CN109046481A - 一种用于细菌耐药性检测的微流控芯片及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物芯片和细菌检测技术领域，尤其涉及一种用于细菌耐药性检测的微流控芯片及其制备方法。本发明微流控芯片由实验区域、微流阀、微流阀蠕动泵和样品输入区构成；每个芯片包含多个相互独立的实验区域，每个实验区域均由集成于芯片的微流阀单独控制，其上包含64个相互连通的微米尺度的试验腔体，可产生16种不同的测试浓度，以实现高通量样品浓度测试的目的；实验区域和样品输入区之间由微流阀蠕动泵连接，通过程序设定顺序开关微流阀，以实现纳升精度样品的定点定时输送。本发明芯片和方法具有高通量、低消耗、检测快速、操控精度高、结果判定准确、人为因素干扰小等优点，能够对细菌耐药性进行高通量快速检测。

Description

一种用于细菌耐药性检测的微流控芯片及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物芯片和细菌检测技术领域，尤其涉及一种用于细菌耐药性检测的微流控芯片及其制备方法，以及其在生物医学中的应用。
背景技术
细菌耐药性又称抗药性，系指细菌对于抗菌药物作用的耐受性，耐药性一旦产生，药物的治疗作用就明显下降。
耐碳青霉烯类抗生素肠杆菌科细菌，是一类极易产生强耐药性的细菌，包括大肠埃希菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌等菌种。其菌株可产生一类β内酰胺酶——碳青霉烯酶，碳青霉烯酶可以水解碳青霉烯类抗生素分子中的β内酰胺环，进而使其失去抗菌活性。目前已证实，通过碳青霉烯酶水解药物介导菌株耐药是细菌对碳青霉烯耐药的主要机制之一。
2015年CLSI药敏试验标准引入的Carba NP试验根据这一原理，通过碳青霉烯酶可以水解亚胺培南分子中的β内酰胺环使其氢键断裂，释放质子，导致反应液pH值降低使指示剂发生颜色的改变来指示细菌是否耐药。Carda NP方法可以很好的将碳青霉烯酶介导的耐药机制同其他机制区分开，具有较高的特异性，此外还有重复性好、费用低等特点。
然而，在使用过程中Carba NP试验也暴露出了以下不足：(1)试验结果易受人为因素干扰，由于指示剂所显示的浅橘色和橘色这两种颜色的界限较模糊，不同的观察者对于颜色的区分和指示终点的判断差异较大；(2)检测效率低，因待检细菌需要在摇床中37℃恒温培养24小时，当出现能够抑制细菌的抗生素最小浓度时才能进行检测，而显色时间又需要至少2个小时，故总检测耗时较长；(3)灵敏度差，本方法通常需要使用3-4个接菌环，且对OXA-48型酶检测敏感度较低，需要单独检测，而对一些黏液性菌落菌株和产低活性碳青霉烯酶菌株检测更加困难。综上，上述缺陷极大地限制了本方法在细菌耐药性检测领域的推广使用。
发明内容
为了克服Carba NP试验存在的上述缺陷，本发明在反复试验的基础上，开发出了一种全新的用于细菌耐药性检测的微流控芯片。
本发明利用微流控芯片高通量、低消耗、自动化等优势，通过特定工艺将Carda NP方法集成到一块微米尺度的芯片上，所得芯片具有纳升量级流体操控精度、消耗试样和试剂极少、分析速度提高数十倍至上百倍等特点，可以在几分钟甚至更短的时间内对上百个样品进行同步分析，并且可以实现样品的在线预处理及分析全过程。
与此同时，本发明利用微流控芯片的微米尺度空间，能够在提高检测浓度梯度数量的同时显著提高颜色(灰度)的辨析程度，有效降低了人为因素对试验结果的干扰。
此外，本发明还通过对各项芯片制备条件的筛选和优化，建立了一套稳定高效的细菌耐药性检测微流控芯片制备工艺流程，本发明方法还可在适当调整的基础上推广适用于制备其他用途的检测微流控芯片，以满足各类研究及临床检测需求。
本发明用于细菌耐药性检测的微流控芯片由实验区域、微流阀、微流阀蠕动泵和样品输入区构成，其中：
微流控芯片包含12-30个相互独立的实验区域，所述实验区域成矩阵式排列，每个实验区域均由集成于芯片的微流阀独立于其他区域进行单独控制；因此本芯片可同时对12-30种生物样品或不同类型抗菌药物进行测试；
上述每个实验区域包含64个相互连通的微米尺度的试验腔体，在样品输送过程中，利用层流分流特性，一次性产生16种不同的测试样品浓度，每种测试样品浓度并行有4个同样条件的重复测试，以实现高通量样品浓度测试的目的；
所述样品输入区由与所述实验区域数目相同的样品输入口构成，每个样品输入口均由集成于芯片的微流阀单独控制；从而可以同时对多种生物样品或抗菌药物进行混合、输送；
在所述实验区域和样品输入区之间由至少一个微流阀蠕动泵连接，通过程序设定顺序开关三个微流阀，以实现纳升精度样品的定点定时输送。
优选地，上述微流控芯片包含20个相互独立的实验区域。
进一步地，上述用于细菌耐药性检测的微流控芯片中所述的细菌为耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌。
进一步地，上述耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌包括但不限于大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、不动杆菌、铜绿假单胞菌、变形菌、弗氏柠檬酸菌、产酸克雷伯菌、摩氏摩根菌、普罗威登菌。
进一步地，上述用于细菌耐药性检测的微流控芯片的制备方法，包括下述步骤：
(1)将表面带有微米结构的流动层硅基底和控制层硅基底放置于密封盒内，取500μl三甲基氯硅烷溶液在室温下对上述流动层硅基底和控制层硅基底进行表面处理10-20分钟；
(2)配制聚二甲基硅烷混合溶液：将聚二甲基硅烷原溶液与固化剂按照10﹕1的质量比混合，在混合机内以2000rpm的转速混胶1分钟，然后以2200rpm的转速去气2分钟；
(3)流动层的制备：取50g上述聚二甲基硅烷混合溶液浸没经表面处理的流动层硅基底，并置于真空箱内进行至少1小时的去气处理，直到所述流动层硅基底表面没有气泡为止，然后将所述流动层硅基底取出沥干后放入80℃烘箱内烘干45分钟；
(4)控制层的制备：将上述经表面处理的控制层硅基底置于匀胶机上，先以1200rpm的转速低速匀胶5秒，接着以2400rpm的转速高速匀胶30秒；然后将30g上述聚二甲基硅烷混合溶液缓慢倾倒在控制层硅基底上，在光学平台上静置5-10分钟，最后将所述控制层硅基底沥干后放入80℃烘箱内烘干7分钟，此时所述控制层硅基底上的聚二甲基硅烷混合溶液基本固化，已丧失流动性但用手接触时仍具有一定的粘性；
(5)多层结构的制备：将(3)步中得到的流动层按照基线进行切割，将切割整齐的流动层与(4)步中得到的控制层置于光学对准仪上进行结构校准与结合，结合过程中及时排除内部空气，避免芯片内有气泡产生，结合完成后将所得多层结构放入80℃烘箱内烘干6-12小时后得到PDMS芯片；
(6)将所述PDMS芯片从硅基底上分离，根据PDMS芯片上的标记点进行缓慢打孔，控制打孔速度避免对芯片结构造成损坏；
(7)等离子体处理：将大小适宜的洁净透明石英板放入等离子体机内，处理时间设置为5分钟；然后将打孔完成的PDMS芯片以控制层向上的方式与所述石英板同时放入等离子体机内，处理时间设置为40秒；完成上述处理步骤后将PDMS芯片以控制层向下的方式与所述石英板键合，放入80℃烘箱内烘干6-12小时后即得到用于细菌耐药性检测的微流控芯片。
优选地，上述制备方法中第(5)步骤中结合完成后将所得多层结构放入80℃烘箱内烘干9小时后得到PDMS芯片；第(7)步骤中将PDMS芯片以控制层向下的方式与所述石英板键合，放入80℃烘箱内烘干9小时后即得到用于细菌耐药性检测的微流控芯片。
进一步地，本发明涉及上述用于细菌耐药性检测的微流控芯片在制备细菌耐药性检测试剂盒中的应用。
同时，本发明还涉及上述用于细菌耐药性检测的微流控芯片在抗菌药物筛选中的应用。
本发明利用微流控芯片高通量、低消耗、自动化等优势，通过特定工艺将Carda NP方法集成到一块微米尺度的芯片上，利用区块化设计将芯片分成相互独立的多个实验区域，可以在几分钟甚至更短的时间内对数十个微量样品进行同步分析，不仅显著提高了分析速度，降低了时间成本，而且大大减少了样品消耗量。另外，本芯片利用多级连通培养腔结构产生16个浓度梯度，可平行完成细菌耐药性浓度依赖测试；并利用集成于芯片中的蠕动泵设计实现纳升体积的样品输入，有效提高了操控精度。与此同时，本发明优化了显色法，通过红色和黄色两种颜色来表明试验结果，显著提高颜色的辨析程度，使得结果判定更加准确，在提高检测灵敏度的同时有效降低了人为因素对试验结果的干扰。
综上，本发明微流控芯片不仅能够应用于细菌耐药性的高通量快速检测，还可在适当改进的基础上推广适用于制备其他用途的检测用微流控芯片，以满足生物医学领域中的各类研究及临床检测需求。
附图说明
图1为本发明微流控芯片实验区域构造图；
图2为本发明微流控芯片样品输入区和连接区构造图；
图3为大肠杆菌EC7耐药性检测结果；
图4为大肠杆菌EC13耐药性检测结果；
图5为大肠杆菌KP7耐药性检测结果。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例
(一)一种用于细菌耐药性检测的微流控芯片
本发明用于细菌耐药性检测的微流控芯片由实验区域、微流阀、微流阀蠕动泵和样品输入区构成，其中：
微流控芯片包含20个相互独立的实验区域，所述实验区域成矩阵式排列，每个实验区域均由集成于芯片的微流阀独立于其他区域进行单独控制；因此本芯片可同时对20种生物样品或不同类型抗菌药物进行测试(参见图1A和1B)；
上述每个实验区域包含64个相互连通的微米尺度的试验腔体，在样品输送过程中，利用层流分流特性，一次性产生16种不同的测试样品浓度(浓度最高为输入样品浓度1，后逐层降低)，每种测试样品浓度并行有4个同样条件的重复测试，以实现高通量样品浓度测试的目的(参见图1C和1D)；
所述样品输入区由与所述实验区域数目相同的样品输入口构成，每个样品输入口均由集成于芯片的微流阀单独控制；从而可以同时对多种生物样品或抗菌药物进行混合、输送(参见图2A)；
在所述实验区域和样品输入区之间由至少一个微流阀蠕动泵连接，通过程序设定顺序开关三个微流阀，以实现纳升精度样品的定点定时输送(参见图2B和2C)。
(二)一种用于细菌耐药性检测的微流控芯片的制备方法
本发明用于细菌耐药性检测的微流控芯片的制备方法，包括下述步骤：
(1)将表面带有微米结构的流动层硅基底和控制层硅基底放置于密封盒内，取500μl三甲基氯硅烷(TMCS,SIGMAALDRICH)溶液在室温下对上述流动层硅基底和控制层硅基底进行表面处理15分钟；
(2)配制聚二甲基硅烷(Polydimethylsilane,PDMS)混合溶液：将聚二甲基硅烷原溶液与固化剂按照10﹕1的质量比混合，在混合机(THINKY MIXER"ARE-310,THINKY)内以2000rpm的转速混胶1分钟，然后以2200rpm的转速去气2分钟；
(3)流动层(厚层)的制备：取50g上述聚二甲基硅烷混合溶液浸没经表面处理的流动层硅基底，并置于真空箱内进行至少1小时的去气处理，直到所述流动层硅基底表面没有气泡为止，然后将所述流动层硅基底取出沥干后放入80℃烘箱内烘干45分钟；
(4)控制层(薄层)的制备：将上述经表面处理的控制层硅基底置于匀胶机上，先以1200rpm的转速低速匀胶5秒，接着以2400rpm的转速高速匀胶30秒；然后将30g上述聚二甲基硅烷混合溶液缓慢倾倒在控制层硅基底上，在光学平台上静置10分钟，最后将所述控制层硅基底沥干后放入80℃烘箱内烘干7分钟，此时所述控制层硅基底上的聚二甲基硅烷混合溶液基本固化，已丧失流动性但用手接触时仍具有一定的粘性；
(5)多层结构的制备：将(3)步中得到的流动层按照基线进行切割，将切割整齐的流动层与(4)步中得到的控制层置于光学对准仪上进行结构校准与结合，结合过程中及时排除内部空气，避免芯片内有气泡产生，结合完成后将所得多层结构放入80℃烘箱内烘干9小时后得到PDMS芯片；
(6)将所述PDMS芯片从硅基底上分离，根据PDMS芯片上的标记点进行缓慢打孔，控制打孔速度避免对芯片结构造成损坏；
(7)等离子体处理：将13*9cm的洁净透明石英板放入等离子体机(PLASMA CLEANERPDC-001AND PDC-FMG)内，处理时间设置为5分钟；然后将打孔完成的PDMS芯片以控制层向上的方式与所述石英板同时放入等离子体机内，处理时间设置为40秒；完成上述处理步骤后将PDMS芯片以控制层向下的方式与所述石英板键合，放入80℃烘箱内烘干9小时后即得到用于细菌耐药性检测的微流控芯片。
等离子体机操作流程如下：
a)检查所有连接口是否密封完好；
b)打开等离子电源和气体调节器的电源(顶盒)，为了保持仪器工作稳定，等离子体机需要在等离子处理前5分钟打开；
c)排气口和腔室，通过将三通阀的方向从垂直变为水平(朝向右侧的排气口)打开前门；
d)从腔室中取出样品托盘；
e)将载玻片放在样品托盘上，然后将托盘放入Plasma Cleaner室中；
f)检查三通阀是否关闭(手柄处于垂直位置)；
g)关闭前门并将门靠在等离子室上；
h)打开真空泵，需要几分钟的时间才能排出室内的空气，等待压力稳定在最低点(～500mbar)；
i)将三通阀打开至室内空气(将杆转至左侧的计量阀)并等待压力稳定；
j)稍微打开计量阀，让空气进入等离子室，调节气体流量为15或稍高，然后等待压力稳定；
k)将频射强度(radio frequency,RF)调至最高；通过等离子清洁器的窗口观察并等待，直到观察到发光，空气腔内应该是紫红色到紫色；
l)处理载玻片5分钟；
m)在该过程结束时，关闭RF电源；
n)调低室内空气流量至零，关闭三通阀(控制杆处于垂直位置)；
o)关闭真空泵电源；
p)缓慢打开三通阀进行排气(杠杆指向排气流量)；
q)达到大气压力后，打开前门；
r)取出托盘，将PDMS芯片放在托盘上载玻片边缘(等离子体所需的表面应朝上)；
s)重复步骤“d”至步骤“q”，但将等离子体处理时间改为20秒；
t)取出芯片和载玻片，将它们放在一起粘合；
u)将样品托盘放回腔室中，关闭腔门和三通阀(垂直方向)，打开泵电源约5秒钟；
v)关闭所有电源开关。
(三)细菌耐药性检测试验
本检测试验所使用的微流控芯片参见图1和图2所示。在一个8*4.5*0.5cm的空间内，微流控芯片具有20个可以独立控制的实验区域，每个区域内包含64个相互连通的微米尺度的试验腔体。利用两种不同流体进入实验区域的模式，在64个腔体内产生16个浓度梯度，并各有4个重复。因此，利用微流控芯片技术结合Carba NP试验方法，我们可以在手掌大小的尺度内对20种细菌样品在1280个试验腔体内同时进行多浓度梯度测试，从而大大减少了试验的时间成本和消耗成本。本芯片中的每个腔体都是相关连通的，这样设计的目的是在一系列腔体中通过扩散的方式形成浓度梯度。
(1)溶液配制
本试验中我们利用显色法来验证细菌的耐药性，具体如下：
A.pH＝7.6的0.05％酚红溶液(含0.1mM Zn2+)：取0.025g酚红研磨后加入7.5ml的0.1mol/L NaOH溶液，然后加超纯水42.5ml至总体积为50ml，再加入0.0033g的ZnSO4粉末，用NaOH和HCl调节溶液pH至7.6；
B.pH＝7.6的8mg/ml亚胺培南溶液：取112g亚胺培南，溶于14ml配好的酚红溶液中，摇匀，用NaOH和HCl调节溶液pH至7.6；
C.细菌(大肠杆菌)：耐药菌：EC7，EC13，EC14，KPC1705，NDM，KP5，KP6，KP7；敏感菌：EC17，KP25。
(2)细菌处理
A.使用移液枪枪头刮取约占培养基1/4的细菌注入4ml离心管内，加入2ml的超纯水并震荡溶解；
B.取溶解后的细菌溶液100μl，用1900μl的超纯水稀释后摇匀；
C.使用紫外分光光度计，在OD600的条件下，先用水做背景扫描，扣除背景后再测量菌液的吸光值，原菌液的OD值即为所测值的20倍；
D.由所测吸光值计算OD8条件下所需菌液浓度，取相应体积高浓度菌液，离心，缓慢吸取上清液，保留沉淀加水稀释至OD8，即得实验所用菌液；
E.准备两个相同的细菌溶液，一个用于对照组，一个用于实验组。
(3)检测流程
A.将制备完成的芯片在倒置显微镜下观察，能够清晰的观察到芯片内部各区域结构；
B.用超纯水对控制层进行脱气处理，将芯片内部空气排出，此压强为28Psi；
C.测试所有控制器都能够正常工作，并能够以完美的方式关闭和打开所有区域；
D.将芯片中的五个区域全部打开，并将每个区域的两个废液口堵塞，在2.5psi下将制备好的0.5mg/ml的酚红与8mg/ml的抗生素溶液混合通入芯片内部来排除空气并将各试验腔体连通，脱气后关闭所有区域；
E.在没有引入细菌时，在显微镜下观察芯片腔体颜色，并拍照保存；
F.打开进液端口，在1.5psi下将配制好的细菌混合液通入芯片20s，确保在每个腔体内都引入了细菌，并形成浓度梯度；
G.导入细菌后分别在0min、5min、15min、30min、60min、90min和120min时对实验区域拍照，保存实验结果。
(4)细菌耐药性检测结果
以EC13为例，我们首先将酚酞-抗生素混合溶液通入区域10中，至每个腔体内都充满混合溶液。如图4A所示，由下至上的每个腔体内都表现出色泽上的不同，从整体上看则形成了一个颜色的变化梯度，从而反映出每个腔体内所含药物的浓度不同。此时我们将准备好的菌液引入芯片中约40s，在引入细菌5min后，我们发现红色的酚酞试液颜色变黄，这表明溶液中有H+产生，促使溶液PH值降低，溶液呈酸性；当引入细菌时间至30min时，酚酞试液颜色变化更加明显，我们继而对不同区域内的颜色变化进行了光强分析(不同细菌耐药性检测结果参见图3-5)。
以上对本发明优选的具体实施方式和实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式和实施例，在本领域技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明构思的前提下作出各种变化。

Claims (8)

1.一种用于细菌耐药性检测的微流控芯片，其特征在于所述微流控芯片由实验区域、微流阀、微流阀蠕动泵和样品输入区构成，其中：
所述微流控芯片包含12-30个相互独立的实验区域，所述实验区域成矩阵式排列，每个实验区域均由集成于芯片的微流阀独立于其他区域进行单独控制；
上述每个实验区域包含64个相互连通的微米尺度的试验腔体，在样品输送过程中，利用层流分流特性，一次性产生16种不同的测试样品浓度，每种测试样品浓度并行有4个同样条件的重复测试，以实现高通量样品浓度测试的目的；
所述样品输入区由与所述实验区域数目相同的样品输入口构成，每个样品输入口均由集成于芯片的微流阀单独控制；
在所述实验区域和所述样品输入区之间由至少一个微流阀蠕动泵连接，通过程序设定顺序开关三个微流阀，以实现纳升精度样品的定点定时输送。
2.如权利要求1所述的用于细菌耐药性检测的微流控芯片，其中所述微流控芯片包含20个相互独立的实验区域。
3.如权利要求1所述的用于细菌耐药性检测的微流控芯片，其中所述细菌为耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌。
4.如权利要求3所述的用于细菌耐药性检测的微流控芯片，其中所述耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌包括大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、不动杆菌、铜绿假单胞菌、变形菌、弗氏柠檬酸菌、产酸克雷伯菌、摩氏摩根菌、普罗威登菌。
5.如权利要求1所述的用于细菌耐药性检测的微流控芯片的制备方法，包括下述步骤：
(1)将表面带有微米结构的流动层硅基底和控制层硅基底放置于密封盒内，取500μl三甲基氯硅烷溶液在室温下对上述流动层硅基底和控制层硅基底进行表面处理10-20分钟；
(2)配制聚二甲基硅烷混合溶液：将聚二甲基硅烷原溶液与固化剂按照10﹕1的质量比混合，在混合机内以2000rpm的转速混胶1分钟，然后以2200rpm的转速去气2分钟；
(3)流动层的制备：取50g上述聚二甲基硅烷混合溶液浸没经表面处理的流动层硅基底，并置于真空箱内进行至少1小时的去气处理，直到所述流动层硅基底表面没有气泡为止，然后将所述流动层硅基底取出沥干后放入80℃烘箱内烘干45分钟；
(4)控制层的制备：将上述经表面处理的控制层硅基底置于匀胶机上，先以1200rpm的转速低速匀胶5秒，接着以2400rpm的转速高速匀胶30秒；然后将30g上述聚二甲基硅烷混合溶液缓慢倾倒在控制层硅基底上，在光学平台上静置5-10分钟，最后将所述控制层硅基底沥干后放入80℃烘箱内烘干7分钟，此时所述控制层硅基底上的聚二甲基硅烷混合溶液基本固化，已丧失流动性但用手接触时仍具有一定的粘性；
(5)多层结构的制备：将(3)步中得到的流动层按照基线进行切割，将切割整齐的流动层与(4)步中得到的控制层置于光学对准仪上进行结构校准与结合，结合过程中及时排除内部空气，避免芯片内有气泡产生，结合完成后将所得多层结构放入80℃烘箱内烘干6-12小时后得到PDMS芯片；
(6)将所述PDMS芯片从硅基底上分离，根据PDMS芯片上的标记点进行缓慢打孔，控制打孔速度避免对芯片结构造成损坏；
(7)等离子体处理：将大小适宜的洁净透明石英板放入等离子体机内，处理时间设置为5分钟；然后将打孔完成的PDMS芯片以控制层向上的方式与所述石英板同时放入等离子体机内，处理时间设置为40秒；完成上述处理步骤后将PDMS芯片以控制层向下的方式与所述石英板键合，放入80℃烘箱内烘干6-12小时后即得到用于细菌耐药性检测的微流控芯片。
6.如权利要求5所述的用于细菌耐药性检测的微流控芯片的制备方法，其特征在于：
其第(5)步骤中结合完成后将所得多层结构放入80℃烘箱内烘干9小时后得到PDMS芯片；
其第(7)步骤中将PDMS芯片以控制层向下的方式与所述石英板键合，放入80℃烘箱内烘干9小时后即得到用于细菌耐药性检测的微流控芯片。
7.如权利要求1所述的用于细菌耐药性检测的微流控芯片在制备细菌耐药性检测试剂盒中的应用。
8.如权利要求1所述的用于细菌耐药性检测的微流控芯片在抗菌药物筛选中的应用。
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