.05mm，所述具有自放大功能的直通道的直径为0.8～1.65mm。
2.如权利要求1所述的惯性聚焦微流控芯片，其中，所述具有自放大功能的直通道至少为两个，第一直通道的直径为0.8～0.85mm，第二直通道的直径为1.60～1.65mm，所述第二直通道接近输出端，所述第一直通道接近输入端。
3.如权利要求1所述的惯性聚焦微流控芯片，其中，所述输入端有1个输入管道，所述输出端含有3个输出管道，第一输出管道与所述直通道位于同一水平线上，第二输出管道和第三输出管道分别与所述第一输出管道有夹角。
4.如权利要求1～3任意一项所述的惯性聚焦微流控芯片，其中，所述惯性聚焦微流控芯片所用的制作材料为聚二甲基硅氧烷。
5.一种惯性聚焦微流控芯片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)分别称取聚二甲基硅氧烷和聚二甲基硅氧烷固化剂，所述聚二甲基硅氧烷和聚二甲基硅氧烷固化剂的质量比为10:1，并且混匀得到混合胶体，
(2)将所述混合胶体放到连接双级旋片式真空泵的真空干燥皿内，抽真空以确保混合胶体中没有气泡，
(3)把抽完真空的混合胶体导入到放置有目标图案的硅片的培养皿内，使混合胶体覆盖硅片表面，继续抽真空，使硅片与培养皿底部之间没有气泡，
(4)将步骤(3)中的培养皿放到电热恒温干燥箱内，烘干，
(5)将步骤(4)的培养皿从电热恒温干燥箱内取出来，分离聚二甲基硅氧烷和硅片，并且将聚二甲基硅氧烷的有图案的部分切成方形，用针头在输入端和输出端处打孔，
(6)清理聚二甲基硅氧烷芯片和载玻片的表面，确保两者表面干净之后，先将聚二甲基硅氧烷芯片和载玻片一并放到等离子清洗机内，
(7)打开等离子清洗机，时间设为50s，开始抽真空，观察等离子清洗机所显示的腔内压强值，当压强降到200pa时，停止继续抽真空，开辉光强度最高的开关，真空腔内出现偏紫色的辉光时，开始计时，取出聚二甲基硅氧烷芯片和载玻片之后，将二者粘在一起，
(8)将外径为0.8mm的四氟乙烯管插入到输入端和输出端，为了避免在实验过程中入口和出口会有液体漏出的现象，用聚二甲基硅氧烷混合液对入口和出口处进行封口，再继续烘0.5h。
6.如权利要求5所述的制备方法，其中，步骤(1)中聚二甲基硅氧烷和聚二甲基硅氧烷固化剂的称取量分别为25g和2.5g。
7.如权利要求5所述的制备方法，其中，步骤(3)的抽真空时间为10～15min。
8.如权利要求5所述的制备方法，其中，步骤(4)的电热恒温干燥箱内的温度为75℃，烘干45-60min。
9.如权利要求5所述的制备方法，其中，步骤(7)中为了更好的粘合聚二甲基硅氧烷芯片和载玻片，把芯片放到烘箱内，75℃下烘0.5h。
10.一种分离循环肿瘤细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)将血液样品进行常规的红细胞裂解、离心和去除上清液，得到实验品，
(b)将所述实验品从如权利要求1所述的惯性聚焦微流控芯片的输入端进入所述惯性聚焦微流控芯片，实验品依次经过之字形通道和两个具有自放大功能的直通道，流速为0.4mL/min，分离时间为30～40min，
(c)循环肿瘤细胞从位于所述惯性聚焦微流控芯片的输出端的第二输出管道和第三输出管道输出并收集，白细胞从与具有自放大功能的直通道处于同一水平线的第一输出管道输出。
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