KR100901995B1 - 씨에이치아이피용 농축 미세칩 및 이를 이용한 씨에이치아이피 수행방법 - Google Patents

Abstract

본 발명의 ChIP(Chromatin immunoprecipitation)용 농축 미세칩(DNA enrichment MEMs chip)은 DNA 및 항체와 결합된 단백질을 포함하는 시료가 투입되는 주입구 상기 주입구와 연통되고, 내부에는 표면에 상기 항체와 결합하는 특정 단백질이 고정된 복수개의 비드가 위치되는 챔버 및 상기 챔버와 연통되며, 상기 투입된 시료가 배출되도록 상기 주입구의 타측에 형성된 배출구를 포함한다.

이를 통해, 종래의 E.P. 튜브를 이용한 ChIP 기술을 대체하여 적은 시료의 양으로 실험이 가능하고 실험시간이 줄어들며, 실험결과의 변동이 적으면서도, 상온에서도 ChIP 실험을 수행할 수 있다.

ChIP, 농축 미세칩

Description

씨에이치아이피용 농축 미세칩 및 이를 이용한 씨에이치아이피 수행방법{DNA ENRICHMENT MEMs CHIP FOR CHROMATIN IMMUNOPRECIPITATION AND ChIP METHOD OF USING THEREOF}

본 발명은 ChIP용 농축 미세칩 및 이를 이용한 ChIP 수행방법에 관한 것으로 보다 상세하게는 기존의 ChIP 실험에 사용되던 E.P.튜브를 대체하여 ChIP 실험을 수행하기 위한 ChIP용 농축 미세칩 및 이를 이용한 ChIP 수행방법에 관한 것이다.

휴먼 게놈 프로젝트 이후 연구단계로 functional genomics가 진행되고 있는데, functional genomics란 유전자의 기능과 조절기작을 세포나 신호전달체계 전체에서 연구하는 것이다.

이러한 functional genomics 분야를 연구하기 위해 유전자가 조절되는데 가장 중요한 역할을 수행하는 전사인자(transcription factor)와 DNA 프로모터 부분 의 결합을 검출하는 것이 중요하다. Functional genomics 분야를 연구하는데 주로 사용되는 DNA 칩 기술은 전체 유전자 발현을 동시에 비교할 수 있다는 장점을 가지 나, DNA와 DNA의 결합만을 검사하므로 전사인자와 프로모터의 결합을 바로 분석 할 수 없다는 단점이 있다.

이러한 문제점을 해결하기 위해 최근 세포 생물학 분야에서는 ChIP(CHROMATIN IMMUNOPRECIPITATION) 기술을 이용하여 전사인자와 promoter를 결합시키고 이것을 DNA 칩에 적용시켜 특정 전사인자에 의해 어떻게 유전자의 발현이 조절되는지 확인하는 방법이 사용되고 있다.

상기 ChIP 기술의 목적은 유전자 발현을 조절하는 전사인자들은 특정한 서열인 프로모터에 결합하여 발현을 조절하는데, 이 조절부위를 세포 전체 단위로 알아보는 것이다.

이러한 ChIP 기술을 구체적으로 설명하면, 1) E.P. 튜브에 세포를 넣은 후 포름알데히드로 처리하여 DNA와 DNA결합단백질을 결합시키는 단계, 2) 세포에 세포 용해액을 넣고 음파처리기(sonicator)를 이용하여 DNA를 200~1kb의 절편으로 자르는 단계, 3) DNA 절편이 있는 용해액에 ChIP 결합액을 넣고 아가로즈 비드 또는 세파로즈 비드를 넣어 비특이적으로 비드에 결합하는 단백질과 DNA를 제거하는 단계, 4) 상기 3)의 과정을 거친 용액에 특정 단백질(예 : acetylated histone H3)의 항체를 넣고 하룻밤동안 반응시키는 단계 (DNA와 DNA결합단백질, 그 단백질의 항체가 모두 결합하는 단계), 5) 단백질 A 또는 G가 고정된 아가로즈 또는 세파로즈 비드를 넣고 반응시키는 단계 (DNA와 DNA결합단백질, 그 단백질의 항체, 아가로즈 또는 세파로즈 비드가 모두 결합하는 단계), 6) 고염, 저염, 염화리튬 면역 복합체 세척 버퍼와 TE 버퍼로 상기 비드를 세척하는 단계 (상기 5)의 결합에 참여하지 않은 DNA, 단백질 등을 세척하는 단계), 7)세척된 비드를 용리액을 처리하여 DNA-단백질-항체를 비드로부터 분리하는 단계, 8)염화나트륨과 프로테아제(protease K)를 처리하여 DNA와 단백질의 결합을 해리시키는 단계, 9) 페놀/클로로포름을 이용하여 DNA를 순수하게 분리하는 단계 및 10) 특정 유전자의 프라이머를 이용하여 PCR하는 단계를 통해 ChIP 기술을 이용하여 PCR 과정을 수행하거나, 상기 7)단계를 대신하여 7-1) 세척된 비드에 SDS 샘플 버퍼를 처리하고 끓여서 웨스턴 블롯(western blot)하는 단계로 이루어졌다.

결국, 종래의 E.P. 튜브를 이용한 ChIP 기술은 전사인자 등의 확인이 용이하다는 장점이 있으나, 시료의 양이 많이 필요하고, 실험시간이 매우 길고 복잡하며, 실험결과의 변동이 심하고, -4℃ 정도에서 수행되어야 하므로 온도 등의 실험조건이 매우 까다로운 단점이 있었다.

본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 종래의 E.P. 튜브를 이용한 ChIP 기술을 대체하여 적은 시료의 양으로 실험이 가능하고 실험시간이 줄어들며, 실험결과의 변동이 적으면서도, 상온에서도 ChIP 실험을 수행할 수 있는 ChIP용 농축 미세칩을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 ChIP 기술에 있어서, 한번에 2종류 이상의 타겟 DNA 또는 단백질의 검출이 가능한 ChIP용 농축 미세칩을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 ChIP용 농축 미세칩을 이용하여 실험조건 등을 간소화한 ChIP용 농축 미세칩을 이용한 ChIP 수행방법을 제공하는 것이다.

상술한 해결하고자 하는 과제를 달성하기 위한 본 발명의 한 특징에 따른 ChIP(Chromatin immunoprecipitation)용 농축 미세칩(DNA enrichment MEMs chip)은 DNA 및 항체와 결합된 단백질을 포함하는 시료가 투입되는 주입구; 상기 주입구와 연통되고, 내부에는 표면에 상기 항체와 결합하는 특정 단백질이 고정된 복수개의 비드가 위치되는 챔버; 및 상기 챔버와 연통되며, 상기 투입된 시료가 배출되도록 상기 주입구의 타측에 형성된 배출구를 포함한다.

상기 특정 단백질은 바람직하게는 단백질 A 또는 단백질 G이며, 상기 비드는 아가로즈 비드 또는 세파로즈 비드를 사용할 수 있으며, 비드의 평균직경은 45 ~ 165 ㎛를 사용할 수 있다. 또한 상기 비드는 6㎍/30㎕ ~ 12㎍/30㎕가 구비될 수 있다.

상기 미세칩은 바람직하게는 챔버의 외주부에 설치되어 상기 시료가 배출되고, 상기 배출구와 연통되는 배출로를 더 포함할 수 있으며, 보다 바람직하게는 , 상기 배출로와 상기 챔버 사이에 설치되고 상기 비드보다 작은 통로를 갖는 배출홀 을 더 포함하는 것도 가능하다.

나아가, 상기 챔버를 밀폐시키는 커버가 결합될 수 있으며, 이 경우 상기 커버는 유리 또는 투명 플라스틱을 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 특징에 따른 ChIP용 다중 농축 미세칩은, 서로 다른 DNA 및 항체가 각각 결합된 2종의 단백질을 포함하는 시료가 투입되는 주입구; 상기 주입구와 연통되고, 내부에는 상기 항체와 결합하는 제1특정단백질이 고정된 복수개의 비드가 위치되는 제1챔버; 상기 제1챔버와 격벽으로 연결되고, 내부에는 상기 항체와 결합하는 제2특정단백질이 도포된 복수개의 비드가 위치되는 제2챔버; 상기 제1챔버로 투입된 상기 시료가 상기 제2챔버로 공급되도록 상기 제2챔버의 외주부 일부에 연결되는 제1배출로; 상기 제1배출로와 이격된 상태로 상기 제2챔버의 외주부에 연결되는 제2배출로; 및 상기 제2챔버 내부로 투입된 상기 시료를 배출시키는 배출구;를 포함한다.

상기 격벽은, 바람직하게는 상기 제1배출로와 상기 제1챔버 및 제2배출로와 제2챔버 사이에 설치되고 상기 비드보다 작은 통로를 갖는 배출홀을 더 포함하며, 상기 제2챔버는 시료를 상기 제2챔버로 공급하는 보조주입구가 더 구비될 수 있다.

한편, 상기 제1단백질과 제2단백질은 바람직하게는 서로 상이한 항체에 결합할 수 있으므로 서로 상이한 종류의 단백질인 것이 바람직하다.

나아가, 상기 제1챔버와 상기 제2챔버는 서로 탈착될 수 있다.

또한, 바람직하게는 상기 제2챔버로 투입된 상기 시료가 상기 배출구로 배출 될 수 있도록 제2챔버와 배출구 사이에 배출홀이 형성된 격벽을 더 구비할 수 있다.

본 발명의 또 다른 특징에 따른 ChIP용 농축 미세칩을 이용한 ChIP 수행방법은, 1) 세포에 포름알데히드를 첨가하여 DNA와 DNA 결합단백질을 결합시키는 단계, 2) 상기 세포를 파괴하고 상기 DNA를 잘게 절단하는 단계, 3) 상기 DNA 결합단백질과 결합하는 항체를 투입하여 시료를 제작하는 단계, 4) 상기 본 발명의 ChIP용 농축 미세칩의 주입구에 상기 시료를 투입하는 단계, 5) 상기 미세칩의 내부의 비드를 세척하는 단계, 및 6) 상기 세척된 비드를 용리액(elution buffer)으로 처리하여 상기 DNA를 용출하는 단계를 포함한다.

이 경우 상기 DNA는 바람직하게는 GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 등 Acetylated Histone H3와 결합하는 모든 DNA를 말하며, 이 때 상기 시료는 바람직하게는 600 ~ 1000ul를 첨가할 수 있고, 보다 바람직하게는 Cell sonication sample 100ul(2.5X10⁶cells)과 IP dilution buffer 900ul를 상기 4) 단계에 투입할 수 있다.

이며, 이 때 상기 시료는 바람직하게는 @ ~ @㎕를 투입할 수 있다.

상기 4) ~ 6)단계는 바람직하게는 15 ~ 30℃에서 수행될 수 있으며, 상기 4)단계에서 상기 시료를 5 ~ 30분간 상기 주입구에 투입할 수 있다.

상기 5)단계는, 바람직하게는 a) 저염 면역 복합체 세척버퍼(low salt immune complex wash buffer) 0.5㎖ b) 고염 면역 복합체 세척버퍼(High salt lmmune complex wash buffer) 0.5㎖, c) 염화리튬 면역 복합체 세척버퍼(LiCl immune complex wash buffer) 0.5㎖ 및 d) TE 버퍼 0.5㎖;로 순차적으로 세척하되, 각각의 세척시간은 30초 ~ 2분이고 상기 d)단계는 2회 수행될 수 있다.

상기 6)단계 이후, 바람직하게는 웨스턴 블랏을 수행하거나 PCR을 수행할 수 있다.

본 발명의 ChIP용 농축 미세칩을 통해 ChIP 실험을 수행하는 경우 종래의 E.P.튜브를 이용할 때에 비하여 적은 시료를 투입하는 경우에도 DNA 및 단백질의 검출이 가능할 뿐 아니라, 사용되는 비드의 수를 절반 이하로 줄일 수 있으며, 기존 ChIP 실험 시 평균 4일이 소요되던 것이 본 발명의 칩을 사용하면 2일 정도로 단축되므로 최대 50%실험시간을 저감할 수 있다. 또한 고가의 항체, 시약, 샘플 등의 양을 줄일 수 있으므로 실험비용을 절감할 수 있으며, 정량화된 시약과 재료를 사용하여 간편하게 ChIP 실험을 수행할 수 있으므로 실험결과 일관성을 담보할 수 있다.나아가 소프트 리소그래피 등에 의하여 다량 생산이 가능한 것이어서 제작비용이 저렴하다.

이하, 본 발명을 첨부된 도면을 참조하여 보다 상세히 설명한다.

종래의 E.P. 튜브를 이용한 ChIP 기술은 전사인자의 확인이 용이하다는 장점이 있으나, 시료의 양이 많이 필요하고, 실험시간이 매우 길고 복잡하며, 실험결과의 변동이 심하고, -4℃ 정도에서 수행되어야 하므로 온도 등의 실험조건이 매우 까다로운 단점이 있었다.

이에 본 발명의 1실시예에 따른 ChIP용 농축 미세칩(enrichment MEMs chip)은 DNA 및 항체와 결합된 단백질을 포함하는 시료가 투입되는 주입구; 상기 주입구와 연통되고, 내부에는 표면에 상기 항체와 결합하는 특정 단백질이 고정된 복수개의 비드가 위치되는 챔버; 및 상기 챔버와 연통되며, 상기 투입된 시료가 배출되도록 상기 주입구의 타측에 형성된 배출구를 포함하여 상술한 종래의 E.P. 튜브의 문제점을 극복하였다.

구체적으로 도 1 ~ 2는 본 발명의 제1실시예에 따른 ChIP용 농축 미세칩의 평면도로서 보다 구체적으로 본 발명은 에칭 등 반도체 가공 기술을 활용하여 실리콘 웨이퍼 상에 구조 형상을 만들고, 이에 PDMS를 부어 PDMS에 원하는 구조의 채널, 챔버, 격벽 등이 형성되도록 하는 소프트 리소그래피(Soft Lithography) 방법으로 제작가능하다.

이와 같이 가공하여 DNA 및 항체와 결합된 단백질을 포함하는 시료가 투입되는 주입구(2), 상기 주입구(2)와 연통되고, 내부에는 표면에 상기 항체와 결합하는 특정 단백질이 고정된 복수개의 비드(4)가 위치되는 챔버(3), 및 상기 챔버(3)와 연통되며, 상기 투입된 시료가 배출되도록 상기 주입구(2)의 타측에 형성된 배출구(6)를 형성한다.

상기 주입구(2)는 도 1과 같이 외부로 돌출되는 형상일 수 있고, 도 2와 같이 내부로 오목하게 함입되는 형상일 수 있다. 또한 상기 주입구에 주입되는 시료는 타겟 DNA와 단백질을 결합시킨 후, 이를 분쇄하고, 상기 단백질에 결합할 수 있는 항체를 첨가하여 생성된 DNA-단백질-항체 복합체를 포함하며, 이 때 사용가능한 항체는 통상의 ChIP 실험에서 사용되는 항체를 사용할 수 있다.

상기 주입구(2)와 연통된 챔버(3)는 그 내부에 특정 항체와 결합할 수 있는 단백질이 고정된(도포된) 복수개의 비드(4)를 구비한다. 상기 비드(3)의 재질은 아가로즈 또는 세파로즈를 사용할 수 있으며, 그 표면에 상기 시료내의 타겟 항체(DNA-단백질-항체 복합체의 항체)와 결합할 수 있는 단백질 A 또는 단백질 G가 통상의 방법으로 도포된다. 상기 비드(4)의 직경은 45 ~ 165 ㎛를 사용할 수 있다. 또한 상기 비드(4)는 6㎍/30㎕ ~ 12㎍/30㎕개가 구비될 수 있으며 이러한 비드(4)의 개수는 종래의 E.T.튜브에서 사용되던 비드의 개수에 비하여 절반 정도에 불과하므로 반응시간을 획기적으로 저감할 수 있는 것이다.

한편 본 발명의 미세칩은 바람직하게는 챔버(3)의 외주부에 설치되어 비드(4)를 통과한 시료가 배출하기 위한 배출로(7)를 더 포함할 수 있으며 상기 배출로(7)는 배출구(6)와 연통되어 시료가 배출될 수 있다. 또한 상기 챔버(4)와 배출 로(7) 사이에 시료는 빠져나갈 수 있지만 비드는 빠져나갈 수 없을 정도의 배출홀(32)이 형성되며, 이러한 배출홀(32)은 챔버(3)와 배출로(7) 사이에 적절한 높이의 격벽(8)을 설치하는 것을 통해 형성될 수 있다. 나아가, 상기 챔버 (3)를 밀폐시키는 커버(30)가 결합될 수 있으며, 이 경우 상기 커버는 유리 또는 투명 플라스틱을 사용할 수 있다.

한편, 상기 격벽(8) 및 배출홀(32)은 챔버(3)와 저장소(5) 사이에도 위치하며 이를 통해 비드(4)를 통과한 시료가 저장소(5)에 집결된 후 배출구(6)를 통해 외부로 배출될 수 있는 것이다. 또한 본 발명에서 비드(4)는 주입구(2)를 통해 주입되거나 커버(30)를 챔버(3)에 결합시키기 전에 직접 비드(4)를 챔버(3)에 위치시킨 후 커버(30)를 결합시키는 것을 통해 주입할 수 있다.

나아가, 배출구(6) 주변에는 시료의 통과를 용이하게 하기 위하여 미세 펌프 또는 미세 실린지 펌프 (미도시)등이 더 구비되는 것도 가능하다.

다음, 상술한 본 발명의 1실시예에 따른 ChIP용 농축 미세칩의 작동을 설명한다. 먼저 상기 주입구(2)로 투입된 미소량의 DNA 및 항체와 결합된 단백질을 포함하는 시료가 챔버(3)에 도달한다. 이러한 챔버(3)에는 다수의 비드(4)로 채워져 있으므로, 시료는 비드(4)의 표면을 타고 흐르게 된다. 이때, 비드(4)의 표면에는 시료에 의한 유체 압력이 가하여 지며, 비드(4)가 챔버(3) 내부에 채워져 있으므로 시료가 유출 가능한 방향으로 큰 압력을 받게 되는 현상이 발생된다. 이때, 본 발명에서는 비드(4)가 시료가 유출되는 방향인 전방과 양측방으로 밀려나게 되는 것 이기는 하나, 비드(4)는 도 6과 같이 챔버(3)와 배출로(7) 사이에 위치하는 격벽(8)과 커버(6) 사이의 공간인 배출홀(32)을 통해 배출되며 상기 배출홀(32)의 직경인 d1이 비드(4)의 직경인 d2보다 작으므로, 비드(4)가 챔버(3)에서 이탈됨을 방지할 수 있게 된다. 그러므로 시료는 비드(4)의 공극 사이를 통하여 격벽(8)에 형성된 배출홀(32)을 통해 배출로(7) 및 저장소(5)로 갈 수 있게 되는 것이다. 이에 따라 저장소(6)를 거쳐서 모아진 시료는 배출구(6)로 배출되는 것이다. 또한, 이러한 과정에서 비드(4)가 챔버(3)의 외주부측의 격벽(8)과 챔버와 배출구(6) 사이의 격벽(8)으로 분산되므로, 비드(4)가 한쪽으로 몰리면서 과도한 압력을 받아 변형, 손상되거나 비드(4)의 밀집에 의하여 배출이 어렵게 되는 경우가 방지되는 것이어서, 안정적이고 효과적인 반응 유도가 가능하게 되는 것이다. 아울러, 이러한 과정에서 본 발명은 비드(4)가 45㎛ ~ 165㎛ 이하로서 매우 작으므로 비드(4)의 표면적은 매우 넓게 되는 것이다. 본 발명은 이러한 비드(4)의 충분히 넓은 표면적에 상기 타겟 항체와 선별적으로 결합될 수 있는 단백질 A 또는 단백질 G가 접합된다.

따라서, 비드(4)의 표면과 접촉한 후 전술한 바와 같은 과정으로 배출되는 시료의 특정 항체는 모두 비드(4)의 표면에 도포된 단백질 A 또는 G와 결합할 수 있게 되는 것이며, 이에 따라 시료의 특정 단백질이 항체와 효과적으로 반응하면서 신속하게 포집되어 고정화된 후 배출될 수 있는 것이다. 이후 상기 비드(4)에 결합된 DNA-단백질-항체 복합체를 적절하게 수세 및 해리하여 원하는 DNA 또는 단백질을 검출할 수 있다.

본 발명은 내부 구조물의 크기가 매우 작은 마이크로 칩이며, 이를 극소량의 시료가 연속 통과하도록 한 구조이므로, 이를 통과하고 반응하는 시료가 매우 적은 경우에도 효율적으로 충분한 반응을 얻을 수 있게 된다. 아울러, 본 발명에서는 비드(4)의 직경에 따라서 격벽의(8)의 높이가 조절될 수 있고, 챔버(3)에 넣는 비드(4)의 숫자도 조절될 수 있다. 아울러, 본 발명에서는 실리콘 웨이퍼에 구조물을 다수 식각하여 많은 수의 ChIP용 농축 미세칩을 반복적으로 양산할 수 있다.

도 3은 본 발명의 제2 실시예에 따른 ChIP용 다중 농축 미세칩의 평면도이다. 제2 실시예의 구성 중 제1 실시예와 동일한 부분은 상술한 설명으로 대체하고 차이점을 중심으로 설명한다.

본 발명의 제2 실시예에 따른 ChIP용 다중 농축 미세칩은, 서로 다른 DNA와 제1제2항체가 각각 결합된 2종의 단백질을 포함하는 시료가 투입되는 주입구, 상기 주입구와 연통되고, 내부에는 상기 항체와 결합하는 제1특정단백질이 고정된 복수개의 비드(4)가 위치되는 제1챔버(3'), 상기 제1챔버(3)와 격벽(8)으로 연결되고, 내부에는 상기 항체와 결합하는 제2특정단백질이 도포된 복수개의 비드(11)가 위치되는 제2챔버(10), 상기 제1챔버(3)로 투입된 상기 시료가 상기 제2챔버(10)로 공급되도록 상기 제1챔버(3)의 외주부 및 제2챔버(10)의 외주부 일부에 연결되는 제1배출로(7),상기 제1배출로(7)와 이격된 상태로 상기 제2챔버의 외주부에 연결되는 제2배출로(14), 및 상기 제2챔버(10) 내부로 투입된 상기 시료를 배출시키는 배출구(13)를 포함한다.

다시 말해, 본 발명의 제2 실시예의 특징은 챔버 2개를 직렬로 배치하고, 제1챔버(3)를 통과한 시료가 다시 제2챔버(10)를 통과하도록 하여, 1번의 실험으로 2종류의 DNA 또는 단백질을 검출하도록 하는 것이다.

투입된 시료는 제1챔버(3') 내의 비드(4)를 통과하며, 이 때 타켓 DNA 또는 단백질과 결합된 항체가 비드(4)에 도포된 단백질과 결합하게 된다. 그 뒤 남은 시료는 제1챔버(3)의 외주부 및 제2챔버(10)의 외주부의 일부와 연통된 제1배출로(7)를 통해 제2챔버(10) 내로 유입되거나, 제1챔버(3)의 하단의 격벽(8)에 위치하는 배출홀(32)을 통과하여 제2챔버(10)내로 유입된다.

제1챔버(3)를 통해 제2챔버(10) 내로 유입된 시료는 제2챔버(10) 내의 비드 (11)를 통과하게 되며, 이 때 제2챔버(10) 내의 비드(11)는 그 크기 및 재질은 제1챔버(3') 내의 비드(4)와 동일하다. 그러나 비드상(11)에 도포되는 단백질의 종류를 제1챔버(3) 내의 비드(4)와 다르게 하고(또 다른 항체와 결합할 수 있는 단백질을 도포하고) 상기 도포된 단백질은 제1챔버(3)에서 반응한 항체와는 다른 종류의 항체와 결합하는 단백질을 선택하여, 결과적으로 제1챔버(3)에서는 검출하지 못했던 다른 종류의 DNA 또는 단백질을 검출할 수 있는 것이다.

그 뒤 제2챔버(10) 내의 비드(11)를 통과한 잔량의 시료는 제2챔버(10)의 외주부와 연통된 제2배출로(14)를 통해 저장소(16)로 집결된 후, 배출구(13)로 배출되거나, 제2챔버(10)의 하단의 격벽(8)에 위치하는 배출홀(32)을 통과하여 저장소로(16) 집결된 후, 배출로(13)로 배출된다.

한편 상기 제2챔버(10)는 필요에 따라 시료 및 비드를 상기 제2챔버(10)로 직접 공급하는 보조주입구(12)가 더 구비될 수 있으며, 나아가, 각각의 챔버의 세척 및 해리 등을 용이하게 하기 위하여 상기 제1챔버(3)와 상기 제2챔버(10)는 서로 탈부착이 용이하도록 형성될 수 있다(미도시). 상기 탈부착 수단은 통상의 챔버의 탈부착에 사용되는 수단들이 모두 사용될 수 있으며, 구체적으로 자성체, 체결부(볼트 등), 억지끼움, 벨크로우즈테이프 등을 사용할 수 있으나 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 제3실시예는 ChIP용 농축 미세칩을 이용한 ChIP 수행방법으로서, 1) 세포에 포름알데히드를 첨가하여 DNA와 DNA 결합단백질을 결합시키는 단계, 2) 상기 세포를 파괴하고 상기 DNA를 잘게 절단하는 단계, 3) 상기 DNA 결합단백질과 결합하는 항체를 투입하여 시료를 제작하는 단계, 4) 상기 본 발명의 ChIP용 농축 미세칩의 주입구에 상기 시료를 투입하는 단계, 5) 상기 미세칩의 내부의 비드를 세척하는 단계, 및 6) 상기 세척된 비드를 용리액(elution buffer)으로 처리하여 상기 DNA를 용출하는 단계를 포함한다.

이를 구체적으로 설명하면, 상기 1) 단계와 2)단계까지는 통상의 ChIP 수행방법과 동일하다. 즉, 타겟 DNA 또는 단백질, 바람직하게는 전사인자 등을 포름알데히드를 첨가하여 결합시킨 후, 세포를 파괴하고 DNA를 잘게 부순다. 이 때, 단백질과 결합된 DNA 부분은 절단되지 않고 남아 있게 된다.

그 뒤, 3)단계로서 상기 단백질과 특정하게 결합할 수 있는 항체를 투입하여 단백질과 결합시킨 후 이를 포함하는 시료를 제조한다. 이를 통해 종래의 E.P.튜브를 이용할 때에 비하여 적은 시료를 투입하는 경우에도 DNA 및 단백질의 검출이 가능할 뿐 아니라, 사용되는 비드의 수를 절반 이하로 줄일 수 있으며, 기존 ChIP 실험 시 평균 4일이 소요되던 것이 본 발명의 칩을 사용하면 2일 정도로 단축되므로 최대 50%실험시간을 저감할 수 있다. 또한 고가의 항체, 시약, 샘플 등의 양을 줄일 수 있으므로 실험비용을 절감할 수 있으며, 정량화된 시약과 재료를 사용하여 간편하게 ChIP 실험을 수행할 수 있으므로 실험결과 일관성을 담보할 수 있다.나아가 소프트 리소그래피 등에 의하여 다량 생산이 가능한 것이어서 제작비용이 저렴하다.

이 때 상기 시료는 바람직하게는 Cell sonication sample 100ul(2.5X10⁶cells)및 IP dilution buffer를 500 ~1,000㎕ 를 투입할 수 있다.

그 뒤 4)단계로서 상기 본 발명의 ChIP용 농축 미세칩의 주입구에 상기 시료를 주입하게 되며, 이때, 상기 시료를 5 ~ 30분간 상기 주입구에 투입할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며, 실험조건에 따라 적절히 시간을 조절할 수 있다.

시료를 주입한 뒤, 잔량의 시료가 ChIP용 농축 미세칩에 구비된 배출구를 통해 빠져 나가면, 5)단계로서 상기 미세칩의 내부의 비드를 세척한다. 이 때 세척방 법은 바람직하게는 a) 저염 면역 복합체 세척버퍼(low salt immune complex wash buffer) 0.5㎖ b) 고염 면역 복합체 세척버퍼(High salt lmmune complex wash buffer) 0.5㎖, c) 염화리튬 면역 복합체 세척버퍼(LiCl immune complex wash buffer) 0.5㎖ 및 d) TE 버퍼 0.5㎖;로 순차적으로 세척하되, 각각의 세척시간은 30초 ~ 2분이고 상기 d)단계는 2회 수행될 수 있다. 이 중 상기 저염 면역 복합체 세척버퍼 및 고염 면역 복합체 세척버퍼는 통상의 ChIP 실험에서 사용되는 버퍼들로서 구체적으로 1) 저염 면역 복합체 세척버퍼는 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2mM EDTA, 20mM Tris-HCl, pH 8.1, 150mM NaCl로 구성되는 세척버퍼를 사용할 수 있으며. 2) 고염 면역 복합체 세척버퍼는 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2mM EDTA, 20mM Tris-HCl, pH 8.1, 500mM NaCl로 구성되는 세척버퍼를 사용할 수 있고, 3) 염화리튬 면역 복합체 세척버퍼는 0.25M LiCl, 1% IGEPAL CA630, 1% deoxycholic acid (sodium salt), 1mM EDTA, 10mM Tris, pH 8.1로 구성되는 세척버퍼를 사용할 수 있으며, 4) TE 버퍼는 10mM Tris-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA로 구성되는 버퍼를 사용할 수 있다.

한편, 통상의 ChIP 세척은 각 단계별로 세척액 500㎕를 넣고 3분~5분 동안 휘젓기를 한 후에 원심분리를 하게 되나. 본 발명의 ChIP 농축 미세칩은 상기 5)단계에서 단계별로 세척액 250㎕를 넣고 1분 이내로 흘려주면 세척이 완료된다.

또한, 통상의 ChIP 방법은 각 단계별로 휘젓기와 원심분리 등의 실험절차가 복잡한 방면 ChIP 농축 미세칩은 그냥 용액을 흘려주는 것으로 세척단계가 완료된다.

나아가 세척단계가 끝나고 비드에 붙어있는 히스톤 복합체를 추출하고 순수 DNA를 추출하는 과정에서 통상의 ChIP 방법은 불순물이 (단백질 외에 기타 침전물) 많이 발생하는 반면 ChIP 농축 미세칩은 불순물이 적게 나타나므로 세척효율이 통상의 ChIP 방법보다 우수하다.

그 뒤 6) 단계로서 상기 세척된 비드를 용리액(elution buffer)으로 처리하여 상기 DNA 등을 용출하여 원하는 DNA 및 단백질을 검출한다. 이 때 사용되는 용리액의 종류 등은 통상의 ChIP 실험에서 사용되는 용리액을 사용할 수 있다. 이때 상기 6)단계는 ChIP 농축 칩 내부에 비드가 들어있는 상태에서 진행하게 된다. 규체적으로 채널 내부의 비드를 세척한 후 비드에 붙어있는 히스톤 복합체를 용출하여 최종 용액 샘플을 얻게된다.

상기 6)단계 이후, 바람직하게는 웨스턴 블랏을 수행하거나 PCR 등을 수행하여 검출된 DNA 또는 단백질의 서열 및 특성을 상세히 파악할 수 있는 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 본 실시예는 가장 바람직한 실시형태를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위함이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1 : 시료의 제작>

세포(293세포, 293F세포, HeLa세포)에 포름알데히드를 1%의 농도로 처리하여 DNA와 히스톤 및 DNA 결합 단백질을 교차결합시켰다. 그 뒤 세포를 5x10⁶ 세포씩 분주한 후 용해버퍼(SDS lysis buffer: 1% SDS, 10mM EDTA, 50mM Tris-HCl, pH8.1)를 100ul(1mM)넣고 세포를 파쇄하였다.

그 뒤 상기 시료에 DNA 결합 단백질과 결합할 수 있는 항체(Anti-acetyl-Histon H3 (Lys18))를 2.5㎕ 넣은 후 3시간 동안 반응시켰다.

<실시예 2 : ChIP 수행>

도 1에 도시된 ChIP용 DNA 농축 미세칩의 챔버내에 protein A 로 처리된 45㎛~165㎛ 크기의 6㎍/30㎕ ~ 12㎍/60㎕를 넣고 30분 동안 인큐베이션을 실시하였다. 그 뒤 실시예 1에서 제조된 시료를 미세칩의 주입구에 15분간 흘려주었다.

잔량의 시료가 배출구를 통해 모두 배출된 후 먼저, DEMc 칩 내부의 단백질 A 비드/항체/DNA(크로마틴) 복합체를 하기 1 ~ 4의 단계별로 1분간 흘려주면서 세척하였다.

1) 저염 면역 복합체 세척버퍼 (0.5ml, one wash, at room temp, 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2mM EDTA, 20mM Tris-HCl, pH 8.1, 150mM NaCl), 2) 고염 면역 복합체 세척버퍼(0.5ml, one wash, at room temp, 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2mM EDTA, 20mM Tris-HCl, pH 8.1, 500mM NaCl), 3) 염화리튬 면역 복합체 세척버퍼(0.5ml, one wash, at room temp, 0.25M LiCl, 1% IGEPAL CA630, 1% deoxycholic acid (sodium salt), 1mM EDTA, 10mM Tris, pH 8.14), 4) TE 버퍼(0.5ml, two washes, at room temp, 10mM Tris-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA)

세척이 끝난 DEMc 칩 내부의 단백질 A 비드/항체/DNA(크로마틴) 복합체에 250ul 용출버퍼(1% SDS, 0.1M NaHCO₃)를 1분 동안 흘려주어 반응시켜 목표로 하는 DNA(크로마틴)을 용출하였다.

<실시예 3 : 웨스턴 블롯 수행>

(1) 먼저, 15% SDS 폴리아크릴아미드 겔을 이용하여, 100V, 1시간 동안 동작하였다. 세척이 끝난 상기 실시예 2를 통해 제조된 샘플 또는 WCE(Whole cell extract)에 2X SDS sample buffer를 넣고 10분 동안 가열한 후 스핀다운시켜 상등액만 사용하였다. 세척이 끝난 샘플은 20㎕ 로딩하고 WCE는 10㎕ 로딩한다. 그 뒤 IgG 0.5㎕에 1X sample buffer 50㎕를 넣고 10분간 가열하여 10㎕로 로딩하였다.

그 뒤 트랜스퍼 세트를 셋팅하고 transfer buffer(48mM Tris base, 39mM Glycine, 20% MeOH, 0.0375% SDS)를 채운 후 100V로 1시간 동안 젤에 있는 단백질을 PVDF membrane으로 트랜스퍼하였다. 그 뒤 membrane을 5% skim milk-TBST에 넣고 1시간 동안 반응 시켰다.

그 뒤 5% skim milk-TBST(10mM Tris-Cl(pH 7.4), 150mM NaCl, 0.05% Tween)에 1:3000으로 1'항체(앞에서 사용된 것과 같은 Ab)를 넣고 2시간 배양한 후, TBST로 15min씩 3번 씻어주었다. 그 뒤 5% skim milk-TBST에 1:3000으로 1'항체b(Anti-rabbit IgG)를 넣고 1시간 배양한 후, TBST로 15min씩 3번 씻어주었다. 그 뒤 Membrane에 TMB 용액을 넣어 발색이 될 때까지 배양하여 검출하였다.

도 7은 웨스턴 블롯의 수행결과를 나타내는 전기영동 사진이다. 구체적으로 사진의 좌측으로부터 (1) 통상의 ChIP western blot positive 샘플, (2) 통상의 ChIP western blot negative 샘플, (3) ChIP 농축 미세칩 western blot positive 샘플, (4) ChIP 농축 미세칩 western blot negative 샘플, (5) Whole cell extract, (6) Anti-acetyl H3 histone IgG의 순으로 구성된다.

그 결과, 표적 단백질인 Acetylated-histone H3(17.3KDa)의 확인을 통해서 원하는 히스톤+DNA 복합체가 포함되어 있는 지 여부를 확인할 수 있다. 위의 실험결과 항체를 넣지 않은 샘플(negative)에서 히스톤 밴드가 나타나지 않았으며, 항체를 넣은 샘플(positive) 에서는 통상의 ChIP 방법과 ChIP 농축 미세칩 둘 다 원하는 밴드가 나타났다. 이를 통해 Protein A 비드 및 히스톤 항체를 통해서 원하는 DNA+히스톤 복합체를 정확히 붙잡았는지 western blot을 통해서 확인 할 수 있으며, 기존의 Tube 방법에서와 같이 ChIP 농축 칩에서도 표적 DNA+히스톤 복합체를 소량의 비드와 히스톤 항체를 이용해 Tube 방법과 같은 양으로 정확히 붙잡을 수 있었다.

<실시예 4 : PCR 수행>

(1) 실시예 2 샘플에 5M NaCl 10㎕를 넣고 65℃, 4시간 가열하여 Histone-DNA crosslink를 풀어주었다.

(2) 0.5M EDTA 5㎕, 1M Tris-HCl pH 6.5 10㎕, 10mg/ml Proteinase K 1㎕를 넣고 1시간 동안 45℃에서 반응시켰다.

(3) 페놀/클로로폼 추출과 에탄올 precipitation에 의해 DNA를 추출하였다.

(5) 하기 서열의 GAPDH 유전자의 프라이머(Product Size: 166 bp)를 미리 제작하여 PCR을 수행하였다.

GAPDH For: 5´-TACTAGCGGTTTTACGGGCG-3´

GAPDH Rev: 5´-TCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA-3´

(6) 2.5% 아가로즈 겔 전기영동를 수행하여 GAPDH가 맞는지 확인하였다

도 8은 상술한 방법을 통해 실시된 전기영동 결과이다. 상기 도 8에서 1레인은DNA size marker 50Kb ladder이고, 2레인은 통상의 ChIP PCR negative 샘플(E.P튜브 사용), 3레인은 통상의 ChIP PCR positive 샘플E.P튜브 사용), 4레인은 본 발명의 ChIP 농축 미세칩 negative 샘플이고, 5레인은 5. ChIP 농축 미세칩 positive 샘플이다.

상술한 표적 유전자는 세포내의 GAPDH 유전자를 사용했으며 166bp 크기에서 밴드가 형성된다. 통상의 ChIP negative 샘플은 항체를 넣지 않은 샘플이며, 통상의 ChIP positive 샘플은 항체를 넣은 샘플이다.

위의 전기영동 결과 통상의 ChIP positive 샘플과 ChIP 농축 미세칩 positive 샘플에서 166bp 크기의 GAPDH gene 밴드가 나타났으며, 따라서 ChIP 농축 미세칩을 이용하여 통상의 ChIP 칩 방식과 동일한 실험결과를 얻을 수 있다.

본 발명은 종래의 E.P. 튜브를 이용한 ChIP 기술을 대체하여 적은 시료의 양으로 실험이 가능하고 실험시간이 줄어들며, 실험결과의 변동이 적으면서도, 상온에서도 ChIP 실험을 수행할 수 있어 바이오 산업에 매우 유용한 발명이다.

도 1은 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 ChIP용 농축 미세칩의 평면도이다.

도 2는 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 ChIP용 농축 미세칩의 평면도이다.

도 3은 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 ChIP용 농축 미세칩의 평면도이다.

도 4는 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 커버가 없는 상태의 ChIP용 농축 미세칩의 사시도이다.

도 5는 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 커버가 부착된 상태의 ChIP용 농축 미세칩의 사시도이다.

도 6은 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 ChIP용 농축 미세칩의 단면도이다.

<도면의 주요부분에 대한 부호의 설명>

2, 2', 12 : 주입구 3 : 챔버 3' : 제1챔버 4, 11: 비드 5, 16 : 저장소 6, 13 : 배출구

7 : 배출로 8 : 격벽 10 : 제2챔버 14 : 제2배출로 15 : 제2격벽 30 : 글라스

32 : 배출홀

Claims (25)

1. DNA 및 항체와 결합된 단백질을 포함하는 시료가 투입되는 주입구;

   상기 주입구와 연통되고, 내부에는 표면에 상기 항체와 결합하는 특정 단백질이 고정된 복수개의 비드가 위치되는 챔버; 및

   상기 챔버와 연통되며, 상기 투입된 시료가 배출되도록 상기 주입구의 타측에 형성된 배출구;를 포함하는 것을 특징으로 하는 ChIP(Chromatin immunoprecipitation)용 농축 미세칩(MEMs chip).
2. 제1항에 있어서,

   상기 특정 단백질은 단백질 A 또는 단백질 G인 것을 특징으로 하는 ChIP용 농축 미세칩.
3. 제1항에 있어서, 상기 비드는 아가로즈 비드 또는 세파로즈 비드인 것을 특징으로 하는 ChIP용 농축 미세칩.
4. 제1항에 있어서, 상기 비드의 직경은 45㎛ ~ 165 ㎛인 것을 특징으로 하는 ChIP용 농축 미세칩.
5. 제1항에 있어서, 상기 챔버의 외주부에 설치되어 상기 시료가 배출되고, 상 기 배출구와 연통되는 배출로를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 ChIP용 농축 미세칩.
6. 제5항에 있어서, 상기 배출로와 상기 챔버 사이에 설치되고 상기 비드보다 작은 통로를 갖는 배출홀을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 ChIP용 농축 미세칩.
7. 제1항에 있어서, 상기 챔버를 밀폐시키는 커버가 결합되는 것을 특징으로 하는 ChIP용 농축 미세칩.
8. 제7항에 있어서, 상기 커버는 유리 또는 투명 플라스틱인 것을 특징으로 하는 ChIP용 농축 미세칩.
9. 제1항에 있어서, 상기 비드는 6㎍/30㎕ ~ 12㎍/30㎕인 것을 특징으로 하는 ChIP용 농축 미세칩.
10. 서로 다른 DNA 및 항체가 각각 결합된 2종의 단백질을 포함하는 시료가 투입되는 주입구;

    상기 주입구와 연통되고, 내부에는 상기 항체와 결합하는 제1특정단백질이 고정된 복수개의 비드가 위치되는 제1챔버;

    상기 제1챔버와 격벽으로 연결되고, 내부에는 상기 항체와 결합하는 제2특정 단백질이 도포된 복수개의 비드가 위치되는 제2챔버;

    상기 제1챔버로 투입된 상기 시료가 상기 제2챔버로 공급되도록 상기 제2챔버의 외주부 일부에 연결되는 제1배출로;

    상기 제1배출로와 이격된 상태로 상기 제2챔버의 외주부에 연결되는 제2배출로; 및

    상기 제2챔버 내부로 투입된 상기 시료를 배출시키는 배출구;를 포함하는 것을 특징으로 하는 ChIP용 다중 농축 미세칩.
11. 제10항에 있어서, 상기 제1배출로와 상기 제1챔버 및 제2배출로와 제2챔버 사이에 설치되고 상기 비드보다 작은 통로를 갖는 배출홀을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 ChIP용 다중 농축 미세칩.
12. 제10항에 있어서, 상기 격벽은, 상기 제1챔버로 투입된 상기 시료가 상기 제2챔버로 배출되도록 배출홀이 형성되는 것을 특징으로 하는 ChIP용 다중 농축 미세칩.
13. 제10항에 있어서, 상기 제2챔버는 시료를 상기 제2챔버로 공급하는 보조주입구가 더 구비된 것을 특징으로 하는 ChIP용 다중 농축 미세칩.
14. 제10항에 있어서, 상기 제1특정단백질과 제2특정단백질은 각각 상이한 종류 의 항체와 결합하는 것을 특징으로 하는 ChIP용 다중 농축 미세칩.
15. 제10항에 있어서, 상기 제1챔버와 상기 제2챔버는 탈착되는 것을 특징으로 하는 ChIP용 다중 농축 미세칩.
16. 삭제
17. 제10항에 있어서, 상기 ChIP용 다중 농축 미세칩은, 상기 제2챔버로 투입된 상기 시료가 상기 배출구로 배출될 수 있도록 제2챔버와 배출구 사이에 배출홀이 형성된 격벽을 더 구비하는 것을 특징으로 하는 ChIP용 다중 농축 미세칩.
18. 1) 세포에 포름알데히드를 첨가하여 DNA와 DNA 결합단백질을 결합시키는 단계;

    2) 상기 세포를 파괴하고 상기 DNA를 잘게 절단하는 단계;

    3) 상기 DNA 결합단백질과 결합하는 항체를 투입하여 시료를 제작하는 단계;

    4) 상기 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 ChIP용 농축 미세칩의 주입구에 상기 시료를 투입하는 단계;

    5) 상기 미세칩의 내부의 비드를 세척하는 단계; 및

    6) 상기 세척된 비드를 용리액(elution buffer)으로 처리하여 상기 DNA를 용 출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 ChIP용 농축 미세칩을 이용한 ChIP 수행방법.
19. 제18항에 있어서,

    상기 DNA는 전사인자 또는 아세틸화 히스톤(Acetylated Histone) H3와 결합할 수 있는 DNA인 것을 특징으로 하는 ChIP용 농축 미세칩을 이용한 ChIP 수행방법.
20. 제18항에 있어서, 상기 시료는 600 ~ 1000㎕를 투입하는 것을 특징으로 하는 ChIP용 농축 미세칩을 이용한 ChIP 수행방법.
21. 제18항에 있어서, 상기 4) ~ 6)단계는 15 ~ 30℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 농축 미세칩을 이용한 ChIP 수행방법.
22. 제18항에 있어서, 상기 4)단계에서 상기 시료를 5 ~ 30분간 상기 주입구에 투입하는 것을 특징으로 하는 농축 미세칩을 이용한 ChIP 수행방법.
23. 제18항에 있어서, 상기 5)단계는,

    a) 저염 면역 복합체 세척버퍼(low salt immune complex wash buffer) 0.5㎖ b) 고염 면역 복합체 세척버퍼(High salt lmmune complex wash buffer) 0.5㎖, c) 염화리튬 면역 복합체 세척버퍼(LiCl immune complex wash buffer) 0.5㎖ 및 d) TE 버퍼 0.5㎖;로 순차적으로 세척하되, 각각의 세척시간은 30초 ~ 2분이고 상기 d)단계는 2회 수행되는 것을 특징으로 하는 농축 미세칩을 이용한 ChIP 수행방법.
24. 제18항에 있어서, 상기 6)단계 이후, 웨스턴 블랏을 수행하는 것을 특징으로 하는 농축 미세칩을 이용한 ChIP 수행방법.
25. 제18항에 있어서, 상기 6)단계 이후, 용출된 DNA에 대하여 PCR을 수행하는 것을 특징으로 하는 농축 미세칩을 이용한 ChIP 수행방법.

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