CN117280019A - 颗粒分离器系统、材料和使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及利用磁性悬浮从细胞和细胞核碎片以及死细胞中分离和/或浓缩细胞核和/或活细胞的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年1月19日提交的美国临时申请序列号No.63/139,301的优先权权益，其全部公开内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明总体上涉及含颗粒样本(例如细胞或生物分子)的浓缩，以便在介质中分离这样的颗粒和分离颗粒贫化介质。在一些实施例中，本发明总体上涉及从细胞核碎片和死细胞中分离和/或浓缩细胞核。
背景技术
分离介质中含有的颗粒是许多化学和生物过程中的一个重要步骤。在一些过程中，可能需要简单地分离颗粒，以便于颗粒的使用或操控，而在其他过程中，可能需要将颗粒与介质中也存在的其他颗粒分离。已经开发了各种装置来促进这种颗粒分离和隔离。此外，已经尝试开发依赖于颗粒及其周围介质的磁性特性以便从颗粒的异质群体中分离出感兴趣的颗粒的装置。
在对细胞操作时，一个常见的需求是通过减少细胞悬浮于其中的体积来浓缩细胞。细胞浓缩的最常见过程是离心细胞以形成球团，并去除大部分介质。离心分离包括施加离心力，根据颗粒的大小、形状、密度、介质粘度和转子速度，将颗粒从溶液中分离出来。然而，在某些情况下，离心是不可取的，因为离心会对细胞造成损伤或使细胞活化。例如，T细胞离心可导致细胞活化。此外，当处理很少的或者小体积的样本时，容积分离技术(如离心)可能会非常浪费或费力，并且不容易实现样本分级分离。此外，当待分离的颗粒易碎或不稳定时，例如对于生物体的处理，提高颗粒稳定性的精确条件可能具有挑战性。
对于难以处理的组织和样本，细胞核已迅速成为单细胞研究和开发的主要目标之一。虽然处理细胞应该比细胞核更简单、更直接，但处理组织的实际情况往往比预期要复杂和困难得多。
各组织在进行处理时的细胞组成、细胞外基质和解离行为各不相同。因此，研究人员发现建立经过充分验证且一致执行的解离和纯化方案来产生可靠的、高品质的单细胞悬浮液变得越来越困难。可选地，细胞核工作流程克服了许多这些挑战，不仅为单细胞分析提供了更加统一和标准化的起始材料，而且还消除了与组织解离和处理相关的基因表达变化的一些可能性。
遗憾的是，细胞核制备也面临其自身的挑战。具体来说，如何纯化从死细胞和碎片中提取的细胞核。传统方法使用起来仍然困难且耗时，产量和纯度较差。LeviCell提供了一种快速、简单且高效的细胞核纯化方法。
本文所述的装置和方法通过提供用于浓缩颗粒(例如细胞和细胞核)和产生不依赖于离心期间所需的高机械力的颗粒贫化介质的替代方法来解决这些问题。
发明内容
在本发明内容中提供的发明实施例仅仅是说明性的，并且提供了这里公开的所选实施例的概述。本发明概述是说明性的和选择性的，不限制任何权利要求的范围，不提供这里公开或构想的发明实施例的整个范围，并且不应该被解释为限制或约束本公开或任何要求保护的发明实施例的范围。
本文提供了一种流体浓缩器装置，其包括入口通道、处理通道和至少两个输出通道，以及用于使含有颗粒的样本移动通过浓缩器装置的泵。浓缩器装置可具有单独的分流通道，这些分流通道可由阀或功能类似的分流技术控制，以收集颗粒浓缩流或颗粒贫化流的全部或部分。浓缩器装置可以在自动控制下操作，并且还包括在处理通道或入口通道的部分的内部或附近的一个或多个传感器，以检测颗粒是否存在或颗粒量或颗粒或样本流的其它物理或化学性质。探测器的输出可以可操作地连接到浓缩器控件，以优化浓度和分级分离条件。粒子浓缩/贫化可以通过重力沉降、磁悬浮/排斥以及它们的组合由设备物理实现。入口通道与处理通道的接口优选地在几何上构造成减少或消除处理通道中的湍流。处理通道和输出通道之间的接口优选地在几何上构造成有助于将分层流、颗粒富集流和颗粒贫化流收集到它们各自的出口通道中。
本文还提供一种流体浓缩装置，其具有沿处理通道(X轴)基本上线性定位的磁性部件，以基于处理通道中的粒子的顺磁性而提供对粒子的磁性排斥或吸引。磁性部件可用于引起或增加颗粒在处理通道内的沉积。包括沿着处理通道的磁体部件的流体浓缩装置的另一个应用是这种装置能够在低重力或微重力环境中操作。或者，在某些情况下，当样本流体为非均质颗粒混合物时，磁性部件可选择性地抑制样本流体中某些颗粒的沉降。在一些实施例中，在入口通道内提供磁场可通过对从入口通道到处理通道的颗粒流提供可克服的抑制而赋予预浓缩效果。可通过将基本上沿处理通道呈线性的磁体延伸到入口通道中而引发入口通道磁场。可替代地，磁性部件可以独立于处理通道并安置成与入口通道磁连通。在一个实施例中，这是条形磁体，在另一个实施例中，它是围绕入口通道的全部或一部分的环形或超环面磁体。入口通道磁体可以是永磁体或在磁控制器控制下的电磁体。在下面举例说明的其他实施例中，处理通道可以具有与处理通道基本成线性放置的多个磁性部件。在一个这样的实施例中，提供不同磁场强度的磁体以平行于处理通道基本上线性的方式彼此相对地定位(例如，顶部和底部)。当与预浓缩步骤或装置配置相结合时，该实施例可选择性地用于浓缩含有异质颗粒组合物的样本的预定颗粒组分。颗粒在处理通道外部的积聚可能是一个被动过程，取决于入口通道内样本液体介质中颗粒的流动性以及样本流量。颗粒在处理通道外部的积聚可以是利用入口通道内的磁场在该磁场内阻止颗粒的主动过程。对从入口通道进入处理通道的颗粒运动的障碍可以通过操控流量或流动模式来克服。例如，通过增加流量或引入一个或多个增加通道压力的脉冲来增加入口通道中的颗粒流动性。当通过入口通道中的电磁场感应实现颗粒抑制时，可通过减小入口通道磁场、改变入口通道流量或压力、或磁场与样本流特性的组合来增加颗粒从入口通道进入处理通道的移动性。
本文还提供了一种颗粒浓缩装置，其包括流体处理通道结构、至少一个磁性部件和至少两个输出端口，其中所述流体处理通道包括基本线性部分，所述基本线性部分具有与所述输入端口流体连通的前端和与所述输出端口流体连通的尾端。至少两个输出端口基本上并行配置。根据该实施例，每个输出端口包括至少一个收集路径，其中收集路径通向收集室，该收集室包含后续处理步骤所需的确定量的材料。流体通道结构通常是微毛细管通道，其中允许颗粒自由地或以期望的速率流过。所述装置还可包括一个或多个泵，所述一个或多个泵构造成驱动流体从输入端口通过所述流体通道结构。在一些实施例中，该装置还包括一个或多个用于控制颗粒路径和/或流量的阀。
样本浓度实施例
在下面编号的实施例中进一步描述了本发明的方法的实施例。编号的实施例不是对本发明的限制，并且可以结合这里描述的其他元素和替代方案。
第一实施例(l)是一种浓缩样本的方法，包括:(I)提供具有处理通道、入口通道和多个出口通道的低体积流体装置，(ii)使含有颗粒的样本在一定条件下通过入口通道流入处理通道，以产生具有至少颗粒富集层和颗粒贫化层的样本流，(iii)使所述颗粒富集层流动通过第一出口通道以产生颗粒富集流，(iv)使所述颗粒贫化层流动通过第二出口通道以产生颗粒贫化流，和(v)从一个或多个出口通道收集所述流中的一个或多个。
第二实施例(2)是第一实施例进一步包括使含颗粒的样本经受足以导致样本颗粒沉降到颗粒富集流中的流动条件。第三实施例(3)是第一实施例(1)还包括提供来自处理通道的顶部并沿处理通道的X轴排列的磁场，并且将样本中的颗粒排斥到颗粒富集流中。第四实施例(4)为实施例三或四还包含(i)在入口通道内引发磁场以阻止颗粒从入口通道移动到处理通道中以在入口通道中形成样本流的颗粒浓缩部分，(ii)将样本流的颗粒浓缩部分移动到处理通道中，(iii)产生颗粒富集流，(iv)使颗粒富集流流过出口通道，及(v)捕获颗粒富集流。
第五实施例(5)是两个或三个(2-3)的实施例的方法还包括(i)在入口通道内引发磁场以阻碍颗粒从入口通道移动到处理通道中以在入口通道中形成样本流的颗粒浓缩段，(ii)将样本流的未受阻碍部分移动到处理通道中，(iii)产生颗粒贫化流，(iv)使颗粒贫化流流过出口通道，和(v)捕获颗粒贫化流。
第六实施例(6)是第一到第四(1-4)的实施例还包括测量处理通道中的颗粒富集层中的颗粒以确定相对颗粒浓度或位置，以及基于处理通道中的颗粒的位置或高相对颗粒浓度收集颗粒富集层的一部分。第七实施例(7)是实施例一至三(1-3)或实施例五(5)还包括测量处理通道中的颗粒贫化层中的颗粒以确定相对颗粒浓度，并基于低的相对颗粒浓度收集颗粒贫化层的一部分。
第八实施例(8)是第五实施例(5)还包括在入口通道内提供磁场，该磁场与从处理通道顶部产生并沿处理通道的X轴排列的磁场连续。第九实施例(9)是实施例五(5)还包括产生围绕入口通道的环形磁场。第十实施例(10)是实施例九(9)的方法还包括调节入口通道内的磁场以有助于入口通道内的颗粒富集段移动到处理通道中。
第十一实施例(11)是实施例1至10(1-10)的方法还包括检测处理通道内的颗粒性质和调节样本流量以操控颗粒富集流内的颗粒浓度。实施例十二(12)是实施例十一(11)还包括检测颗粒富集流内的颗粒性质和调节样本流量以操控颗粒富集流内的颗粒浓度。实施例十三(13)是实施例十或十二(10或12)的方法还包括检测处理通道内的颗粒性质并调节入口通道内的磁场以操控颗粒富集流内的颗粒浓度。
第十四实施例(14)是实施例十三(13)的方法还包括检测颗粒富集流内的颗粒性质，并调节入口通道内的磁场以操控颗粒富集流内的颗粒浓度。
第十五实施例(15)是实施例1至10(1-10)的方法还包括检测入口通道内的颗粒性质和调节样本流量以操控颗粒富集流内的颗粒浓度。第十六实施例(16)是实施例十(10)的方法还包括检测入口通道内的颗粒性质和调制入口通道内的磁场，以操控颗粒富集流内的颗粒浓度。第十七实施例(17)是根据实施例11至16(11-16)的方法还包括检测相对颗粒浓度或颗粒密度。实施例十八(18)是根据实施例十至十七(10-17)的方法还包括检测处理通道内的化学性质和调节样本流量以操控颗粒富集流内的颗粒浓度。第十九实施例(19)是根据实施例十至十七(10-17)的方法还包括检测颗粒富集流内的化学性质和调节样本流量以操控颗粒富集流内的颗粒浓度。
第二十实施例(20)是根据实施例十至十七(10-17)的方法还包括检测处理通道内的化学性质并调节入口通道内的磁场以操控颗粒富集流内的颗粒浓度。第二十一实施例(21)是第二十实施例(20)的方法还包括检测颗粒富集流体的化学性质和调节入口通道内的磁场以操纵颗粒富集流内的颗粒浓度。第二十二实施例(22)是实施例1至21(1-21)的方法还包括检测入口通道内的化学性质和调节样本流量以操控颗粒富集流内的颗粒浓度。
实施例二十三(23)是根据实施例十至二十二(10-22)的方法还包括检测入口通道内的化学性质和调节入口通道内的磁场以操控颗粒富集流内的颗粒浓度。
实施例二十四(24)是实施例十八至二十三(18-23)的方法，其中所述性质是电化学、光子、光谱或结合性质。实施例二十五(25)是根据实施例一至二十四(1-24)的方法还包括将颗粒贫化流转向到收集通道中并捕获颗粒贫化流的一部分。
实施例二十六(26)是根据实施例一至二十五(1-25)的方法还包括将颗粒富集流转向到收集通道中并捕获颗粒富集流的一部分。
实施例二十七(27)是根据实施例1至26(1-26)的方法还包括将颗粒贫化流和颗粒富集流分别转向到各自的收集通道中，并捕获各流的一部分。实施例二十八(28)是根据实施例二十七(27)的方法还包括捕获流的多个离散部分。实施例二十九(29)是根据实施例二十七或二十八(27或28)的方法还包括从颗粒贫化流和颗粒富集流中捕获非同时部分。
实施例三十(30)是根据实施例一至二十九(1-29)的方法还包括在引入入口通道之前向样本中加入顺磁性化合物。实施例三十一(31)是根据实施例一至三十(1-30)的方法还包括对分离的部分进行后续反应。实施例三十二(32)是实施例三十一(31)的方法，其中后续反应是结合、PCR、测序样本制备、酶降解或酶合成反应。实施例三十三(33)是实施例三十一(31)的方法，其中对收集的样本进行细胞培养、荧光激活细胞分选、或磁悬浮细胞分选。
实施例三十四(34)是根据实施例一至三十三(1-33)中任一个的方法，其中样本流体首先以与处理通道基本上不线性对齐的角度流动，然后以与处理通道基本上线性的角度流动。
实施例三十五(35)是分级分离血液样本的方法，包括(i)提供全血样本或稀释血液样本，和(ii)使样本经受实施例一至三十四(134)的样本浓缩方法，并从全血样本或稀释血液样本中分离血浆和/或血细胞。第三十六实施例(36)是实施例三十五(35)的方法，其中血液样本的体积为从约50μL到约10mL。第三十七实施例(37)是实施例三十六(36)的方法，其中血浆级分(部分，fraction)包含血液样本中的少于约1％的血细胞。第三十八实施例(38)是实施例三十七(37)的方法，其中血浆级分包含血液样本中的少于约0.01％的血细胞。第三十九实施例(39)是实施例三十八(38)的方法，其中血浆级分基本上不含血样中的血细胞。第四十实施例(40)是根据实施例三十五至三十九(35-39)的方法，其中血液样本是外周血液样本、脐带血样本、胎儿血液样本或动脉血液样本。第四十一实施例(41)是根据实施例三十五至四十(35-40)的方法还包括对分离的部分进行诊断测定。第四十二实施例(42)是根据实施例四十一(41)的方法，其中所述测定是酶免疫测定法、化学发光免疫测定法、血凝/颗粒凝集测定法、核酸扩增技术测定法、药物测定法、法医测定法或基因性状测定法。实施例四十三(43)是根据实施例一至四十一(1-41)中任一方法的实施例，其中在入口通道和/或处理通道内的颗粒贫化层的颗粒或组分上进行反应，并且可选地与颗粒分离/浓缩同时进行。实施例四十四(44)是根据方法实施例四十三(43)的实施例，其中所述反应是结合或染色反应。
实施例四十五(45)是根据实施例一(1)至四十四(44)中任一个的实施例，其中所述颗粒是细胞或细胞核。
实施例四十六(46)是一种分离细胞核的方法，包括：将包含细胞核的样本和包含顺磁性化合物或铁磁流体的样本介质加载到分离通道中；利用至少一个磁体使样本承受磁力以对分离起作用；收集经分离样本的包含细胞核的至少一个级分，无需进一步离心；并且，可选地在分离之前、期间和/或之后对样本中的核进行成像。
实施例四十七(47)是根据方法实施例四十六(46)的实施例，其中所述样本包含约50至约10,000,000个细胞核。
实施例四十八(48)是根据方法实施例四十六(46)至四十七(47)中任一个的实施例，其中所述样本还包含活细胞、死细胞或细胞碎片。
实施例四十九(49)是根据方法实施例四十六(46)至四十八(48)中任一个的实施例，其中一个级分中细胞核的浓度相对于原始样本增加至少1.1:1。
实施例五十(50)是根据方法实施例四十六(46)至四十九(49)中任一个的实施例，其中原始样本中的非核颗粒的浓度在所述级分中降低了至少约1％。
实施例五十一(51)是根据方法实施例四十六(46)至五十(50)中任一个的实施例，其中在来自样本的一个级分中的分离出的细胞核的完整性比通过包括离心作用的方法在来自样本的一个级分中分离出的细胞核的完整性高至少约30％。
实施例五十二(52)是根据方法实施例四十六(46)至五十一(51)中任一个的实施例，其中所述细胞核是从人类细胞、非人类动物细胞或植物细胞中分离出的。
实施例五十三(53)是根据方法实施例四十六(46)至五十一(52)中任一个的实施例，其中所述细胞核是从健康细胞、病变细胞、感染细胞、转染细胞或基因改造细胞中分离出的。
实施例54是一种用于从混合物中分离活细胞和/或细胞核的方法，所述混合物包含所述活细胞和/或细胞核、死细胞和核碎片，所述方法包括：
A)提供流体样本处理装置，该流体样本处理装置包括：
(i)处理通道，
(ii)入口通道，
(iii)将入口通道连接到处理通道的入口连接区域，
(iv)在处理通道的上侧和下侧沿处理通道的X轴排列的多个磁性部件，
(v)多个出口通道，
(vi)将处理通道连接到出口通道的出口连接区域，
(vii)在出口连接区域处与处理通道的上部区域流体连通的第一出口通道，
(viii)在出口连接区域处与处理通道的下部区域流体连通的第二出口通道，以及
(ix)与第一出口通道相关联的第一流量调节器和与第二出口通道相关联的第二流量调节器；以及
B)使所述混合物流过流体样本处理装置，以提供富含所述活细胞和/或细胞核的第一回收样本和贫于所述活细胞和/或细胞核的第二回收样本。
实施例五十五(55)是根据方法实施例五十四(54)的实施例，其中所述第一回收样本富含细胞核。
实施例五十六(56)是根据方法实施例五十四(54)的实施例，其中所述第一回收样本富含活细胞。
实施例五十七(57)是根据方法实施例五十四(454)至五十六(56)中任一个的实施例，其中a)第一回收样本中活细胞的产量为混合物的总活细胞组分的至少约50％、至少约60％、至少约70％或至少约75％；和/或b)第一回收样本中细胞核的产量为来自混合物的活细胞组分的总细胞核的至少约50％、至少约60％、至少约70％或至少约75％。
实施例五十八(58)是根据方法实施例五十四(54)至五十七(57)中任一个的实施例，其中所述出口连接区域还包括料流分流器部分。
实施例五十九(59)是根据方法实施例五十八(58)的实施例，其中所述料流分流器部分突出到处理通道中，并且被构造和布置成在出口通道中将一个流体流分离成各个单独的流。
实施例六十(60)是根据方法实施例五十四(46)至五十九(59)中任一个的实施例，其中所述流体样本处理装置还包括与第一出口通道相关联的第一流量传感器和与第二出口通道相关联的第二流量传感器。
实施例六十一(61)是根据方法实施例六十(60)的实施例，其中一个流量传感器与一个流量调节器操作性链接。
实施例六十二(62)是根据方法实施例五十四(54)至六十一(61)中任一个的实施例，其中所述流体样本处理装置还包括光学传感器和照明源，所述照明源被配置为与光学传感器相对或角向相邻；可选地，其中所述照明源发射紫外光。
实施例六十三(63)是根据方法实施例五十四(54)至六十二(62)中任一个的实施例，其中所述流体样本处理装置进一步包括传感器，其中所述传感器是光电探测器、多像素成像探测器、磁场探测器、电化学探测器、光学相位探测器、散射探测器、霍尔传感器、磁阻传感器、测辐射热传感器、表面声波传感器、生物传感器、电容传感器、电导传感器、热敏传感器、流量传感器、超声波传感器、重力传感器、磁场传感器或其组合；以及操作性链接到多个流量调节器的控制器。
实施例六十四(64)是根据方法实施例五十四(54)至六十三(63)中任一个的实施例，其中所述流体样本处理装置还包括流动池盒，该流动池盒包括平面基底，所述平面基底包括：
(i)上表面和下表面；
(ii)形成成像表面的第一纵向侧；
(iii)形成照明表面的第二纵向侧；以及
(iv)第一和第二横向侧；
(v)上表面上的入口井；
(vi)入口通道；
(vii)与入口通道流体连通并基本平行于纵向侧定位的样本处理通道；
(viii)处理通道内的样本分流器；
(ix)与所述处理通道流体连通的多个出口通道；以及
(x)与所述多个出口通道中的每一个流体连通的多个收集井；
其中，所述基底可选地包括光学透明材料，并且其中所述处理通道在所述基底的平面内偏移以在空间上朝所述成像表面偏置。
实施例六十五(65)是根据方法实施例五十四(54)至六十四(64)中任一个的实施例，其中所述流体样本处理装置还包括流动池盒，该流动池盒包括平面基底，所述平面基底包括：
(i)上表面上的入口井；
(ii)入口通道；
(iii)样本处理通道；
(iv)在所述处理通道内的样本分流器；
(v)与所述处理通道流体连通的多个出口通道；以及
(vi)与所述多个出口通道中的每一个流体连通的多个收集井；
其中，所述基底包括光学透明材料，并且其中所述多个出口通道中的每一个的组合体积大于所述处理通道的体积。
实施例六十六(66)是根据方法实施例六十四(64)和六十五(65)中任一个的实施例，其中所述流动池盒的出口通道遵循紧凑路径，例如其中所述出口通道是蜿蜒通道。
实施例六十七(67)是用于从混合物中分离活细胞和/或细胞核的方法，所述混合物包含所述活细胞和/或细胞核、死细胞和核碎片，所述方法包括：
提供包括处理通道和多个出口通道的流动池盒，其中流动池盒的出口通道具有大于处理通道的体积；
使包含活细胞和死细胞的样本溶液以及顺磁性化合物流入处理通道；
将流动池盒放置在基本上平行于处理通道排列的磁场中；
将处理通道和其中包含的样本完全保持在磁场内处于停止流动状态一段时间，该段时间足以在处理通道内以一定竖直距离分离活细胞和死细胞；以及
同时将富含活细胞和/或细胞核的样本级分以及富含死细胞和核碎片的样本级分抽取到出口通道中。
浓缩器装置实施例
在下面编号的实施例中进一步描述了本发明的装置的实施例。编号的实施例不是对本发明的限制，并且可以结合这里描述的其他元件和替代方案。
第一实施例(1)是一种磁性流体样本处理装置，包括:(i)处理通道，(ii)入口通道，(iii)将入口通道连接到处理通道的入口连接区域，(iv)多个出口通道，(v)将处理通道连接到出口通道的出口连接区域，(vi)在出口连接区域处与处理通道的上部区域流体连通的第一出口通道，(vii)在出口连接区域处与处理通道的下部区域流体连通的第二出口通道，以及(viii)在处理通道的上侧或下侧沿处理通道的X轴排列的磁体。
第二实施例(2)是一种磁性流体样本处理装置，包括:(i)处理通道，(ii)入口通道，(iii)将入口通道连接到处理通道的入口连接区域，(iv)多个出口通道，(v)将处理通道连接到出口通道的出口连接区域，(vi)在出口连接区域处与处理通道的上部区域流体连通的第一出口通道，(vii)在出口连接区域处与处理通道的下部区域流体连通的第二出口通道，以及(viii)在处理通道的上侧和下侧沿处理通道的X轴排列的多个磁性部件，其中处理装置被构造和布置成在引入处理通道之前提供颗粒的预浓缩。
第三实施例(3)是一种流体样本处理装置，包括(i)处理通道，(ii)入口通道，(iii)将入口通道连接到处理通道的入口连接区域，(iv)多个出口通道，(v)将处理通道连接到出口通道的出口连接区域，(vi)在出口连接区域处与处理通道的上部区域流体连通的第一出口通道，(vii)在出口连接区域处与处理通道的下部区域流体连通的第二出口通道，以及(viii)入口通道流控制器。
第四实施例(4)是实施例二的装置，其中加工通道的上侧和加工通道的下侧的磁性部件被构造和布置成在加工通道内提供不同强度的磁场。
第五实施例(5)是根据实施例一至四(1-4)的装置，其中入口通道包括第一横截面积，而处理通道包括第二横截面积，第一横截面积小于第二横截面积。第六实施例(6)是根据实施例五(5)的装置，其中通道是微流体或毛细管。
第七实施例(7)是根据实施例一至六(1-6)的装置，其中入口连接区域以小于90度的角度渐缩。在第八实施例(8)中，提供了实施例七(7)的装置，其中角度等于或小于60度。在实施例九(9)中，根据实施例八(8)的设备具有等于或小于45度的连接角度。
第十实施例(10)提供了来自实施例一至九(1-9)的装置，其中出口连接区域还包括料流分流器部分。实施例十一(11)是实施例十(10)的装置，其中，所述料流分流器部分伸入所述处理通道中，并且被构造和布置成将相应的流分流到它们的出口通道中。
实施例十二(12)是根据实施例一至十一(1-11)的装置，其中第一出口通道包括第一出口收集通道和第一出口导流通道。实施例十三(13)提供了实施例十二(12)的装置，其中第一出口通道还包括阀，该阀被构造和布置成使得第一出口通道中的流与第一出口收集通道或第一出口导流通道可选择地流体连通。
实施例十四(14)是实施例一至十三(1-13)的装置，其中第二出口通道包括第二出口收集通道和第二出口导流通道。
实施例十五(15)是实施例十四(14)的装置，其中第二出口通道还包括阀，该阀被构造和布置成使得第二出口通道中的流与第二出口收集通道或第二出口导流通道可选择地流体连通。实施例十六(16)提供了根据实施例一至十五(1-15)的装置，其中流体装置还包括在入口通道或入口区域中产生选通磁场的磁体。实施例十七(17)是实施例十六(16)的装置，其中产生选通磁场的磁体是围绕入口通道或入口区域的环形或超环形磁体。在实施例十八(18)中，根据实施例十六(16)提供了一种装置，其中产生选通磁场的磁体与处理通道对齐并相邻，并且延伸到或超出入口通道的通道入口区域。
第十九实施例(19)，实施例一至十八(1-18)的装置包括光学透明的处理通道。在实施例二十中，实施例一至十八(1-18)的装置包括光学透明的入口通道。实施例二十一提供了实施例一至二十(1-20)的装置，还包括入口通道流量控制器、第一出口通道控制器、第二出口通道控制器或其组合。实施例二十二(22)是根据实施例15-18的装置，还包括磁场控制器(可操作地链接到环形或超环形磁体)。
实施例二十三(23)提供了实施例一至二十二(1-22)的装置，其中流体装置包括一个或多个传感器。实施例二十四(24)是实施例二十三(23)的装置，其中传感器选自光学传感器、电容传感器、电导传感器、热敏传感器、流量传感器、超声传感器、重力传感器、磁场传感器或其组合。实施例二十五(25)是根据实施例二十四(24)的设备，其中传感器是光电探测器、多像素成像探测器、磁场探测器、电化学探测器、光学相位探测器、散射探测器、霍尔传感器、磁阻传感器、测辐射热传感器、表面声波传感器、生物传感器或其组合。
第二十六(26)实施例提供了实施例二十三至二十五(23-25)的装置，其中传感器被集成到处理通道中或邻近处理通道。第二十七实施例(27)提供了实施例二十三至二十五(23-25)的装置，其中传感器集成到入口通道中或邻近入口通道。第二十八实施例(28)提供了实施例二十三至二十五(23-25)的装置，其中传感器被集成到一个或多个出口通道中或邻近一个或多个出口通道。实施例二十九(29)是实施例二十三至二十五(23-25)的装置，其中流体装置包括在处理通道中或附近的一个或多个传感器、在入口通道中或附近的一个或多个传感器、在至少一个出口通道中或附近的一个或多个传感器、或其组合。
实施例三十(30)是根据实施例二十五至二十七(25-27)的装置，还包括入口通道流量控制器，其中至少一个传感器可操作地链接到入口流量控制器。实施例三十一(31)是根据实施例二十五至二十八(25-28)的装置，还包括出口通道流量控制器，其中至少一个传感器可操作地链接到出口流量控制器。实施例三十二是根据实施例二十三至二十九(23-29)的装置，还包括围绕入口通道或入口区域的环形或超环形磁体、和磁场控制器，其中传感器可操作地链接到磁场控制器以控制环形或超环形磁体的磁场。
实施例三十二(32)是根据装置实施例一至三十一(1-31)的装置，其中入口通道进一步包括与处理通道基本上成线性的部分和与处理通道基本上不线性对齐的部分，它们在以角度(θ)成角度的部分处连接，其中θ≠180°和θ≥90°，相对于Y轴或Z轴或独立地相对于Y轴和Z轴为≥100°，为≥135°，为≥140°，为≥165°>180°，为≥205°，为≥225°，≥250°或≤270°。
流动池盒实施例
本发明的流动池盒的第一实施例(1)包括平面基底，该平面基底包括上表面和下表面、形成成像表面的第一纵向侧、形成照明表面的第二纵向侧、以及第一和第二横向侧、上表面上的入口井、入口通道、与入口通道流体连通并基本平行于纵向侧定位的样本处理通道、在所述处理通道内的样本分流器、与所述处理通道流体连通的多个出口通道、以及与所述多个出口通道中的每一个流体连通的多个收集井，其中所述基底可选地包括光学透明材料，并且其中所述处理通道在所述基底的平面内偏移以在空间上朝所述成像表面偏置。
本发明的流动池盒的第二实施例(2)包括平面基底，该平面基底包括上表面上的入口井、入口通道、样本处理通道、在处理通道内的样本分流器、与处理通道流体连通的多个出口通道、以及与多个出口通道中的每一个流体连通的多个收集井，其中所述基底包括光学透明材料，并且其中所述多个出口通道中的每一个的组合体积大于处理通道的体积。
第三实施例(3)是根据实施例1和2的流动池盒，其中所述出口通道遵循紧凑路径，一种示例性构造是蜿蜒通道。
第四实施例(4)是根据实施例1-3的流动池盒，其中所述流动池盒的出口通道形成为平面基底内的凹部，第一出口通道包括在平面基底的一个表面上的凹部，第二出口通道包括在平面基底的相对侧上的凹部。在实施例1-4中，通过蚀刻、机械加工、3D打印或模制所述平面基底来形成通道。
实施例4的流动池盒的第五实施例(5)包括一个或多个附加的平面层，所述附加的平面层定位在平面基底中的凹部上方以形成封闭的通道。
第六实施例(6)包括实施例1-5的流动池盒，其中所述基底由非铁金属、陶瓷、玻璃、聚合物或塑料组成，并且对于具有基底和一个或多个层的实施例，所述基底和平面层可以由相同或不同的材料组成。
流动池盒的第七实施例(7)包括实施例5-6，其中所述一个或多个平面层通过以下手段附接到平面基底：加压、粘合剂粘合(优选生物相容性粘合剂，更优选基于硅橡胶的粘合剂或硅橡胶粘合剂)、溶剂粘合、超声波焊接、热粘合、熔焊或3D打印。
流动池盒的第八实施例(8)包括实施例5-7，其中所述平面基底和所述一个或多个平面层由相同材料组成。
流动池盒的第九实施例(9)包括实施例1-8的流动池盒，其中所述平面基底包含聚合物材料。
流动池盒的第十实施例(10)包括实施例9的流动池盒，其中实施例8的聚合物材料包括环烯烃聚合物或环烯烃共聚物。
第十一流动池盒实施例(11)包括实施例1-10，并且还包括形成在平面基底上并且与出口通道的终端部分流体连通的收集井。
实施例1-11的流动池盒的第十二实施例(12)，其中所述收集井还包括在第一井高度处的内部通道入口和在第二井高度处的内部出口，其中所述入口与流动池盒的出口通道流体连通，并且其中第二井高度高于第一井高度。
流动池盒的第十三实施例(13)包括实施例11-12的流动池盒，其中所述收集井还包括提供从入口的终端孔到收集井到收集井底部的成角度过渡的台阶。
流动池盒的第十四实施例(14)包括流动池盒实施例11-13，还包括覆盖一个或多个收集井的顶部的密封膜。
流动池盒的第十五实施例(15)包括流动池盒实施例11-14，其中流动池盒还包括在平面基底中的与收集井流体连通的收集井出口通道。
细胞或细胞核分离系统实施例
本发明的第一细胞分离系统实施例(1)包括用于保持流动池盒的接收块、包含光学传感器、透镜和照明源的光学系统、以及多个流调节部件，其中接收块将流动池盒可移除地放置成与光学系统光学对准，可移除地接合邻近流动池的处理通道的磁性部件，并且将流动池盒的多个出口通道可移除地放置成与多个流调节部件流体连通。
在第二实施例(2)中，实施例1还包括可见光照明源，其被构造和布置为提供通过平面基底内的处理通道的光传输。
在第三实施例(3)中，实施例1-2的系统还包括一个或多个紫外光照射源，其被构造和布置成将紫外光照射(可选地，其在约474nm和/或560nm的波长处)相对于被保持在接收块中的平面基底内的处理通道置于一定角度取向。
在包括实施例3的细胞分离系统的第四实施例(4)中，所述光学系统包括双带通滤波器，该双带通滤波器优选地使所发射的以大约524nm和628nm的波长为中心的波段中的辐射通过。
活细胞-死细胞和/或细胞核分离方法实施例
用于分离活细胞和死细胞的混合物和/或用于将细胞核从核碎片和/或死细胞中分离的方法的第一实施例(1)包括：提供包括处理通道和多个出口通道的流动池盒，其中流动池盒的出口通道具有大于处理通道的体积；使包含活细胞和死细胞和/或细胞核的样本溶液以及顺磁性化合物流入处理通道；将流动池盒放置在基本上平行于处理通道排列的磁场中；将处理通道和其中包含的样本完全保持在磁场内处于停止流动状态一段时间，该段时间足以在处理通道内以一定竖直距离分离活细胞和死细胞，同时将富含活细胞和/或细胞核的样本级分以及富含死细胞和/或完整细胞和核碎片的样本级分抽取到出口通道中。
包括实施例1的方法的第二实施例(2)进一步包括在引入样本溶液之前提供基本上不含任何液体或顺磁性化合物的流动池盒。
分离方法的第三实施例(3)包括实施例1-2的方法，还包括提供这样的流动池盒，即，其中出口通道具有小于处理通道的横截面积的横截面积，并且被布置成遵循紧凑路径，一种示例性构造是蜿蜒通道。
第四实施例(4)包括实施例1-3的方法，还包括紧邻处理通道的顶部竖直表面和紧邻处理通道的底部竖直表面提供磁场，每个磁场具有相似的强度和表面场强，表面场强在大约0.8特斯拉到大约2.0特斯拉之间、可选地在大约0.9特斯拉到大约1.4特斯拉之间。
分离方法的第五实施例(5)包括实施例1-4的方法，还包括在样本溶液中以约50mM至约200mM、可选的约65mM至约175mM、进一步可选的约70mM至约150mM的浓度提供顺磁性化合物。
分离方法的第六实施例(6)包括分离方法实施例1-5，其进一步包括以约75μL/分钟至约150μL/分钟的流量，可选地以约75μL/分钟、约90μL/分钟、约100μL/分钟、约110μL/分钟、约120μL/分钟或约150μL/分钟的流量，将各样本级分抽取到出口通道中的步骤。
分离方法的第七实施例(7)包括实施例1-6，其中所回收的富集样本级分包含至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％的活细胞。
分离方法的第八实施例包括实施例1-7，其中所回收的富集样本级分中活细胞的产量为样本的总活细胞组分的至少约50％、至少约60％、至少约70％、或至少约75％。
分离方法的第九实施例包括实施例1-7，其中所回收的富集样本级分中细胞核的产量为来自样本的活细胞组分的总细胞核的至少约50％、至少约60％、至少约70％、或至少约75％。
附图说明
图1是如本文所述的单磁性成分颗粒聚集和隔离装置的实施例的截面图。
图2是如本文所述的具有成角度的入口通道的单磁性成分颗粒聚集和隔离装置的实施例的横截面图。
图3是如本文所述的具有成角度的入口通道和入口磁场部件的单磁性部件颗粒聚集和隔离装置的实施例的截面图。
图4是如本文所述的粒子聚集和隔离装置的实施例的横截面图，该粒子聚集和隔离装置包括围绕入口通道的一部分的磁性部件。
图5是如本文所述的具有成角度的入口通道和入口磁场部件的单磁性部件颗粒聚集和隔离装置的实施例的截面图。
图6描绘了根据本文所述的实施例的在单个磁性部件配置中的处理通道内施加的磁场。
图7是如本文所述的具有成角度的入口通道和入口磁场部件的多磁性部件颗粒聚集和隔离装置的实施例的截面图。
图8是如本文所述的具有成角度的入口通道和入口磁场部件的颗粒聚集和隔离装置的实施例的截面图。
图9是如所述的具有可选阀和入口通道泵部件的颗粒浓缩和分离装置的实施例的剖视图。
图10是根据这里描述的各种实施例的集成系统的图。
图11描绘了如本文所述的粒子聚集和分离装置的单个磁性部件实施例的操作。
图12描绘了如本文所述的颗粒浓缩和分离装置的倾斜入口通道实施例的操作。
图13描绘了根据本文所述的颗粒浓缩和分离装置的操作实施例的含颗粒样本的流动使能分级分离。
图14描绘了根据本文所述的颗粒浓缩和分离装置的实施例的入口通道磁场辅助的样本浓缩。
图15描绘了根据本文所述的颗粒浓缩和分离装置的实施例的入口通道磁场辅助的样本浓缩。
图16描绘了根据本文所述的颗粒浓缩和分离装置的操作实施例的促进含颗粒样本浓缩的弯液面。
图17是通过本文所述的颗粒浓缩和分离装置的实施例进行的从血样中分离血细胞的显微照片。
图18是如本文所述的颗粒浓缩和分离装置的实施例的透视图。
图19是示例性流动池盒的视图，示出了纵向侧上的成像表面和第二纵向侧上的照明表面。
图20是示例性流动池盒的详细视图，示出了平面基底的顶侧和底侧。
图21显示了收集井的示例性构造。
图22显示了系统接收块的示例，以及示例性流动池相对于多个磁性部件的取向。
图23显示了与示例性接收块成一定取向的光学系统的示例。
图24显示了示例性颗粒分离和出口通道压力稳定性的图像。
图25显示了所收集细胞的存活力和活细胞产量的示例。
图26显示了所收集活细胞的纯度和各种细胞类型的产量的示例。
图27显示了源自肺组织(A，B)和脑组织(C，D)的未分选的细胞核(A，C)和分选的细胞核(B，D)的显微镜图像。
图28显示了源自Jurkat细胞的未分选的细胞核(A)和分选的细胞核(B)的流式细胞仪分析。
图29显示了与通过Levicell系统分离的输入细胞核相比，在被分离的样本中细胞核特异性靶标(SCARNA5)和污染性细胞质靶标(SNHG6)的水平。
具体实施方式
I.定义/术语
提供以下定义是为了帮助理解本发明。除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语、符号和其他科学或工程术语或用语都具有本领域技术人员通常理解的含义。在一些情况下，为了清楚和/或便于参考，在本文中定义了具有通常理解的含义的术语，在本文中包括这种定义不应当被认为其代表与本领域中通常理解的含义有实质性的差异，而是旨在补充这样的通常理解。至于本文中的定义与本领域中通常的理解的不一致的情况，除非另有明确说明，否则本文提供的定义和本领域中通常的理解都应被视为作为替代实施例在本发明的范围内。
如本文所用，除非另有说明，否则开放式术语如“含有”、“包含”等都表示包括。
本文的一些实施例考虑了数值范围。当提供一个数值范围时，除非另有说明，否则该范围包括范围端点。除非另有说明，否则数值范围包括其中的所有值和子范围，就像明确写出的一样。
本文所用的冠词“一”指一个或多个，除非另有明确说明。
本文中的一些值被术语“约”或“大约”修饰。在某些情况下，与一个参考数值相关联的术语“约”或“大约”可包括与该值相差±10％的值的范围。例如，数量“约10”可以包括9至11的数量。在其他实施例中，与一个参考数值相关联的术语“约”或“大约”可以包括与该值相差±10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的值的范围。如果一系列值以术语“约”或“大约”开头，则该术语旨在修饰该系列中包含的每个值。
如本文所用，术语“关于磁场不对称”是指相关流体通道的区域中的磁场关于穿过流体通道中心的一个或多个平面不对称，根据一个优选实施例，其关于水平面不对称。
如本文所用，术语“毛细管”是指具有如下文所定义的通道的管。
如本文所用，术语“通道”、“流动通道”、“流体通道”可互换使用，是指流体可在其中流动的位于流体装置上的路径。通道包括最大高度尺寸为约100mm、约50mm、约30mm、约25mm、约20mm、约15mm、约10mm、约5mm、约4mm、约3mm、约2mm、约1mm或约0.5mm的路径。磁体之间的通道具有约30mm x 0.5mm、约25mm x 1mm、约20mm x 2mm、约15mm x 3mm、约10mm x5mm、约5mm x 3mm、约3mm x 2mm、约2mm x 1mm或约1mm x 0.5mm的尺寸。例如，磁体之间的通道尺寸约为2mm x 1mm。通道的内部高度在其横截面上可以不均匀，并且在几何上所述横截面可以是任何形状，包括圆形、正方形、椭圆形、矩形或六边形。术语“通道”包括但不限于微通道和纳米通道，对于本文中对通道的任何提及，所述通道都可以包括微通道或纳米通道。
如本文所用，术语“浓度”是指包含在第二组分中的第一组分的量，并且可以基于每单位体积的颗粒数、每单位体积的摩尔量、每单位体积的重量，或基于每单位体积的组合组分中的第一组分的体积。
如本文所用，术语“流体联接”或“流体连通”是指流体可在如此联接或连通的两个部件之间流动。
如本文所用，术语“分离”或“隔离”或“分开”或“偏析”可互换使用，在关于组分时它们是指将这种组分与其它组分分离，包括增加溶液中一种组分的浓度，或者将一种组分与溶液中的其它组分分离，或者增加溶液中一种组分的浓度同时将这种组分与溶液中的其它组分分离这两者的结合。如果溶液中的一种颗粒从溶液中的其他颗粒偏析出来和/或位于溶液的限定部分内，则认为该颗粒是“分离的”。如果处理溶液后，溶液中的一种颗粒或组分的浓度增加至少约100:1、90:1、80:1、70:1、60:1、50:1、40:1、30:1、20:1、10:1、5:1、3:1或2:1的比率，则该颗粒或组分也被视为“分离的”。如果在处理溶液之后溶液内的感兴趣的颗粒的浓度与其它颗粒的浓度之比增加，或者如果感兴趣的颗粒的浓度与其它颗粒的浓度之比增加至少约100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％，或者如果其它组分的浓度降低到小于约20％、15％、10％、8％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0.5％，则认为含有其它颗粒的溶液中所述感兴趣的颗粒是“分离的”。
如本文所用，术语“流体的”是指用于处置、处理、喷射和/或分析流体样本的系统、装置或元件，包括至少一个如上文所定义的“通道”。术语“流体的”包括但不限于微流体的和纳米流体的。
如本文所用，术语“流体功能”是指对流体系统中的流体或样本执行或表达的任何操作、功能或过程，包括但不限于过滤、泵送、流体流动调节、控制流体流动等。
如本文所用，术语“颗粒”是指任何物质，包括但不限于原子、化学元素、分子、化合物、生物分子、细胞、坏死细胞、凋亡细胞、癌细胞、癌症或肿瘤循环细胞、细胞核、血液、血浆、蛋白质、脂质、体液、核酸、核苷酸、氨基酸、肽、抗体、抗原、碳水化合物、微生物、细菌、病毒、真菌、精子、配子、卵、胚胎，或任何物理物质，其在任何方向上的最大尺寸小于约3毫米、2毫米、1毫米、0.5毫米、0.25毫米、100微米、75微米、50微米、40微米、30微米、20微米、10微米、5微米、2微米、1微米或0.1微米。颗粒在任何方向上的最大尺寸可以为约0.001微米至约3毫米、约0.1微米至约2毫米、约0.5微米至约1.5毫米、约10微米至约1毫米、或者约20微米至约100微米。
如本文所用，术语“端口”是指使用例如流体通道在两个元件之间提供流体连通的结构。术语“入口端口”或“入口开口”或“输入开口”或“输入通道”可互换使用，它们是指将样本流体注入到本文所述的装置中的开口。
如本文所用，术语“浓缩(concentrate)”是指通过除去水、水性或非水性介质或其它物质而使介质中的一种物质具有增加的群体密度或更纯。该物质是本文所述类型的颗粒或颗粒混合物。通常，如本文所述的浓缩涉及促进颗粒或颗粒混合物在介质中的沉积，从而使颗粒或颗粒混合物到达特定区域。或者，浓缩可涉及从颗粒混合物中分离特定类型的颗粒，并在收集通道中收集该特定类型的颗粒，通常使用预定体积的液体介质。所述浓缩不需要通过转动或旋转散装样本来浓缩颗粒。通过本发明进行的浓缩允许颗粒的分离，而没有颗粒的显著损伤、裂解或剪切。此外，在某些操作条件下，本发明提供了在操作期间样本内的絮凝或结晶，以及样本的已絮凝或结晶颗粒的分离。
在本文描述的方法和步骤表示了以特定顺序发生的特定事件的情况下，本领域普通技术人员将认识到，可以修改特定步骤的顺序，并且这种修改符合本发明的变型。此外，如果可能，某些步骤可以在并行过程中同时执行，也可以顺序执行。
II.磁场
本公开提供了使用处理通道或入口通道内的磁场进行浓缩的方法和装置。磁场与样本流体中颗粒的顺磁性的相互作用可以对颗粒产生排斥或吸引效应，以促进分离或浓缩。
根据一个实施例，磁体是永磁体或电磁体。根据一个实施例，磁体的最大能量积在约1兆高斯奥斯特至约1000兆高斯奥斯特的范围内，更优选在约10兆高斯奥斯特至约100兆高斯奥斯特的范围内。根据一个实施例，磁体的表面场强的范围从大约0.1特斯拉到大约100特斯拉，并且更优选地从大约1特斯拉到大约10特斯拉。根据一个实施例，磁体的剩磁在约0.5特斯拉至约5特斯拉的范围内，并且更优选在约1特斯拉至约3特斯拉的范围内。
根据一个优选实施例，磁体由包括钕与铁和硼的合金、钕、铝与镍的合金、钕与铁的合金、铝和钴与铁的合金、钐-钴、稀土元素与铁的其它合金、稀土合金与镍的合金、铁氧体或其组合的材料制成。根据包括多个磁体的实施例，这些磁体由相同材料制成或由不同材料制成。
根据一个实施例，通过在流体通道的一侧上使用较强的磁性材料并且在流体通道的相对侧上使用较弱的磁性材料来实现不对称磁场。根据一个优选实施例，通过在流体通道的一侧上使用磁性材料并且在流体通道的相对侧上使用基本类似的磁性材料来实现不对称磁场。根据这样的实施例，上磁体和下磁体可以是基本相同的尺寸。根据这样的实施例，上磁体可以包括钕，下磁体可以包括钐-钴，并且其中两个磁体基本上是相同的尺寸。或者，上磁体可以包括钐-钴，下磁体可以包括钕，并且其中两个磁体的尺寸基本相同。
根据一个实施例，可以使用替代的磁体配置。参考附图，根据本发明的装置可以包括围绕流体通道定位的多个上磁体和多个下磁体。上磁体可以包括前上磁体、中心上磁体和后上磁体。下磁体可以包括前下磁体、中心下磁体和后下磁体。
根据另一种磁体配置，所述装置可包括前上磁体、后上磁体、前下磁体和后下磁体，其中这些磁体围绕流体通道定位。前上磁体和后下磁体位于磁排斥方向。示例性NdFeB磁性部件尺寸包括：对于底部磁体部件，约50x 15x 2mm(通过15mm轴磁化)；对于顶部磁体部件，约50x 5x 2mm(通过5mm轴磁化)。其他磁体部件的实施例包括60x 15x 2mm、60x 5x2mm、75x 20x 3mm和25x 15x 2mm。图6示出了在处理通道104底部具有基本上沿X轴排列的矩形磁体的实施例，并且示出了处理通道内的磁力线和磁力。另一个优选的磁体部件实施例包括上下磁体，其尺寸约为75×20×3.2毫米，上下磁体之间的间距为约2.5毫米、约3.0毫米、约3.5毫米、约2.9毫米、约3.0毫米、约3.1毫米、约3.2毫米、约3.3毫米或者约2.72毫米、约2.88毫米、约2.98毫米、约3.18毫米、约3.20毫米或约3.37毫米。
在一个优选实施例中，该装置具有上磁体和下磁体，其中下磁体延伸到入口通道中。底部磁体的尺寸可以是大约50毫米到大约100毫米x大约10毫米到大约30毫米x大约2毫米到大约4毫米。优选的实施例包括约75毫米、约80毫米、约85毫米、约90毫米、约93毫米或约95毫米×约15毫米、约18毫米、约20毫米、约23毫米、约25毫米×约2毫米、约2.3毫米、约2.5毫米、约2.7毫米、约3毫米、约3.18毫米和约3.5毫米。上磁体和下磁体之间的磁体间距优选在2至4.3毫米之间、约2.5毫米、约4.0毫米、约3.5毫米、约2.9毫米、约3.0毫米、约3.1毫米、约3.2毫米、约3.3毫米、或者约2.72毫米、约2.88毫米、约2.98毫米、约3.18毫米、约3.20毫米、约3.37毫米、约3.5毫米、约3.7毫米或约4毫米。
在图7A-D中示出了在顶部和底部集成平行的磁体部件并且基本上沿处理通道的X轴对准的流体浓缩装置的实施例。
III.顺磁性介质
通过本发明的磁促进浓缩处理的样本通常具有添加的顺磁性组分或添加的抗磁性组分。根据本发明的方法，将含有感兴趣的颗粒的物质与顺磁性介质结合以产生处理溶液。顺磁性介质包括顺磁性材料和溶剂。根据一个优选实施例，顺磁性介质是生物相容的，即，能够与活细胞混合并且不影响细胞的存活力或影响细胞行为，例如影响基因表达。顺磁性材料可选自包括钆、钛、钒、镝、铬、锰、铁、镍、镓(包括其离子)及其组合的群组。根据一个实施例，顺磁性材料选自包括钛(III)离子、钆(III)离子、钒(I)离子、镍(II)离子、铬(III)离子、钒(III)离子、镝(III)离子、钴(II)离子和镓(III)离子的群组。根据一个优选实施例，顺磁性材料包括螯合化合物。根据一个优选实施例，顺磁性材料包括钆螯合物、镝螯合物或锰螯合物。根据一个实施例，所述顺磁性介质包括顺磁性材料、盐和用于维持细胞完整性的其它添加剂。在本发明的一个实施例中，顺磁性材料可以是美国专利申请序列号14/407,736中所述的[Aliq]2[MnC14]，[Aliq]3[GdCl6]，[Aliq]3[HoCl6]，[Aliq]3[HoBr6]，[BMIM]3[HoCl6]，[BMIM][FeCl4]，[BMIM]2[MnCl4]，[BMIM]3[DyCl6]，BDMIM]3[DyCl6]，[AlaCl][FeC14]，[AlaCl]2[MnCl4]，[AlaCl]3[GdCl6]，[AlaCl]3[HoCl6]，[AlaCl]3[DyCl6]，[GlyC2][FeC14]，该美国专利申请结合在本文中作为参考。
根据一个实施例，顺磁性材料可以以至少约10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、120mM、150mM、200mM、250mM、300mM、500mM或1M的浓度存在于顺磁性介质中。根据一个实施例，顺磁性材料可以以约10mM至约50mM、约25mM至约75mM、约50mM至约100mM、约100mM至约150mM、约150mM至约200mM、约200mM至约250mM、约250mM至约300mM、约300mM至约500mM、或者约500mM至约1M的浓度存在于顺磁性介质中。
根据一个实施例，顺磁性材料包括钆，并且以至少约10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或l00mM的浓度存在于顺磁性介质中。根据一个实施例，顺磁性材料包括钆，并且以约10mM至约50mM、约25mM至约75mM、或约50mM至约100mM的浓度存在于顺磁性介质中。
IV.装置的配置
参考图1至图5和图7至图10，示出了用于颗粒浓缩和分离的本发明的颗粒浓缩装置的各种实施例，其中该装置的入口通道、处理通道和出口通道部分包括相互连接的单独部件。处理通道优选地是细长的流体通道，其沿x轴具有足够的长度，以允许基于颗粒浓缩在处理通道内的料流层(其中“层”在此意义上表示沿y轴的小范围的位置)中所需的停留时间和基于期望的系统吞吐量，有足够的时间来处理包含感兴趣的颗粒的流体。在一些实施例中，处理通道是具有以下高度的流体通道：约200微米至约30毫米、约200微米至约20毫米、约200微米至约15毫米、约200微米至约10毫米、约200微米至约5毫米、约200微米至约2毫米、约200微米至约1毫米、约0.5毫米至约1毫米、约0.5毫米至约2毫米，约0.5毫米至约3毫米、约1毫米至约2毫米、约1毫米至约3毫米、或约1.5毫米至约2毫米。根据一个实施例，处理通道的长度是约20毫米至约200毫米、约20毫米至约150毫米、约20毫米至约100毫米、约20毫米至约50毫米、约40毫米至约100毫米、约40毫米至约90毫米、或约40毫米至约80毫米。对于一些实施例，通道深度(在Z方向上)为约100微米至约5毫米、约500微米至约3毫米、约1毫米至约2.5毫米、或约1.5毫米至约2毫米。通道长度的实施例的长度可以是40、45、50、60、70毫米。示例性处理通道的尺寸包括1mm和1.9mm高(Y轴，在图中的竖直方向)x0.8或1.0或1.5或2.0mm深(Z轴)，并且长度(X轴)为40-70mm。处理通道的一个优选实施例具有的示例性处理通道尺寸包括约2mm高(Y轴，在图中的竖直方向)x约2.0mm深(Z轴)，并且长度(X轴)约50-70mm。其他优选的处理通道实施例具有的长度约55毫米、约56毫米、约57毫米、约58毫米、约59毫米、约60毫米、约61毫米、约62毫米、约63毫米、约64毫米、约65毫米或约66毫米。
处理通道可以具有任意的横截面几何构造，并且可以包括正方形、矩形、圆形或椭圆形的横截面几何构造。这里描述的处理通道的几何特征同样适用于入口、出口和以上关于本发明的部件构造描述的任何其它流体通道。
入口通道的横截面积(其应为πr2，其中r是当通道为圆形时通道内径的半径)显著小于处理通道的横截面积。在此上下中，“直径”用于描述特征横截面尺寸，并且通道的横截面可以不是圆形的。在各种实施例中，入口通道的横截面积比处理通道的横截面积小至少100倍、80倍、50倍、40倍、20倍、10倍、8倍、6倍、4倍或2倍。在一些实施例中，入口通道的横截面积比处理通道的横截面积小至少10倍。在一些实施例中，入口通道的横截面积比处理通道的横截面积小至少5倍。在一些实施例中，入口通道的横截面积为至多0.2mm2、至多0.8mm2、至多3.1mm2、至多7.1mm2、至多12.6mm2、至多19.6mm2、至多28.3mm2、至多38.5mm2、至多50.3mm2、至多78.5mm2、至多176.7mm2或至多314.2mm2。出口通道通常具有与入口通道相似的尺寸特征，但可以具有如下文所述的变化的横截面积。
颗粒浓缩装置的实施例包括通向处理通道(103)的锥形入口部分。本发明的颗粒分离装置还包括锥形进入端口，以减少由旋涡引起的湍流，并因此减小与不同横截面积的流体通道的连接相关联的相关剪切力。这些旋涡可能会降低处理样本的效率或速率，因为它们提供了细胞或其他粒子可能被捕获在循环路径中的位置，而不是流过装置。旋涡还可能在细胞等粒子上诱发剪应力。锥度角可以在约10°至约70°之间，优选在约20°至约60°之间，在约30°至约45°之间，或者在一些实施例中约为30°。
所述装置的出口部分可包括分流器，该分流器有助于将处理通道中的样本料流部分分流为离散的多个流，以用于分离或进一步处理。分流器优选地定位在处理通道内，但靠近处理通道的尾端，使得当流体离开装置时，通过使流体经过处理通道而实现的任何颗粒分离得以保持。分流器可以包括一个或多个水平隔离件，其从出口通道延伸到处理通道的尾端中。分流器可以延伸到处理通道中，对于磁体基本上沿X轴排列并且位于处理通道的相对侧上的实施例，其延伸长度是磁体之间距离的0.5-3.5倍、1-3倍、1.5-2.5倍、1-2倍或2倍。对于颗粒浓缩装置的单个磁体实施例，分流器延伸到处理通道中的延伸长度可以是单个磁体部件沿Z轴方向的厚度的1-5倍、1.5-5倍、1.5-4倍、2-4倍、3-4倍或4倍。对于没有磁体部件沿处理通道的X轴排列的实施例，分离器的延伸长度可以是处理通道长度的5-40％、5-30％、5-25％、10-30％、10-20％或10-15％，优选大于5％，优选小于35％。分流器在处理通道内逐渐变细成末端的点。锥度角可以在大约5°到大约45°之间，优选地在大约10°到大约30°之间，在大约15°到大约25°之间，或者在一些实施例中，为大约20°。使用分流器可以水平分割处理通道。此外，分流器可包括一个或多个竖直隔离件，从而形成流出物流体出口开口的水平和竖直栅格，其与多个出口通道流体连通。在此实施例中，处理通道的尾端附近的所述多个出口通道通过出口端口通向多个收集室，例如收集管或Eppendorf管。分流器限定了多个出口通道。根据一个实施例，本发明的颗粒浓缩装置包括限定2、3、4、5、6、7、8、9或10个出口通道的分流器。根据一个实施例，本发明的颗粒浓缩装置包括的分流器限定了至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个出口通道。根据一个实施例，本发明的颗粒浓缩装置包括限定2至4、5至7或8至10个出口通道的分流器。本文所述的分流器以及各种所得到的出口通道可结合到上文关于本发明的部件配置所述的处理通道中。
所述多个出口通道从处理通道延伸到对应的多个出口端口。所述多个出口通道可包括流体流量调节器，例如泵或输出阀，其控制从处理通道通过相应的流出物通道到相应的出口端口的流量。通过增加或减少流向各个出口的流体流量，可以将样本溶液分成每个流出物部分，从而可以修改分配比例。根据一个实施例，该比例可以至多修改50％。例如，如果分流器包含两个横截面相等的通道，则几何分配比例为l:l。通过对于一个部分施加比另一部分更大(或更小)的泵送率，可以将更多(或更少)量的流体抽到所述一个部分中，从而可以改变分配比例，例如，改变为大约3∶1，4∶1，5∶1，6∶1，7∶1，8∶1，9∶1或10∶1。在一个优选实施例中，这种几何比例的分配将在约2∶1至约1∶2的范围内。在另一个优选实施例中，这种几何比例的分配将在约10∶1至约1∶10的范围内。分配可以是约1∶10，约1∶9.5，约1∶9，约1∶8.5，约1∶8，约1∶7.5，约1∶7，约1∶6.5，约1∶6，约1∶5.5，约1∶5，约1∶4.5，约1∶4，约1∶3.5，约1∶3，约1∶2.5，约1∶2，约1∶1.5，约1∶1，约1.5∶1，约2∶1，约2.5∶1，约3∶1，约3.5∶1，约4∶1，约4.5∶1，约5∶1，约5∶5，约5.5∶1，约6∶1，约6.5∶1，约7∶1，约7.5∶1，约8∶1，约8.5∶1，约9∶1，约9.5∶1，约10∶1，每个比例分别是上出口通道流量与下出口通道流量的比例。
图1A示出了具有基本上沿着处理通道(104)的顶部X轴排列的单个磁体部件(101)、入口通道(102)和入口连接区域(103)、多个出口通道(106)和料流分流器部分(105)的装置。图1B示出了类似的配置，其中101沿着处理通道的底部排列。图1C示出了1A的配置，其中附加的磁体部件或部分(107)延伸超出处理通道并进入入口部分。图1D示出了这种类型的配置，其中磁体部件基本上沿着处理通道底部的X轴排列，并延伸到入口部分。根据一个实施例，上磁体和下磁体中的一个或两者可移动地安装在系统内，以允许磁体相对于流体通道的竖直位置的受控调节，从而调节通道内的磁场强度。在本发明的某些实施例中，利用入口通道几何形状和入口通道磁场来调整处理通道内的颗粒浓度。通过在处理通道的入口处或附近积聚颗粒，某些实施例能够产生其颗粒的相对富集度变化的料流部分。例如，颗粒在处理通道入口处或附近的积聚可能导致处理通道内的料流中的颗粒数量的瞬间贫化。通过释放或克服颗粒约束力，其为沉积力、磁力或其组合，则处理通道中的料流内的颗粒浓度可以增加。暂时地，这可导致处理通道中的料流的颗粒富集层内的颗粒富集水平发生改变。在一个方面，这种选择性过程对于创建本发明的装置和方法的用户特别感兴趣的料流部分是有用的，所述用户能够识别和利用特别增强的(富集的)或特别贫化的料流部分。
图2A-D示出了进一步包括入口通道部分(203)的单磁体部件配置，该入口通道部分具有与处理通道基本上线性对准的部分和与处理通道不线性对准的部分，这两个部分在以角度θ倾斜的部分处连接。非线性入口部分可包含一个或多个相交通道(201)，线性入口部分可包括一个或多个相交通道(202)。入口通道的相交通道提供液体、悬浮液或气体的引入或移除。相交通道可将试剂引入样本流，例如顺磁性介质、缓冲液、絮凝剂、样本预处理试剂或反应物等。相交通道还可用于将反应物试剂引入样本介质中，以在入口通道内或处理通道内与样本介质的颗粒或其它组分反应。例如，细胞染色反应或配体结合反应可在分离前在入口通道中进行。此外，在一些实施例中，如果需要或期望的话，反应可以在处理通道中进行或继续，如沉淀、絮凝或结晶反应的情况那样。一个或多个相交通道也可用作输出，以收集被排斥或以其他方式被阻止进入分离通道的颗粒。图2A示出了在处理通道顶部具有基本上沿X轴排列的磁体部件的流体浓缩装置。入口通道的非线性部分相对于入口通道的基本线性部分成约90°。图2B示出了类似的实施例，其中磁体部件在处理通道的底部基本上线性排列，并且入口通道的非线性对齐部分相对于入口通道的基本线性部分大约为270°。图2C示出了如图2A所示的实施例，其中磁体部件沿着处理通道的底部排列。图2D示出了类似于图2B的实施例，其中磁体组件沿着处理通道的底部排列。在图2A-D中的实施例中，非线性对齐的入口通道部分相对于入口通道的基本线性部分大约为90°(图2B，2D)或大约为270°(图2A，2C)，角度θ可由装置要求确定，其中θ≠0°，θ≠180°和θ≥30°，θ≥45°，θ≥70°，θ≥90°，相对于x轴和/或独立地相对于y轴和z轴的任意角度θ为≥100°，≥135°，≥140°，≥165°，>180°，≥205°，≥225°，≥250°，≥280°，≥300°或≤330°。例如，图2E显示了平面图，其中θ(x)＝90°，θ(y)＝180°，θ(z)＝0°。图2F显示了平面图，其中θ(x)＝90°，θ(y)＝225°，θ(z)＝0°。
图3A-D示出了类似于图2A-D的实施例，其中磁体部件107延伸到入口区域中。
图4A-D示出了具有另一部件(401)的流体浓缩装置的实施例，该另一部件是围绕入口通道的环形或超环形(toroidal)磁体部件(环形磁体)。环形磁体可包括一个或多个磁体，所述一个或多个磁体相对于它们的磁极以排斥取向定位，由此产生沿入口通道的X轴的对称磁力。在一个实施例中，环形磁体包括围绕入口配置的多个矩形磁体，使得各个排斥场在入口通道内对齐。通过对粒子的顺磁性提供排斥力，环形磁体施加的力减缓了粒子的流量。环形磁体可配置在入口通道的基本线性部分中，如图4A所示，其中磁体组件基本上沿处理通道顶部的X轴排列，以及如图4B所示，其中磁体组件基本上沿处理通道底部的X轴排列。图4C示出了图4A的配置，其中附加的磁体部件或部分(107)延伸超出处理通道并进入入口部分。图4D示出了环形磁体，该环形磁体被配置为围绕流体浓缩装置的入口部分，而没有沿处理通道的轴线排列的磁体部件。尽管在图4A-D中图示为401围绕入口通道的线性部分，但是这些实施例是非限制性的，并且在其他实施例中，环形磁体可以放置在沿着入口通道的任何地方，包括入口通道的非线性对齐部分。
图5A-D示出了具有基本上沿着处理通道的X轴的顶部或底部排列的单磁体部件的实施例，还包括环形磁体401以及非线性对齐的入口通道部分和相交通道。一个或多个相交通道也可用作输出，以收集被排斥或以其他方式被阻止进入分离通道的颗粒。
颗粒浓缩装置的许多实施例包括基本上沿处理通道的X轴的顶部或底部排列的单个磁体部件。本文所述的其它实施例不具有沿处理通道的主要部分排列的磁体组件。在其他实施例中，该设备可以包括多个磁体组件，这些磁体组件基本上沿着处理通道的X轴的顶部和底部排列。这样的实施例提供了通道内的顺磁性颗粒的磁悬浮，因此提供了处理通道内的异质颗粒的分离。根据一个实施例，悬浮装置包括上部磁体或下部磁体，该上部磁体或下部磁体包括可移动地安装的多个磁体，使得被接合的磁体的数量(即，主动产生跨流体通道的处理区段的磁场)可以被控制，从而控制磁场的幅度和梯度分布。随时间变化而控制磁场允许更复杂的协议，该协议在实验或测定过程中可以随时更改。除了相对于静态系统的其他优势之外，这还允许:更灵活的样本划分；颗粒分离的分辨率更高；更灵活的清洗、灌注和处理流体路径的方法；以及在运行实验或测定时优化或改变分离参数的反馈。
根据一个实施例，上磁体和下磁体包括细长矩形磁体(优选地，条形磁体)，其尺寸范围为从约2mm至约25mm的高度(y轴距(竖直轴))，从约30mm至约80mm或至约95mm的宽度(x轴距)，以及从约0.5mm至约7mm的深度(z轴距)。优选地，上磁体和下磁体的尺寸范围为从大约4mm至约20mm的高度(y轴距),从约40mm至约60mm的宽度(x轴距),以及从约1mm至约3mm的深度(z轴距)。这里描述的优选磁体尺寸可以通过一个磁体实现，或通过组合多个磁体来实现。根据一个实施例，上磁体和下磁体的深度和宽度基本相同。根据一个实施例，上磁体的高度比下磁体的高度大至少约25％、50％、75％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％或500％。根据一个实施例，上磁体的高度比下磁体的高度大大约25％至约100％、约100％至约200％、约200％至约300％、约300％至约400％、约400％至约500％、或约500％至约600％。根据一个实施例，下磁体的高度比上磁体的高度大至少约25％、50％、75％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％或500％。根据一个实施例，下磁体的高度比上磁体的高度大大约25％至约100％、约100％至约200％、约200％至约300％、约300％至约400％、约400％至约500％、或约500％至约600％。
根据一个实施例，上磁体和下磁体与流体通道、毛细管或中央处理部分之间沿垂直轴的距离为至少约1微米、10微米、50微米或100微米和/或不大于约500微米、1毫米、2毫米、3毫米、4毫米或5毫米。根据一个实施例，磁体中的任一个和流体处理通道之间沿垂直轴的距离在大约1微米到大约5毫米之间，并且优选地在大约10微米到大约2毫米之间。
根据一个实施例，上磁体和流体处理通道之间的竖直距离比下磁体和流体处理通道之间的竖直距离大至少约25％、50％、75％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％或500％。根据一个实施例，上磁体和流体处理通道之间的竖直距离比下磁体和流体处理通道之间的竖直距离大至少约25％至约100％、约100％至约200％、约200％至约300％、约300％至约400％、约400％至约500％、或约500％至约600％。
根据一个实施例，下磁体和流体处理通道之间的竖直距离比上磁体和流体处理通道之间的竖直距离大至少约25％、50％、75％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％或500％。根据一个实施例，下磁体和流体处理通道之间的竖直距离比上磁体和流体处理通道之间的竖直距离大至少约25％至约100％、约100％至约200％、约200％至约300％、约300％至约400％、约400％至约500％、或约500％至约600％。
根据一个实施例，上磁体和下磁体是永磁体或电磁体。根据一个实施例，上磁体和下磁体的最大能量积在约1兆高斯奥斯特至约1000兆高斯奥斯特的范围内，更优选在约10兆高斯奥斯特至约100兆高斯奥斯特的范围内。根据一个实施例，上磁体和下磁体的表面场强的范围从大约0.1特斯拉到大约100特斯拉，并且更优选地从大约1特斯拉到大约10特斯拉。根据一个实施例，上磁体和下磁体的剩磁在约0.5特斯拉至约5特斯拉的范围内，并且更优选地在约1特斯拉至约3特斯拉的范围内。
根据一个优选实施例，通过在处理通道的一侧上使用较强磁性材料而在处理通道的相对侧上使用较弱磁性材料来实现不对称磁场。根据一个优选实施例，通过在流体通道的一侧上使用磁性材料并且在流体通道的相对侧上使用基本类似的磁性材料来实现不对称磁场。根据这样的实施例，上磁体和下磁体可以是基本相同的尺寸。根据这样的实施例，上磁体可以包括钕和铁的合金，下磁体可以包括钐-钴，并且其中两个磁体基本上是相同的尺寸。或者，上磁体可以包括钐-钴，下磁体可以包括钕，并且其中两个磁体的尺寸基本相同。
根据一个实施例，可以使用替代磁体配置。参考附图，根据本发明的装置可以包括围绕流体通道定位的多个上磁体和多个下磁体。上磁体可以包括前上磁体、中心上磁体和后上磁体。下磁体可以包括前下磁体、中心下磁体和后下磁体。
根据另一磁体配置，所述装置可包括前上磁体、后上磁体、前下磁体和后下磁体，其中这些磁体围绕流体通道定位。前上磁体和后下磁体沿磁排斥方向定位。非对称磁悬浮装置的描述在国际专利申请PCT/US19/24138中进一步描述，该申请通过引用结合于此。
图7A-D示出了双磁体部件颗粒浓缩装置的实施例，其中具有可选的环形磁体401和在示例性取向上的可选的入口通道部分201、202和203。
本文所述的颗粒浓缩装置的某些实施例不具有沿处理通道的主要部分排列的磁体部件。颗粒浓缩是通过在入口通道中颗粒的沉淀和可选的预浓缩的组合，即通过颗粒在入口通道内的可克服的磁排斥、以及通过介质流(flow-mediated)的预浓缩而实现的，这可选地可通过入口通道几何形状得到增强。图8A-D示出了设备配置的实施例。图8E-H示出了控制流体移动的入口通道阀(801、802、803)结合到可选的相交通道。泵(804)可以与任何通道、入口、入口相交、出口、转向等相关联。如本文进一步描述的，泵可在各种实施例中被配置成当在与流体连通的通道相关联的多个泵中操作时提供驱动相应通道中的流体以及累积流所需的正压或负压。图8H示出了具有入口相交通道805和806的颗粒浓缩装置。如图8H所示，入口通道相交通道可以位于环形磁铁的上游、下游或两者。在一个实施例中，相交通道(806)仅设置在入口通道的与环形磁体上游的处理通道大致成直线的部分中。
图9示出了单磁体部件颗粒浓缩装置的实施例。图9A示出了具有泵(804)的颗粒浓缩器装置，该泵将流从入口通道驱动到处理通道中。图9B示出了具有分别控制出口通道的的多个泵(804)的颗粒浓缩装置。组合流速对于处理通道和入口通道中的流是相加的。取决于样本流体特性，如粘度和颗粒浓度，以及入口通道、处理通道和出口通道的尺寸和配置，流量可以在每分钟0.1μL至1mL的范围内。在一个优选实施例中，处理通道和出口通道的流量可以为约0.2μL/分钟至约200μL/分钟，或约0.5μL/分钟至约40μL/分钟。浓缩也可以在停止流动或间歇流动操作下进行。阀(902)可被致动以将出口通道转向到出口端口(903)或(904)。在一些实施例中，相对于处理通道，入口通道泵和出口通道泵分别以正压或负压配置使用。在停止流动条件下，执行样本分离，并通过恢复处理通道内的流动将样本移除至单独的出口通道。
根据本发明，该装置可以包括一个或多个泵以驱动流体通过该装置。“泵”用于指在装置的不同位置之间施加压力差的任何装置。泵可以放置在系统的入口侧(将流体推向出口)，或放置在出口侧(从入口抽取液体)，或两者的组合。压力差可以是正的，也可以是负的。压力差可以跨多个出口或入口被公共地施加，或者可以布置成使得每个出口或入口具有直接施加的压力差。在一些实施例中，可施加压力差以克服入口通道中的颗粒预浓缩力、磁力、沉积力、或力的组合。泵可以是可变的，以允许对施加的压力差进行控制。泵的类型包括但不限于：诸如注射泵等的容积泵；蠕动泵；隔膜泵；调节静压源；诸如体积升高或降低的液体的受重力控制的压力源；和诸如塑料或箔泡罩的手动压力源。
在一些实施例中，泵可被包括在入口管线上以大体上驱动流体通过通道结构，并且还可被包括在某些出口通道或端口上以驱动流体通过定向的出口管线。例如，泵可被包括在与一种或多种感兴趣的颗粒的一个或多个颗粒富集或颗粒贫化层相关的一个或多个出口管线上。此外，所有出口管线可包括可变泵，该可变泵可基于一种或多种感兴趣的颗粒的一个或多个预期料流高度而被激活或停用。类似地，可以控制外部泵以提供可变的压力差。实施例可以进一步包括附加部件，包括：用于保持一个或多个出口收集管的容器(即，接纳器)；用于保持一个或多个输入管的容器；包括用于一个或多个温控管的容器的部件，例如在接近4摄氏度的温度下存放一个或多个出口管的冷板；或微孔板支架，其可包括将入口或出口连接到微孔板中的井(well)的定位装置。在一个实施例中，出口通道或端口流体地联接到移液机器人。移液机器人可与颗粒浓缩装置集成，以从处理通道中选择性地分配浓缩颗粒群的试样或部分，可替代地或附加地，从处理通道中分配颗粒贫化流出物的试样或组分。该装置还可以与微处理器或计算机集成，该微处理器或计算机被编程以记录、分析和/或控制通过该装置的流体和/或颗粒的流动和分离。
图10示出了包括示例性颗粒浓缩装置的颗粒浓缩系统。该装置还可以包括一个或多个传感器。例如，处理通道传感器(1001)和入口通道传感器(1002)可以被实现到系统中。系统集成器(1003)可包括信号处理器，以从传感器(1001)和(1002)接收信号，并通过预编程或可编程命令，控制其它部件，例如入口泵(804)或出口通道泵、环形磁体(201)的磁场或其它电磁部件、阀或其它接口装置或部件。传感器选自光学传感器、电容传感器、电导传感器、热敏传感器、流量传感器、超声传感器、重力传感器、磁场传感器或其组合。在实施例中，传感器是光电探测器、多像素成像探测器、磁场探测器、电化学探测器、光学相位探测器、散射探测器、霍尔传感器、磁阻传感器、测辐射热传感器、表面声波传感器、生物传感器或其组合。传感器可以进一步包括在处理通道或入口通道的部分内部或附近的一个或多个传感器，以检测颗粒的存在与否或颗粒量，或颗粒或样本流的其它物理或化学特性。
如图18中颗粒浓缩装置的平面图所示，该装置还可以包括可视化部件或成像传感器、传感器照明器件和传感器光学器件。可视化部件可以包括任何如下装置：其能够实现或增强在颗粒通过处理通道时实时观察和/或记录颗粒的能力，从而能够实现颗粒隔离的观察和/或测量，包括颗粒隔离的程度和/或粒子隔离的速率。可视化还可包括分析颗粒和/或样本其他成分的大小、形状或其他特性。根据一个实施例，用于包围并由此限定处理通道的材料沿着处理通道的至少一段是清透的(clear)或透明的，以有助于观察穿过其中的颗粒。可视化系统可采用光学器件，以允许对样本成分进行明场照明、暗场照明和/或荧光检测。
在一个实施例中，该装置包括两个光学清透或透明的通道段，各通道段位于通道的相对侧。根据该实施例，可视化部件位于一侧并通过所述清透或透明段中的一个段聚焦，而照明部件位于相对侧并通过所述清透或透明段中的第二段聚焦。照明部件被配置为提供足够的光以有助于通过可视化部件对处理通道内的颗粒的可视化。在另一个实施例中，该装置在通道的一侧包括一个清透或透明段。根据该实施例，可视化组件位于一侧并通过所述清透或透明段聚焦，而照明组件位于同一侧并通过所述清透或透明段聚焦。照明部件被配置为提供足够的光以有助于通过可视化部件对处理通道内的颗粒的可视化。
在一个优选实施例中，照明系统是可见光或紫外光的源。照明源可被配置以照明包括处理通道的光学透明流动通道中的样本，其中所述光通过所述流动通道传输到与所述照明源相对的光学传感器。在一个实施例中，照明源与光学传感器角向相邻，使得来自光源的光从流动通道中的样本反射到光学传感器中。在一个实施例中，光源是紫外光源，并且被构造和布置成照明流动通道内的样本，使得来自与样本相关联的自然荧光或人工荧光的可见光被光学传感器检测到。
V.颗粒分离和浓缩方法
有机或无机颗粒可以通过本发明的方法被浓缩。颗粒可以是生物实体，例如细胞、细胞片段、细胞器(例如，细胞核)、簇、组织、组织成分、微生物(包括细菌、真菌(酵母和霉菌)、病毒、原生动物和藻类)及其片段、细胞器、簇和其的其它成分。颗粒可以是大分子、复合物、螯合物、缀合物、晶体、非晶形固体、凝胶、凝结物等。DNA、RNA、蛋白质根据本发明的方法是可浓缩的。珠、壳、纳米颗粒、层压品以及沉淀物和共沉淀物也可以被浓缩。许多应用需要分离颗粒，包括需要将类似颗粒与其他颗粒分离、识别颗粒、以及处置或以其他方式处理颗粒的应用。此类应用包括但不限于分离活细胞和死细胞、从活细胞和死细胞以及细胞核碎片中分离细胞核、分离和/或处置循环肿瘤细胞、乳液PCR富集、产生诸如富血小板血浆的血浆、针对特定性状分离精子诸如性别选择、细菌负荷试验、抗生素抗性试验、败血症或血液污染的识别、免疫细胞分离、化合物筛选、外来体分离、或细胞外囊泡分离。本发明的颗粒分离方法可用于这些应用中的任一种应用。
样本介质中存在的颗粒在颗粒浓缩装置中在基本上富集颗粒浓度和基本上贫化样本介质层的条件下进行浓缩。基于大小、密度和顺磁不均匀性以及磁力的选择性取向和处理通道流量，可选择性地富集具有不均匀颗粒群的样本介质。颗粒的异质群体可能来自生物样本。在一些情况下，作为示例，生物样本是体液，包括血液、唾液、尿液、精子，血浆、血清和粪便；拭子，包括皮肤、肛门、鼻和阴道拭子或来自门把手的环境拭子；以及近端流体，包括泪液、来自肺的灌洗液或来自乳房的间质组织液。在某些情况下，作为示例，生物样本是活细胞和死细胞、溶解细胞、循环肿瘤细胞、核酸、核苷酸、氨基酸、肽、蛋白质、抗原、抗体或免疫细胞(例如，白细胞，T细胞。吞噬细胞)。在某些情况下，作为示例，生物样本是生物分子、细胞、蛋白质、脂质、碳水化合物、微生物、病毒、病毒体或细菌。
颗粒富集部分的浓度水平相对于样本介质中的颗粒浓度为至少30％，优选为40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。在一个实施例中，颗粒贫化部分基本上不含颗粒。
在引入处理通道之前，试剂流体或气体可在样本介质沿包含相交通道的位置通过之前、同时或之后引入料流中。在一个实施例中，可以将顺磁性介质、缓冲液、絮凝剂、样本预处理试剂或反应物引入并混合到样本介质中，作为用于在处理通道中浓缩或分离或分析的制剂。
颗粒以一定流量被引入处理通道中，并在处理通道中经受沉降和/或磁排斥和/或吸引，以在料流内形成颗粒富集和颗粒贫化层。在各种实施例中，在连续流动、停止流动或间歇流动条件下，在料流内形成颗粒富集层和颗粒贫化层。颗粒富集和/或颗粒贫化层的收集是在各层在加工通道流中被分离时进行的。从处理通道输出的流、颗粒富集流和/或颗粒贫化流可被选择性地通道引导以用于抽样或分级分离(fractionation)。一旦感兴趣的颗粒在处理通道内的流动层中达到它们的平衡(或接近平衡)高度，它们就会通过分流器，分流器将处理溶液分成多个部分。因为感兴趣的颗粒在处理溶液中是几何隔离的，所以基本上所有感兴趣的颗粒都保留在某些几何部分的流出物中。然后收集包含感兴趣颗粒的一个或多个几何流出物部分，如果感兴趣颗粒存在于一个以上的部分中，则可以进行重组，从而分离出感兴趣颗粒。在一些实施例中，可能需要将细胞与顺磁性介质分离。如果希望从顺磁性介质中分离细胞，可以通过稀释来完成。
作为替代，可通过增加或减少流向各个出口的流体流量来实现将样本溶液分流到各流出物部分，从而可修改分流比率。根据一个实施例，该比率可以修改高达50％。例如，如果分流器包含两个横截面相等的通道，则分流的几何比率为1:1。通过施加比施加到另一部分的泵送率更大(或更小)的泵送率，将更大(或更小)量的流体抽回到一个部分中，例如，可以改变分流比率至约3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1或10∶1。在一个优选实施例中，这种几何比率的分流将在约2∶1至约1∶2的范围内。在另一个优选实施例中，这种几何比率的分流将在约10∶1至约1∶10的范围内。该分流可以是约1∶10、约1∶9.5、约1∶9、约1∶8.5、约1∶8、约1∶7.5、约1∶7、约1∶6.5、约1∶6、约1∶5.5、约1∶5、约1∶4.5、约1∶4、约1∶3.5、约1∶3、约1∶2.5、约1∶2、约1∶1.5、约1∶1、约1.5∶1、约2∶1、约2.5∶1、约3∶1、约3.5∶1、约4∶1、约4.5∶1、约5∶1、约5∶5、约5.5∶1、约6∶1、约6.5∶1、约7∶1、约7.5∶1、约8∶1、约8.5∶1、约9∶1、约9.5∶1、约10∶1，每个比率分别为上出口通道流量与下通道流量的比率。
在一个实施例中，包含浓缩颗粒的样本流体以相对较慢的速率通过流体通道，直到其到达处理段的尾端，在那里流量增加至少2倍。在一个优选实施例中，在处理段的尾端，样本流体的流量增加至少4倍。在一些情况下，样本流体暴露于由文中所述的磁体环或一对上磁体和下磁体产生的磁场。在某些情况下，样本流体不会暴露于磁场中。
试样或级分(fraction)可被转移到收集室或容器，诸如管或板。部分或试样可进一步处理、分析或反应。在一个实施例中，收集室、板、井和/或管包括后续处理步骤所需的预定量的材料，允许使用者不仅浓缩细胞，而且将它们从一种介质转移到另一种介质，或添加试剂。示例性试剂包括但不限于用于RNA分离、DNA分离、mRNA分离、蛋白质分离的试剂、生长培养基、培养基和固定剂。可对分离的试样和/或部分进行进一步处理，包括磁悬浮和分离、化学或生物化学分析、分级分离、衍生化、测序样本制备、质谱分析、NMR分析、显微镜分析、FACS分选和分析、以及X射线衍射分析。生物细胞可被收集并以其天然收集状态用于诊断或治疗过程，或被进行基因或生化修饰。
在停留入口、处理或出口通道中期间，可查询颗粒的性质，包括速度、密度、生物、化学、基因、分类、构型、存活力、浓度或取向。可以利用在入口、处理、出口通道或其组合以及收集室、井、板或管内部的、与其邻近的、与其疑问地链接的一个或多个传感器或传感器阵列来执行查询。检测到的特性可用于独立分析，并可被系统控制器组件用来控制或自动化系统操作。受控制的系统成分和参数包括样本介质流量、磁场强度、用于分流、收集、分级分离的阀门驱动以及后续反应条件。在一个实施例中，入口通道内的传感器被集成为可操作地链接到系统控制器，以提供试剂流体或气体到入口通道中的样本流中的自动引入。
图11示出了利用本发明的装置进行颗粒浓缩。通过入口通道经由样本介质流将颗粒引入到处理通道中。沉降和/或磁排斥力将颗粒浓缩在料流的下层，浓缩颗粒通过下部出口通道被收集。通过上部出口通道收集颗粒贫化层。该方法包括以下步骤:(I)提供具有处理通道、入口通道和多个出口通道的低体积流体装置，(ii)在产生至少具有颗粒富集层和颗粒贫化层的样本流的条件下，使含有颗粒的样本流过入口通道进入处理通道，(iii)使颗粒富集层流过第一出口通道以产生颗粒富集流，(iv)使所述颗粒贫化层流过第二出口通道以产生颗粒贫化流，和(v)从一个或多个出口通道收集所述流中的一个或多个。
图12示出了辅助流动颗粒浓缩方法，其中入口通道还包括与处理通道基本上呈线性的部分和与处理通道非线性对齐的部分，这两个部分在具有角度θ的成角度的部分处连接。含颗粒的样本介质以足以允许在入口通道的非线性对齐部分内沉降的流量流过入口通道，以将颗粒浓缩在入口通道内。保持含颗粒样本进入处理通道的流动，以提供持续或进一步的沉降(可选地利用颗粒的磁排斥)，以形成料流的颗粒富集层和颗粒贫化层。料流的各层在它们各自的出口通道处被收集。不受任何理论的约束，颗粒的浓缩大概是由于密度大于它们悬浮在其中的液体(例如，水、溶剂)的颗粒在重力作用下趋向于沉降以及来自磁场的排斥的组合而导致的。可使颗粒沉淀至少1分钟、至少2分钟、至少5分钟、至少10分钟、至少20分钟、至少30分钟或至少60分钟。可允许颗粒沉淀至少10秒、至少20秒、至少30秒、至少40秒、至少50秒、至少60秒、至少100秒或至少200秒。在一些实施例中，浓缩颗粒以至多50μl/min(微升/分钟)、至多40μl/min、至多30μl/min、至多20μl/min、至多10μl/min、至多5μl/min或至多2μl/min的流量通过流体通道。在一些实施例中，浓缩的颗粒以约20μl/min的流量通过流体通道，这将使液体通过流动装置，但允许颗粒积聚在磁场之外。在一些实施例中，浓缩的颗粒以约10μl/min的流量通过流体通道，这将使液体通过流动装置，但允许颗粒积聚在磁场之外。通过流动池的液体将通过通向收集室的出口通道之一沉积。一旦大部分液体已经通过装置并且看到颗粒进入流动池，具有悬浮颗粒(例如，悬浮的细胞)的液体将以较高的流量进入第二输出通道，该第二输出通道通向专门用于收集感兴趣的颗粒的收集室。
图13示出了加工通道内颗粒浓度部分的流动辅助形成。通过下部出口通道收集浓缩(颗粒富集)部分，以提供高度富集的颗粒试样。料流的颗粒富集部分可由诸如观察处理通道内的颗粒的成像传感器的传感器来识别，或者在时间上经由样本的部分的定时收集来识别，其中处理通道内的分级分离模式被表征。
图14示出了在颗粒进入处理通道之前，通过对颗粒施加磁斥力，在入口通道内对颗粒进行预浓缩。颗粒进入加工通道是通过中断或降低通道内的磁排斥力，或通过调节料流以克服磁排斥力，或通过磁力降低和料流调节的组合来实现的。料流的调节可包括增加样本介质料流的流量，或例如通过执行脉动入口通道压力使料流波动，以将颗粒引入处理通道。
图15示出了颗粒浓缩的方法，其中提供了沿处理通道的X轴排列的磁性部件，以在入口通道内扩展磁排斥力，从而禁止颗粒进入处理通道。保持流量以提供颗粒在入口通道中的浓缩。在足够的颗粒预浓缩后，磁性排斥力被克服，颗粒被引入处理通道。预浓缩的程度由样本介质的流量调节。进入处理通道的颗粒沉积/被磁排斥或吸引到处理通道料流的颗粒富集层中，并被收集在出口通道中。
在根据图16的方法的实施例中，在样本介质进入处理通道之后，引入气泡或不混溶的液滴(1601)。气泡或液滴在处理通道中在样本介质之后流动，以基本上将剩余的颗粒富集层和颗粒贫化层从处理通道冲洗到出口通道中。这允许基本上完全分离各样本级分，并提供离散样本或样本级分的处理。可调整空气引入频率，将较大的初始样本打碎成较小的单位，以实现更高效的处理。
本发明方法的一个实施例是分级分离血液样本的方法，包括提供全血样本或稀释的血液样本，并使样本经受本文所述的样本浓缩方法，以及从全血或稀释的血液样本中分离血浆和/或血细胞。血液样本可以是来自外周血样本、脐带血样本、胎儿血样本或动脉血样本的全样本或稀释样本，其体积为约50μL至约50mL、50μL至约20mL、50μL至约10mL或约50μL至约5mL。根据该方法，分离的血浆级分可含有少于约1％到少于约0.01％的血样中的血细胞，或基本上不含血细胞。分离的血液样本级分可用于诊断测定，例如酶免疫测定法、化学发光免疫测定法、血凝/颗粒凝集测定法、核酸扩增技术测定法、药物测定法、法医测定法或基因性状测定法。
作为血细胞浓缩/血浆分离的一个示例，在本发明的颗粒浓缩装置和方法中将脐带血样本分级分离成血浆和细胞部分。10mL血样被获得并被加入钆布醇顺磁性介质以获得最终浓度100mM。通过处理通道的入口通道引入500微升的总样本体积，处理通道配置有基本上沿处理通道顶部的X轴排列的单磁体组件(尺寸X x Y x Z为50x 1.9x 1mm)，允许进行约5分钟的平衡，然后以20微升/分钟的起始流量流动。20微升/分钟的组合流量包括流向底部收集通道的10微升/分钟和流向顶部收集通道的10微升/分钟。使用实时成像监测分离后，流量增加至50微升/分钟，然后增加至100微升/分钟。进入顶部收集通道和底部收集通道的流量的比率分别从1:1调到4:1，然后不对称度超过10:1(底部收集通道为10，顶部收集通道为1)，以将更高比例的流体吸入底部通道，从而保持高纯度。血细胞富集层的浓缩发生在料流的底层，通过底部出口通道进行收集。图16是样本分流器以及前部区域的处理通道处的显微照片(比例尺：流动通道高度为1.9mm)，示出了下部血细胞层和上部血浆层的显著浓缩和隔离。
VI.流动池盒(Flowcell Cartridge)
精确度、准确度和可再现性是对科学仪器的要求。其他考虑因素包括易用性和可制造性。本发明的流动池具有可用装置的所有要求的特征，这些特征使得已经不可能实现的或者有时只能通过冗长和/或复杂并且昂贵的过程来实现的科学实验和开发成为可能。
本发明的流动池盒包括平面基底，该平面基底包括上表面和下表面、形成成像表面的第一纵向侧、形成照明表面的第二纵向侧、以及第一和第二横向侧、上表面上的入口井、入口通道、与入口通道流体连通并且基本平行于纵向侧定位的样本处理通道、处理通道内的样本分流器、与所述处理通道流体连通的多个出口通道、以及与所述多个出口通道中的每一个流体连通的多个收集井，其中所述基底可选地包括光学透明材料，并且其中所述处理通道在所述基底的平面内偏移以在空间上朝所述成像表面偏置。这种平面配置允许将所有所需的流动池功能集成在盒中，并提高实验室或临床环境中的性能和可再现性。在操作中，提高性能的关键是穿过处理通道进入出口通道中的料流尽可能没有湍流。空气和液体之间的可压缩性差异的影响以及通道构造的影响将降低颗粒分离的性能，其中通道构造可能限制流动、与样本溶液弯液面相互作用或以其他方式诱发湍流。通过在样本进入处理通道之前将样本的流动条件降至最低，可以减少样本损失，减少样本粘附和/或颗粒聚集在流动池的通道内的机会，以及减少操控样本对样本细胞或生物体的活性的影响。本发明的特征使得这些和其它影响降至最小，以改善性能和可再现性。当需要在流动池内成像时，平面基底包括光学透明材料。玻璃、塑料或聚合物材料(包括环烯烃聚合物(COP)或环烯烃共聚物(COC))均可满足此应用要求。COP或COP可以通过精密注射成型来利用。可以使用其他材料，这些材料可以通过注射成型、蚀刻、激光烧蚀、机械加工或3D打印来形成所述盒。平面基底的典型尺寸可以是至少50mm长、20mm宽和至少1.5mm厚。可选范围为至少100mm长、35mm宽、约2至约6mm厚。所述盒的纵向侧用作照明和成像的波导。为此原因，处理通道在基底的平面中偏移，并且平行于且邻近基底的成像纵向侧。距成像侧壁的距离可以为约0.5mm至约10mm，优选地约0.5mm至约5mm，可选地约1mm至约3.5mm。在一个实施例中，处理通道与成像壁的间距约为2mm。处理通道的通道尺寸可以是本文前面描述的任何实施例。处理通道的体积可以配置为约10μL至约800μL，优选约50μL至约600μL，并且可选地为100μL至约400μL或约150μL至约300μL。在一些实施例中，所述体积为至少约150μL、至少约200μL、至少约250μL或至少约300μL。出口通道的组合体积必须大于处理通道的体积。当在系统实施例中操作时，两个出口通道之间的体积流量分流可以是均匀分流，或者可以在约4∶1至约1∶4、约3∶1至约1∶3或约2∶1至约1∶2的范围内，或者可以从1∶1变化约50％或更少、或约40％或更少、或约30％或更少、或约15％或更少。
本发明的流动池可选地包括在平面基底上的收集井。收集井具有与出口通道流体连通的入口，其中所述入口处于第一井高度，并且构造有从入口端口孔过渡到井的底部的台阶。这为样本级分流入井内提供了过渡表面，并且能够抑制样本级分反向虹吸到出口通道内以及在收集井内形成气泡。在收集井内的出口通道设置有开口，该开口位于距收集井的底部一定高度处，该高度高于入口通道的开口。内部出口可以布置成与流量调节器连通，在某些情况下，流量调节器是一个单独的泵，用于提供通过流动池的流动。在操作中，用一层材料或膜来密封收集井以提供一个封闭系统，以允许样本和样本级分流动或泵送通过流动池。在组装流动池层时以及使用粘合剂时，提供生物相容粘合剂是重要的。必须正确选择粘合剂，以最小化或防止粘合剂成分渗入溶液中、粘附到细胞上或捆绑来自溶液的分子、自发荧光、具有增加表面积从而增加对细胞的影响的纹理、以及过度亲水或疏水。优选的粘合剂是硅橡胶粘合剂或基于硅橡胶的粘合剂。
VII.细胞分离系统
本发明的细胞分离系统包括用于保持流动池盒的接收块、包含光学传感器、透镜和照明源的光学系统、以及多个料流调节部件，其中接收块将流动池盒可移除地放置成与光学系统光学对齐，可移除地接合邻近流动池的处理通道的磁性部件，并且将流动池盒的多个出口通道可移除地放置成与所述多个料流调节部件流体连通。光学元件构造成提供上述流动池盒的处理通道的显微成像。可选地，光学系统构造和布置成利用可选的紫外光激励器模块为荧光发射提供成像。光学系统可以包括可见光照明源，其构造和布置为提供通过平面基底内的处理通道的光传输。接收块构造和布置为保持平面流动池盒相对于光学系统处于一定取向以使得成像光学器件与平面盒的成像侧对齐，并且可见光发射器被取向为照亮平面流动池盒的照明侧。可选地，光学系统还可以包括一个或多个紫外光照射源，其构造和布置成将紫外光照射(其可选地在约474nm和/或560nm的波长处)与平面盒的成像侧成一定角度取向，以激发所述盒的处理通道内的荧光基团。
为了对处理通道内部的荧光实体成像，光学系统可选地包括双带通滤波器，该双带通滤波器优选地使所发射的以大约524nm和628nm的波长为中心的波段中的辐射通过。
所述接收块的一个可选特征是一系列流量调节器适配器，这些适配器与流动池盒的顶部或底部上的出口相接口。适配器有助于与流量调节器(例如系统中的泵)以及流动池的出口通道(例如收集井出口通道)流体连通。一旦流动池盒被插入到接收块中，则接收块被机械地致动以支承所述盒，将平面盒的照明侧和成像侧与光学成像系统对齐，将磁性部件对准到它们在流动池处理通道的上方和下方的位置，并且在需要时，将流量调节器适配器放置成与流动池盒的相应出口通道流体连通。
系统的流量调节器向流动池盒内的样本和样本级分提供料流。在分离过程中，由流量调节器提供的流量可以在低至1μL/分钟到高至1mL/分钟的范围内。流量可以为或至少为约25μL/分钟、为或至少为约50μL/分钟、为或至少为约100μL/分钟、为或至少为约200μL/分钟、为或至少为约250μL/分钟、为或至少为约300μL/分钟、或约300μL/分钟至约1mL/分钟。总样本体积流量可以是约50μL/分钟、约75μL/分钟、约100μL/分钟、约150μL/分钟、约200μL/分钟或约300μL/分钟。当在系统实施例中进行操作时，两个出口通道之间的体积流量分流可以是均匀分流，或者可以在约4∶1至约1∶4、约3∶1至约1∶3、或约2∶1至约1∶2的范围内，或者可以从1∶1变化约50％或更少、或约40％或更少、或约30％或更少、或约15％或更少。
系统的磁性部件可以包括如上文所述的材料、尺寸和强度，并且可以放置在如上文和下文所述的配置中。
VIII.细胞和细胞核的分离和离析
用于分离活细胞和死细胞的混合物的方法包括：提供流动池盒，例如上述实施例的流动池盒，其包括处理通道和多个出口通道，其中流动池盒的出口通道的组合体积大于处理通道的体积；使包含活细胞和死细胞的样本溶液以及顺磁性化合物流入处理通道；将所述流动池盒置于与所述处理通道基本上平行排列的磁场中；将所述处理通道和其中包含的样本完全保持在所述磁场中处于停止流动状态一段时间，所述一段时间足以在所述处理通道内将活细胞和死细胞分开一段竖直距离，同时将富含活细胞的样本级分和富含死细胞的样本级分抽取到所述出口通道中。可选地，该方法还包括在引入样本溶液之前提供基本上不含任何液体或顺磁性化合物的流动池盒。
在本发明的方法中使用的流动池盒可以包括这样的出口通道，即，所述出口通道具有小于处理通道的横截面积的横截面积，并且被布置成遵循紧凑的路径，一个示例性构造是蜿蜒通道。磁场被布置成紧邻处理通道的顶部竖直表面并且紧邻处理通道的底部竖直表面，每个磁场具有相似的强度和表面场强，表面场强在约0.5特斯拉和约2.0特斯拉之间，可选地在约0.9特斯拉和约1特斯拉之间。表面场强可以是约0.5特斯拉、约0.6特斯拉、约0.7特斯拉、约0.8特斯拉、约0.9特斯拉或约1.0特斯拉。
该方法可进一步包括在样本溶液中提供顺磁性化合物，其浓度为约50mM至约200mM，可选地约65mM至约175mM，进一步可选地约70mM至约150mM。浓度可以是约70mM、约75mM、约80mM、约90mM、约100mM、约110mM、约120mM、约130mM、约140mM、约150mM、约160mM、约170mM、约180mM、约190mM或约200mM。
该方法可进一步包括以约75μL/分钟至约150μL/分钟的流量，可选地以约75μL/分钟、约90μL/分钟、约100μL/分钟、约110μL/分钟、约120μL/分钟或约150μL/分钟的流量，将样本级分抽取到出口通道中的步骤。
该方法使得活细胞级分的回收率和纯度非常高。所回收的富集样本级分包含至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％的活细胞，并且所回收的富集样本级分中活细胞的产量为样本总活细胞组分的至少约50％、至少约60％、至少约70％或至少约75％。
在具有不同流动池配置的不同仪器上进行实验以分离存活的和死亡的Jurkat细胞。通过用70％乙醇处理新鲜的Jurkat细胞，构建了死亡Jurkat细胞群体。除去乙醇并在培养基中冲洗了死亡细胞后，通过将死亡细胞混合回原始活细胞群体来创建混合群体。在此最终混合物中，死亡细胞的浓度约为20％。使用针对每种仪器配置优化的条件，使用本文描述的流动池和系统来分离细胞混合物的等分试样/小份试样。图25A和25B示出了通过本文所述方法获得的活细胞级分的活性和活细胞的产量。图2A和26B示出了通过本文所述方法能够在多种细胞类型上提供有效的活细胞分离。已经对于原代细胞、从人类和动物组织分离的原代细胞、从肿瘤分离的细胞、培养的细胞和本文所述的其它细胞进行了活细胞分离和富集。
细胞核或颗粒的分离被快速完成，而不使细胞核受到与其他洗涤和/或分离技术(例如FACS或洗涤/离心作用)相关联的应力。通过包括以下步骤的方法进行细胞核的快速分离：将包含细胞核的样本和包含顺磁性化合物或铁磁流体的样本介质加载到分离通道中；利用至少一个磁体使样本经受磁力以对分离起作用；在没有进一步的离心作用的情况下收集被分离样本的包含细胞核的至少一个级分；以及可选地在分离之前、期间和/或之后对样本中的颗粒进行成像。在该方法中，样本可包含约50至约10,000,000个细胞核。用于分离的总时间可在约1分钟至约20分钟的范围内。在该快速分离方法中，感兴趣的细胞核的浓度在溶液内或部分溶液内以至少约100:1、90:1、80:1、70:1、60:1、50:1、40:1、30:1、20:1、10:1、5:1、3:1、2:1、1.5:1或1.1:1的比率增加。如果在处理溶液后，感兴趣的细胞核与其他类型颗粒的浓度的比率增加，或者如果细胞核的浓度与其他类型颗粒的浓度的比率增加至少约10％、50％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％，或者如果溶液中非核颗粒的浓度降低至少约20％、15％、10％、8％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0.5％，则含有多种类型颗粒的溶液内的细胞核可以被认为是“分离的”。在细胞核富集方法的一个优选实施例中，样本的被收集的富集部分中分离细胞核的完整性相比通过包括离心作用的方法分离的类似细胞核的完整性大30％。优选地，样本的被收集的富集部分中分离细胞核的完整性是通过包括离心作用的方法分离的相似细胞核的完整性的至少35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％。“完整性”被限定为导致分离细胞核内含有相当比例的DNA和RNA的核膜的完整性。起始样本可以包含约50至约10,000,000个细胞核、约500至约10,000,000、约2,000至10,000,000、约10,000至约10,000,000、约25,000至约10,000,000、约50,000至约10,000,000，约75,000至约10,000,000、约100,000至约10,000,000、约150,000至约10,000,000、约200,000至约100,000,000、或约500,000至约10,000,000个颗粒。分离和收集所分离颗粒的级分的时间可以是20分钟或更短、18分钟或更短、15分钟或更短、12分钟或更短、10分钟或更短、8分钟或更短、5分钟或更短、3分钟或更短，或短于1分钟。通过上述方法分离的细胞核类型可包括人类细胞、非人类动物细胞、植物细胞、真核细胞(例如但不限于，免疫细胞、内皮细胞、酵母和T细胞)。分离的细胞核可以来自单核、双核、多核或去核细胞。多种细胞类型可以包括死细胞、活细胞、健康细胞、病变细胞、感染细胞、转染细胞或基因改造细胞。根据本公开的方法分离的细胞核可以从生物体或者从增殖或培养的细胞直接获得。在快速、高容量分离方法的一个具体实施例中，将活细胞与死细胞分离。在分离方法的另一个实施例中，从有活性的转染细胞和/或crispr改造细胞或以其他方式基因编辑的细胞中分离细胞核。在该方法的另一个实施例中，将细胞核与细胞、细胞片段和/或样本碎片分离。在各种实施例中，利用本文描述的盒和系统来执行这些方法。
示例1从速冻的肺和脑组织分离细胞核
通过使用细胞核裂解缓冲液(ThermoFisher)在冰上孵育30分钟，从快速冷冻的肺和脑组织中分离出细胞核。然后用含有0.1％BSA的PBS洗涤细胞核两次，然后重新悬浮于细胞核储存缓冲液(包含1M蔗糖)中。根据本发明已经发现，在细胞核储存缓冲液中使用蔗糖有利于促进细胞核的储存。通过将3e5细胞核重新悬浮于含有100mM悬浮剂的悬浮缓冲液中，使细胞核准备好进行分离。分离后留出样本用于比较。使用30分钟的平衡时间段在本文所述的分离器设备(LeviCell，可从LevitasBio Inc.，MenloPark，CA购得)中分离细胞核。利用PI对输出物进行染色并使用回波显微镜成像。
利用PI将细胞核染色为明亮的颜色，而细胞碎片没有这样染色。LeviCell的染色输入和输出的图像显示，两种组织样本的未染色碎片数量明显减少。肺组织产生的碎片比脑组织多(图27A和C)，但两个样本在用LeviCell分选后都显示碎片明显减少(图27B和D)。
对源自Jurkat细胞的未分选细胞核(图28A)和分选细胞核(图28B)进行流式细胞术分析。利用PI和CellBrite Fix Green将样本在室温下染色15分钟，然后在Sony SH800S分选机上进行分析。分选后碎片和死细胞群体均减少，并且核群体富集(50.81％至63.57％)。此外，单线态核群体从28.28％富集到43.98％。
示例2-从Jurkat细胞中分离细胞核
在不更换培养基的情况下将Jurkat细胞(ATCC#TIB-152)老化数天，以诱导细胞衰老和凋亡。使用AO/PI在Nexcelom Spectrum细胞计数仪上收集这些细胞并计数。保留这些细胞的一部分用于总RNA输入控制。使用含有RNAse Out RNAse抑制剂(Thermo)的细胞核EZ裂解缓冲液(sigma)从800万个存活率约为50％的细胞中提取细胞核。将细胞核成团并重新悬浮于含有100mM钆、1X PBS、1％BSA和RNAse Out至0.2U/ul的悬浮缓冲液中-该样本现在称为输入。将100万个提取的细胞核在LeviCell系统中悬浮30分钟。从Levicell盒的底部通道收集细胞核，与在先前步骤(输入)中提取的细胞核并行，并从初始样本中保留全细胞，使用RNEasy制备迷你试剂盒(Qiagen)处理总RNA。对总RNA进行归一化，并使用10ng总RNA来将Primescript RT与gDNA擦除试剂盒(Takara)联用以制备cDNA。将针对18S、SCARNA5和SNHG6的预先设计和验证的黄金期qPCR探针测定(IDT)在含有5μl 2x黄金期基因表达主混合液(IDT)和200pg当量cDNA的10μl反应体积中进行多重分析。在Quantstudio5(Thermo)仪器上扩增三次反应。使用ΔΔCT方法分析扩增数据，并报告为归一化为18S内参基因的相对量，并与全细胞RNA进行比较。
结果：如图29所示，与输入细胞核相比，在LeviCell系统上处理的细胞核的核特异性靶标(SCARNA5)富集度更高，并且污染性细胞质靶标(SNHG6)更少。与全细胞相比，在LeviCell系统上处理的细胞核表现出近3倍的核特异性信号富集，但没有表现出细胞质靶标的富集。与输入细胞核相比，悬浮样本的核特异性信号富集度也高出50％。相比之下，输入细胞核显示出与全细胞RNA相差较少的细胞核依赖性靶标信号富集度和与全细胞RNA相差较多量的污染性细胞质RNA。这些数据表明，与通过常规方法提取的细胞核相比，在LeviCell系统上的细胞核悬浮能够富集细胞核和细胞核特异性RNA。
IX.公开的实施例是非限制性的
虽然这里已经示出和描述了本发明的各种实施例，但是要强调的是，这些实施例仅作为示例提供。在不脱离本发明的各种实施例的情况下，可以进行多种变化、改变和替换。具体而言，当本文描述任何范围时，除非另有明确说明，否则该范围包括其中的所有值以及其中的所有子范围。
此外，更一般地，根据本文的公开内容、讨论、实例和实施例，可以采用本领域技术范围内的常规流体学、分子生物学、细胞生物学、微生物学和重组DNA技术。通过引用并入本文的资源是针对其各自的内容和其中的教导。这种合并至少是为了特定的教导和/或在引用本文参考文献时可能会注意到的其他目的。如果没有注明具体的教学和/或其他目的，则针对参考文献的标题、摘要和/或概述中的一个或多个所指示的教学，专门并入已发表的资源。如果没有这种特别确定的教导和/或其他目的可能是如此相关，则并入所公开的资源，以便更全面地描述本发明所属的技术的状态，和/或提供本领域技术人员通常已知的这种教导，如可能适用的。然而，特别声明的是，在此公开的资源的引用不应被解释为承认这是本发明的现有技术。此外，在一个或多个并入的公开资源不同于本申请或者与本申请抵触(包括但不限于定义的术语、术语用法、描述的技术等)的情况下，本申请控制为优选实施例，并且任何矛盾可被视为替代实施例。
虽然本发明的优选实施例已经在本文中示出和描述，但是对于本领域的技术人员来说显而易见的是，这些实施例仅作为示例提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现在可以想到许多变化、改变和替换。应当理解，在实践本发明时可以采用这里描述的本发明实施例的各种替代方案。
Claims (22)
1.一种分离细胞核的方法，包括：
将包含细胞核的样本和包含顺磁性化合物或铁磁流体的样本介质加载到分离通道中；
利用至少一个磁体使样本受到磁力以对分离起作用；
在没有进一步离心作用的情况下收集被分离样本的包含细胞核的至少一个级分；以及
可选地在分离之前、期间和/或之后对样本中的细胞核进行成像。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述样本包含约50个至约10,000,000个细胞核。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中，所述样本还包含活细胞、死细胞或细胞碎片。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，在级分中的细胞核的浓度相比原始样本增加至少1.1:1。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，原始样本中非核颗粒的浓度在所述级分中降低至少约1％。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，在样本级分中已分离的细胞核的完整性相比通过包括离心作用的方法在样本级分中被分离的细胞核的完整性大至少约30％。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，所述细胞核是从人类细胞、非人类动物细胞或植物细胞中分离出的。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，所述细胞核是从健康细胞、病变细胞、感染细胞、转染细胞或基因改造细胞中分离出的。
9.一种从混合物中分离活细胞和/或细胞核的方法，所述混合物包含所述活细胞和/或细胞核、死细胞和细胞核碎片，所述方法包括：
A)提供流体样本处理装置，其包括：
(i)处理通道，
(ii)入口通道，
(iii)将入口通道连接到处理通道的入口连接区域，
(iv)在处理通道的上侧和下侧沿处理通道的X轴排列的多个磁性部件，
(v)多个出口通道，
(vi)将处理通道连接到出口通道的出口连接区域，
(vii)在出口连接区域处与处理通道的上部区域流体连通的第一出口通道，
(viii)在出口连接区域处与处理通道的下部区域流体连通的第二出口通道，以及
(ix)与第一出口通道相关联的第一流量调节器和与第二出口通道相关联的第二流量调节器；以及
B)使所述混合物流过所述流体样本处理装置，以提供富含所述活细胞和/或细胞核的第一回收样本以及贫于所述活细胞和/或细胞核的第二回收样本。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述第一回收样本富含细胞核。
11.根据权利要求9所述的方法，其中，所述第一回收样本富含活细胞。
12.根据权利要求9-11中任一项所述的方法，其中：
a)所述第一回收样本中活细胞的产量为所述混合物的总活细胞组分的至少约50％、至少约60％、至少约70％或至少约75％；和/或
b)所述第一回收样本中细胞核的产量为来自所述混合物的活细胞组分的总细胞核的至少约50％、至少约60％、至少约70％或至少约75％。
13.根据权利要求9-12中任一项所述的方法，其中，所述出口连接区域还包括料流分流器部分。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述料流分流器部分伸入所述处理通道中，并被构造和布置成将一股料流分离成在这些出口通道中的多个单独的料流。
15.根据权利要求9-14中任一项所述的方法，还包括与所述第一出口通道相关联的第一流量传感器和与所述第二出口通道相关联的第二流量传感器。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，一流量传感器与一流量调节器操作性链接。
17.根据权利要求9-16中任一项所述的方法，还包括光学传感器和照明源，所述照明源被配置为与所述光学传感器相对或角向相邻；可选地，其中所述照明源发射紫外光。
18.根据权利要求9-17中任一项所述的方法，包括：
传感器，其中所述传感器是光电探测器、多像素成像探测器、磁场探测器、电化学探测器、光学相位探测器、散射探测器、霍尔传感器、磁阻传感器、测辐射热传感器、表面声波传感器、生物传感器、电容传感器、电导传感器、热敏传感器、流量传感器、超声波传感器、重力传感器、磁场传感器或其组合；和
与多个流量调节器操作性链接的控制器。
19.根据权利要求9-18中任一项所述的方法，其中，所述流体样本处理装置包括流动池盒，所述流动池盒包括平面基底，所述平面基底包括：
(i)上表面和下表面；
(ii)形成成像表面的第一纵向侧；
(iii)形成照明表面的第二纵向侧；和
(iv)第一和第二横向侧；
(v)上表面上的入口井；
(vi)入口通道；
(vii)与入口通道流体连通并基本平行于一纵向侧定位的样本处理通道；
(viii)所述处理通道内的样本分流器；
(ix)与所述处理通道流体连通的多个出口通道；以及
(x)与所述多个出口通道中的每一个流体连通的多个收集井；
其中，所述基底可选地包括光学透明材料，并且其中所述处理通道在所述基底的平面内偏移以在空间上朝所述成像表面偏置。
20.根据权利要求9-19中任一项所述的方法，其中，所述流体样本处理装置包括流动池盒，所述流动池盒包括平面基底，所述平面基底包括：
(i)上表面上的入口井；
(ii)入口通道；
(iii)样本处理通道；
(iv)在所述处理通道内的样本分流器；
(v)与所述处理通道流体连通的多个出口通道；以及
(vi)与所述多个出口通道中的每一个流体连通的多个收集井；
其中，所述基底包括光学透明材料，并且其中所述多个出口通道中的每一个的组合体积大于所述处理通道的体积。
21.根据权利要求19或权利要求20所述的方法，其中，所述流动池盒的出口通道遵循紧凑路径，例如其中所述出口通道是蜿蜒通道。
22.一种从混合物中分离活细胞和/或细胞核的方法，所述混合物包含所述活细胞和/或细胞核、死细胞和细胞核碎片，所述方法包括：
提供包括处理通道和多个出口通道的流动池盒，其中所述流动池盒的出口通道具有大于所述处理通道的体积；
使包含活细胞和死细胞的样本溶液以及顺磁性化合物流入处理通道；
将所述流动池盒放置在基本上平行于所述处理通道排列的磁场中；
将所述处理通道和其中包含的样本完全保持在所述磁场内处于停止流动状态一段时间，该段时间足以在所述处理通道内以一定竖直距离分离活细胞和死细胞；以及
同时将富含活细胞和/或细胞核的样本级分以及富含死细胞和细胞核碎片的样本级分抽取到所述出口通道中。
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