CN103667051A - 用于肿瘤细胞分离的表面声波微流控芯片 - Google Patents

用于肿瘤细胞分离的表面声波微流控芯片 Download PDF

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张丽果
汲振余
赫培远
赵立群
郑立运
欧阳军
张壮丽
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    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
    • C12M47/04—Cell isolation or sorting

Abstract

本发明公开了一种用于肿瘤细胞分离的表面声波微流控芯片，包括基底和粘贴在基底上的开设有微通道的盖片；微通道包括带有入口和出口的中间通道，在其入口两侧开设有与其相连的细胞液注入通道，在出口两侧开设有与其相连的细胞收集通道；在注入通道和收集通道之间的中间通道两侧基底上依次沉积有两对频率、声强一致的叉指转换器，第二对叉指转换器距中间通道中心的距离比第一对叉指转换器距中间通道中心的距离大1/4个表面波波长；在两对叉指转换器之间的中间通道两侧对称开设有较小细胞收集通道。本发明的优点在于采用驻波型表面声波技术，实现了对肿瘤细胞（CTCs）高效、经济、无污染的分离，同时该分离芯片成本廉价，制备工艺成熟。

Description

用于肿瘤细胞分离的表面声波微流控芯片
技术领域
本发明涉及细胞分离技术，尤其是涉及一种用于肿瘤细胞分离的表面声波微流控芯片。
背景技术
恶性肿瘤是严重危害人类健康的重大疾病之一，具有很高的致死率。然而原发性肿瘤的形成却不是肿瘤病人死亡的主因，90%的肿瘤病人的死亡源于肿瘤病灶的转移，肿瘤的转移主要是由于肿瘤细胞的迁移引起的。肿瘤细胞之间的粘附力非常弱，很容易从原发灶脱落，脱落的肿瘤细胞分泌一种蛋白溶解酶，破坏周边宿主结缔组织而使其进入外周血循环，成为循环肿瘤细胞（Curculating Tumor Cells, CTCs），进入循环的肿瘤细胞绝大多数在短期内死亡，少数具有高度活力、高度转移潜能的肿瘤细胞在循环系统中存活下来，相互聚集形成微小癌栓，并在一定条件下发展为转移灶。外周血中肿瘤细胞的存在为肿瘤病灶的转移提供了可能性。通常在CTCs的分离、捕获中，一般均采用磁珠免疫分离方法，该方法能分离CTCs，但是会引入抗体、磁珠、荧光标记物等材料，在某些情况下会影响被分离细胞的活性，甚至是污染细胞，被分离的细胞不能直接回收再利用。因此，找到一种简单，高效，无污染的分离方法，及时的监测外周血中肿瘤细胞的存在性，并实时的把肿瘤细胞从血细胞中分离出来，对控制肿瘤的转移以及肿瘤治疗具有重要的临床应用价值。
微流控技术是一种精确控制和操控微尺度流体、尤其是亚微米结构的技术。最近十几年中，它作为一重要平台出现在化学，生物和医学领域，具有尺寸小，试剂用量少，分析速度快，成本低等优点。随着微流控技术的迅速发展，声波开始引入到微流控芯片实验室上，用于微粒、微液滴、甚至细胞的分离和操纵。微粒的声波操纵方式有体声波和表面声波。表面声波是机械波（即声波），是电场激励压电基片而使之震动，基片振动激励了周围介质粒子的振动，由此产生的弹性波，它沿着压电晶体表面传播，能量只集中在晶体表面2--3个波长的范围。和基于体声波的微流控分离技术相比，基于表面声波的微流控分离方法对设备制作工艺要求较低，低能耗，而且还具有较好的通用性。
现有基于表面声波的微流控技术研究发现，表面声波能依据大小和密度对微粒实现分离。2013年，Ding et al.对微流体中受到表面声波作用的微粒受力的理论原理进行了深入全面的剖析。这些微粒受到两个力的作用：一个是声压波动形成的声辐射力；另一个是表面声波引起的声流。两个力共同作用于微流体中的微粒，但是两个力谁起主导作用，主要还是依据微粒的大小。当微粒尺寸大于一个临界值，微粒的运动就主要由声辐射力主导，运动到波节或波腹处就不再运动；而小于临界尺寸的微粒，就跟随声流做漩涡运动。大小不一样的微粒，就可以在不同力的作用下实现分离。通过实验发现该临界尺寸主要和声频相关，在流动液体中，大于临界尺寸的颗粒，在声辐射力的作用下迁移到远处的波节或波腹处，小于临界尺寸的颗粒仍然沿着液流方向运动，实现颗粒的分离。声场中，作用于颗粒的声辐射力的大小和微粒的大小、密度、可压缩率三者相关。大于临界尺寸的颗粒中，尺寸较大的颗粒受到较大的声辐射力作用，其迁移到波节或波腹的速度比尺寸较小的颗粒快一些。 在此结论基础上，有研究采用尺寸梯度方法有效的实现了对血细胞的分离。
物理性质上，肿瘤细胞（CTCs）和血细胞在大小、可压缩率、密度三者上都存在差异。由于作用于声场中细胞上的声辐射力除了受到细胞大小的影响，还受到由细胞密度和可压缩率共同决定的声比因子的影响，故截至目前，还未有人将基于表面声波的微流控分离技术应用到CTCs分离中。
发明内容
本发明的目的在于提供一种成本低、制备工艺成熟、高效无污染的用于肿瘤细胞分离的表面声波微流控芯片。
为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：
本发明所述的用于肿瘤细胞分离的表面声波微流控芯片，包括基底和通过等离子键合粘贴在所述基底上的开设有微通道的盖片；所述微通道包括水平设置的宽度为1/2表面波波长的中间通道，所述中间通道的入口和出口分别延伸至盖片的上表面，在所述中间通道的入口两侧对称开设有与所述中间通道相连通的细胞液注入通道，在所述中间通道的出口两侧对称开设有与所述中间通道相连通的细胞收集通道，所述细胞液注入通道的入口和细胞收集通道的出口均延伸至盖片的上表面；在位于细胞液注入通道和细胞收集通道之间的中间通道两侧的基底上依次沉积有两级驻波型表面声波生成器，所述驻波型表面声波生成器为等距离沉积在中间通道两侧且频率、声强一致的两对叉指转换器，靠近中间通道出口的第二对叉指转换器距中间通道中心的距离比靠近中间通道入口的第一对叉指转换器距中间通道中心的距离大1/4个表面波波长；在位于两对叉指转换器之间的中间通道两侧对称开设有出口延伸至盖片上表面的较小细胞收集通道。
基底由128°Y切，X传播的铌酸锂材质（LiNbO3）制作；所述盖片由聚二甲基硅氧烷（PDMS）材质制作；所述叉指换能器的叉指为由Au/Cr(100nm/10nm)薄膜沉积制备而成；表面声波的频率由待分离细胞体积决定，待分离细胞越大，所需的频率越小，待分离细胞体积越小，所需频率越大。
本发明的优点在于采用驻波型表面声波技术，实现了对肿瘤细胞（CTCs）高效、经济、无污染的分离。本发明芯片结合CTCs的物理性质的不同，依据CTCs和血细胞在大小，密度和可压缩率三者之间的差异，不需要加入任何材料即可实现CTCs的分离，而且分离出来的细胞都可以重复再利用。同时该分离芯片成本廉价，制备工艺成熟。
附图说明
图1是本发明的结构示意图。
图2a、图2b是图1中中间通道内声波分离细胞示意图。
具体实施方式  
如图1所示，本发明所述的用于肿瘤细胞分离的表面声波微流控芯片，包括LiNbO3基底1和通过等离子键合粘贴在LiNbO3基底1上的开设有微通道的PDMS盖片2；其中微通道包括水平设置的宽度为1/2表面波波长（λ）的中间通道3，中间通道3的入口4和出口5分别延伸至盖片2的上表面，在中间通道3的入口两侧对称开设有与中间通道相连通的细胞液注入通道6，在中间通道3的出口两侧对称开设有与中间通道相连通的细胞收集通道7，细胞液注入通道6的入口和细胞收集通道7的出口均延伸至盖片2的上表面；在位于细胞液注入通道6和细胞收集通道7之间的中间通道两侧的基底1上依次沉积有两级驻波型表面声波生成器，即等距离沉积在中间通道两侧且频率、声强一致的两对叉指转换器，靠近中间通道出口的第二对叉指转换器8距中间通道3中心的距离比靠近中间通道入口的第一对叉指转换器9距中间通道3中心的距离大1/4个表面波波长（如第一对两叉指转换器9距中间通道3中心的距离为h，则第二对两叉指转换器8距中间通道3中心的距离应为h+λ/4）；第一对叉指转换器9生成的驻波波节位于中间通道3的中心，第二对叉指转换器8生成的驻波波节位于中间通道的两侧边；在位于两对叉指转换器之间的中间通道3两侧对称开设有出口延伸至盖片上表面的较小细胞收集通道10。
本发明的微流控芯片分两级实现对CTCs的分离，即通过两对叉指转换器在中间通道内生成的驻波型表面声波实现对CTCs的分离。
中间通道的入口4中注入血清或生理盐水，CTCs和血细胞混合液自细胞液注入通道6的两个入口在蠕动泵作用下进入中间通道3，沿着中间通道3的两侧前移，在经过第一对叉指转换器9时，如图2a所示，混合细胞被表面声波按照细胞大小分离，体积较大的细胞在声辐射力的作用下，迁移到中心通道3中心的波节处，而体积较小的细胞仍然随着液流沿中间通道两边前移，至较小细胞收集通道10的出口处被收集。在中间通道3中心处的较大细胞在通过第二对叉指转换器8时，如图2b所示，中间通道3内驻波的波节在通道边沿，声比因子较大（即可压缩率大、密度大）的细胞就获得较大的声辐射力，而向中间通道边沿迁移，同时压缩率小、密度小的CTCs获得的声辐射力小，仍然停留在中间通道3的中心，随同液流前进，在中间通道的出口5处被收集得到。

Claims (2)

1.一种用于肿瘤细胞分离的表面声波微流控芯片，包括基底（1）和通过等离子键合粘贴在所述基底（1）上的开设有微通道的盖片（2）；其特征在于：所述微通道包括水平设置的宽度为1/2表面波波长的中间通道（3），所述中间通道（3）的入口（4）和出口（5）分别延伸至盖片（2）的上表面，在所述中间通道（3）的入口两侧对称开设有与所述中间通道相连通的细胞液注入通道（6），在所述中间通道（3）的出口两侧对称开设有与所述中间通道相连通的细胞收集通道（7），所述细胞液注入通道（6）的入口和细胞收集通道（7）的出口均延伸至盖片（2）的上表面；在位于细胞液注入通道（6）和细胞收集通道（7）之间的中间通道两侧的基底（1）上依次沉积有两级驻波型表面声波生成器，所述驻波型表面声波生成器为等距离沉积在中间通道两侧且频率、声强一致的两对叉指转换器，靠近中间通道出口的第二对叉指转换器（8）距中间通道（3）中心的距离比靠近中间通道入口的第一对叉指转换器（9）距中间通道（3）中心的距离大1/4个表面波波长；在位于两对叉指转换器之间的中间通道（3）两侧对称开设有出口延伸至盖片上表面的较小细胞收集通道（10）。
2.根据权利要求1所述的用于肿瘤细胞分离的表面声波微流控芯片，其特征在于：所述基底（1）由128°Y切，X传播的铌酸锂材质制作；所述盖片（2）由聚二甲基硅氧烷材质制作；所述叉指换能器的叉指为由Au/Cr薄膜沉积制备而成。
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