JP2007521495A - 磁気効果により生物学的試料を分割するための方法及びデバイス - Google Patents

Abstract

溶液中に含まれ、磁性粒子に固定される検体を分割する方法を開示する。本方法では、磁性粒子を複数の残渣に分割しながら沈殿させる。好適な実施形態の一つでは、磁性粒子の少なくとも一つの残渣（２２、３０）を第１容器（１０）内に形成し、残渣（群）を複数の第２容器（１２）に向かって、好適には磁気システム（２０、２４）の相対的な平行移動によって移動させ、第２容器（群）（１２）は流路（１４）により第１容器（１０）に接続される。これらの方法において使用されるデバイス、並びにこれらの方法を実行するためのシステムも開示する。

Description

技術分野
本発明は、試料に含まれる検体を等分割又は不等分割する方法、並びにこの方法を実行するデバイス及びシステムに関する。
具体的には、本発明は、磁性粒子に既に固定されている検体を分割する磁気手段の使用法に関する。

背景技術
検体とは、使用及び／又は実証を目的に別の培地に単離された、及び／又は移動された、小体又は分子の全部又は一部を意味し、例えば、微生物、バクテリア、菌体、ウィルス、真核細胞；化合物；ペプチド、タンパク質、酵素、多糖類、脂質、リポタンパク質、リポ多糖類、核酸、ホルモン、抗原、抗体、成長因子、ハプテンのような分子；腫瘍細胞などのような細胞を挙げることができる。
本発明は、例えば複数の処置が互いに相容れない場合、又は複数の処置を互いに混じりあわない溶液中で行なう必要がある場合に、複数の処置を１つの試料に対して平行して行なう必要がある全ての分野に適用することができる。

従って、一部の生体外診断検査では、多数のＰＣＲ増幅を初期試料に対して行なうことが望ましい。これらの異なる増幅では、増幅を最適化するために、異なるプライマー、異なる熱条件、及び異なる緩衝液成分を必要とすることが多い。
同様に、免疫検査の間、初期タンパク質で多数の異なる配位子を検査する必要があり、試料に含まれる単一種に多数の反応にさらして抗体／抗原を検出する。

ここで、これらの用途では、特定の相の培地を等分割又は不等分割する必要があり、この培地を複数の相に分離する必要はないことに留意されたい。
液相に含まれる試料を多数の部分試料に分割する最も簡単な解決法の一つでは、初期容積の一部分を採取し、それを容器に加え、その中で複数の反応の一つを検体に行う。

この解決法には、約１％の精度で操作可能な最小容積が約数マイクロリットルであるという明らかな制限がある。内容がもっと少ない場合、液体が失われるため、検体は、ピペットコーン、フラスコなどのような「大型」容器で搬送すると失われる。生じる他の問題は、これらの操作の間に容器壁において生じる蒸発及び吸収の問題である。この問題の解決法でも、手動又は自動による液体の輸送が必要となり、よって解析可能な検体の量が必然的に減少し、検体が希釈され、その結果初期に計画した分割とは全く異なる分割が行なわれることになる。初期試料中の検体濃度が低い場合、検体が全て無くなるか、又は検体の量が減って検出不能になるという結果が生じ得る。
別の解決法では、複数のバルブを備えるスイッチングデバイスを含むことにより複数の部分容器が形成される構成の１つの容器を充填する。このようなバルブの配置は複雑となり、部分容器の数が数個より多い場合には、バルブにより必然的に非常に大きな空間が占有される。

従って、検体を等分割又は不等分割し、流体操作を行なわず、且つ高い効率で、最初の容器から多数の第２容器に輸送する方法及びデバイスが必要とされている。本発明を説明するために、検体の輸送とは、検体を一の容器から別の容器に、検体を含む液体培地を用いて、又は用いずに、移動させることを意味する。

本発明の概要
本発明は、特に上記の需要を満たすという利点を有する。
本発明の一態様によれば、本発明は、第１容器内の溶液に含まれ、磁性粒子に固定された検体を分割する方法に関する。粒子は第１磁気手段によって沈殿し、検体は第２容器に位置する複数の残渣に分布する。

一実施形態によれば、磁性粒子は第１容器内の少なくとも一つの残渣に沈着し、生成された残渣は第２磁気手段によって第２容器に移される。有利には、第２磁気手段、及び／又はこれらの第２磁気手段によって生成される磁界は第１容器に対して移動する。好適には、同じ磁気手段を使用して残渣を沈殿させ、移動させることができ、換言すれば、第１及び第２磁気手段を同一の構成要素とすることができる。
複数の第２容器は、それぞれ流路により第１容器に接続され、同一又は異なる、第１容器内の溶液と同様の溶液又は同様でなない溶液で充填される。

従って、本分割方法では、溶液をピペッティングにより滴下し、移動させる操作を回避することにより、精度を高め、小さな容積に対する作業を可能にする。本方法はまた、初期溶液から検体に必要な別の溶液に検体を移す場合、そのような移動と同時に分割を行なう手段を提供する。
有利には、各第２容器は１つの流路を介して第１容器に接続されるが、これらの第２容器を異なる数の流路により互いに接続することができる。流路のレイアウトを制御することにより、各第２容器内の検体の量を決定する。このようにして、流路間の間隔を正確に同じくする同一流路を平行に配置することにより、等分割方法を容易に実現することができる。

本実施形態の好適な一変形例によれば、１つの直線的残渣が形成され、この残渣の大きさはそれが通過した第１容器の大きさと同じである。使用可能な一つの方法では、例えば長形の磁石又は細長の誘導コイルを使用する。次に、例えばコイル又は磁石をデバイスに対して相対的に移動させることにより、残渣を移動させる。従って、直線的残渣及び可能であれば磁石の相対的平行移動によって、第１容器を「浚い」、流路への入り口の面積に応じて残渣をサブユニットに分割する。例えば、全ての流路が同一であり、残渣がそれに沿って形成される中心線に対して同じ側に位置する場合、分割は等分に行なわれる。有利には、磁石又は誘導コイルは第１容器よりも長いので、磁石又は誘導コイルが第１容器の表面から「突出」し、従って磁性粒子が完全且つ均一に移動することができ、速やかに沈殿する。好適には、これらの磁気手段は流路に対して垂直に移動する。
別の構成では、磁気手段を物理的に移動させることなく、例えば連続コイルを含む磁気手段を用いて磁界を移動させる。
形成された残渣の分割が行なわれるこの変形例の主たる利点は、この方法の使用が単純であること、及び磁気構造と流体構造との間の正確な位置合わせが不要なことである。

同じ実施形態の別の変形例によれば、各流路に向かって小さな寸法の残渣が形成される。例えば、複数の尖端部を有する磁気構造を使用して、各残渣を該当する流路内へ平行移動させる。
有利には、流路はネック部により第１容器に接続され、このネック部によって磁性粒子の流れ込みが可能になり、輸送量を高精度に制御することができる。等分割を行なう場合、各流路のネック部は同一である。

流路は毛管とすることができる。一以上の磁気トラックを形成して磁性粒子を導くこともできる。有利には、小さな試料について、流路を磁気トラックで置き替えることができる。
磁性粒子を第２容器まで輸送して検体を放出するプロセスを行なうか、又は検体が第２容器に達する前に放出を行ない、その後の検体の輸送は液体移動によって行なうことができる。

別の実施形態によれば、検体と結合した状態で第１容器内の溶液に含まれる磁性粒子の沈殿は、複数の第２容器において直接生じる。この場合、これらの第２容器は、第１容器と一体的に形成することができ、有利には、粒子が第２容器の外部で固定化される領域（平面など）が無い。
検体は、溶液を第１容器に加える前に磁性粒子に固定することができるか、又は溶液を加え、固定化を容器内において行なうことができる。

本発明はまた、磁性粒子に固定される検体を分割するデバイスに関し、本デバイスは、第１容器に、例えば流路を通して接続される複数の第２容器を備える。好適には、流路網全体を一つの支持体の中に設け、この支持体は基台又はデバイスのカバーとすることができる。有利には、流入手段が支持体に接続される。
これらのデバイスは、磁気手段を含む本発明によるシステムの一部分を構成し、磁気手段は移動可能で、特に輸送デバイス又は分割デバイスに対する相対的平行移動を行なうことができ、更にこれらのシステムは、磁性粒子をデバイスの第１容器から第２容器に輸送する。別の構成は、移動磁界を生成できる手段に関する。

デバイス及びシステムの好適な実施形態は、分割方法の利点に対応する利点を直接反映した構成を有する。
他の特徴及び利点は、明らかに説明を目的とし、いかなる意味でも本発明を制限しない以下の実施例の説明と、添付図面により明らかとなる。
添付図面では、同じ参照記号は同じ構成要素を指す。

本発明の第１の実施形態によるデバイス１の概略的構造を図１に示す。本デバイスは、基台２、できれば長形の流入手段４、及びカバー６により構成される。流入チャンバ（又は第１容器）１０が基台２の上に位置し、ネック部１６を備える複数の流路１４、この場合は複数の毛管を介して複数の反応チャンバ（又は第２容器）１２に接続する。これらの流路１４の底部は強磁気テープによって覆うことができる。
チャンバ１０、１２の特定の形状は例示として示されており、容器及び毛管は、その用途又はデバイス１の製造に使用される技術に応じて、他の形状及び／又は大きさを有してもよく、互いに異なっていてもよい。同様に、第１チャンバ１０を１つの反応チャンバ１２に接続する複数の流路１４を設けることができる。更に、反応に必要な他の構成要素を流路網の内部に取り入れることができ、例えば毛管１４に沿って又は第２容器１２上に、気泡調整バルブ８を設けることができる。

図１にデバイス１の作製方法を示す。本デバイスは、容器１０、１２及び流路１４を、基台２として機能する平板材料の中にエッチングにより形成し、次にグルーイング又は他の接着手段を用いてカバー６を組み立てることにより作製される。これは一つの可能な作製方法であるが、本発明はこの方法のみに限定されない。一又は複数の流路１４により複数の反応チャンバ１２に接続される流入チャンバ１０を作製するために、他のいずれかの方法を用いることもできる。特に、支持体上に流路網を一体化するために用いることが可能な方法には、シリコン又はガラスへのエッチング、マイクロインジェクション、ホットスタンピング、プラズマエッチング法、リソグラフィを使用する「ＬＩＧＡ」法に類似の方法、電気めっき法及びプラスチック成形が含まれる。好ましくはエッチングの深さは約１００μｍである。
基台２ではなくカバー６をエッチングすることも可能である。

「物理的」流路１４を使用せず、単に、基台２の底部に載置され、エッチング流路のように磁性粒子を導く強磁気テープを使用すると有利である。これによって、残渣が流れる経路の自由度が高くなり、粒子が強磁性トラックによって導かれることとなり、更に磁気テープを設けると流体チャンバにおける表面状態の問題を無くすことができる。
これらの２つの技術（「物理的」流路及び磁性ガイド流路）を組み合せることもでき、デバイスの用途によっては磁気テープを各「物理的」流路１４の底部に設けることができる。

流体を容器に充填又は輸送するときに流体（気体又は液体）を排出するために、排出口１８が設けられる。排出口は、デバイスに含まれるガスを排出するために充填を行なっているとき、並びに検体溶液を回収する最終ステップにおいて使用できるが、排出口は必須ではない。
試料及び異なる試薬又は緩衝液は、デバイスに様々な方法で加えることができる。例えば、図１に示す第１の変形例では、デバイスのカバー６には、錐状の皿４の形態の流入手段が設けられる。この形状は例示に過ぎないことを明記する。例えば、この錐状の皿にピペット又はシリンジの先端を当てることにより、圧力を液体に加えて緩衝液又は試薬をデバイスの内部に「流し込む」ことができる。デバイスに含まれる空気又はその他のいかなる流体（液体又はガス）も、排出口１８を通してデバイスから排出される。この場合、これらの排出口は反応チャンバ１２に通じるが、これらの排出口は、状況に応じてデバイス１の他の位置に配置することができる。

液体をデバイスに加える別の変形例（図示せず）では、排出口１８と同様の第１チャンバ１０に開口する流路又は毛管を通して、及びインターフェースを介してデバイスの外部に接続するチャンバ自体を通して、液体を加える。
デバイス１を使用する第１ステップでは、公知の方法に従って、検体を含む均等な溶液を調製する。例えば、検体を含有する試料から検体を抽出するか、又は「純粋な」検体を溶液中で直接希釈する。

次に、検体を磁性粒子に固定する。磁性粒子の大きさは、単離対象の検体及び溶液の体積に適する大きさである。例えば、検体が分子である場合、磁性粒子はサブミクロンの大きさとすることができる。使用する粒子の量は、固定する検体の性質及び量に応じて決定し、好適には検体全体を固定するために十分な粒子数を使用する。一般に、適切な磁性粒子が常套的に分子生物学及び細胞生物学において使用されている。可能であれば、特にこれらの磁性粒子は、磁界が無くなった後で自然に再拡散できるような超常磁性粒子とする必要がある。これらの粒子は磁性コロイド系の一部を形成し、多数の抗体と結合することにより重合及び官能化される。
固定方法は本技術分野において公知であり、粒子表面に存在するヌクレオチドによる吸収、癒合、捕捉、温熱感受性を挙げることができる。

この固定化は可逆性であることが好ましい。検体が化学試薬又は検出手段に更に容易に近づくことができるか、又は一層接近可能となるように、検体を解放することが必要である。当業者であれば、検体の解放又は溶出について精通していると思われる。
固定化ステップは、溶液を第１容器１０に加える前に行なうことができるが、この容器内で行なうこともでき、その場合、磁性粒子も含む容器に溶液を加える。

検体を加える前に、デバイス１に、検出対象の検体を含まず、且つ磁性粒子を含まない緩衝液を充填する。この緩衝液は、必要な量だけ流入手段４に注ぎ込み、流入手段に気圧を印加することにより添加することができる。デバイスが充填されたら、流入手段４に含まれる過剰な緩衝液を、例えばピペットを使用して取り除くことができる。第２容器１２には、流入チャンバ４、１０の緩衝液とは異なる溶液を充填することができ、デバイスの用途及び予定する分析によっては、チャンバ１２毎に異なる溶液を充填することができる。
注目する検体を予め磁性粒子に固定した、所定量の緩衝液から成る試料を、第１容器１０に加える。この試料は単一相と考えられる。輸送及び分割対象の検体は単一相で存在する。

上述のように、磁性粒子を第１容器に収容することができ、次に溶液中の検体を緩衝液に加えて検体を粒子に固定することができる。
この第１の実施形態では、次の沈殿ステップにおいて、磁性粒子を流入チャンバ１０の底部に誘導する。好適には、沈殿は、（第１）磁気手段を使用して行ない、粒子の大きさはほぼマイクロメートルのオーダーであるか、場合によってはナノメートルのオーダーであり、磁気手段によって沈殿速度を自然沈殿よりも高めることができる。
固定サイズの磁性粒子の沈殿速度は、粒子溶液を含む容器の下に位置する磁気ブロックの上面から粒子までの距離に依存し、更にブロックの体積にも依存する。

以降の図に示される実施形態では、残渣は磁石２０によって表わされる第１磁気手段を使用して形成され、この磁石は更に残渣２２を移動させ、図２に示す形状である。磁石はデバイス１の下に、図示の場合においては錐状の皿４の直下に配置される。次に、線ＡＡに沿って第１チャンバ１０を走る直線的残渣２２に磁性粒子を回収する。しかしながら、既に記載したように、第１磁気手段は、初期残渣の中に、この残渣２２と同じ形状で粒子を沈降させるためにだけ使用されてもよく、残渣の移動は異なる第２磁気手段によって行ってもよい。この場合、第２磁気手段２０によって第１残渣を配置し直すことができる。
好適な一実施形態によれば、残渣２２は、第２磁気手段と一致する第１磁気手段を相対的に移動させることにより変えることができる。これについては後述で詳細に記載する。このような相対移動により、残渣の移動及び印加する磁界の均一性を制御することができる。しかしながら、他の解決手段、例えば第２容器の方向に位置し、残渣２２を引き付ける強力な固定磁石を用いることができる。磁石の代わりにコイルを使用する場合、コイルを移動させる代わりに、本目的のために設けられるアセンブリの連続コイルを切り替えることができる。従って、物理的磁気手段の位置を変えることなく、磁界の位置が相対的に変わる。上記構成の組み合わせを用いることができる。

有利には、この長い磁石２０は第１容器１０から「突出」している。従って、磁石２０は、移動する間に、磁石の右、即ちその移動方向（矢印）に位置する容器１０全体を「浚う」。実際、可能であれば移動期間に亘り、磁石が直線的残渣２２よりも長いことが好ましい。従って、一般的に、磁石２０の長さには、磁石が相対移動する期間に亘って第１容器の幅が、磁石を含む平面（例えばこの場合は水平面）から移動方向と直交する平面内（この場合はＡＡ軸を通過する垂直平面）に沿って突出する部分が含まれ、第１容器１０の幅は、垂直軸と、第１容器１０を通過する直線的残渣２２の交差部分によって形成される最大幅のセグメントによって規定される。
ここでまた、図２にはネック部１６が無いことに注目されたい。「櫛形」構造は分割の制御を向上させるために有利である。

図３は、残渣の分割、従って残渣２２を第１容器１０から第２容器１２に移動させることによる検体の分割を示している。図３ａは、図２の構成、つまり直線的残渣２２を表わし、この残渣は、第２磁気手段によって粒子が再配置された結果である。
本実施形態では、全ての流路を残渣２２によって示されるＡＡ軸の同じ側に位置させることが望ましい。そうでない場合、後述に更に明確に示すように、残渣を平行移動させても、平行移動方向の反対側に位置する反応チャンバ１２には充填が行なわれないこととなる。

初期残渣は、磁石２０が第２チャンバ１２に向かって相対移動、この場合平行移動するにより、流路１４に「導かれる」（図３ｂ参照）。相対移動とは、何らかの機構によって、又は支持体２〜６の下方で行われる手動によって、移動させることができる磁石２０（又は生成された磁界）の物理的移動、或いは、例えば磁石２０の上方のレールに沿った支持体２〜６の移動を意味する。例えば、ステップモータ又は気圧ジャッキを平行移動手段として使用することができることを強調するが、当業者であれば、公知の何らかの移動手段を状況に応じて用いることができる。

磁気手段又は磁界の相対的平行移動により、残渣は移動中にその直線構造を維持することが分かる。
このようにして残渣２２は流路１４の流入口に到達し、壁の作用により残渣は複数のセグメントに分離される（図３ｃ参照）。残渣２２の平行移動は流路１４に沿って継続し（図３ｄ）、試料は第２容器（又は反応チャンバ）１２に到達する（図３ｅ）。

図３に示す実施例では、流路１４は互いに平行であり、残渣２２の軸に直交し、磁石の相対移動は流路の方向に平行である。これらの流路及び反応チャンバにおける検体の位置を制御することが容易であるので、これら２つの要素は好ましい。しかしながら、他の構成を用いることもできる（斜めの磁石及び／又は分岐流路、及び／又は斜め方向の移動など）。
更に、図３に示す分割は等分割である。換言すれば、第２容器１２の各々が同じ量の検体を受け入れ、初期検体は等しい部分に、この場合は８つの部分に分割される。特に、流路１４のピッチは一定であり、ネック部１６は正確に同じ大きさを有する。しかしながら、流路のレイアウトを変更することにより、不等分であるが制御された分割部分を形成することができる。図４はそのような分割の一実施例を示しており、この実施例では、第２容器１２ａ〜ｈはそれぞれが初期検体の量の８分の１を含む構成にはなっていない。チャンバ１２ａは検体量のほぼ３分の１を受け入れ、この量は、例えば一定のピッチで分割され、収容量がそれぞれ同じになるチャンバ１２ｄ〜ｆの３倍超である。

別の変数は、１つの反応チャンバ１２に通じる流路の数に関するものである。流路レイアウトが図３に示すものと同様であり、２つの流路が互いに結合して第１チャンバ１２に達する一方、他の流路の各々が個別のチャンバに通じるとすると、この第１チャンバ１２は他のチャンバの２倍の量の検体を受け入れることになる。
従って、本発明による方法によって、液体自体を操作する前に、制御下において不等分な分割部分を実現することができる。例えば、いずれかの公知の手段によって試薬が既に反応チャンバ１２に収容され、流路１４のレイアウト、従って分割率が反応感度に応じて決定されているキットを作製することができる。このようなキットは、等分割部分が得られるように作製することもできる。

別の変形例によれば、移動に一つの長い磁石及び一つの直線的残渣を使用する代わりに、流路１４の数に応じて残渣の数を直接変えることができる。例えば、複数の突起２４を有する磁石構造を、図２に示すようなデバイスに用いる長い磁石２０の代わりに用いることができる。
複数の突起２４を有するデバイスは、磁石ブロック２６から成り、このブロックの上面を切断して図５に示すような「尖端部」又はピラミッド形突起２８が得られるようにすることが好ましい。強磁性材料（鉄、Ｉｍｐｈｙ ＳＡ社製のＡＦＫ５０２合金のような鉄−クロム合金）により作製される磁極部分を付け加えることもでき、この磁極部分は、磁石ブロックの平坦面の上に、好ましくはピラミッド２８の形に加工された尖端部を備える。尖端部２８の役割は、磁性粒子の軌跡を粒子の沈殿の最後に屈曲させることである。ブロック２６による影響は、溶液中の粒子が尖端部の高さの２〜３倍の距離だけ尖端部から離れ、沈殿が均一になるまで支配的である。次に、粒子が第１容器１０の底部、従って磁石ブロック２６の表面に近づくと、尖端部２８によって実体化される磁性隆起により粒子に対する相対的な影響が増大する。従って、残渣３０自体は尖端部２８の上方に位置する。

図５では、説明を簡単にするために離間した尖端部を数個のみ示しているが、これらの尖端部がもっと高密度な網目を形成できることは明らかである。同様に、この場合これらの尖端部はＢＢ軸に沿って整列しているが、一部の用途においては、「市松模様」を形成するように配置することができ、例えば複数の突起部ラインＢＢを設けるか又は他の適切な構造とすることができる。
規模を縮小しても理論的には磁気特性に影響を与えることはない（磁界値が維持される）が、磁界の勾配に比例する磁力が変化する。何故なら、容積が小さく、磁力は寸法に反比例して大きくなるからである。従って、磁気システムの寸法及び材料の選択は使用条件によって決まる。

大型磁石ブロックの作製に制限は無く、最大数十センチメートル、例えば６５ｍｍの長さに１３個の尖端部を５ｍｍのピッチで配置することができる。沈殿速度は磁石ブロックの体積によって変わるので、検体溶液の第１容器１０の表面積よりも大きな表面積を有するブロック２６を使用することにより均一な沈殿を実現することができ、有利である。
別の例示的実施形態は、１辺が５ｍｍの正方形断面を有する高さ２ｍｍのピラミッド６個を有する、１５×４０×２５ｍｍのＮｄＦｅＢブロックである。このモデルは極めて高い性能を有し、特に第１容器１０の静止液の高さは５ｍｍに等しい。

特に、３ｍｍの区画及び４ｍｍの深さを有する第１容器１０に関して、好適な実施形態の一つでは、第１容器の底部と磁石ブロックの頂部との間、即ち、磁性粒子３０の残渣と尖端部（群）２８の頂部との間の距離を約１ｍｍに等しくする。
実際に、磁石ブロック２６の寸法は、約１００平方ミリメートルの面積にまで相似形に容易に小さくすることができる。小さい寸法においては、純粋鉄又はＦｅ_５０Ｃｏ_５０合金のような大きな飽和磁化を有する軟磁性材料を機械加工することにより尖端部を作製する必要がある。

面積を更に小さくする場合（一辺約１００μｍ）、表面ニッケルメッキのようなマイクロエレクトロニック技術を使用し、平行六面体状ブロックを使用して堆積物を磁化する（分極させる）ことができる。本実施形態は特に、磁気トラックの使用と組み合わせることができ、堆積物の形状は、例えばこれらの磁気トラックを通して反応チャンバ１２に接続される高密度パッドにより構成され、堆積された材料は、好適には保護層によって覆われる。
長い磁石２０と同じように、突起（群）２４を有する磁気手段は、相対移動、例えば流路に沿った相対的平行移動によって、残渣３０、この場合は小さい残渣を、各流路内で移動させることができる。
本変形例を磁気トラックと組み合わせない場合、変形例は特に、残渣３０のピッチ、つまりは流路のピッチが１ミリメートル超の、更に大きなデバイスの動作に適する。このようにして、磁気構造と流体構造とは非常に正確に位置合わせされる。しかしながら、変形例は、尖端部２８の密度に応じて、もっと濃度の低い初期溶液を分割するのに使用できる。更に、分離は機械的分離装置を用いることなく行なわれるので、磁性粒子が分離器の壁に集まることはない。

本発明の方法を可能にするデバイス４０の別の実施形態を図６に示す。図示するように、流路は実際に、流体の通過を可能にする連通部に対応しており、第２容器４２は第１容器４４の直接延長部分として設けられる。デバイス４０は実際には、成形又は抜き打ち加工などによる壁４６により形成された第２容器４２を含む単一部品とすることができる。この壁４６は、作製済み容器に付け加えることもできる。必須ではないが、遷移はネック部４８を通して徐々に行なわれることが望ましい。また、第２容器４２の各々を錐状とすることができる。特に、第１容器４４の壁４６には平面領域が無いことが好ましく、その上に複数の突起が配置されて第２容器４２を形成する。
従って、分割は沈殿の直接的な結果として行われる。表面４６の下方に位置する第１磁気手段５０が溶液中の磁性粒子を第１容器４４に引き付け、残渣が第２容器４２の各々に形成され、その結果、初期試料に含まれる検体が分割される。

本実施形態では、磁石５０の磁力は、可能であればいずれの第２容器４２においても均一とする。デバイス４０の作製及び磁石５０の制御機構は、上述の実施形態におけるものよりも単純である。
図６は、磁石がデバイス４０の下方に位置する実施形態を示している。この実施形態は、重力を平行に使用するので好ましいが、第２容器４２を形成する突起を有する表面４８が基台の上に位置しない構成の、同様のデバイスを提供することが可能である。同様に、図示の構成は単なる例示であり、沈殿は、ブロック５０とは異なる形状の磁石（例えば、各第２容器４２の下方の突起）を用いて行なうことができる。

上述のように、第２容器４２内の複数の残渣に沈殿した後、これらの第２容器から流路（図示せず）に沿って検体を輸送して解析を行なうこともできる。
従って、本発明による検体を含む相の分割は、初期溶液を加える以外はいかなる液体輸送も利用することなく、特に必然的に累積的な不正確さを招くピペット滴下を使用することなく行なわれる。バルブは必要でなく、デバイス１、４０の製造は、機械部品を無くすことにより精度の向上を考慮する必要がないため簡単である。

本発明によるシステムは、数マイクロメートルから最大数センチメートルまでの、異なる大きさの容器及びデバイスを用いて構成することができる。例えば、図１に示すデバイスと同様のデバイスは、次のような大きさとすることができる。
第１容器１０の容積：０．６μｌ
第１容器１０の寸法：４ｍｍ×１．５ｍｍ×０．１ｍｍ
第２容器１２の容積：４０ｎｌ
第２容器１２の寸法：０．４ｍｍ×１ｍｍ×０．１ｍｍ
接続毛管１４の大きさ：２ｍｍ×０．１ｍｍ×０．１ｍｍ
チャンバ間のピッチ：５００μｍ
基台２の全体の大きさ：６ｍｍ×６ｍｍ
磁石基台の大きさ：８ｍｍ×８ｍｍ
８ｍｍ×８ｍｍの寸法を有する基台２に替えて、メインブロックの寸法が８ｍｍ×８ｍｍよりもわずかに大きい磁石を設けることができる。

同様に、上述のように、磁石の大きさ及び形状を替えることができる。長い磁石自体が異なる形状を有することができ、例えば平行六面体状ブロック、又は５角形状の断面を有するブロック、或いは矩形上に、可能であれば先端部が切断された三角形を有するブロックとすることができる。
分割デバイスは、更に幅の広いアセンブリの一部分を形成することができる。この場合、初期試料の連続分割を考慮することができ、この構成では、デバイスの第２容器自体が後続の別の容器にとっての第１容器となり、異なる連続分割の間で試料を処理することができる。

最後に、同じ磁気手段を使用して、さらに多くの且つ非常に多種類のデバイス１、４０における分割を制御することができる。例えば、第１の実施形態に関し、同じ形状及び大きさを有し、流入チャンバ１０は同様であるが流体回路１４が異なる支持体２〜６のどのような組も、同じ磁石によって制御することができる。

使用例
分子マーカによるリアルタイム検出を組み合わせたＮＡＳＢＡ増幅法を各反応チャンバ１２に導入することができる。溶液に含まれる核標的を検出／解析する本方法では、最大数の検査を並行して進めるために、試料を複数の流路に分割しなければならない。
この手順は次のように行なわれる。
ｉ．増幅対象の標的を従来技術により磁性粒子を使用して捕獲する。粒子に固定される捕獲プローブの数は、増幅対象の標的の数と同じであり、これらの標的に相補的である。
ｉｉ．図１に模式的に示すデバイスと同様のデバイスに適切な緩衝液、例えばＴＥ １Ｍ ＮａＣｌ又はＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００ ０．０５％を約３０℃の温度で充填する。充填の間、毛管１４に沿って設けられるエアトラップチャンバ８にはエアが充填されたままである。
ｉｉｉ．図１に示すように、試料をデバイスの錐状の入口４に注ぎ込む。
ｉｖ．本発明による磁気沈殿、分割、及び輸送を実施し、検体を輸送して第２チャンバ１２に移す。
ｖ．酵素及び特殊プライマーを含む増幅混合液を各チャンバに、例えばシリンジポンプを使用して注入する。この注入は、試料を加える端部とは反対側の端部、即ち排出口１８を通して行う。
ｖｉ．次に、デバイスの温度を４２℃まで上げて、システムを１〜２時間インキュベートし、各反応チャンバ１２においてマーカからの蛍光を等時間間隔で観察する。

比較検査
４種類のデバイス６０を、図７ａ〜７ｄに模式的に示すように作製した。
図７ａ及び７ｂに示すチップタイプ６０ａ、６０ｂ、及び６０ｃを、シリコン技術における同一のディープエッチングを使用した後、熱酸化工程を行って作製した。
チップ６０ａと６０ｂは同一で、櫛形分割の設計を唯一の違いとしており、櫛形分割の歯の先端は、それぞれ丸みが付いているか、尖っている。チップ６０ｃは同じ形状を有するが寸法が小さく、中に磁気残渣が形成される容器６２の表面が３分の１の大きさである。詳細には、櫛の歯の幅（即ち流路６４のピッチ）は、デバイス６０ｃでは約５００μｍであり、デバイス６０ａ及び６０ｂが９００μｍであるのに対して狭い。

図７ｄのデバイス６０ｄは、ＫＯＨの液槽内での異方性エッチングにより作製され、傾斜辺を有する皿６６を形成する。
上にＰＤＭＳカバー７０を接着したデバイス６０を使用して磁気分割実験を行なった。カバーの形状は、２５μｌの試料容量を収容するために十分な厚さを持つように構成される。換言すれば、例えば特にデバイス６０ａ〜６０ｃの場合、平板カバー７０は、第１容器に位置する隆起７２を除いて均一な厚さを有する（図７ｃ参照）。次に、試料注入用の領域７４を手術用メスの刃で開き、流路６４内における破片の凝集を防止した。

磁性粒子は、Ｉｍｍｕｎｉｃｏｎ粒子７．５×１０^６個／μｌの濃度のＩｍｍｕｎｉｃｏｎ磁性粒子（Ｎｏ． Ｆ−３１０６）上に６０５Ｑｄｏｔｓ（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ Ｃｏｒｐ．製カタログ番号１０００−１）を、１０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液中に１０Ｑｄｏｔ／Ｉｍｍｕｎｉｃｏｎの割合（ｐＨ＝８：１ＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００ 、０．１４ ｍｇのサケＤＮＡ／ｍｌ）で用いるマーキングプロトコルを使用して、蛍光粒子でマーキングし、よって分割の定量化を可能にした。
デバイスの構造に応じて、粒子を含む溶液は異なる特性を示した。８の流路６４を備える構成要素６０ａには、粒子を含む８μｌの溶液及び１７μｌの緩衝液を使用した。２５個の皿を備えるデバイス６０ｄには、粒子を含む２５μｌの溶液を、緩衝液を全く追加せずに使用した。

全ての測定は、水銀アークランプタイプＨＢＯ １００Ｗ／２及びＺｅｉｓｓ製の電源装置ｅｂｑ １００を備えるＺｅｉｓｓ製のタイプＨＢＯ １００／１００７−９８０照明システムが装着されたＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｌａｎ ＩＩ顕微鏡を使用して行なった。５ｘ／０、１３ＨＤ−４４２９２４レンズ、及び１０ｘ／０、２０ＨＤ−４４２９３４レンズ、並びに蛍光キューブ（光フィルタアセンブリ）を使用して、特に黒背景及びエピ蛍光での観察を行なった。イメージ化のため、顕微鏡を、浜松ホトニクス製のＨＰＦ−ＣＯＭＰＸ−ＳＩＭＰＬＥ−ＰＣＩ取得ソフトウェアを有する浜松ホトニクス製のタイプＯＲＣＡ Ｅｒｇｓ ＨＰＦ−Ｃ４７４２−８０−１２−ＡＧカメラに接続した。全ての画像を同じ解析ソフトウェアで処理した。
Ｒｏｌｉｎ磁石をデバイス６０ａ〜６０ｃに使用した。表裏一体式ＡＰＩＳ型磁石をデバイス６０ｄに使用して、平板基台に均一な磁界を得た。

操作方法は以下のステップから構成される。
−予め緩衝液を充填する（デバイス６０ａ、６０ｂ、６０ｃを真空チャンバ内に配置した）。
−磁石を顕微鏡の下に配置し、位置合わせする。
−磁石を下げる。
−デバイスを正規の位置に配置する。
−各容器の底部を蛍光撮影する。
−粒子を注入する（２５μｌの緩衝液中の８の残渣）。
−複数の実験で平衡状態に達する。
−磁石を持ち上げる。
−沈殿をブラックライトでモニタリングする（チップ６０ｄについては、顕微鏡のスライドをチップ６０ｄの上に配置してメニスカスによる光の反射を防止する）。
−デバイスを磁石に対して移動させて磁気分割を行なう。
−各容器を蛍光撮影する。
各残渣の蛍光強度は残渣を広範囲に含む表面の積分強度である。この強度は、分割前に得られる強度を分割後に得られる強度から差し引くことにより得られるので、マーキングされた磁性粒子により発生する蛍光強度のみを表わす。変動率（ＣＶ）は、一連の測定値（デバイス６０ａ〜６０ｃの８の流路に関する）から、必要に応じて異常ポイント（例えば、大きな外部汚染粒子）を取り除く形で計算した。

次の表に、得られたＣＶと、緩衝液のみが充填された流路において蛍光測定で得られた変動率をまとめる。

ここで、分割前に緩衝液が充填された構成要素における蛍光測定値の変動率は、２５の皿を有するチップ６０ｄ以外は５％未満であることに注目されたい。分割後の蛍光測定値の変動率は、沈殿前の平衡時間が長いチップ６０ｃの場合５％未満である。このような極めて良好な結果が、カバー７０（及び特に試料注入用の開口７４）を非常におおまかに切断した構造のチップに得られた。従って、カバーの開口の形状は、チップ６０ｃにより高品質の磁気分割を行なうための重要パラメータではない。垂直方向に沈殿が生じる場合（チップ６０ｄ）、９の皿からなるマトリクス構造に関して良好な結果が得られる（ＣＶ＜１０％）。
更に、６０ａ〜６０ｃのデバイスの８つの流路に沿った蛍光強度分布を分析した。カバーに設けられる注入領域の構造に起因する影響は認められなかった。

全体的な蛍光強度の低下は、デバイス６０の種類に関係なく、沈殿、分割、第１容器への残渣の戻り、残渣の分散、沈殿、分割からなるステップを含むシーケンスの間に観察されなかった。従って、分割櫛を通過する間の粒子損失は生じなかった。他方、これらのステップの間、ＣＶ（変動率）は、尖鋭端部を有する櫛の形をしたチップ６０ｃに関して悪化したが、丸み端部を有する櫛の形をしたチップに関しては５％未満を維持した。
これらの結果から、本分割方法は、一組の磁性粒子を複数のサブセットに等しい大きさで分散させるのに有効であることが極めて明瞭である。重要な結論は主に次の通りである。
−複数の流路への等分割を５％未満のＣＶで行なうことができる。
−分割中の粒子損失は無視できる程度である。
−分割櫛を有するデバイス（６０ａ、６０ｂ、６０ｃ）は複数の皿（６０ｄ）への沈殿により分割を行なうデバイスよりも良好な結果をもたらす。
−試料注入領域の構造は有意な影響を及ぼさない。
−粒子の沈殿の前にブラウン分散ステップを行なうことが好ましい。

本発明によるデバイスの第１の実施形態の部分断面を表わす分解斜視図を示す。 本発明による分割システムの第１の実施形態による残渣の形成を模式的に示す。 本発明の一実施形態による分割方法を示す模式図である。 本発明による第２のデバイスの模式図である。 複数の尖端部を有する磁気構造とその作用を示す模式図である。 本発明による分割デバイスの別の実施形態を示す。 Ａ〜Ｄは、検査に使用するデバイスを示す。

Claims (36)

1. 第１容器（１０、４４）内の溶液に含まれ、磁性粒子に固定された検体を複数の第２容器（１２、４２）に分割する方法であって、第１磁気手段によって磁性粒子を沈殿させ、第２容器（１２、４２）内に複数の残渣を形成する方法。
2. 少なくとも一の第１残渣（２２、３０）の形態で第１容器（１０）に磁性粒子を沈殿させ、それぞれが少なくとも一の流路（１４）により第１容器（１０）に接続される第２容器（１２）に第１残渣（群）を輸送する、請求項１記載の方法。
3. 第２磁気手段（２０、２４）によって生成される磁界を流路（１４）に対して相対移動させることにより、第１残渣（群）（２２、３０）を第２容器（１２）に輸送する、請求項２記載の方法。
4. 各流路（１４）は他の流路に対して平行であり、第２磁気手段（２０、２４）によって生成される磁界の相対移動は流路（１４）の方向に平行である、請求項３記載の方法。
5. 第１及び第２磁気手段を１つの構造体に一体化する、請求項３又は４記載の方法。
6. 第１残渣（２２）は単一の直線的残渣であり、第１容器（１０）を２つの部分に分割する、請求項２ないし５のいずれか一項に記載の方法。
7. 各流路（１４）を、残渣（２２）の同じ側に、第２磁気手段（２０）によって生成される磁界の移動方向に向かって配置する、請求項６記載の方法。
8. 第２磁気手段は、流路（１４）に対して移動する長い磁石（２０）を含む、請求項６又は７記載の方法。
9. 磁石（２０）を流路（１４）に対して移動させる方法であって、磁石（２０）の長さは、移動方向に直交して磁石（２０）を含む平面と、残渣（２２）が堆積する第１容器（１０）の底部との交差部分によって規定されるセグメントの磁石の、前記移動方向に直交して磁石（２０）を含む平面に沿って突出する部分が、磁石が相対移動する間に亘り、磁石（２０）によって画定されるセグメントの内部に含まれるような長さを有する、請求項８記載の方法。
10. 第２磁気手段（２４）を、各流路（１４）の前面に１つの残渣（３０）を形成するように構成する、請求項２ないし５のいずれか一項に記載の方法。
11. 残渣（３０）の全てを各流路（１４）の方向に沿って同時に移動させる、請求項１０記載の方法。
12. 第２磁気手段（２４）が、流路（１４）に対して自由に移動する１又は複数の突起（２８）を含む、請求項１１記載の方法。
13. 第１残渣（群）（２２、３０）を第２容器（１２）の位置まで移動させる、請求項２ないし１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 各流路（１４）が強磁気テープを含み、第１残渣（群）をこの強磁気テープに沿って移動させて導く、請求項２ないし１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 各第２容器（１２）が、毛管から成る１の流路（１４）により第１容器（１０）に接続される、請求項２ないし１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 磁性粒子の沈殿によって第２容器（４２）内に複数の残渣を直接形成する、請求項１記載の方法。
17. 分割は等分割であり、即ち各第２容器（１２、４２）内の検体の量を同じにする、請求項１ないし１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 検体を粒子に固定し、粒子に固定された検体を含む溶液を第１容器に加える先行ステップを含む、請求項１ないし１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 液体に含まれる、磁性粒子に固定された検体を分割するデバイス（１、４０）であって、液体を収容するための第１容器（１０、４４）と、各々が流路（１４、４８）により第１容器（１０、４４）に接続された複数の第２容器（１２、４２）とを備えるデバイス。
20. 各流路（１４）が毛管である、請求項１９記載のデバイス。
21. 各流路（１４）がネック部（１６、４８）を介して第１容器に接続される、請求項１９又は２０に記載のデバイス。
22. 第１容器（１０、４４）が溶液を加える手段（４）に接続される、請求項１９ないし２１のいずれか一項に記載のデバイス。
23. 各第２容器（１２）には流体の流入−排出流路（１８）が設けられる、請求項１９ないし２２のいずれか一項に記載のデバイス。
24. 第１容器（１０）、第２容器（１２）、及び流路（１４）を含む支持体（２、６）を備える、請求項１９ないし２３のいずれか一項に記載のデバイス。
25. 各流路（１４）が同一であり、２つの隣接する流路を分離するピッチが一定である、請求項２４記載のデバイス。
26. 各流路（１４）に、磁性粒子の残渣（２２、３０）の移動を導くための磁気トラックを備える、請求項１９ないし２５のいずれか一項に記載のデバイス。
27. 検体を分割するデバイスセットであって、請求項１９ないし２６のいずれか一項に記載のデバイス（１、４０）を複数個含むデバイスセット。
28. 各デバイスの第１容器（１０、４４）が同様の大きさ及び形状を有する、請求項２７記載のデバイスセット。
29. 液体に含まれる、磁性粒子に固定された検体を分割するシステムであって、請求項１９ないし２６のいずれか一項に記載のデバイス（１、４０）、又は請求項２７又は２８に記載のデバイスセット、及び磁気手段（２０、２４、５０）を備えるシステム。
30. 磁気手段が、流路（１４）に対して自由に移動可能であることにより、検体が固定された磁性粒子を第１容器（１０）から流路（１４）を通して第２容器（１２）に移動させることができる磁気手段（２０、２４）を含む、請求項２９記載のシステム。
31. 可動磁気手段（２０、２４）が、流路（群）（１４）に対する平行移動に適している、請求項３０記載のシステム。
32. 可動磁気手段が長い磁石（２０）を含む、請求項３０又は３１に記載のシステム。
33. 磁石（２０）の長さには、移動方向に直交して磁石を含む平面に沿って磁石の上に突出する第１容器（１０）の幅の部分が含まれ、第１容器の幅は、移動方向に直交する平面と第１容器（１０）の底部との交差部分により形成されるセグメントによって規定される、請求項３２記載のシステム。
34. 各流路（１４）が、磁石の移動方向に沿って第１容器の同じ側に配置される、請求項３２又は３３記載のシステム。
35. 磁気手段が１又は複数の突起（２４）を備える構造である、請求項２９ないし３１のいずれか一項に記載のシステム。
36. 磁気手段が、流路（１４）に対して自由に平行移動する磁界を生成できる一組の磁気要素を含む、請求項２９記載のシステム。

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