KR20230158469A - 입자 분리기 시스템, 재료 및 사용 방법 - Google Patents

입자 분리기 시스템, 재료 및 사용 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 자기 부상을 이용하여 세포 및 핵 파편과 사세포로부터 세포 핵 및/또는 생세포를 분리/농축하는 방법에 관한 것이다.

Description

입자 분리기 시스템, 재료 및 사용 방법
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2021년 1월 19일자로 출원되었고 그 전체 내용이 본원에 참조로 인용되어 있는 미국 가특허 출원 63/139,301호에 대해 우선권의 이익을 주장한다.
본 발명은 일반적으로 세포 또는 생체분자와 같은 입자 함유 샘플의 농축에 관한 것으로서, 배지(medium) 내에서 이러한 입자를 단리하고 입자 고갈 배지를 단리하기 위한 것이다. 일부 실시예에서, 본 발명은 일반적으로 핵 파편 및 사세포로부터의 세포 핵의 분리 및/또는 농축에 관한 것이다.
배지 내에 함유된 입자의 단리(isolation)는 많은 화학적 및 생물학적 프로세스에서 중요한 단계이다. 일부 프로세스에서는, 입자의 사용 또는 조작을 용이하게 하기 위해 입자를 단순히 단리할 필요가 있을 수 있는 반면, 다른 프로세스에서는, 배지에 또한 존재하는 다른 입자로부터 입자를 단리할 필요가 있을 수도 있다. 이러한 입자 단리 및 분리(separation)를 용이하게 하기 위해 다양한 장치가 개발되어 있다. 또한, 이종 입자 집단으로부터 관심 입자를 분리하기 위해 입자 및 주변 배지의 자기 특성에 의존하는 장치를 개발하려는 시도가 있어 왔다.
세포로 작업할 때의 일반적인 요구는 세포가 현탁되는 양을 감소시킴으로써 세포를 농축시키는 것이다. 세포 농축을 위한 가장 일반적인 절차는 세포를 원심분리하여 펠릿(pellet)을 형성하고 대부분의 배지를 제거하는 것이다. 원심분리는 입자의 크기, 형상, 밀도, 배지의 점도 및 로터 속도에 따라 용액으로부터 입자를 분리하기 위해 원심력을 인가하는 것을 포함한다. 그러나, 원심분리가 세포에 손상을 야기하거나 세포를 활성화시킬 수 있는, 원심분리가 바람직하지 않은 경우가 있다. 예를 들어, T 세포의 원심분리는 세포의 활성화를 초래할 수 있다. 추가적으로, 희박하거나 적은 양의 샘플을 작업할 때, 원심분리와 같은 벌크(bulk) 분리 기술은 엄청나게 낭비적이거나 수고로울 수 있으며, 샘플을 용이하게 분획할 수 없게 한다. 또한, 분리될 입자가 취약하거나 불안정한 경우, 예컨대 생물학적 개체를 작업하는 경우, 입자 안정성을 향상시키기 위한 정밀한 조건은 곤란할 수 있다.
처리하기 어려운 조직 및 샘플을 작업하는 경우, 핵은 빠르게 단일-세포 연구 및 개발의 주요 대상 중 하나가 되었다. 세포를 작업하는 것은 핵보다 훨씬 더 간단하고 직접적이어야 하지만, 조직 처리의 현실은 예상보다 훨씬 더 복잡하고 어려운 경우가 꽤 많다.
조직은 처리될 때의 세포 조성, 세포외 기질 및 해리 거동이 다양하다. 이러한 연구자들은, 신뢰 가능한 고품질의 단일 세포 현탁액을 생성하는 충분히 검증되고 균일하게 수행되는 해리 및 정제 프로토콜을 형성하기가 점점 더 어렵다는 것을 알아내었다. 대안적으로, 핵 작업 흐름은, 단일 세포 분석을 위한 훨씬 더 균일하고 표준화된 출발 물질을 제공할 뿐만 아니라 조직 해리 및 처리와 연관된 유전자 발현 변화의 가능성의 일부를 제거함으로써, 상기한 과제의 대부분을 극복한다.
불행하게도, 핵 준비에는 고유한 문제가 수반된다. 구체적으로는, 사세포와 파편으로부터 추출된 핵을 정제하는 법이다. 통상의 방법은 여전히 어렵고 사용하는 데 많은 시간이 걸려, 좋지 않은 수율과 순도가 얻어진다. LeviCell은 빠르고 간단하며 매우 효율적인 핵 정제 방법을 제공한다.
본원에 기술된 장치 및 방법은, 원심분리 동안에 요구되는 높은 기계적인 힘에 의존하지 않는, 예를 들어 세포 및 세포 핵 등의 입자를 농축하고 입자 고갈 배지를 생성하기 위한 대안적인 방법을 제공함으로써 이러한 문제를 해결한다.
이러한 [발명의 내용]에서 제공되는 본 발명의 실시예는 단지 예시적인 것이고 본원에 개시된 선택된 실시예의 개요를 제공하는 것으로 의도된다. 예시적이고 선택적인 [발명의 내용]은 어떠한 청구항의 범위도 제한하지 않고, 본원에 개시되거나 고려되는 본 발명의 실시예의 전체 범위를 제공하지 않으며, 본 개시 또는 임의의 청구된 발명의 실시예의 범위를 제한하거나 한정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본원에는 유체 농축기 장치로서, 입구 채널, 처리 채널, 적어도 2개의 출력 채널, 및 농축기 장치를 통해 입자 함유 샘플을 이동시키기 위한 펌프를 포함하는 유체 농축기 장치가 제공된다. 농축기 장치는 입자 농축 스트림 또는 입자 고갈 스트림의 전부 또는 분획부를 수집하기 위해 밸브 또는 기능적으로 유사한 전환 기술에 의해 제어될 수 있는 별도의 전환 채널을 가질 수 있다. 농축기 장치는 자동 제어 하에서 작동 가능할 수 있고, 입자의 존재 또는 부재 또는 양, 또는 입자 또는 샘플 유동 스트림의 다른 물리적 또는 화학적 특성을 검출하기 위해 처리 채널 또는 입구 채널의 일부분 내부에 또는 그에 인접하게 하나 이상의 센서를 더 포함할 수 있다. 검출기의 출력부는 농축 및 분획 조건을 최적화하기 위해 농축기 제어부에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 입자 농축/고갈은 중력 침강, 자기 부상/척력, 및 이들의 조합을 통해 장치에 의해 물리적으로 달성될 수 있다. 처리 채널에 대한 입구 채널의 인터페이스는 바람직하게는 처리 채널에서 난류를 감소시키거나 제거하도록 기하학적으로 구성된다. 처리 채널과 출력 채널 사이의 인터페이스는 바람직하게는 층상 스트림, 입자 농후 스트림 및 입자 고갈 스트림을 각각의 출구 채널 내로 수집하는 것을 용이하게 하도록 기하학적으로 구성된다.
또한 본원에는, 상자성 특성에 기초하여 처리 채널 내의 입자에 자기 척력 또는 인력을 제공하기 위해 처리 채널(X-축)을 따라 실질적으로 선형으로 위치된 자기 구성요소를 갖는 유체 농축 장치가 제공된다. 자기 구성요소는 처리 채널 내의 입자의 침강을 유도하거나 증대시키도록 기능할 수 있다. 처리 채널을 따라 자석 구성요소를 포함하는 유체 농축 장치의 추가적인 응용은 이러한 장치가 저중력 또는 미세-중력 환경에서 작동 가능한 능력인 것이다. 대안적으로, 일부 경우에, 자기 구성요소는 샘플 유체가 이종 입자 혼합물인 경우에 샘플 유체 내의 특정 입자의 침강을 선택적으로 억제할 수 있다. 일부 실시예에서, 입구 채널 내에 자기장을 제공하는 것은 입구 채널로부터 처리 채널 내로의 입자 유동의 극복 가능한 억제를 제공함으로써 사전 농축 효과를 부여할 수 있다. 입구 채널 자기장은 처리 채널을 따라 실질적으로 선형인 자석을 입구 채널로 연장시켜서 유도될 수 있다. 대안적으로, 자기 구성요소는 처리 채널과 독립적이고 입구 채널과 자기 연통하도록 배치될 수 있다. 일 실시예에서, 이것은 막대 자석이고, 다른 실시예에서 이것은 입구 채널의 전부 또는 일부분을 둘러싸는 환형 또는 원환형 자석이다. 입구 채널 자석은 자기 제어기의 제어 하에 있는 전자석 또는 영구 자석일 수 있다. 하기에 예시된 추가 실시예에서, 처리 채널은 처리 채널에 대해 실질적으로 선형으로 배치된 복수의 자기 구성요소를 가질 수 있다. 이러한 하나의 실시예에서, 상이한 자기장 강도를 제공하는 자석은 처리 채널에 평행한 실질적으로 선형 방식으로 서로 반대측(예를 들어, 상부 및 하부)에 위치된다. 사전 농축 단계 또는 장치 구성과 조합되는 경우, 이러한 실시예는 이종 입자 조성을 함유하는 샘플의 사전 결정된 입자 구성요소를 농축하도록 선택적으로 작용할 수 있다. 처리 채널 외부의 입자 축적은 샘플 유량과, 입구 채널 내의 샘플 액체 배지의 입자 이동도에 따라 달라지는 수동적 프로세스일 수 있다. 처리 채널 외부의 입자 축적은 입구 채널 내에 자기장을 이용하여 자기장 내에서 입자를 방해하는 능동적 프로세스일 수 있다. 입구 채널로부터 처리 채널 내로의 입자 이동의 방해는 유량 또는 유동 패턴의 조작에 의해 극복될 수 있다. 예를 들어 유량의 증가, 또는 채널 압력을 증가시키는 하나 이상의 펄스의 도입을 통해 입구 채널에서의 입자 이동도를 증가시킴으로써, 극복될 수 있다. 입자 억제가 입구 채널에서의 전자기장 유도에 의해 달성되는 경우, 입구 채널로부터 처리 채널 내로의 입자 이동도는 입구 채널 자기장의 감소, 입구 채널 유량 또는 압력의 수정, 또는 자기장과 샘플 유동 특성의 조합에 의해 증가될 수 있다.
본원에는, 유체 처리 채널 구조물, 적어도 하나의 자기 구성요소, 및 적어도 2개의 출력 포트를 포함하는 입자 농축 장치가 추가로 제공되며, 유체 처리 채널은 입력 포트와 유체 연통하는 전단부 및 출력 포트와 유체 연통하는 후단부를 갖는 실질적으로 선형인 부분을 포함한다. 적어도 2개의 출력 포트는 실질적으로 병렬로 구성된다. 이러한 실시예에 따르면, 출력 포트 각각은 적어도 하나의 수집 경로를 포함하고, 수집 경로는 후속 처리 단계에 필요한 결정된 양의 재료를 수용하는 수집 챔버로 이어진다. 유체 채널 구조물은 통상적으로 입자가 자유롭게 또는 소기의 속도로 유동할 수 있게 하는 미세-모세관 채널이다. 장치는 입력 포트로부터 유체 채널 구조물을 통해 유체를 구동하도록 구성된 하나 이상의 펌프를 더 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 장치는 입자 경로 및/또는 유량을 제어하기 위한 하나 이상의 밸브를 더 포함한다.
샘플 농축 실시예
본 발명의 방법의 실시예는 하기의 번호 매겨진 실시예에서 추가로 설명된다. 번호 매겨진 실시예는 본 발명을 제한하지 않으며, 본원에 기술된 추가 요소 및 대안을 포함할 수 있다.
제1 실시예(1)는, 샘플을 농축시키는 방법으로서, (i) 처리 채널, 입구 채널 및 복수의 출구 채널을 갖는 저용량 유체 장치를 제공하는 단계, (ⅱ) 적어도 입자 농후 층 및 입자 고갈 층을 갖는 샘플 유동 스트림을 생성하는 조건 하에서 입자 함유 샘플을 상기 입구 채널을 통해 상기 처리 채널 내로 유동시키는 단계, (ⅲ) 입자 농후 유동 스트림을 생성하기 위해 상기 입자 농후 층을 제1 출구 채널을 통해 유동시키는 단계, (ⅳ) 입자 고갈 유동 스트림을 생성하기 위해 상기 입자 고갈 층을 제2 출구 채널을 통해 유동시키는 단계, 및 (v) 상기 출구 채널 중 하나 이상으로부터 상기 유동 스트림 중 하나 이상을 수집하는 단계를 포함하는, 샘플 농축 방법이다.
제2 실시예(2)는 상기 입자 농후 유동 스트림 내로의 샘플 입자의 침강을 유도하기에 충분한 유동 조건에 입자 함유 샘플을 두는 단계를 더 포함하는 제1 실시예이다. 제3 실시예(3)는 상기 처리 채널의 상부로부터 상기 처리 채널의 X-축과 정렬된 자기장을 제공하고, 상기 샘플 내의 입자를 입자 농후 유동 스트림 내로 밀어내는 단계를 더 포함하는 제1 실시예(1)이다. 제4 실시예(4)는, (i) 상기 입구 채널로부터 상기 처리 채널 내로의 입자의 이동을 방해하여 상기 입구 채널에 상기 샘플 유동 스트림의 입자 농축 부분을 형성하기 위해 상기 입구 채널 내에 자기장을 유도하는 단계, (ⅱ) 상기 샘플 유동 스트림의 입자 농축 부분을 상기 처리 채널 내로 이동시키는 단계, (ⅲ) 입자 농후 유동 스트림을 생성하는 단계, (ⅳ) 출구 채널을 통해 상기 입자 농후 유동 스트림을 유동시키는 단계, 및 (v) 상기 입자 농후 유동 스트림을 포착하는 단계를 더 포함하는 제2 또는 제3 실시예이다.
제5 실시예(5)는, (i) 상기 입구 채널로부터 상기 처리 채널 내로의 입자의 이동을 방해하여 상기 입구 채널에 상기 샘플 유동 스트림의 입자 농축 부분을 형성하기 위해 상기 입구 채널 내에 자기장을 유도하는 단계, (ⅱ) 상기 샘플 유동 스트림의 방해받지 않은 부분을 상기 처리 채널 내로 이동시키는 단계, (ⅲ) 입자 고갈 유동 스트림을 생성하는 단계, (ⅳ) 출구 채널을 통해 상기 입자 고갈 유동 스트림을 유동시키는 단계, 및 (v) 상기 입자 고갈 유동 스트림을 포착하는 단계를 더 포함하는 제2 또는 제3 실시예(2-3)의 방법이다.
제6 실시예(6)는 상대 입자 농도 또는 위치를 결정하기 위해 상기 처리 채널 내의 입자 농후 층의 입자를 측정하는 단계, 및 상기 처리 채널 내의 입자의 위치 또는 높은 상대 입자 농도에 기초하여 상기 입자 농후 층의 분획부를 수집하는 단계를 더 포함하는 제1 내지 제4 실시예(1-4)이다. 제7 실시예(7)는 상대 입자 농도를 결정하기 위해 상기 처리 채널 내의 입자 고갈 층의 입자를 측정하는 단계, 및 낮은 상대 입자 농도에 기초하여 상기 입자 고갈 층의 분획부를 수집하는 단계를 더 포함하는 제1 내지 제3 실시예(1-3) 또는 제5 실시예(5)이다.
제8 실시예(8)는 상기 처리 채널의 상부로부터 생성되고 상기 처리 채널의 X-축을 따라 정렬된 자기장과 연속인 자기장을 상기 입구 채널 내에 제공하는 단계를 더 포함하는 제5 실시예(5)이다. 제9 실시예(9)는 상기 입구 채널을 둘러싸는 원환형 자기장을 생성하는 단계를 더 포함하는 제5 실시예(5)이다. 제10 실시예(10)는 상기 입구 채널 내의 입자 농축 부분의 상기 처리 채널 내로의 이동을 용이하게 하기 위해 상기 입구 채널 내의 자기장을 조절하는 단계를 더 포함하는 제9 실시예(9)의 방법이다.
제11 실시예(11)는 상기 처리 채널 내의 입자 특성을 검출하고 상기 입자 농후 유동 스트림 내의 입자의 농도를 조작하기 위해 샘플 유량을 조절하는 단계를 더 포함하는 제1 내지 제10 실시예(1-10)의 방법이다. 제12 실시예(12)는 상기 입자 농후 유동 스트림 내의 입자 특성을 검출하고 상기 입자 농후 유동 스트림 내의 입자의 농도를 조작하기 위해 샘플 유량을 조절하는 단계를 더 포함하는 제11 실시예(11)이다. 제13 실시예(13)는 상기 처리 채널 내의 입자 특성을 검출하고 상기 입자 농후 유동 스트림 내의 입자의 농도를 조작하기 위해 상기 입구 채널 내의 자기장을 조절하는 단계를 더 포함하는 제10 또는 제12 실시예(10 또는 12)의 방법이다.
제14 실시예(14)는 상기 입자 농후 유동 스트림 내의 입자 특성을 검출하고 상기 입자 농후 유동 스트림 내의 입자의 농도를 조작하기 위해 상기 입구 채널 내의 자기장을 조절하는 단계를 더 포함하는 제13 실시예(13)의 방법이다.
제15 실시예(15)는 상기 입구 채널 내의 입자 특성을 검출하고 상기 입자 농후 유동 스트림 내의 입자의 농도를 조작하기 위해 샘플 유량을 조절하는 단계를 더 포함하는 제1 내지 제10 실시예(1-10)의 방법이다. 제16 실시예(16)는 상기 입구 채널 내의 입자 특성을 검출하고 상기 입자 농후 유동 스트림 내의 입자의 농도를 조작하기 위해 상기 입구 채널 내의 자기장을 조절하는 단계를 더 포함하는 제10 실시예(10)의 방법이다. 제17 실시예(17)는 상대 입자 농도 또는 입자 밀도를 검출하는 단계를 더 포함하는 제11 내지 제16 실시예(11-16)에 따른 방법이다. 제18 실시예(18)는 상기 처리 채널 내의 화학적 특성을 검출하고 상기 입자 농후 유동 스트림 내의 입자의 농도를 조작하기 위해 샘플 유량을 조절하는 단계를 더 포함하는 제10 내지 제17 실시예(10-17)에 따른 방법이다. 제19 실시예(19)는 상기 입자 농후 유동 스트림 내의 화학적 특성을 검출하고 상기 입자 농후 유동 스트림 내의 입자의 농도를 조작하기 위해 샘플 유량을 조절하는 단계를 더 포함하는 제10 내지 제17 실시예(10-17)에 따른 방법이다.
제20 실시예(20)는 상기 처리 채널 내의 화학적 특성을 검출하고 상기 입자 농후 유동 스트림 내의 입자의 농도를 조작하기 위해 상기 입구 채널 내의 자기장을 조절하는 단계를 더 포함하는 제10 내지 제17 실시예(10-17)에 따른 방법이다. 제21 실시예(21)는 상기 입자 농후 유동 스트림 내의 화학적 특성을 검출하고 상기 입자 농후 유동 스트림 내의 입자의 농도를 조작하기 위해 상기 입구 채널 내의 자기장을 조절하는 단계를 더 포함하는 제20 실시예(20)의 방법이다. 제22 실시예(22)는 상기 입구 채널 내의 화학적 특성을 검출하고 상기 입자 농후 유동 스트림 내의 입자의 농도를 조작하기 위해 샘플 유량을 조절하는 단계를 더 포함하는 제1 내지 제21 실시예(1-21)의 방법이다.
제23 실시예(23)는 상기 입구 채널 내의 화학적 특성을 검출하고 상기 입자 농후 유동 스트림 내의 입자의 농도를 조작하기 위해 상기 입구 채널 내의 자기장을 조절하는 단계를 더 포함하는 제10 내지 제22 실시예(10-22)에 따른 방법이다.
제24 실시예(24)는 상기 특성이 전기화학적, 광자적, 분광학적 또는 결합(binding) 특성인 것인 제18 내지 제23 실시예(18-23)의 방법이다. 제25 실시예(25)는 상기 입자 고갈 유동 스트림을 수집 채널 내로 전환하고 상기 입자 고갈 유동 스트림의 분획부를 포착하는 단계를 더 포함하는 제1 내지 제24 실시예(1-24)에 따른 방법이다.
제26 실시예(26)는 상기 입자 농후 유동 스트림을 수집 채널 내로 전환하고 상기 입자 농후 유동 스트림의 분획부를 포착하는 단계를 더 포함하는 제1 내지 제25 실시예(1-25)에 따른 방법이다.
제27 실시예(27)는 각각의 수집 채널 내로 상기 입자 고갈 유동 스트림을 전환하고 상기 입자 농후 유동 스트림을 전환하며, 각 유동 스트림의 분획부를 포착하는 것을 더 포함하는 제1 내지 제26 실시예(1-26)에 따른 방법이다. 제28 실시예(28)는 상기 유동 스트림의 다수의 개별 분획부를 포착하는 단계를 더 포함하는 제27 실시예(27)에 따른 방법이다. 제29 실시예(29)는 상기 입자 고갈 유동 스트림 및 상기 입자 농후 유동 스트림으로부터 비동시적인 분획부를 포착하는 단계를 더 포함하는 제27 또는 제28 실시예(27 또는 28)에 따른 방법이다.
제30 실시예(30)는 상기 입구 채널에 도입하기 전에 상기 샘플에 상자성 화합물을 첨가하는 단계를 더 포함하는 제1 내지 제29 실시예(1-29)에 따른 방법이다. 제31 실시예(31)는 단리된 분획부에 대해 후속 반응을 수행하는 단계를 더 포함하는 제1 내지 제30 실시예(1-30)에 따른 방법이다. 제32 실시예(32)는 상기 후속 반응이 결합, PCR, 시퀀싱 샘플 조제, 효소 분해 또는 효소 합성 반응인 것인 제31 실시예(31)의 방법이다. 제33 실시예(33)는 수집된 샘플에 세포 배양, 형광-활성화 세포 분류 또는 자기 부상 세포 분류가 행해지는 것인 제31 실시예(31)의 방법이다.
제34 실시예(34)는 샘플 유체가 먼저 상기 처리 채널에 실질적으로 선형으로 정렬되지 않은 각도로 유동된 후에, 상기 처리 채널과 실질적으로 선형인 각도로 유동되는 것인 제1 내지 제33 실시예(1-33) 중 어느 하나에 따른 방법이다.
제35 실시예(35)는, (i) 전혈 샘플 또는 희석된 혈액 샘플을 제공하는 단계, 및 (ⅱ) 제1 내지 제34 실시예(1-34)의 샘플 농축 방법을 상기 샘플에 행하고, 전혈 또는 희석된 혈액 샘플로부터 혈장 및/또는 혈액 세포를 단리하는 단계를 포함하는, 혈액 샘플을 분획하는 방법이다. 제36 실시예(36)는 상기 혈액 샘플이 약 50 μL 내지 약 10 mL의 체적을 갖는 것인 제35 실시예(35)의 방법이다. 제37 실시예(37)는 혈장 분획부가 상기 혈액 샘플 내의 혈액 세포의 약 1% 미만을 함유하는 것인 제36 실시예(36)의 방법이다. 제38 실시예(38)는 혈장 분획부가 상기 혈액 샘플 내의 혈액 세포의 약 0.01% 미만을 함유하는 것인 제37 실시예(37)의 방법이다. 제39 실시예(39)는 혈장 분획부에는 상기 혈액 샘플 내의 혈액 세포가 실질적으로 없는 것인 제38 실시예(38)의 방법이다. 제40 실시예(40)는 혈액 샘플이 말초 혈액 샘플, 제대혈 샘플, 태아 혈액 샘플, 또는 동맥혈 샘플인 것인 제35 내지 제39 실시예(35-39)에 따른 방법이다. 제41 실시예(41)는 단리된 분획부에 대한 진단 분석을 수행하는 단계를 더 포함하는 제35 내지 제40 실시예(35-40)에 따른 방법이다. 제42 실시예(42)는 상기 분석이 효소 면역분석, 화학발광 면역분석, 혈구 응집/입자 응집 분석, 핵산 증폭 기술 분석, 약물 분석, 법의학적 분석, 또는 유전 형질 분석인 것인 제41 실시예(41)에 따른 방법이다. 제43 실시예(43)는 상기 입구 채널 및/또는 상기 처리 채널 내의 입자 고갈 층의 입자 또는 구성요소에 대해, 그리고 선택적으로 입자 단리/농축과 동시에, 반응이 수행되는 것인 제1 내지 제41 실시예(1-41) 중 어느 하나의 방법에 따른 실시예이다. 제44 실시예(44)는 상기 반응이 결합 또는 염색 반응인 것인 제43 실시예(43)의 방법에 따른 실시예이다.
제45 실시예(45)는 입자가 세포 또는 세포 핵인 제1 내지 제44 실시예(1-44) 중 어느 하나에 따른 실시예이다.
제46 실시예(46)는, 세포 핵을 포함하는 샘플 및 상자성 화합물 또는 강자성 유체를 포함하는 샘플 배지를 분리 채널에 장입하는 단계; 분리에 영향을 미치도록 적어도 하나의 자석으로 샘플에 자기력을 가하는 단계; 세포 핵을 포함하는 분리된 샘플의 적어도 하나의 분획부를 추가적인 원심분리 없이 수집하는 단계; 선택적으로 분리 이전, 분리 동안, 및/또는 분리 이후에 샘플의 핵을 이미징하는 단계를 포함하는 세포 핵의 단리 방법이다.
제47 실시예(47)는 샘플이 약 10,000,000개의 세포 핵을 포함하는 제46 실시예(46)의 방법에 따른 실시예이다.
제48 실시예(48)는 샘플이 생세포, 사세포 또는 세포 파편을 추가적으로 포함하는 제46 내지 제47 실시예(46-47) 중 어느 하나의 방법에 따른 실시예이다.
제49 실시예(49)는 분획부에 있어서의 세포 핵의 농도가 원래의 샘플로부터 적어도 1.1:1만큼 증가되는 제46 내지 제48 실시예(46-48) 중 어느 하나의 방법에 따른 실시예이다.
제50 실시예(50)는 원래의 샘플에 있어서의 비핵 입자의 농도는 분획부에서 적어도 약 1%만큼 감소되는 제46 내지 제49 실시예(46-49) 중 어느 하나의 방법에 따른 실시예이다.
제51 실시예(51)는 샘플로부터의 분획부에 있어서의 단리된 세포 핵의 무결성이 원심분리를 포함하는 방법에 의해 샘플로부터의 분획부에서 단리된 세포 핵의 무결성보다 적어도 약 30% 더 큰 제46 내지 제50 실시예(46-50) 중 어느 하나의 방법에 따른 실시예이다.
제52 실시예(52)는 인간 세포, 비인간 동물 세포 또는 식물 세포로부터 세포 핵이 단리되는 제46 내지 제51 실시예(46-51) 중 어느 하나의 방법에 따른 실시예이다.
제53 실시예(53)는 건강한 세포, 병든 세포, 감염된 세포, 핵산전달 감염된 세포, 또는 유전자 변형된 세포로부터 핵이 단리되는 제46 내지 제52 실시예(46-52) 중 어느 하나의 방법에 따른 실시예이다.
제54 실시예(54)는 생세포 및/또는 세포 핵, 사세포 및 핵 파편을 포함하는 혼합물로부터 생세포 및/또는 세포 핵을 분리하는 방법으로서:
A) 유체 샘플 처리 장치로서,
(i) 처리 채널,
(ⅱ) 입구 채널,
(ⅲ) 상기 입구 채널을 상기 처리 채널에 연결하는 입구 연결 영역,
(ⅳ) 상기 처리 채널의 상부측 및 하부측에서 상기 처리 채널의 X-축을 따라 정렬된 복수의 자기 구성요소,
(v) 복수의 출구 채널,
(ⅵ) 상기 처리 채널을 상기 출구 채널에 연결하는 출구 연결 영역,
(ⅶ) 출구 연결 영역에서 상기 처리 채널의 상부 영역과 유체 연통하는 제1 출구 채널,
(ⅷ) 출구 연결 영역에서 상기 처리 채널의 하부 영역과 유체 연통하는 제2 출구 채널, 및
(ⅸ) 상기 제1 출구 채널과 연관된 제1 유동 조절기 및 상기 제2 출구 채널과 연관된 제2 유동 조절기
를 포함하는 유체 샘플 처리 장치를 제공하는 단계; 및
B) 상기 생세포 및/또는 세포 핵이 농후한 제1 회수 샘플 및 상기 생세포 및/또는 세포 핵이 고갈된 제2 회수 샘플을 제공하도록 상기 혼합물을 상기 유체 샘플 처리 장치를 통해 유동시키는 단계를 포함한다.
제55 실시예(55)는 상기 제1 회수 샘플은 세포 핵이 농후한 것인 제54 실시예(54)의 방법에 따른 실시예이다.
제56 실시예(56)는 상기 제1 회수 샘플은 생세포가 농후한 것인 제54 실시예(54)의 방법에 따른 실시예이다.
제57 실시예(57)는 제54 내지 제56 실시예(54-56) 중 어느 하나의 방법에 따른 실시예로서, a) 제1 회수 샘플에 있어서의 생세포의 수율은 혼합물의 총 생세포 조성의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75%이고; 및/또는 b) 제1 회수 샘플에 있어서의 핵의 수율은 혼합물의 생세포 조성에서의 총 핵의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75%이다.
제58 실시예(58)는 상기 출구 연결 영역이 유동 스트림 스플리터 부분을 더 포함하는 것인 제54 내지 제57 실시예(54-57) 중 어느 하나의 방법에 따른 실시예이다.
제59 실시예(59)는 상기 유동 스트림 스플리터 부분이 상기 처리 채널 내로 돌출되고 유동 스트림을 출구 채널에 있어서의 개별 스트림으로 분리하도록 구성 및 배열되는 것인 제58 실시예(58)의 방법에 따른 실시예이다.
제60 실시예(60)는 상기 유체 샘플 처리 장치가 상기 제1 출구 채널과 연관된 제1 유량 센서 및 상기 제2 출구 채널과 연관된 제2 유량 센서를 더 포함하는 제54 내지 제59 실시예(54-59) 중 어느 하나의 방법에 따른 실시예이다.
제61 실시예(61)는 유량 센서가 유동 조절기에 작동 가능하게 연결되는 것인 제60 실시예(60)의 방법에 따른 실시예이다.
제62 실시예(62)는 상기 유체 샘플 처리 장치가 광학 센서와, 상기 광학 센서에 대향하거나 상기 광학 센서에 각도적으로 인접하게 구성된 조명원을 더 포함하고; 선택적으로 상기 조명원은 자외선을 방출하는 것인 제54 내지 제61 실시예(54-61) 중 어느 하나의 방법에 따른 실시예이다.
제63 실시예(63)는 상기 유체 샘플 처리 장치가 센서; 및 복수의 유동 조절기에 작동 가능하게 연결된 제어기를 더 포함하고, 상기 센서는 광검출기, 다중 픽셀 이미징 검출기, 자기장 검출기, 전기화학적 검출기, 광학 위상 검출기, 산란 검출기, 홀 센서, 자기저항 센서, 볼로메트릭 센서, 표면 탄성파 센서, 바이오센서, 용량성 센서, 전도성 센서, 열 센서, 유량 센서, 초음파 센서, 중량 센서, 자기장 센서 또는 이들의 조합인 것인 제54 내지 제62 실시예(54-62) 중 어느 하나의 방법에 따른 실시예이다.
제64 실시예(64)는 제54 내지 제63 실시예(54-63) 중 어느 하나의 방법에 따른 실시예로서, 상기 유체 샘플 처리 장치는 평면 기판을 포함하는 플로우셀 카트리지를 더 포함하고, 상기 평면 기판은:
(i) 상부 표면과 하부 표면;
(ⅱ) 이미징 표면을 형성하는 제1 종방향 측면;
(ⅲ) 조명 표면을 형성하는 제2 종방향 측면;
(ⅳ) 제1 및 제2 횡방향 측면;
(v) 상부 표면 상의 입구 웰;
(ⅵ) 입구 채널;
(ⅶ) 입구 채널과 유체 연통하고 종방향 측면에 실질적으로 평행하게 배치되는 샘플 처리 채널;
(ⅷ) 상기 처리 채널 내의 샘플 스플리터;
(ⅸ) 상기 처리 채널과 유체 연통하는 복수의 출구 채널; 및
(ⅹ) 복수의 출구 채널 각각과 유체 연통하는 복수의 수집 웰을 포함하며;
상기 기판은 광학적으로 투명한 재료를 선택적으로 포함하고, 상기 처리 채널은 공간적으로 상기 이미징 표면에 편향되도록 기판의 평면 내에서 오프셋된다.
제65 실시예(65)는 제54 내지 제64 실시예(54-64) 중 어느 하나의 방법에 따른 실시예로서, 상기 유체 샘플 처리 장치는 평면 기판을 포함하는 플로우셀 카트리지를 더 포함하고, 상기 평면 기판은:
(i) 상부 표면 상의 입구 웰;
(ⅱ) 입구 채널;
(ⅲ) 샘플 처리 채널;
(ⅳ) 상기 처리 채널 내의 샘플 스플리터;
(v) 상기 처리 채널과 유체 연통하는 복수의 출구 채널; 및
(ⅵ) 복수의 출구 채널 각각과 유체 연통하는 복수의 수집 웰을 포함하며;
상기 기판은 광학적으로 투명한 재료를 포함하고, 상기 복수의 출구 채널 각각의 통합 체적은 처리 채널의 체적보다 크다.
제66 실시예(66)는 제64 및 제65 실시예(64-65) 중 어느 하나의 방법에 따른 실시예로서, 플로우셀 카트리지의 출구 채널이 촘촘한 경로를 추종하고, 예를 들어 출구 채널은 사행형 채널이다.
제67 실시예(67)는 생세포 및/또는 세포 핵, 사세포 및 핵 파편을 포함하는 혼합물로부터 생세포 및/또는 세포 핵을 분리하는 방법으로서:
처리 채널과 복수의 출구 채널을 포함하는 플로우셀 카트리지로서, 플로우셀 카트리지의 출구 채널은 처리 채널보다 큰 체적을 갖는 것인 플로우셀 카트리지를 제공하는 단계;
생세포 및 사세포를 포함하는 샘플 용액과 상자성 화합물을 처리 채널로 유동시키는 단계;
실질적으로 처리 채널에 평행하게 정렬된 자기장에 플로우셀 카트리지를 배치하는 단계;
처리 채널 내에서 생세포와 사세포를 수직 거리를 두고 분리하기에 충분한 기간 동안 흐름 정지 조건으로 처리 채널과 처리 채널 안의 샘플을 완전히 자기장 내에 유지하는 단계; 및
생세포 및/또는 세포 핵이 농후한 샘플 분획부와 사세포 및 핵 파편이 농후한 샘플 분획부를 출구 채널로 동시에 인출하는 단계를 포함한다.
농축기 장치 실시예
본 발명의 장치 실시예는 하기의 번호 매겨진 실시예에서 추가로 설명된다. 번호 매겨진 실시예는 본 발명을 제한하지 않으며, 본원에 기술된 추가 요소 및 대안을 포함할 수 있다.
제1 실시예(1)는, 자성 유체 샘플 처리 장치로서, (i) 처리 채널, (ⅱ) 입구 채널, (ⅲ) 상기 입구 채널을 상기 처리 채널에 연결하는 입구 연결 영역, (ⅳ) 복수의 출구 채널, (v) 상기 처리 채널을 상기 출구 채널에 연결하는 출구 연결 영역, (ⅵ) 출구 연결 영역에서 상기 처리 채널의 상부 영역과 유체 연통하는 제1 출구 채널, (ⅶ) 출구 연결 영역에서 상기 처리 채널의 하부 영역과 유체 연통하는 제2 출구 채널, 및 (ⅷ) 상기 처리 채널의 상부측 또는 하부측에서 상기 처리 채널의 X-축을 따라 정렬된 자석을 포함하는 자성 유체 샘플 처리 장치이다.
제2 실시예(2)는, 자성 유체 샘플 처리 장치로서, (i) 처리 채널, (ⅱ) 입구 채널, (ⅲ) 상기 입구 채널을 상기 처리 채널에 연결하는 입구 연결 영역, (ⅳ) 복수의 출구 채널, (v) 상기 처리 채널을 상기 출구 채널에 연결하는 출구 연결 영역, (ⅵ) 출구 연결 영역에서 상기 처리 채널의 상부 영역과 유체 연통하는 제1 출구 채널, (ⅶ) 출구 연결 영역에서 상기 처리 채널의 하부 영역과 유체 연통하는 제2 출구 채널, 및 (ⅷ) 상기 처리 채널의 상부측 및 하부측에서 상기 처리 채널의 X-축을 따라 정렬된 복수의 자기 구성요소를 포함하며, 상기 처리 장치가 상기 처리 채널 내로 도입되기 전에 입자의 사전 농축을 제공하도록 구성 및 배치되는 것인 자성 유체 샘플 처리 장치이다.
제3 실시예(3)는, 유체 샘플 처리 장치로서, (i) 처리 채널, (ⅱ) 입구 채널, (ⅲ) 상기 입구 채널을 상기 처리 채널에 연결하는 입구 연결 영역, (ⅳ) 복수의 출구 채널, (v) 상기 처리 채널을 상기 출구 채널에 연결하는 출구 연결 영역, (ⅵ) 출구 연결 영역에서 상기 처리 채널의 상부 영역과 유체 연통하는 제1 출구 채널, (ⅶ) 출구 연결 영역에서 상기 처리 채널의 하부 영역과 유체 연통하는 제2 출구 채널, 및 (ⅷ) 입구 채널 유동 제어기를 포함하는 유체 샘플 처리 장치이다.
제4 실시예(4)는 상기 처리 채널의 상부측 및 상기 처리 채널의 하부측의 자기 구성요소가 상기 처리 채널 내에 상이한 강도의 자기장을 제공하도록 구성 및 배치되는 것인 제2 실시예의 장치이다.
제5 실시예(5)는 상기 입구 채널이 제1 단면적을 포함하고 상기 처리 채널이 제2 단면적을 포함하며, 상기 제1 단면적이 상기 제2 단면적보다 작은 것인 제1 내지 제4 실시예(1-4)에 따른 장치이다. 제6 실시예(6)는 상기 채널들이 미세유체 채널 또는 모세관 채널인 것인 제5 실시예(5)에 따른 장치이다.
제7 실시예(7)는 상기 입구 연결 영역이 90도 미만의 각도로 테이퍼진 것인 제1 내지 제6 실시예(1-6)에 따른 장치이다. 제8 실시예(8)에서, 상기 각도가 60도 이하인 것인 제7 실시예(7)의 장치가 제공된다. 제9 실시예(9)에서, 제8 실시예(8)에 따른 장치가 45도 이하의 연결 각도를 갖는다.
제10 실시예(10)는 상기 출구 연결 영역이 유동 스트림 스플리터 부분을 더 포함하는 것인 제1 내지 제9 실시예(1-9)의 장치를 제공한다. 제11 실시예(11)는 상기 유동 스트림 스플리터 부분이 상기 처리 채널 내로 돌출되고 각각의 유동 스트림을 이들의 출구 채널로 분리하도록 구성 및 배치되는 것인 제10 실시예(10)의 장치이다.
제12 실시예(12)는 상기 제1 출구 채널이 제1 출구 수집 채널 및 제1 출구 전환 채널을 포함하는 것인 제1 내지 제11 실시예(1-11)에 따른 장치이다. 제13 실시예(13)는 상기 제1 출구 채널이, 상기 제1 출구 채널 내의 유동 스트림이 상기 제1 출구 수집 채널 또는 상기 제1 출구 전환 채널과 선택 가능하게 유체 연통하도록 구성 및 배치된 밸브를 더 포함하는 것인 제12 실시예(12)의 장치를 제공한다.
제14 실시예(14)는 상기 제2 출구 채널이 제2 출구 수집 채널 및 제2 출구 전환 채널을 포함하는 것인 제1 내지 제13 실시예(1-13)의 장치이다.
제15 실시예(15)는 상기 제2 출구 채널이, 상기 제2 출구 채널 내의 유동 스트림이 상기 제2 출구 수집 채널 또는 상기 제2 출구 전환 채널과 선택 가능하게 유체 연통하도록 구성 및 배치된 밸브를 더 포함하는 것인 제14 실시예(14)의 장치이다. 제16 실시예(16)는 상기 유체 장치가 상기 입구 채널 또는 상기 입구 영역에 게이팅 자기장을 생성하는 자석을 더 포함하는 것인 제1 내지 제15 실시예(1-15)에 따른 장치를 제공한다. 제17 실시예(17)는 게이팅 자기장을 생성하는 자석이 상기 입구 채널 또는 상기 입구 영역을 둘러싸는 환형 또는 원환형 자석인 제16 실시예(16)의 장치이다. 제18 실시예(18)에서, 게이팅 자기장을 생성하는 자석이 상기 처리 채널에 대해 정렬되고 그에 인접하며, 상기 입구 채널의 채널 입구 영역까지 또는 그 너머로 연장되는 것인 제16 실시예(16)에 따른 장치가 제공된다.
제19 실시예(19)에서, 제1 내지 제18 실시예(1-18)의 장치는 광학적으로 투명한 처리 채널을 포함한다. 제20 실시예에서, 제1 내지 제18 실시예(1-18)의 장치는 광학적으로 투명한 입구 채널을 포함한다. 제21 실시예는 입구 채널 유동 제어기, 제1 출구 채널 제어기, 제2 출구 채널 제어기, 또는 이들의 조합을 더 포함하는 제1 내지 제20 실시예(1-20)의 장치를 제공한다. 제22 실시예(22)는 자기장 제어기(환형 또는 원환형 자석에 작동적으로 연결됨)를 더 포함하는 제15 내지 제18 실시예(15-18)에 따른 장치이다.
제23 실시예(23)는 상기 유체 장치가 하나 이상의 센서를 포함하는 것인 제1 내지 제22 실시예(1-22)의 장치를 제공한다. 제24 실시예(24)는 상기 센서가 광학 센서, 용량성 센서, 전도성 센서, 열 센서, 유량 센서, 초음파 센서, 중량 센서, 자기장 센서, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 것인 제23 실시예(23)의 장치이다. 제25 실시예(25)는 상기 센서가 광검출기, 다중 픽셀 이미징 검출기, 자기장 검출기, 전기화학적 검출기, 광학 위상 검출기, 산란 검출기, 홀 센서, 자기저항 센서, 볼로메트릭 센서, 표면 탄성파 센서, 바이오센서, 또는 이들의 조합인 것인 제24 실시예(24)에 따른 장치이다.
제26 실시예(26)는 센서가 상기 처리 채널 내에 또는 그에 인접하게 통합되는 것인 제23 내지 제25 실시예(23-25)의 장치를 제공한다. 제27 실시예(27)는 센서가 상기 입구 채널 내에 또는 그에 인접하게 통합되는 것인 제23 내지 제25 실시예(23-25)의 장치를 제공한다. 제28 실시예(28)는 센서가 하나 이상의 출구 채널 내에 또는 그에 인접하게 통합되는 것인 제23 내지 제25 실시예(23-25)의 장치를 제공한다. 제29 실시예(29)는 상기 유체 장치가 상기 처리 채널 내에 있거나 그에 인접한 하나 이상의 센서, 상기 입구 채널 내에 있거나 그에 인접한 하나 이상의 센서, 적어도 하나의 출구 채널 내에 있거나 그에 인접한 하나 이상의 센서, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 제23 내지 제25 실시예(23-25)의 장치이다.
제30 실시예(30)는 입구 채널 유량 제어기를 더 포함하는 제25 내지 제27 실시예(25-27)에 따른 장치로서, 적어도 하나의 센서는 입구 유동 제어기에 작동적으로 연결되어 있는 장치이다. 제31 실시예(31)는 출구 채널 유동 제어기를 더 포함하는 제25 내지 제28 실시예(25-28)에 따른 장치로서, 적어도 하나의 센서가 출구 유동 제어기에 작동적으로 연결되어 있는 장치이다. 제32 실시예는 상기 입구 채널 또는 입구 영역을 둘러싸는 환형 또는 원환형 자석 및 자기장 제어기를 더 포함하는 제23 내지 제29 실시예(23-29)에 따른 장치로서, 센서가 상기 환형 또는 원환형 자석의 자기장을 제어하도록 자기장 제어기에 작동적으로 연결되어 있는 장치이다.
제32 실시예(32)는 상기 입구 채널이 각도 세타(θ)로 각진 부분에서 연결되는, 상기 처리 채널에 대해 실질적으로 선형인 부분 및 상기 처리 채널에 대해 실질적으로 선형으로 정렬되지 않은 부분으로 추가로 구성되고, Y-축 또는 Z-축에 대해, 또는 Y-축 및 Z-축에 대해 독립적으로 θ≠180°, 및 θ≥90°, θ≥100°, θ≥135°, θ≥140°, θ≥165°, θ＞180 , θ≥205°, θ≥225°, θ≥250°, 또는 θ≤270°인 것인 제1 내지 제31 실시예(1-31)에 따른 장치이다.
플로우셀 카트리지 실시예
본 발명의 플로우셀 카트리지의 제1 실시예(1)는 평면 기판을 포함하고, 평면 기판은 상부 표면과 하부 표면, 이미징 표면을 형성하는 제1 종방향 측면, 조명 표면을 형성하는 제2 종방향 측면, 제1 및 제2 횡방향 측면, 상부 표면 상의 입구 웰, 입구 채널, 입구 채널과 유체 연통하고 종방향 측면에 실질적으로 평행하게 배치되는 샘플 처리 채널, 상기 처리 채널 내의 샘플 스플리터, 상기 처리 채널과 유체 연통하는 복수의 출구 채널, 및 복수의 출구 채널 각각과 유체 연통하는 복수의 수집 웰을 포함하며, 상기 기판은 광학적으로 투명한 재료를 선택적으로 포함하고, 상기 처리 채널은 공간적으로 상기 이미징 표면에 편향되도록 기판의 평면 내에서 오프셋된다.
본 발명의 플로우셀 카트리지의 제2 실시예(2)는 평면 기판을 포함하고, 평면 기판은 상부 표면 상의 입구 웰, 입구 채널, 샘플 처리 채널, 상기 처리 채널 내의 샘플 스플리터, 상기 처리 채널과 유체 연통하는 복수의 출구 채널, 및 복수의 출구 채널 각각과 유체 연통하는 복수의 수집 웰을 포함하며, 상기 기판은 광학적으로 투명한 재료를 포함하고, 상기 복수의 출구 채널 각각의 통합 체적은 처리 채널의 체적보다 크다.
제3 실시예(3)는 제1 및 제2 실시예에 따른 플로우셀 카트리지로서, 출구 채널은 촘촘한 경로를 추종하고, 어느 한 예시적인 구성은 사행형 채널이다.
제4 실시예(4)는 제1 내지 제3 실시예에 따른 플로우셀 카트리지로서, 플로우셀 카트리지의 출구 채널은 평면 기판 내에 리세스로서 형성되고, 제1 출구 채널이 평면 기판의 표면에 리세스를 포함하며, 제2 출구 채널이 평면 기판의 반대편에 리세스를 포함한다. 제1 내지 제4 실시예에서, 채널은 평면 기판을 에칭, 기계 가공, 3D 인쇄, 몰딩함으로써 형성된다.
제5 실시예(5)는 제4 실시예에 따른 플로우셀 카트리지로서, 밀폐된 채널을 형성하도록 상기 평면 기판의 리세스 위에 배치된 하나 이상의 추가적인 평면 층을 포함한다.
제6 실시예(6)는 제1 내지 제5 실시예에 따른 플로우셀 카트리지로서, 기판은 비철 금속, 세라믹, 유리, 폴리머 또는 플라스틱으로 구성되고, 기판 및 하나 이상의 층을 갖는 실시예의 경우, 기판 및 평면 층은 동일한 또는 서로 다른 재료로 구성될 수 있다.
제7 실시예(7)는 제5 내지 제6 실시예에 따른 플로우셀 카트리지로서, 하나 이상의 평면 층은 압축, 접착제 접합(바람직하게는 생체 적합성 접착제, 더 바람직하게는 실리콘 또는 실리콘-기반 접착제), 솔벤트 접합, 초음파 용접, 열 접합, 용접, 또는 3D 인쇄에 의해 평면 기판에 부착된다.
제8 실시예(8)는 제5 내지 제7 실시예에 따른 플로우셀 카트리지로서, 평면 기판 및 하나 이상의 평면 층은 동일한 재료로 구성된다.
제9 실시예(9)는 제1 내지 제8 실시예에 따른 플로우셀 카트리지로서, 평면 기판은 폴리머 재료를 포함한다.
제10 실시예(10)는 제9 실시예에 따른 플로우셀 카트리지로서, 폴리머 재료는 환형 올레핀 폴리머 또는 환형 올레핀 코폴리머를 포함한다.
제11 실시예(11)는 제1 내지 제10 실시예에 따른 플로우셀 카트리지로서, 평면 기판에 형성되고 출구 채널의 말단 부분과 유체 연통하는 수집 웰을 추가로 포함한다.
제12 실시예(12)는 제1 내지 제11 실시예에 따른 플로우셀 카트리지로서, 수집 웰은 제1 웰 높이에 내부 채널 입구를 제2 웰 높이에 내부 출구를 추가로 포함하고, 입구는 플로우셀 카트리지의 출구 채널과 유체 연통하며, 제2 웰 높이는 제1 웰 높이보다 높다.
제13 실시예(13)는 제11 내지 제12 실시예에 따른 플로우셀 카트리지로서, 수집 웰은 수집 웰에 대한 입구의 말단 개구로부터 수집 웰의 바닥으로의 각진 전이부를 제공하는 단차부를 추가로 포함한다.
제14 실시예(14)는 제11 내지 제13 실시예에 따른 플로우셀 카트리지로서, 하나 이상의 수집 웰의 상부를 덮는 밀봉 필름을 추가로 포함한다.
제15 실시예(15)는 제11 내지 제14 실시예에 따른 플로우셀 카트리지로서, 플로우셀 카트리지는 수집 웰과 유체 연통하는 수집 웰 출구 채널을 평면 기판에 추가로 포함한다.
세포 또는 핵 분리 시스템 실시예
본 발명의 제1 세포 분리 시스템 실시예(1)는, 플로우셀 카트리지를 유지하기 위한 수용 블록과, 광학 센서, 렌즈 및 조명원을 포함하는 광학 시스템, 그리고 복수의 유동 조절 구성요소를 포함하고, 상기 수용 블록은 상기 광학 시스템과 광학 정렬 관계로 상기 플로우셀 카트리지를 분리 가능하게 배치하고, 상기 플로우셀의 처리 채널에 인접하게 자기 구성요소를 분리 가능하게 결합하며, 상기 복수의 유동 조절 구성요소와 유체 연통 관계로 상기 플로우셀 카트리지의 복수의 출구 채널을 분리 가능하게 배치한다.
제2 실시예(2)에서, 제1 실시예는 평면 기판 내의 처리 채널을 통한 광 투과를 제공하도록 구성 및 배열된 가시 광 조명원을 추가적으로 포함한다.
제3 실시예(3)에서, 제1 내지 제2 실시예의 시스템은, 상기 수용 블록에 유지된 평면 기판 내의 처리 채널에 대해 각을 이루는 배향의 관계로, 선택적으로는 474 ㎚ 및/또는 560 ㎚ 파장의, 자외선 조명을 배치하도록 구성 및 배열된 하나 이상의 자외선 조명원을 추가적으로 포함한다.
제3 실시예(3)를 포함하는 세포 분리 시스템의 제4 실시예(4)에서, 광학 시스템은, 바람직하게는 약 524 ㎚ 및 628 ㎚ 파장에 중심이 맞춰진 대역의 방출 광선을 통과시키는 듀얼 대역 통과 필터를 포함한다.
생세포-사세포 및/또는 세포 핵 분리 방법 실시예
생세포 및 사세포의 혼합물을 분리하고; 및/또는 핵 파편 및/또는 사세포로부터 세포 핵을 분리하는 방법의 제1 실시예는, 처리 채널과 복수의 출구 채널을 포함하는 플로우셀 카트리지로서, 플로우셀 카트리지의 출구 채널은 처리 채널보다 큰 체적을 갖는 것인 플로우셀 카트리지를 제공하는 단계; 생세포와 사세포 및/또는 세포 핵을 포함하는 샘플 용액과 상자성 화합물을 처리 채널로 유동시키는 단계; 실질적으로 처리 채널에 평행하게 정렬된 자기장에 플로우셀 카트리지를 배치하는 단계; 처리 채널 내에서 생세포와 사세포를 수직 거리를 두고 분리하기에 충분한 기간 동안 흐름 정지 조건으로 처리 채널과 처리 채널 안의 샘플을 완전히 자기장 내에 유지하는 단계; 및 생세포 및/또는 세포 핵이 농후한 샘플 분획부와 사세포 및/또는 온전한 세포 및 핵 파편이 농후한 샘플 분획부를 출구 채널로 동시에 인출하는 단계를 포함한다.
제1 실시예를 포함하는 제2 실시예(2)는, 샘플 용액을 도입하기 전에 액체 또는 상자성 화합물이 실질적으로 없는 플로우셀 카트리지를 제공하는 단계를 추가적으로 포함한다.
제1 내지 제2 실시예의 방법을 포함하는 제3 실시예(3)의 분리 방법은, 플로우셀 카트리지로서, 출구 채널은 처리 채널의 단면적보다 작은 단면적을 갖고, 촘촘한 경로를 추종하도록 배치되며, 어느 한 예시적인 구성은 사행형 채널인 것인 플로우셀 카트리지를 제공하는 단계를 추가적으로 포함한다.
제1 내지 제3 실시예의 방법을 포함하는 제4 실시예(4)의 분리 방법은, 처리 채널의 상단 수직면에 인접하고 처리 채널의 하단 수직면에 인접하게 자기장을 제공하는 단계로서, 각각의 자기장은 유사한 강도를 갖고 약 0.8 테슬라 내지 약 2.0 테슬라 그리고 선택적으로 약 0.9 테슬라 내지 약 1.4 테슬라의 표면 자계 강도를 갖는 것인 자기장 제공 단계를 추가적으로 포함한다.
제1 내지 제4 실시예의 방법을 포함하는 제5 실시예(5)의 분리 방법은, 약 50 mM 내지 약 200 mM, 선택적으로 약 65 mM 내지 약 175 mM, 그리고 더 선택적으로 약 70 mM 내지 약 150 mM의 농도로 샘플 용액에 상자성 화합물을 제공하는 단계를 추가적으로 포함한다.
제1 내지 제5 실시예의 분리 방법을 포함하는 제6 실시예(6)의 분리 방법은, 분당 약 75 μL 내지 분당 약 150 μL, 그리고 선택적으로 분당 약 75 μL, 분당 약 90 μL, 분당 약 100 μL, 분당 약 110 μL, 분당 약 120 μL, 또는 분당 약 150 μL의 유량으로 샘플 분획부를 출구 채널로 인출하는 단계를 추가적으로 포함한다.
제1 내지 제6 실시예의 방법을 포함하는 제7 실시예(7)의 분리 방법은, 농후한 회수 샘플 분획부가 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%의 생세포를 포함한다.
제1 내지 제7 실시예의 방법을 포함하는 제8 실시예의 분리 방법은, 농후한 회수 샘플 분획부에서의 생세포의 수율이 샘플의 총 생세포 조성의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75%이다.
제1 내지 제7 실시예의 방법을 포함하는 제9 실시예의 분리 방법은, 농후한 회수 샘플 분획부에서의 핵의 수율이 샘플의 생세포 조성으로부터의 총 핵의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75%이다.
도 1은 본원에 기술된 바와 같은 단일-자기 구성요소 입자 농축 및 단리 장치의 실시예의 단면도이다.
도 2는 각진 입구 채널을 갖는, 본원에 기술된 바와 같은 단일-자기 구성요소 입자 농축 및 단리 장치의 실시예의 단면도이다.
도 3은 각진 입구 채널 및 입구 자기장 구성요소를 갖는, 본원에 기술된 바와 같은 단일-자기 구성요소 입자 농축 및 단리 장치의 실시예의 단면도이다.
도 4는 자기 구성요소가 입구 채널의 일부를 둘러싸는, 본원에 기술된 바와 같은 입자 농축 및 단리 장치의 실시예의 단면도이다.
도 5는 각진 입구 채널 및 입구 자기장 구성요소를 갖는, 본원에 기술된 바와 같은 단일-자기 구성요소 입자 농축 및 단리 장치의 실시예의 단면도이다.
도 6은 본원에 기술된 바와 같은 실시예에 따른 단일 자기 구성요소 구성에서 처리 채널 내에 부여된 자기장을 도시한다.
도 7은 각진 입구 채널 및 입구 자기장 구성요소를 갖는, 본원에 기술된 바와 같은 다중-자기 구성요소 입자 농축 및 단리 장치의 실시예의 단면도이다.
도 8은 각진 입구 채널 및 입구 자기장 구성요소를 갖는, 본원에 기술된 바와 같은 입자 농축 및 단리 장치의 실시예의 단면도이다.
도 9는 선택 가능한 밸브 및 입구 채널 펌프 구성요소를 갖는, 기술된 바와 같은 입자 농축 및 단리 장치의 실시예의 단면도이다.
도 10은 본원에 기술된 바와 같은 다양한 실시예에 따른 통합 시스템의 도면이다.
도 11은 본원에 기술된 바와 같은 입자 농축 및 단리 장치의 단일 자기 구성요소 실시예의 작동을 도시한다.
도 12는 본원에 기술된 바와 같은 입자 농축 및 단리 장치의 각진 입구 채널 실시예의 작동을 도시한다.
도 13은 본원에 기술된 바와 같은 입자 농축 및 단리 장치의 작동 실시예에 따른 입자 함유 샘플의 유동-가능 분획부를 도시한다.
도 14는 본원에 기술된 바와 같은 입자 농축 및 단리 장치의 실시예에 따른 샘플의 입구 채널 자기장 지원 농축을 도시한다.
도 15는 본원에 기술된 바와 같은 입자 농축 및 단리 장치의 실시예에 따른 샘플의 입구 채널 자기장 지원 농축을 도시한다.
도 16은 본원에 기술된 바와 같은 입자 농축 및 단리 장치의 작동 실시예에 따른 입자 함유 샘플의 메니스커스 촉진 농축을 도시한다.
도 17은 본원에 기술된 바와 같은 입자 농축 및 단리 장치의 실시예에 의해 수행된 혈액 샘플로부터의 혈액 세포의 단리의 현미경 사진이다.
도 18은 본원에 기술된 바와 같은 입자 농축 및 단리 장치의 실시예의 사시도이다.
도 19는 종방향 측면 상의 이미징 표면과 제2 종방향 측면 상의 조명 표면을 보여주는 예시적인 플로우셀 카트리지의 도면이다.
도 20은 평면 기판의 상부 측면과 하부 측면을 보여주는 예시적인 플로우셀 카트리지의 상세도이다.
도 21는 수집 웰의 예시적인 구성을 보여준다.
도 22는 복수의 자기 구성요소에 대한 예시적인 플로우셀의 배향 및 시스템 수용 블록의 예를 보여준다.
도 23은 예시적인 수용 블록을 지향하는 광학 시스템의 예를 보여준다.
도 24는 예시적인 입자 분리 및 출구 채널 압력의 안정성의 이미지를 보여준다.
도 25는 수집된 세포의 생존율과 생세포 수율의 예를 보여준다.
도 26은 수집된 생세포 순도와 여러 세포 타입에 대한 수율의 예를 보여준다.
도 27은 폐(A, B)와 뇌(C, D) 조직으로부터 유래된 분류되지 않은 핵(A, C)과 분류된 핵(B, D)의 현미경 이미지를 보여준다.
도 28은 Jurkat 세포로부터 유래된 분류되지 않은 핵(A)과 분류된 핵(B)의 흐름 세포 측정 분석을 보여준다.
도 29는 Levicell 시스템에 의해 분리된 입력 핵과 비교하여 분리된 샘플에 있어서의 핵 특정 타겟(SCARNA5) 및 오염 세포질 타겟(SNHG6)의 레벨을 보여준다.
I. 정의/명명법
하기의 정의는 본 발명을 이해하는 것을 돕도록 제공된다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어, 표기법 및 다른 과학 또는 공학 용어 또는 전문용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 것으로 의도된다. 일부 경우에, 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 용어가 명확화 및/또는 용이한 참조를 위해 본원에 정의되며, 본원에의 이러한 정의의 포함은 당업계에서 일반적으로 이해되는 것과 실질적인 차이를 나타내는 것으로 가정해서는 안 되며, 이러한 일반적인 이해를 보완하는 것으로 의도된다. 본원의 정의가 당업계에서 일반적으로 이해되는 것과 일치하지 않는 범위에서, 달리 명시적으로 언급되지 않는 한, 본원에 제공된 정의 및 당업계에서 일반적으로 이해되는 것은 모두 대안적인 실시예로서 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주되어야 한다.
본원에 사용된 바와 같이, 달리 언급되지 않는 한, "함유하다", "함유하는", "구비하다", "구비하는" 등과 같은 개방형 용어는 '포함하는'을 의미한다.
본원의 일부 실시예는 수치 범위를 고려한다. 수치 범위가 제공되는 경우, 달리 언급되지 않는 한, 범위는 범위의 종점을 포함한다. 달리 언급되지 않는 한, 수치 범위는 명시적으로 기재된 것처럼 그 안의 모든 값 및 하위 범위를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 부정관사는 달리 명시적으로 언급되지 않는 한 하나 이상을 의미한다.
본원에서의 일부 값은 용어 "약"에 의해 수식된다. 일부 경우에, 기준 수치와 관련하여 용어 "약"은 해당 값으로부터 10%를 가감한 값의 범위를 포함할 수 있다. 예를 들어, "약 10"의 양은 9 내지 11의 양을 포함할 수 있다. 다른 실시예에서, 기준 수치와 관련하여 용어 "약"은 해당 값으로부터 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%를 가감한 값의 범위를 포함할 수 있다. 일련의 값이 용어 "약"으로 시작되는 경우, 이 용어는 일련의 값 내에 포함되는 각 값을 수식하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 바와 같이, 자기장에 대한 용어 "비대칭"은 관련 유체 채널의 영역에서의 자기장이 유체 채널의 중심을 통과하는 하나 이상의 평면에 대해 대칭이 아니며, 바람직한 실시예에 따르면 수평면에 대해 대칭이 아니라는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "모세관(capillary)" 또는 "모세관 튜브"는 하기에서 정의되는 바와 같이 채널을 갖는 튜브를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "채널", "유동 채널(flow channel)", "유체 채널(fluid channel)" 및 "유체 공학 채널(fluidic channel)"은 상호 교환 가능하게 사용되며, 유체가 유동할 수 있는 유체 장치의 경로를 지칭한다. 채널은 약 100 ㎜, 약 50 ㎜, 약 30 ㎜, 약 25 ㎜, 약 20 ㎜, 약 15 ㎜, 약 10 ㎜, 약 5 ㎜, 약 5 ㎜, 약 3 ㎜, 약 2 ㎜, 약 1 ㎜, 또는 약 0.5 ㎜의 최대 높이 치수를 갖는 경로를 포함한다. 자석 사이의 채널은 약 30 ㎜×0.5 ㎜, 약 25 ㎜×1 ㎜, 약 20 ㎜×2 ㎜, 약 15 ㎜×3 ㎜, 약 10 ㎜×5 ㎜, 약 5 ㎜×3 ㎜, 약 3 ㎜×2 ㎜, 약 2 ㎜×1 ㎜, 또는 약 1 ㎜×0.5 ㎜의 치수를 갖는다. 예를 들어, 자석 사이의 채널은 약 2 ㎜×1 ㎜의 치수를 갖는다. 채널의 내부 높이는 그 단면에 걸쳐 균일하지 않을 수 있고, 기하학적으로 단면은 원형, 정사각형, 타원형, 직사각형 또는 육각형을 포함하는 임의의 형상일 수 있다. 용어 "채널"은 마이크로채널 및 나노채널을 포함하지만 이에 제한되지 않고, 본원에서 채널에 대한 임의의 언급과 관련하여, 이러한 채널은 마이크로채널 또는 나노채널을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "농도"는 제2 구성요소 내에 함유된 제1 구성요소의 양을 의미하고, 단위 체적당 입자의 수, 단위 체적당 몰량, 또는 단위 체적당 중량에 기초하거나, 통합 구성요소들의 체적당 제1 구성요소의 체적에 기초할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유체적으로 결합되는(fluidically coupled)" 또는 "유체 연통(fluidic communication)"은 그렇게 결합되거나 연통하는 2개의 구성요소 사이에서 유체가 유동할 수 있다는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "단리하다(isolate)" 또는 "단리하는" 또는 "분리하다(separate)" 또는 "분리하는" 또는 "구분하다(segregation)" 또는 "구분하는"은 상호 교환 가능하게 사용되며, 구성요소와 관련하여 이러한 구성요소를 다른 구성요소로부터 분리하는 것을 의미하고, 용액 내에서 구성요소의 농도를 증가시키는 것, 또는 용액에서 구성요소를 다른 구성요소로부터 분리하는 것, 또는 용액 내에서 구성요소의 농도를 증가시키면서 용액에서 이러한 구성요소를 다른 구성요소로부터 분리하는 것의 조합을 포함한다. 용액 내의 입자는 용액 내의 다른 입자로부터 구분되고, 및/또는 용액의 한정된 부분 내에 위치되는 경우에 "단리된" 것으로 간주된다. 용액 내의 입자 또는 구성요소는, 용액을 처리한 후에, 이러한 입자 또는 구성요소의 농도가 약 100:1, 90:1, 80:1, 70:1, 60:1, 50:1, 40:1, 30:1, 20:1, 10:1, 5:1, 3:1 또는 2:1 이상의 비율로 증가되는 경우에 "단리된" 것으로 또한 간주된다. 다른 입자를 함유하는 용액 내의 관심 입자는, 이러한 용액을 처리한 후에, 이러한 다른 입자의 농도에 대한 이러한 관심 입자의 농도의 비율이 증가되는 경우, 또는 이러한 다른 입자의 농도에 대한 이러한 관심 입자의 농도의 비율이 약 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900% 또는 1000% 이상으로 증가되는 경우, 또는 이러한 다른 구성요소의 농도가 약 20%, 15%, 10%, 8%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 0.5% 미만으로 감소되는 경우에 "단리된" 것으로 간주된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유체의(fluidic)"는 상기에서 정의된 바와 같이 적어도 하나의 "채널"을 포함하는 유체 샘플을 취급, 처리, 배출 및/또는 분석하기 위한 시스템, 장치 또는 요소를 지칭한다. 용어 "유체의"는 '마이크로 유체의' 및 '나노 유체의'를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유체 기능(fluidic function)"은 여과, 펌핑, 유체 유동 조절, 유체 유동 제어 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 유체 시스템 내의 유체 또는 샘플에 대해 수행되거나 표현되는 임의의 작동, 기능 또는 프로세스를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "입자"는 원자, 화학 원소, 분자, 화합물, 생체분자, 세포, 괴사 세포(necrotic cell), 사멸 세포(apoptotic cell), 암 세포, 암 또는 종양 순환 세포, 세포 핵, 혈액, 혈장, 단백질, 지질, 체액, 핵산, 뉴클레오타이드(nucleotide), 아미노산, 펩타이드, 항체, 항원, 탄수화물, 미생물, 박테리아, 바이러스, 균류(fungi), 정자, 배우자(gamete), 난자, 배아, 또는 임의의 방향으로 가장 큰 치수가 약 3 ㎜, 2 ㎜, 1 ㎜, 0.5 ㎜, 0.25 ㎜, 100 미크론, 75 미크론, 50 미크론, 40 미크론, 30 미크론, 20 미크론, 10 미크론, 5 미크론, 2 미크론, 1 미크론, 또는 0.1 미크론 미만인 임의의 물리적 물질을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 물질을 지칭한다. 입자는 약 0.001 미크론 내지 약 3 ㎜, 약 0.1 미크론 내지 약 2 ㎜, 약 0.5 미크론 내지 약 1.5 ㎜, 약 10 미크론 내지 약 1 ㎜, 또는 약 20 미크론 내지 약 100 미크론인 임의의 방향으로 가장 큰 치수를 가질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "포트"는, 예를 들어 유체 채널을 사용하여, 2개의 요소 사이에 유체 연통을 제공하기 위한 구조물을 지칭한다. 용어 "입구 포트" 또는 "입구 개구" 또는 "입력 개구" 또는 "입력 채널"은 상호 교환 가능하게 사용되며, 샘플 유체가 본원에 기술된 장치 내로 주입되는 개구를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "농축하다(concentrate)" 또는 "농축하는"은 물, 수성 또는 비수성 배지, 또는 다른 물질을 제거함으로써 배지 내의 물질을 군집 밀도가 증가되게 또는 보다 순수하게 만드는 것을 지칭한다. 물질은 본원에 기술된 바와 같은 입자의 유형 또는 입자의 혼합물이다. 통상적으로, 본원에 기술된 바와 같은 농축은 배지에서 입자 또는 입자의 혼합물의 침강을 촉진하여, 이에 의해 입자 또는 입자의 혼합물을 특정 영역으로 가져가는 것을 포함한다. 대안적으로, 농축은 입자의 혼합물로부터 특정 유형의 입자를 분리하고, 통상적으로 사전 결정된 양의 액체 배지와 함께, 특정 유형의 입자를 수집 채널에 수집하는 것을 포함할 수 있다. 농축은 입자를 농축하기 위해 벌크 샘플을 스핀 또는 회전시키는 것을 포함할 필요는 없다. 본 발명에 의해 수행되는 농축은 입자의 상당한 손상, 용해 또는 전단 없이 입자의 분리를 허용한다. 추가적으로, 특정 작동 조건 하에서, 본 발명은 작동 동안 샘플 내에서의 응집(flocculation) 또는 결정화, 및 샘플의 응집 또는 결정화된 입자의 단리를 제공한다.
본원에 기술된 방법 및 단계가 특정 순서로 일어나는 특정 이벤트를 나타내는 경우, 당업자는 특정 단계의 순서가 변경될 수 있고, 이러한 변경이 본 발명의 변형에 따라 이루어진다는 것을 인식할 것이다. 추가적으로, 특정 단계는 가능한 경우에 병렬 프로세스에서 동시에 수행될 뿐만 아니라, 순차적으로 수행될 수도 있다.
Ⅱ. 자기장
본 개시는 처리 채널 또는 입구 채널 내에 자기장을 사용하여 농축시키기 위한 방법 및 장치를 제공한다. 샘플 유체 내 입자의 상자성 특성과 자기장의 상호 작용은 분리 또는 농축을 용이하게 하기 위해 입자에 대해 척력 또는 인력 효과를 제공할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 자석은 영구 자석 또는 전자석이다. 일 실시예에 따르면, 자석의 최대 에너지 곱은 약 1 메가-가우스 외르스테드(Mega-Gauss Oersted) 내지 약 1000 메가-가우스 외르스테드의 범위에 있고, 보다 바람직하게는 약 10 메가-가우스 외르스테드 내지 약 100 메가-가우스 외르스테드의 범위에 있다. 일 실시예에 따르면, 자석의 표면 자기장 강도는 약 0.1 테슬라 내지 약 100 테슬라의 범위에 있고, 보다 바람직하게는 약 1 테슬라 내지 약 10 테슬라의 범위에 있다. 일 실시예에 따르면, 자석의 잔류자기(remanence)는 약 0.5 테슬라 내지 약 5 테슬라의 범위에 있고, 보다 바람직하게는 약 1 테슬라 내지 약 3 테슬라의 범위에 있다.
바람직한 실시예에 따르면, 자석은 철 및 붕소와 네오디뮴 합금, 네오디뮴, 알루미늄과 니켈의 합금, 철과 네오디뮴 합금, 철과 합금된 알루미늄 및 코발트, 사마륨-코발트, 철과 희토류 원소의 다른 합금, 니켈과 희토류 원소의 합금, 페라이트, 또는 이들의 조합으로 제조된다. 복수의 자석을 포함하는 실시예에 따르면, 자석들은 동일한 재료로 제조되거나 서로 다른 재료로 제조된다.
일 실시예에 따르면, 비대칭 자기장은 유체 채널의 일 측부에 보다 강한 자성 재료를 사용하고 유체 채널의 반대 측부에 보다 약한 자성 재료를 사용함으로써 달성된다. 바람직한 실시예에 따르면, 비대칭 자기장은 유체 채널의 일 측부에 자성 재료를 사용하고 유체 채널의 반대 측부에 실질적으로 유사한 자성 재료를 사용함으로써 달성된다. 이러한 실시예에 따르면, 상부 자석과 하부 자석은 실질적으로 동일한 크기일 수 있다. 이러한 실시예에 따르면, 상부 자석은 네오디뮴을 포함할 수 있고, 하부 자석은 사마륨-코발트를 포함할 수 있으며, 양 자석 모두는 실질적으로 동일한 크기이다. 대안적으로, 상부 자석은 사마륨-코발트를 포함할 수 있고, 하부 자석은 네오디뮴을 포함할 수 있으며, 양 자석 모두는 실질적으로 동일한 크기이다.
일 실시예에 따르면, 대안적인 자석 구성이 사용될 수 있다. 참조하면, 본 발명에 따른 장치는 유체 채널 주위에 위치된 복수의 상부 자석 및 복수의 하부 자석을 포함할 수 있다. 상부 자석은 전방 상부 자석, 중앙 상부 자석 및 후방 상부 자석을 포함할 수 있다. 하부 자석은 전방 하부 자석, 중앙 하부 자석 및 후방 하부 자석을 포함할 수 있다.
다른 자석 구성에 따르면, 장치는 전방 상부 자석, 후방 상부 자석, 전방 하부 자석 및 후방 하부 자석을 포함할 수 있고, 자석은 유체 채널 주위에 위치된다. 전방 상부 자석과 후방 하부 자석은 자기 반발 방향으로 위치된다. 예시적인 NdFeB 자기 구성요소 치수에는 하부 자석 구성요소의 경우 약 50×15×2 ㎜(15 ㎜ 축을 통해 자화됨)가 포함되고, 상부 자석 구성요소의 경우 50×5×2 ㎜(5 ㎜ 축을 통해 자화됨)가 포함된다. 다른 자석 구성요소 실시예는 60×15×2 ㎜, 60×5×2 ㎜, 75×20×3 ㎜, 및 25×15×2 ㎜를 포함한다. 도 6은 처리 채널(104)의 하부에서 X-축을 따라 실질적으로 정렬된 직사각형 자석을 갖는 실시예를 도시하는 것으로, 처리 채널 내의 자기장선 및 자기력을 보여준다. 추가적인 바람직한 자석 구성요소 실시예는 약 75×20×3.2 ㎜의 치수를 갖는 상부 및 하부 자석을 포함하며, 상부 자석과 하부 자석 사이의 간격은 약 2.5 ㎜, 약 3.0 ㎜, 약 3.5 ㎜, 약 2.9 ㎜, 약 3.0 ㎜, 약 3.1 ㎜, 약 3.2 ㎜, 약 3.3 ㎜, 또는 약 2.72 ㎜, 약 2.88 ㎜, 약 2.98 ㎜, 약 3.18 ㎜, 약 3.20 ㎜, 또는 약 3.37 ㎜을 갖는다.
바람직한 실시예에서, 장치는 상부 자석 및 하부 자석을 가지며, 플라워 자석(flower magnet)은 입구 채널 내로 연장된다. 하부 자석 치수는 약 50 ㎜ 내지 약 100 ㎜×약 10 ㎜ 내지 약 30 ㎜×약 2 ㎜ 내지 약 4 ㎜일 수 있다. 바람직한 실시예는 약 75 ㎜, 약 80 ㎜, 약 85 ㎜, 약 90 ㎜, 약 93 ㎜ 또는 약 95 ㎜×약 15 ㎜, 약 18 ㎜, 약 20 ㎜, 약 23 ㎜ 및 약 25 ㎜×약 2 ㎜, 약 2.3 ㎜, 약 2.5 ㎜, 약 2.7 ㎜, 약 3 ㎜, 약 3.18 ㎜ 및 약 3.5 ㎜를 포함한다. 상부 자석과 하부 자석 사이의 자석 간격은 바람직하게는 2 내지 4.3 ㎜, 약 2.5 ㎜, 약 4.0 ㎜, 약 3.5 ㎜, 약 2.9 ㎜, 약 3.0 ㎜, 약 3.1 ㎜, 약 3.2 ㎜, 약 3.3 ㎜, 또는 약 2.72 ㎜, 약 2.88 ㎜, 약 2.98 ㎜, 약 3.18 ㎜, 약 3.20 ㎜, 약 3.37 ㎜, 약 3.5 ㎜, 약 3.7 ㎜, 또는 약 4 ㎜일 수 있다.
상부 및 하부에 평행한 자석 구성요소를 포함하고 처리 채널의 X-축을 따라 실질적으로 정렬된 유체 농축 장치의 실시예가 도 7의 (a)-(d)에 도시되어 있다.
Ⅲ. 상자성 배지
본 발명에 의해 자기 촉진 농축에 의해 처리된 샘플은 통상적으로 추가된 상자성 구성요소 또는 추가된 반자성 구성요소를 가질 것이다. 본 발명의 방법에 따르면, 관심 입자를 함유하는 물질은 상자성 배지와 조합되어 처리 용액을 생성한다. 상자성 배지는 상자성 재료 및 용매를 포함한다. 바람직한 실시예에 따르면, 상자성 배지는 생체적합성이며, 즉 생세포와 혼합되고 세포의 생존율에 영향을 미치지 않거나 또는 세포 거동, 예를 들어 유전자 발현에 영향을 미치지 않을 수 있다. 상자성 재료는 가돌리늄, 티타늄, 바나듐, 디스프로슘(dysprosium), 크롬, 망간, 철, 니켈, 갈륨, 이들의 이온 및 이들의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택될 수 있다. 일 실시예에 따르면 상자성 재료는 티타늄 (Ⅲ) 이온, 가돌리늄 (Ⅲ) 이온, 바나듐 (I) 이온, 니켈 (Ⅱ) 이온, 크롬 (Ⅲ) 이온, 바나듐 (Ⅲ) 이온, 디스프로슘 (Ⅲ) 이온, 코발트 (Ⅱ) 이온 및 갈륨 (Ⅲ) 이온을 포함하는 그룹으로부터 선택된다. 바람직한 실시예에 따르면, 상자성 재료는 킬레이트 화합물(chelated compound)을 포함한다. 바람직한 실시예에 따르면, 상자성 재료는 가돌리늄 킬레이트, 디스프로슘 킬레이트, 또는 망간 킬레이트를 포함한다. 일 실시예에 따르면, 상자성 배지는 상자성 재료, 염, 및 세포 무결성(cellular integrity)을 유지하도록 기능하는 다른 첨가제를 포함한다. 본 발명의 일 실시예에서, 상자성 재료는 미국 특허 출원 제14/407,736호에 기술된 바와 같이, [Aliq]2[MnCl4], [Aliq]3[GdCl6], [Aliq]3[HoCl6], [Aliq]3[HoBr6], [BMIM]3[HoCl6], [BMIM] [FeCl4], [BMIM]2[MnCl4], [BMIM]3[DyCl6], [BDMIM]3[DyCl6], [AlaC1] [FeCl4], [AlaC1]2[MnCl4], [AlaC1]3[GdCl6], [AlaC1]3[HoCl6], [AlaC1]3[DyCl6], [GlyC2] [FeCl4]일 수 있으며, 이 문헌은 본원에 참조로 포함된다.
일 실시예에 따르면, 상자성 재료는 상자성 배지에 약 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 120 mM, 150 mM, 200 mM, 250 mM, 300 mM, 500 mM, 또는 1M 이상의 농도로 존재할 수 있다. 일 실시예에 따르면, 상자성 재료는 상자성 배지에 약 10 mM 내지 약 50 mM, 약 25 mM 내지 약 75 mM, 약 50 mM 내지 약 100 mM, 약 100 mM 내지 약 150 mM, 약 150 mM 내지 약 200 mM, 약 200 mM 내지 약 250 mM, 약 250 mM 내지 약 300 mM , 약 300 mM 내지 약 500 mM, 또는 약 500 mM 내지 약 1 M의 농도로 존재할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상자성 재료는 가돌리늄을 포함하고, 상자성 배지에 약 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 또는 100 mM 이상의 농도로 존재한다. 일 실시예에 따르면, 상자성 재료는 가돌리늄을 포함하고, 상자성 배지에 약 10 mM 내지 약 50 mM, 약 25 mM 내지 약 75 mM, 또는 약 50 mM 내지 약 100 mM의 농도로 존재한다.
Ⅳ. 장치 구성
도 1 내지 도 5, 및 도 7 내지 도 10을 참조하면, 입자 농축 및 분리를 위한 본 발명의 입자 농축 장치의 다양한 실시예가 도시되어 있으며, 여기서 장치의 입구 채널, 처리 채널 및 출구 채널 부분은 상호 연결된 별도의 개별 구성요소를 포함한다. 처리 채널은 바람직하게는, 입자가 처리 채널 내의 유동 스트림의 층(여기서, 이러한 의미에서의 "층"은 y-축을 따른 작은 범위의 위치를 나타냄) 내에 농축되는 데 필요한 체류 시간, 및 시스템으로부터의 소기의 스루풋에 기초하여, 관심 입자를 함유하는 유체를 처리하기에 충분한 시간을 허용하도록 x-축을 따라 충분한 길이를 갖는 기다란 유체 채널이다. 일부 실시예에서, 처리 채널은, 약 200 미크론 내지 약 30 ㎜, 약 200 미크론 내지 약 20 ㎜, 약 200 미크론 내지 약 15 ㎜, 약 200 미크론 내지 약 10 ㎜, 약 200 미크론 내지 약 5 ㎜, 약 200 미크론 내지 약 2 ㎜, 약 200 미크론 내지 약 1 ㎜, 약 0.5 ㎜ 내지 약 1 ㎜, 약 0.5 ㎜ 내지 약 2 ㎜, 약 0.5 ㎜ 내지 약 3 ㎜, 약 1 ㎜ 내지 약 2 ㎜, 약 1 ㎜ 내지 약 3 ㎜, 또는 약 1.5 ㎜ 내지 약 2 ㎜의 높이를 갖는 유체 채널이다. 일 실시예에 따르면, 처리 채널은 약 20 ㎜ 내지 약 200 ㎜, 약 20 ㎜ 내지 약 150 ㎜, 약 20 ㎜ 내지 약 100 ㎜, 약 20 ㎜ 내지 약 50 ㎜, 약 40 ㎜ 내지 약 100 ㎜, 약 40 ㎜ 내지 약 90 ㎜, 또는 약 40 ㎜ 내지 약 80 ㎜의 길이를 갖는다. 일부 실시예에서, (Z 방향으로의) 채널 깊이는 약 100 미크론 내지 약 5 ㎜, 약 500 미크론 내지 약 3 ㎜, 약 1 ㎜ 내지 약 2.5 ㎜, 또는 약 1.5 ㎜ 내지 약 2 ㎜이다. 채널 길이 실시예는 길이가 40, 45, 50, 60, 70 ㎜일 수 있다. 예시적인 처리 채널의 치수는 40 내지 70 ㎜ 길이(X-축)와 함께, 1 ㎜ 및 1.9 ㎜ 높이(Y-축, 이미지에서 수직)×0.8 또는 1.0 또는 1.5 또는 2.0 ㎜ 깊이(Z-축)를 포함한다. 처리 채널의 바람직한 실시예는 약 50 내지 70 ㎜ 길이(X-축)와 함께, 약 2 ㎜ 높이(Y-축, 이미지에서 수직)×약 2.0 ㎜ 깊이(Z-축)를 포함하는 예시적인 처리 채널의 치수를 갖는다. 추가의 바람직한 처리 채널 실시예는 약 55 ㎜, 약 56 ㎜, 약 57 ㎜, 약 58 ㎜, 약 59 ㎜, 약 60 ㎜, 약 61 ㎜, 약 62 ㎜, 약 63 ㎜, 약 64 ㎜, 약 65 ㎜, 또는 약 66 ㎜의 길이를 갖는다.
처리 채널은 임의의 기하학적 단면 구성을 가질 수 있고, 정사각형, 직사각형, 원형 또는 타원형인 기하학적 단면 구성을 포함할 수 있다. 본원에 기술된 처리 채널의 기하학적 특성은 본 발명의 구성요소 구성을 참조하여 전술한 입구, 출구 및 임의의 다른 유체 채널에 동일하게 적용 가능하다.
입구 채널의 단면적(채널이 원형일 때 r이 채널의 내경의 반경인 경우, πr2임)은 처리 채널의 단면적보다 실질적으로 작다. 이러한 맥락에서, "직경"은 특징적인 단면 치수를 기술하는 데 사용되고, 채널은 단면이 원형이 아닐 수 있다. 다양한 실시예에서, 입구 채널의 단면적은 처리 채널의 단면적보다 적어도 100배, 80배, 50배, 40배, 20배, 10배, 8배, 6배, 4배 또는 2배 더 작다. 일부 실시예에서, 입구 채널의 단면적은 처리 채널의 단면적보다 적어도 10배 더 작다. 일부 실시예에서, 입구 채널의 단면적은 처리 채널의 단면적보다 적어도 5배 더 작다. 일부 실시예에서, 입구 채널의 단면적은 0.2 ㎟ 이하, 0.8 ㎟ 이하, 3.1 ㎟ 이하, 7.1 ㎟ 이하, 12.6 ㎟ 이하, 19.6 ㎟ 이하, 28.3 ㎟ 이하, 38.5 ㎟ 이하, 50.3 ㎟ 이하, 78.5 ㎟ 이하, 176.7 ㎟ 이하, 또는 314.2 ㎟ 이하이다. 출구 채널은 통상적으로 입구 채널과 유사한 치수 특성을 갖지만, 후술하는 바와 같은 다양한 단면적을 가질 수 있다.
입자 농축 장치의 실시예는 처리 채널(103)에 대해 테이퍼진 입구 부분을 포함하고, 본 발명의 입자 단리 장치는 또한, 와류에 의해 유발되는 난류를 감소시키고 그에 따라 서로 다른 단면적의 유체 채널의 연결과 연관된 관련 전단력을 감소시키는 테이퍼진 진입 포트를 포함한다. 이러한 와류는, 세포 또는 다른 입자가 장치를 통해 유동하기보다는 순환 경로에 포획될 수 있는 위치를 제공함으로써, 샘플을 처리하는 효율 또는 속도를 감소시킬 수 있다. 와류 유동은 또한 세포와 같은 입자에 전단 응력을 유발할 수 있다. 테이퍼 각도는 약 10° 내지 약 70°, 바람직하게는 약 20° 내지 약 60°, 약 30° 내지 약 45°, 또는 일부 실시예에서 약 30°일 수 있다.
장치의 출구 부분은 단리 또는 추가 처리를 위해 처리 채널 내의 샘플 스트림의 일부분을 별개의 스트림으로 전환하는 것을 돕는 스플리터를 포함할 수 있다. 스플리터는 바람직하게는 처리 채널 내에, 그러나 처리 채널의 후단부 근처에 위치되며, 그에 따라 처리 채널을 통해 유체를 통과시킴으로써 달성된 임의의 입자 단리는 유체가 장치를 빠져나갈 때 유지된다. 스플리터는 출구 채널로부터 처리 채널의 후단부 내로 연장되는 하나 이상의 수평 칸막이를 포함할 수 있다. 스플리터는, 처리 채널의 대향 양 측부에 실질적으로 X-축을 따라 정렬된 자석을 갖는 실시예에서, 자석 사이의 거리의 0.5-3.5 ×, 1-3 ×, 1.5-2.5 ×, 1-2 × 또는 2 ×의 길이로 처리 채널 내로 연장될 수 있다. 입자 농축 장치의 단일 자석 실시예의 경우, 스플리터는 단일 자석 구성요소의 Z-축 방향으로의 두께의 1-5 ×, 1.5-5 ×, 1.5-4 ×, 2-4 ×, 3-4 × 또는 4 ×로 처리 채널 내로 연장될 수 있다. 처리 채널의 X-축을 따라 정렬된 자석 구성요소가 없는 실시예의 경우, 스플리터는 처리 채널 길이의 5%-40%, 5%-30%, 5%-25%, 10%-30%, 10%-20%, 또는 10%-15%로, 바람직하게는 5% 초과, 바람직하게는 35% 미만으로 연장될 수 있다. 스플리터는 처리 채널 내의 말단 단부에서 뾰족하게 되도록 테이퍼진다. 테이퍼 각도는 약 5° 내지 약 45°, 바람직하게는 약 10° 내지 약 30°, 약 15° 내지 약 25°, 또는 일부 실시예에서는 약 20°일 수 있다. 처리 채널은 스플리터를 사용하여 수평으로 분할될 수 있다. 또한, 스플리터는 하나 이상의 수직 칸막이를 포함할 수 있고, 이에 의해 복수의 출구 채널로 이어지는, 유체 연통하는 유출물 유체 출구 개구의 수평 및 수직 그리드를 생성할 수 있다. 이러한 실시예에서, 처리 채널의 후단부 근처의 복수의 출구 채널은 출구 포트를 통해 수집 튜브 또는 에펜도르프 튜브(Eppendorf tube)와 같은 복수의 수집 챔버로 이어진다. 스플리터(들)는 복수의 출구 채널을 획정한다. 일 실시예에 따르면, 본 발명의 입자 농축 장치는 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 출구 채널을 획정하는 스플리터를 포함한다. 일 실시예에 따르면, 본 발명의 입자 농축 장치는 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 이상의 출구 채널을 획정하는 스플리터를 포함한다. 일 실시예에 따르면, 본 발명의 입자 농축 장치는 2개 내지 4개, 5개 내지 7개, 또는 8개 내지 10개의 출구 채널을 획정하는 스플리터를 포함한다. 본원에 기술된 스플리터 및 다양한 결과적인 출구 채널은 본 발명의 구성요소 구성을 참조하여 전술한 처리 채널에 합체될 수 있다.
복수의 출구 채널은 처리 채널로부터 대응하는 복수의 출구 포트까지 연장된다. 복수의 출구 채널은 처리 채널로부터 각각의 유출물 채널을 통해 각각의 출구 포트로의 유동의 양을 제어하는 펌프 또는 출력 밸브와 같은 유체 유동 조절기(fluidic flow modulator)를 포함할 수 있다. 각 유출물 분획부로의 샘플 용액의 분할은 개별 출구로 향하는 유체 유동을 증가 또는 감소시킴으로써 달성될 수 있고, 그에 따라 분할 비율이 수정될 수 있다. 일 실시예에 따르면, 비율은 50%까지 수정될 수 있다. 예컨대, 스플리터가 동일한 단면을 갖는 2개의 채널을 포함하는 경우, 분할의 기하학적 비율은 1:1이다. 다른 분획부에 적용되는 것보다 큰(또는 작은) 펌핑 속도의 적용을 통해 보다 많은(또는 보다 적은) 양의 유체를 하나의 분획부로 인출함으로써, 분할의 비율은, 예컨대 약 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 또는 10:1까지 변경될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 이러한 기하학적 비율을 위한 분할은 약 2:1 내지 약 1:2의 범위 내에 있을 것이다. 추가의 바람직한 실시예에서, 이러한 기하학적 비율을 위한 분할은 약 10:1 내지 약 1:10의 범위 내에 있을 것이다. 분할은 상부 출구 채널 유량 대 하부 출구 채널 유량의 각각의 비율이 약 1:10, 약 1:9.5, 약 1:9, 약 1:8.5, 약 1:8, 약 1:7.5, 약 1:7, 약 1:6.5, 약 1:6, 약 1:5.5, 약 1:5, 약 1:4.5, 약 1:4, 약 1:3.5, 약 1:3, 약 1:2.5, 약 1:2, 약 1:1.5, 약 1:1, 약 1.5:1, 약 2:1, 약 2.5:1, 약 3:1, 약 3.5:1, 약 4:1, 약 4.5:1, 약 5:1, 약 5.5:1, 약 6:1, 약 6.5:1, 약 7:1, 약 7.5:1, 약 8:1, 약 8.5:1, 약 9:1, 약 9.5:1, 약 10:1일 수 있다.
도 1의 (a)는 처리 채널(104)의 상부 X-축을 따라 실질적으로 정렬된 단일 자석 구성요소(101), 입구 채널(102) 및 입구 연결 영역(103), 복수의 출구 채널(106) 및 유동 스트림 스플리터 부분(105)을 갖는 장치를 도시한다. 도 1의 (b)는 처리 채널의 하부를 따라 정렬된 단일 자석 구성요소(101)를 갖는 유사한 구성을 도시한다. 도 1의 (c)는 처리 채널을 넘어서 입구 부분으로 연장되는 추가적인 자석 구성요소 또는 부분(107)을 갖는 도 1의 (a)의 구성을 도시한다. 도 1의 (d)는 처리 채널의 하부의 X-축을 따라 실질적으로 정렬되고 입구 부분으로 연장되는 자석 구성요소를 갖는 이러한 유형의 구성을 도시한다. 일 실시예에 따르면, 상부 자석 및 하부 자석 중 어느 하나 또는 양자 모두는 유체 채널에 대한 자석의 수직 위치의 제어된 조정을 허용하고 이에 의해 채널 내의 자기장 강도를 조정하도록 시스템 내에 이동 가능하게 장착된다. 입구 채널 기하구조 및 입구 채널 자기장의 사용은 본 발명의 특정 실시예에서 처리 채널 내에서의 입자 농축을 조절하는 데 사용된다. 처리 채널의 입구에 또는 그 근처에 입자를 축적함으로써, 특정 실시예는 입자의 상대적 농후화가 변하는 유동 스트림의 부분을 생성하는 능력을 제공한다. 예를 들어, 처리 채널의 입구에 또는 그 근처에 입자가 축적되면, 처리 채널 내의 유동 스트림에 있어서의 입자의 양이 즉시 고갈될 수 있다. 입자 구속력, 침강력, 자기력 또는 이들의 조합을 해제하거나 극복함으로써, 이후에 처리 채널 내의 유동 스트림 내에서의 입자 농축이 증가된다. 일시적으로, 이것은 처리 채널 내의 유동 스트림의 입자 농후화 층 내에서 다양한 레벨의 입자 농축을 야기할 수 있다. 이러한 선택적인 프로세스는, 하나의 양태에서, 특히 강화된(농후화된) 또는 특히 고갈된 유동 스트림 분획부를 식별 및 이용할 수 있는 본 발명의 장치 및 방법의 사용자에게 특히 관심 대상인 유동 스트림 분획부를 생성하는 데 유용하다.
도 2의 (a)-(d)는 처리 채널에 대해 실질적으로 선형으로 정렬된 부분과 처리 채널에 대해 선형으로 정렬되지 않은 부분이 각도 세타(θ)로 각진 부분에서 연결되는 입구 채널 부분(203)을 더 포함하는 단일 자석 구성요소 구성을 도시한다. 비선형 입구 부분은 하나 이상의 교차 채널(201)을 포함할 수 있고, 선형 입구 부분은 하나 이상의 교차 채널(202)을 포함할 수 있다. 입구 채널에 대한 교차 채널은 액체, 현탁액 또는 가스의 도입 또는 제거를 제공한다. 교차 채널은 상자성 배지, 완충액, 응집제, 샘플 전처리 시약 또는 반응물 등과 같은 시약의 샘플 유동 스트림 내로의 도입을 제공할 수 있다. 교차 채널은 또한 입구 채널 내에서의 또는 처리 채널 내에서의 입자 또는 샘플 배지의 다른 구성요소와의 반응을 위해 반응 시약을 샘플 배지 내로 도입하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포 염색 반응 또는 리간드 결합 반응은 분리 전에 입구 채널에서 수행될 수 있다. 추가적으로, 일부 실시예에서, 침전, 응집 또는 결정화 반응과 같은 반응이, 필요한 또는 원하는 경우에 처리 채널에서 수행 또는 계속될 수 있다. 교차 채널 중 하나 이상은 또한 분리 채널로 진입하는 것이 거부되거나 다른 방식으로 저지된 입자를 수집하기 위한 출력부로서 사용될 수도 있다. 도 2의 (a)는 처리 채널의 상부에서 X-축을 따라 실질적으로 정렬된 자석 구성요소를 갖는 유체 농축 장치를 도시한다. 입구 채널의 비선형 부분은 입구 채널의 실질적으로 선형인 부분에 대해 약 90°로 있다. 도 2의 (b)는 처리 채널의 하부에서 실질적으로 선형으로 정렬된 자석 구성요소를 갖는 유사한 실시예를 도시하고, 입구 채널의 비선형적으로 정렬된 부분은 입구 채널의 실질적으로 선형인 부분에 대해 약 270°로 있다. 도 2의 (c)는 처리 채널의 하부를 따라 정렬된 자석 구성요소를 갖는 도 2의 (a)에서의 실시예를 도시한다. 도 2의 (d)는 처리 채널의 하부를 따라 정렬된 자석 구성요소를 갖는 도 2의 (b)와 유사한 실시예를 도시한다. 도 2의 (a)-(d)의 실시예에서, 비선형적으로 정렬된 입구 채널 부분은 입구 채널의 실질적으로 선형인 부분에 대해 약 90°(도 2의 (b), (d)) 또는 약 270°(도 2의 (a), (c))로 있으며, 각도 θ는 장치 요건에 의해 결정될 수 있고, X-축에 대해 θ≠0°, θ≠180°, 및 θ≥30°, θ≥45°, θ≥70°, θ≥90°, θ≥100°, θ≥135°, θ≥140°, θ≥165°, θ＞180°, θ≥205°, θ≥225°, θ≥250°, θ≥280°, θ≥300° 또는 θ≤330°이고, 및/또는 Y-축 및 Z-축에 대해 독립적으로 임의의 각도 세타(θ)이다. 예를 들어, 도 2의 (e)는 θ(x)=90°, θ(y)=180°, θ(z)=0°인 평면도를 도시한다. 도 2의 (f)는 θ(x)=90°, θ(y)=225°, θ(z)=0°인 평면도를 도시한다.
도 3의 (a)-(d)는 자석 구성요소(107)가 입구 영역으로 연장되는 도 2의 (a)-(d)의 실시예와 유사한 실시예를 도시한다.
도 4의 (a)-(d)는 입구 채널을 둘러싸는 환형 또는 원환형 자석 구성요소(링 자석)인 추가 구성요소(401)를 갖는 유체 농축 장치의 실시예를 도시한다. 링 자석은 자극에 대해 반발 배향으로 위치된 하나 이상의 자석을 포함할 수 있고, 이에 의해 입구 채널의 X-축을 따라 대칭적인 자기력이 생성된다. 하나의 실시예에서, 링 자석은 입구 채널 내에 개별 반발장(repelling field)이 정렬되도록 입구 주위에 구성된 복수의 직사각형 자석을 포함한다. 링 자석으로부터 가해지는 힘은 입자의 상자성 특성에 척력을 제공함으로써 입자 유속을 늦춘다. 링 자석은 도 4의 (a)에 도시된 바와 같이 입구 채널의 실질적으로 선형인 부분에 구성될 수 있고, 자석 구성요소는 처리 채널의 상부의 X-축을 따라 실질적으로 정렬되고, 도 4의 (b)에 도시된 바와 같이 자석 구성요소는 처리 채널의 하부의 X-축을 따라 실질적으로 정렬된다. 도 4의 (c)는 처리 채널을 넘어서 입구 부분으로 연장되는 추가적인 자석 구성요소 또는 부분(107)을 갖는 도 4의 (a)의 구성을 도시한다. 도 4의 (d)는 처리 채널의 축을 따라 정렬된 자석 구성요소 없이 유체 농축 장치의 입구 부분을 둘러싸도록 구성된 링 자석을 도시한다. 도 4의 (a)-(d)에서 입구 채널의 선형 부분을 둘러싸는 구성요소(401)로서 도시되어 있지만, 이러한 실시예는 비제한적이며, 링 자석은 다른 실시예에서 입구 채널의 비선형적으로 정렬된 부분을 포함하는 입구 채널을 따라 임의의 곳에 배치될 수 있다.
도 5의 (a)-(d)는 처리 채널의 X-축의 상부 또는 하부를 따라 실질적으로 정렬된 단일 자석 구성요소를 갖고, 링 자석(401) 및 비선형적으로 정렬된 입구 채널 부분 및 교차 채널을 더 포함하는 실시예를 도시한다. 교차 채널 중 하나 이상은 또한 분리 채널로 진입하는 것이 거부되거나 다른 방식으로 저지된 입자를 수집하기 위한 출력부로서 사용될 수도 있다.
입자 농축 장치의 다수의 실시예는 처리 채널의 X-축의 상부 또는 하부를 따라 실질적으로 정렬된 단일 자석 구성요소를 포함한다. 본원에 기술된 다른 실시예는 처리 채널의 실질적인 부분을 따라 정렬된 자석 구성요소를 갖지 않는다. 다른 실시예에서, 장치는 처리 채널의 X-축의 상부 및 하부를 따라 실질적으로 정렬된 다수의 자석 구성요소를 포함할 수 있다. 이러한 실시예는 처리 채널 내의 상자성 입자의 자기 부상, 및 그에 따라 처리 채널 내의 이종 입자의 분리를 제공한다. 일 실시예에 따르면, 부상 장치는, 결합되는 자석(즉, 유체 채널의 처리 섹션에 걸쳐 자기장을 능동적으로 생성함)의 수를 제어하여 이에 의해 자기장의 크기 및 구배 프로파일을 제어할 수 있도록, 이동 가능하게 장착된 복수의 자석을 포함하는 상부 자석 또는 하부 자석을 포함한다. 시간의 함수로서의 자기장에 대한 제어는, 실험 또는 분석 동안에 언제든지 변경될 수 있는 보다 복잡한 프로토콜을 허용한다. 정적 시스템에 대한 다른 이점 중에서, 이것은 샘플의 보다 유연한 분할; 입자 분리의 보다 높은 분해능; 유체 경로를 퍼지(purging), 프라이밍(priming) 및 처리하는 보다 유연한 방법; 및 실험 또는 분석을 실행할 때 분리 파라미터를 최적화하거나 변경하기 위한 피드백을 허용한다.
일 실시예에 따르면, 상부 자석 및 하부 자석은 기다란 직사각형 자석(바람직하게는 막대 자석)을 포함하고, 그 치수는 약 2 ㎜ 내지 약 25 ㎜의 (y-축(수직 축)으로부터) 높이, 약 30 ㎜ 내지 약 80 ㎜, 또는 약 95 ㎜의 (x-축으로부터) 폭, 및 약 0.5 ㎜ 내지 약 7 ㎜의 (z-축으로부터) 깊이의 범위에 있다. 바람직하게는, 상부 자석 및 하부 자석은 약 4 ㎜ 내지 약 20 ㎜의 (y-축으로부터) 높이, 약 40 ㎜ 내지 약 60 ㎜의 (x-축으로부터) 폭, 및 약 1 ㎜ 내지 약 3 ㎜의 (z-축으로부터) 깊이의 범위인 치수를 갖는다. 본원에 기술된 바람직한 자석 크기는 하나의 자석에 의해 또는 다수의 자석의 조합에 의해 달성될 수 있다. 일 실시예에 따르면, 상부 자석 및 하부 자석의 깊이 및 폭은 실질적으로 동일하다. 일 실시예에 따르면, 상부 자석의 높이는 하부 자석의 높이보다 적어도 약 25%, 50%, 75%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 225%, 250%, 275%, 300%, 325%, 350%, 375%, 400%, 425%, 450%, 475%, 또는 500% 더 크다. 일 실시예에 따르면, 상부 자석의 높이는 하부 자석의 높이보다 약 25% 내지 약 100%, 약 100% 내지 약 200%, 약 200% 내지 약 300%, 약 300% 내지 약 400%, 약 400% 내지 약 500%, 또는 약 500% 내지 약 600% 더 크다. 일 실시예에 따르면, 하부 자석의 높이는 상부 자석의 높이보다 적어도 약 25%, 50%, 75%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 225%, 250%, 275%, 300%, 325%, 350%, 375%, 400%, 425%, 450%, 475%, 또는 500% 더 크다. 일 실시예에 따르면, 하부 자석의 높이는 상부 자석의 높이보다 약 25% 내지 약 100%, 약 100% 내지 약 200%, 약 200% 내지 약 300%, 약 300% 내지 약 400%, 약 400% 내지 약 500%, 또는 약 500% 내지 약 600% 더 크다.
일 실시예에 따르면, 상부 및 하부 자석과 유체 채널, 모세관 또는 중앙 처리 섹션 사이의 수직 축을 따른 거리는 적어도 약 1 미크론, 10 미크론, 50 미크론, 또는 100 미크론이고, 및/또는 약 500 미크론, 1 ㎜, 2 ㎜, 3 ㎜, 4 ㎜, 또는 5 ㎜ 이하이다. 일 실시예에 따르면, 자석들 중 어느 하나와 유체 처리 채널 사이의 거리는 수직 축을 따라 약 1 미크론 내지 약 5 ㎜, 바람직하게는 약 10 미크론 내지 약 2 ㎜이다.
일 실시예에 따르면, 상부 자석과 유체 처리 채널 사이의 수직 거리는 하부 자석과 유체 처리 채널 사이의 수직 거리보다 적어도 약 25%, 50%, 75%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 225%, 250%, 275%, 300%, 325%, 350%, 375%, 400%, 425%, 450%, 475% 또는 500% 더 크다. 일 실시예에 따르면, 상부 자석과 유체 처리 채널 사이의 수직 거리는 하부 자석과 유체 처리 채널 사이의 수직 거리보다 적어도 약 25% 내지 약 100%, 약 100% 내지 약 200%, 약 200% 내지 약 300%, 약 300% 내지 약 400%, 약 400% 내지 약 500%, 또는 약 500% 내지 약 600% 더 크다.
일 실시예에 따르면, 하부 자석과 유체 처리 채널 사이의 수직 거리는 상부 자석과 유체 처리 채널 사이의 수직 거리보다 적어도 약 25%, 50%, 75%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 225%, 250%, 275%, 300%, 325%, 350%, 375%, 400%, 425%, 450%, 475% 또는 500% 더 크다. 일 실시예에 따르면, 하부 자석과 유체 처리 채널 사이의 수직 거리는 상부 자석과 유체 처리 채널 사이의 수직 거리보다 적어도 약 25% 내지 약 100%, 약 100% 내지 약 200%, 약 200% 내지 약 300%, 약 300% 내지 약 400%, 약 400% 내지 약 500%, 또는 약 500% 내지 약 600% 더 크다.
일 실시예에 따르면, 상부 자석 및 하부 자석은 영구 자석 또는 전자석이다. 일 실시예에 따르면, 상부 자석 및 하부 자석의 최대 에너지 곱은 약 1 메가-가우스 외르스테드 내지 약 1000 메가-가우스 외르스테드의 범위에 있고, 보다 바람직하게는 약 10 메가-가우스 외르스테드 내지 약 100 메가-가우스 외르스테드의 범위에 있다. 일 실시예에 따르면, 상부 및 하부 자석의 표면 자기장 강도는 약 0.1 테슬라 내지 약 100 테슬라의 범위에 있고, 보다 바람직하게는 약 1 테슬라 내지 약 10 테슬라의 범위에 있다. 일 실시예에 따르면, 상부 및 하부 자석의 잔류자기는 약 0.5 테슬라 내지 약 5 테슬라의 범위에 있고, 보다 바람직하게는 약 1 테슬라 내지 약 3 테슬라의 범위에 있다.
바람직한 실시예에 따르면, 비대칭 자기장은 처리 채널의 일 측부에 보다 강한 자성 재료를 사용하고 처리 채널의 반대 측부에 보다 약한 자성 재료를 사용함으로써 달성된다. 바람직한 실시예에 따르면, 비대칭 자기장은 유체 채널의 일 측부에 자성 재료를 사용하고 유체 채널의 반대 측부에 실질적으로 유사한 자성 재료를 사용함으로써 달성된다. 이러한 실시예에 따르면, 상부 자석과 하부 자석은 실질적으로 동일한 크기일 수 있다. 이러한 실시예에 따르면, 상부 자석은 네오디뮴과 철의 합금을 포함할 수 있고, 하부 자석은 사마륨-코발트를 포함할 수 있으며, 양 자석 모두는 실질적으로 동일한 크기이다. 대안적으로, 상부 자석은 사마륨-코발트를 포함할 수 있고, 하부 자석은 네오디뮴을 포함할 수 있으며, 양 자석 모두는 실질적으로 동일한 크기이다.
일 실시예에 따르면, 대안적인 자석 구성이 사용될 수 있다. 참조하면, 본 발명에 따른 장치는 유체 채널 주위에 위치된 복수의 상부 자석 및 복수의 하부 자석을 포함할 수 있다. 상부 자석은 전방 상부 자석, 중앙 상부 자석 및 후방 상부 자석을 포함할 수 있다. 하부 자석은 전방 하부 자석, 중앙 하부 자석 및 후방 하부 자석을 포함할 수 있다.
다른 자석 구성에 따르면, 장치는 전방 상부 자석, 후방 상부 자석, 전방 하부 자석 및 후방 하부 자석을 포함할 수 있고, 자석은 유체 채널 주위에 위치된다. 전방 상부 자석과 후방 하부 자석은 자기 반발 방향으로 위치된다. 비대칭 자기 부상 장치에 대한 설명은 본원에 참조로 포함되는 국제 특허 출원 PCT/US19/24138호에 추가로 기술되어 있다.
도 7의 (a)-(d)는 예시적인 배향으로 선택적인 링 자석(401) 및 선택적인 입구 채널 부분(201, 202 및 203)을 갖는 이중 자석 구성요소 입자 농축 장치의 실시예를 도시한다.
본원에 기술된 입자 농축 장치의 특정 실시예는 처리 채널의 상당 부분을 따라 정렬된 자석 구성요소를 갖지 않는다. 입자 농축은, 입구 채널 내의 입자의 극복 가능한 자기 반발을 통한, 및 입구 채널 기하구조를 통해 선택적으로 향상될 수 있는 유동-매개 사전 농축을 통한, 입구 채널에 있어서의 입자의 침강과 선택적으로 사전 농축의 조합을 통해 달성된다. 도 8의 (a)-(d)는 장치 구성의 실시예를 도시한다. 도 8의 (e)-(h)는 선택적인 교차 채널(들)로의 유체 이동을 제어하는 입구 채널 밸브(801, 802, 803)의 합체를 도시한다. 펌프(804)는 임의의 채널, 입구 채널, 입구 교차 채널, 출구 채널, 전환 채널 등과 연관될 수 있다. 본원에서 추가로 기술되는 바와 같이, 펌프는 다양한 실시예에서, 유체 연통하도록 채널과 연관된 다수의 펌프에서 작동될 때 누적 유동 및 대응하는 채널 내의 유체를 구동하는 데 필요한 양압 또는 음압을 제공하도록 구성될 수 있다. 도 8의 (h)는 입구 교차 채널(805 및 806)을 갖는 입자 농축 장치를 도시한다. 도 8의 (h)에 도시된 바와 같이, 입구 채널 교차 채널은 링 자석의 상류, 하류 또는 양자 모두에 있을 수 있다. 일 실시예에서, 교차 채널(806)은 링 자석의 상류에 있는 처리 채널에 실질적으로 선형인 입구 채널의 부분에만 제공된다.
도 9는 단일 자석 구성요소 입자 농축 장치의 실시예를 도시한다. 도 9의 (a)는 입구 채널로부터 처리 채널 내로 유동을 구동하는 펌프(804)를 갖는 입자 농축기 장치를 도시한다. 도 9의 (b)는 출구 채널의 유량을 개별적으로 제어하는 복수의 펌프(804)를 갖는 입자 농축 장치를 도시한다. 조합된 유량이 처리 및 입구 채널의 유동에 추가된다. 유량은 점도 및 입자 농도와 같은 샘플 유체 특성과, 입구 채널, 처리 채널 및 출구 채널 치수 및 구성에 따라 분당 0.1 μL 내지 1 mL의 범위에 있을 수 있다. 바람직한 실시예에서, 처리 채널 및 출구 채널 유량은 약 0.2 μL/분 내지 약 200 μL/분, 또는 약 0.5 μL/분 내지 약 40 μL/분일 수 있다. 농축은 또한 정지-유동 또는 간헐-유동 작동 하에서 수행될 수 있다. 밸브(902)는 출구 채널을 출구 포트(903 또는 904)로 전환하도록 작동될 수 있다. 일부 실시예에서, 입구 채널 펌프(들) 및 출구 채널 펌프(들)는 처리 채널에 대해 각각 양압 또는 음압 구성으로 이용된다. 정지-유동 조건 하에서, 샘플의 분리가 수행되고, 샘플은 처리 채널 내에서 유동을 재개함으로써 별도의 배출 채널 내로 제거된다.
본 발명에 따르면, 장치는 장치를 통해 유체를 구동하기 위한 하나 이상의 펌프를 포함할 수 있다. "펌프"는 장치 내의 서로 다른 위치들 사이에 압력차를 인가하는 임의의 장치를 지칭하는 데 사용된다. 펌프는 시스템의 입구측(유체를 출구(들)를 향해 밀어붙임)에, 또는 출구(입구(들)로부터 액체를 끌어당김)에, 또는 양자의 조합에 배치될 수 있다. 압력차는 양 또는 음일 수 있다. 압력차는 다수의 출구 또는 입구에 걸쳐 공통으로 인가될 수 있거나, 각각의 출구 또는 입구가 직접 인가된 압력차를 갖도록 배열될 수 있다. 압력차는, 일부 실시예에서, 입구 채널에 있어서의 입자 사전 농축력, 자기력, 침강력, 또는 이들 힘의 조합을 극복하도록 인가될 수 있다. 펌프는 인가된 압력차의 제어를 허용하도록 가변적일 수 있다. 펌프 타입은, 시린지 펌프와 같은 용적형 펌프(positive displacement pump); 연동 펌프(peristaltic Pump); 다이어프램 펌프; 조절식 정압 소스; 액체의 상승 또는 하강된 체적과 같은 중력-제어식 압력 소스; 플라스틱 또는 호일 블리스터(foil blister)와 같은 수동 압력 소스를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 실시예에서, 펌프는 일반적으로 채널 구조물을 통해 유체를 구동하기 위해 입구 라인(들)에 포함될 수 있고, 또한 지향된 출구 라인을 통해 유체를 구동하기 위해 특정 출구 채널 또는 포트에 포함될 수 있다. 예를 들어, 펌프는 하나 이상의 관심 입자의 입자 농후화된 또는 입자 고갈된 층의 높이(들)와 연관된 하나 이상의 출구 라인에 포함될 수 있다. 또한, 모든 출구 라인은 하나 이상의 관심 입자의 예상되는 유동 스트림 높이(들)에 기초하여 활성화되거나 비활성화될 수 있는 가변 펌프를 포함할 수 있다. 유사하게, 외부 펌프는 가변 압력차를 제공하도록 제어될 수 있다. 실시예는 하나 이상의 출구 수집 튜브를 유지하기 위한 리셉터클; 하나 이상의 입력 튜브를 유지하기 위한 리셉터클; 온도 제어되는 하나 이상의 튜브용 리셉터클을 포함하는 구성요소, 예를 들어 4 ℃에 근접한 온도로 하나 이상의 출구 튜브를 보관하는 저온 플레이트; 또는 입구 또는 출구를 마이크로 플레이트의 웰에 결합하기 위한 위치결정 수단을 포함할 수 있는 마이크로 플레이트 홀더를 포함하는 추가 구성요소를 더 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 출구 채널 또는 포트는 피펫팅 로봇(pipetting robot)에 유체적으로 결합된다. 피펫팅 로봇은, 처리 채널로부터 농축된 입자 집단의 분취부 또는 분획부를 선택적으로 분배하고, 대안적으로 또는 추가적으로 처리 채널로부터 입자 고갈 유출물의 분취부 또는 분획부를 분배하기 위해, 입자 농축 장치와 통합될 수 있다. 장치는 또한 장치를 통한 유체 및/또는 입자 유동 및 분리를 기록, 분석 및/또는 제어하도록 프로그래밍된 마이크로프로세서 또는 컴퓨터와 통합될 수 있다.
도 10은 예시적인 입자 농축 장치를 포함하는 입자 농축 시스템을 도시한다. 장치는 하나 이상의 센서를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 처리 채널 센서(1001) 및 입구 채널 센서(1002)가 시스템 내에 구현될 수 있다. 시스템 적분기(system integrator)(1003)는 센서(1001 및 1002)로부터 신호를 수신하고 사전 프로그래밍되거나 프로그램 가능한 명령을 통해 입구 펌프(들)(804) 또는 출구 채널 펌프와 같은 다른 구성요소, 링 자석(201) 또는 다른 전자기 구성요소의 자기장, 밸브 또는 인터페이스 장치 또는 구성요소를 제어하기 위한 신호 프로세서를 포함할 수 있다. 센서는 광학 센서, 용량성 센서, 전도성 센서, 열 센서, 유량 센서, 초음파 센서, 중량 센서, 자기장 센서, 또는 이들의 조합으로부터 선택된다. 실시예들에서, 센서는 광검출기, 다중 픽셀 이미징 검출기, 자기장 검출기, 전기화학적 검출기, 광학 위상 검출기, 산란 검출기, 홀 센서, 자기저항 센서, 볼로메트릭 센서, 표면 탄성파 센서, 바이오센서, 또는 이들의 조합이다. 센서는 입자의 존재 또는 부재 또는 양, 또는 입자 또는 샘플 유동 스트림의 다른 물리적 또는 화학적 특성을 검출하기 위해 처리 채널 또는 입구 채널의 일부분 내부에 또는 그에 인접하게 하나 이상의 센서를 더 포함할 수 있다.
도 18의 입자 농축 장치의 평면도에 도시된 바와 같이, 장치는 시각화 구성요소 또는 이미징 센서, 센서 조명기, 및 센서 광학기기를 더 포함할 수 있다. 시각화 구성요소는 입자가 처리 채널을 통과할 때 입자를 실시간으로 관찰하고 및/또는 기록하는 능력을 가능하게 하거나 향상시키는 임의의 장치를 포함하며, 이에 의해 입자 단리의 정도 및/또는 입자 단리의 속도를 포함하여, 입자 단리의 관찰 및/또는 측정을 가능하게 할 수 있다. 시각화는 또한 입자 및/또는 샘플의 다른 성분의 크기, 형상 또는 다른 특성에 대한 분석을 포함할 수 있다. 일 실시예에 따르면, 처리 채널을 둘러싸서 획정하는 데 사용되는 재료는 처리 채널의 적어도 하나의 세그먼트를 따라 투명성(clear)이거나 투과성(transparent)이어서, 통과하는 입자의 관찰을 용이하게 한다. 시각화 시스템은 명시야 조명, 암시야 조명 및/또는 샘플 구성요소의 형광 검출을 허용하기 위한 광학기기를 이용할 수 있다.
일 실시예에서, 장치는 채널의 대향 양 측부에 각각 있는 2개의 광학적으로 투명성이거나 투과성인 채널 세그먼트를 포함한다. 이러한 실시예에 따르면, 시각화 구성요소는 일 측부에 위치되고 상기 투명성이거나 투과성인 세그먼트 중 하나를 통해 포커싱되고, 조명 구성요소는 반대 측부에 위치되고 상기 투명성이거나 투과성인 세그먼트 중 제2 세그먼트를 통해 포커싱된다. 조명 구성요소는 시각화 구성요소에 의한 처리 채널 내의 입자의 시각화를 용이하게 하기에 충분한 광을 제공하도록 구성된다. 다른 실시예에서, 장치는 채널의 일 측부에 하나의 투명성이거나 투과성인 세그먼트를 포함한다. 이러한 실시예에 따르면, 시각화 구성요소는 일 측부에 위치되고 상기 투명성이거나 투과성인 세그먼트를 통해 포커싱되고, 조명 구성요소는 동일한 측부에 위치되고 상기 투명성이거나 투과성인 세그먼트를 통해 포커싱된다. 조명 구성요소는 시각화 구성요소에 의한 처리 채널 내의 입자의 시각화를 용이하게 하기에 충분한 광을 제공하도록 구성된다.
바람직한 실시예에서, 조명 시스템은 가시광 또는 자외선 광원이다. 조명원은 처리 채널을 포함하는 광학적으로 투과성인 유동 채널 내의 샘플을 조명하도록 구성될 수 있고, 여기서 광은 조명원의 반대측의 광학 센서로 유동 채널을 통해 투과된다. 일 실시예에서, 조명원은 광원으로부터의 광이 유동 채널 내의 샘플로부터 광학 센서 내로 반사되도록 광학 센서에 각도적으로 인접하여 있다. 일 실시예에서, 광원은 자외선 광원이고, 샘플과 연관된 인공 형광의 자연 형광으로부터의 가시광이 광학 센서에 의해 검출되도록 유동 채널 내의 샘플을 조명하도록 구성 및 배열된다.
V. 입자 단리 및 농축 방법
유기 또는 무기 입자는 본 발명의 방법에 의해 농축될 수 있다. 입자는 세포, 세포 단편, 세포기관(organelle)(예컨대, 세포 핵), 클러스터, 조직, 조직 구성요소, 박테리아, 균류(효모 및 곰팡이), 바이러스, 원생동물(protozoa) 및 조류(algae)를 포함하는 미생물, 및 이들의 단편, 세포기관, 클러스터 및 다른 구성요소와 같은 생물학적 개체일 수 있다. 입자는 거대분자, 착물, 킬레이트, 결합체(conjugates), 결정, 비정질 고체, 겔, 응고물 등일 수 있다. DNA, RNA, 단백질은 본 발명의 방법에 따라 농축 가능하다. 비드, 쉘, 나노입자, 라미네이트, 침전물 및 공침전물도 마찬가지로 농축될 수 있다. 다른 입자로부터 유사한 입자의 분리, 입자의 식별, 입자의 처리 또는 다른 방식의 조작을 필요로 하는 용례를 포함하는 수많은 용례가 입자의 분리를 필요로 한다. 이러한 용례는 생세포와 사세포의 분리, 생세포와 사세포 및 핵 파편으로부터 세포 핵의 분리, 순환하는 종양 세포의 단리 및/또는 처리, 에멀젼 PCR 농후화, 혈소판이 풍부한 혈장과 같은 혈장의 생성, 성별 선택과 같은 특정 형질을 위한 정자 단리, 박테리아 부하 테스트, 항생제 내성 테스트, 패혈증 또는 혈액 오염의 식별, 면역 세포 단리, 화합물 스크리닝, 엑소좀(exosome) 분리 또는 세포외 소포(extracelluar vesicle) 분리를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 입자 단리 방법은 이들 용례 중 어떠한 것에도 이용될 수 있다.
샘플 배지에 존재하는 입자는 입자 농도를 실질적으로 농후화하고 샘플 배지 층을 실질적으로 고갈시키는 조건 하에서 입자 농축 장치에서 농축된다. 이종 입자 집단을 갖는 샘플 배지는 크기, 밀도, 자기력의 선택적 배향 및 상자성 이질성 및 처리 채널 유량에 기초하여 선택적으로 농후화될 수 있다. 이종 입자 집단이 생물학적 샘플로부터 얻어질 수 있다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 예시적인 예로서, 혈액, 타액, 소변, 정자, 혈장, 혈청 및 대변을 포함하는 체액; 피부, 항문, 비강 및 질 면봉 또는 문 손잡이의 환경 면봉을 포함하는 면봉; 및 눈물, 폐로부터의 세척액, 또는 유방으로부터의 간질 조직액을 포함하는 근위액(proximal fluid)을 포함한다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은, 예시적인 예로서, 생세포 및 사세포, 용해된 세포, 순환하는 종양 세포, 핵산, 뉴클레오타이드, 아미노산, 펩타이드, 단백질, 항원, 항체 또는 면역 세포(예를 들어, 백혈구, T 세포, 식세포(phagocytic Cell))이다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은, 예시적인 예로서, 생체분자, 세포, 단백질, 지질, 탄수화물, 미생물, 바이러스, 비리온(virion) 또는 박테리아이다.
샘플 배지 내의 입자 농도에 대한 입자 농후화 분획부의 농도의 레벨은 적어도 30%, 바람직하게는 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%이다. 일 실시예에서, 입자 고갈 분획부에는 실질적으로 입자가 없다.
처리 채널 내로 도입하기 전에, 시약 유체 또는 가스는 교차 채널을 포함하는 위치를 따라 샘플 배지를 통과하기 전에, 그와 동시에, 또는 그 이후에 유동 스트림 내로 도입될 수 있다. 일 실시예에서, 상자성 배지, 완충액, 응집제, 샘플 전처리 시약 또는 반응물이 처리 채널에서 농축 또는 단리 또는 분석을 위한 조제물(preparation)로서 샘플 배지에 도입 및 혼합될 수 있다.
입자는 소정 유량으로 처리 채널 내로 도입되고, 처리 채널 내에서 침강 및/또는 자기 척력 및/또는 인력을 받아서 유동 스트림 내에 입자 농후 및 입자 고갈 층을 형성한다. 다양한 실시예에서, 유동 스트림 내에의 입자 농후 및 입자 고갈 층의 형성은 연속 유동, 정지 유동 또는 간헐 유동 조건 하에서 일어난다. 입자 농후 및/또는 입자 고갈 층의 수집은, 층들이 처리 채널 유동 스트림에서 분할될 때 수행된다. 처리 채널로부터의 유동 출력, 입자 농후 스트림 및/또는 입자 고갈 스트림은 분취 또는 분별을 위해 선택적으로 채널링될 수 있다. 관심 입자는 처리 채널 내의 유동 층에서 평형(또는 거의 평형) 높이에 도달하면, 처리 용액을 다수의 분획부로 분할하는 스플리터를 통과한다. 관심 입자가 처리 용액 내에서 기하학적으로 단리되기 때문에, 실질적으로 모든 관심 입자가 특정 기하학적 분획부의 유출물 내에 유지된다. 다음에, 관심 입자를 포함하는 기하학적 유출물 분획부(들)는 수집되고, 관심 입자가 하나 초과의 분획부에 존재하는 경우에 재결합되어, 이에 의해 관심 입자를 단리할 수 있다. 일부 실시예에서는 상자성 배지로부터 세포를 분리하는 것이 필요할 수 있다. 이것은 상자성 배지로부터의 세포의 분리를 원하는 경우에 희석을 통해 수행될 수 있다.
대안적으로, 각 유출물 분획부로의 샘플 용액의 분할은 개별 출구로 향하는 유체 유동을 증가 또는 감소시킴으로써 달성될 수 있고, 그에 따라 분할 비율이 변경될 수 있다. 일 실시예에 따르면, 비율은 50%까지 변경될 수 있다. 예컨대, 스플리터가 동일한 단면을 갖는 2개의 채널을 포함하는 경우, 분할의 기하학적 비율은 1:1이다. 다른 분획부에 적용되는 것보다 큰(또는 작은) 펌핑 속도의 적용을 통해 보다 많은(또는 보다 적은) 양의 유체를 하나의 분획부로 인출함으로써, 분할의 비율은, 예컨대 약 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 또는 10:1까지 변경될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 이러한 기하학적 비율을 위한 분할은 약 2:1 내지 약 1:2의 범위 내에 있을 것이다. 추가의 바람직한 실시예에서, 이러한 기하학적 비율을 위한 분할은 약 10:1 내지 약 1:10의 범위 내에 있을 것이다. 분할은 상부 출구 채널 유량 대 하부 출구 채널 유량의 각각의 비율이 약 1:10, 약 1:9.5, 약 1:9, 약 1:8.5, 약 1:8, 약 1:7.5, 약 1:7, 약 1:6.5, 약 1:6, 약 1:5.5, 약 1:5, 약 1:4.5, 약 1:4, 약 1:3.5, 약 1:3, 약 1:2.5, 약 1:2, 약 1:1.5, 약 1:1, 약 1.5:1, 약 2:1, 약 2.5:1, 약 3:1, 약 3.5:1, 약 4:1, 약 4.5:1, 약 5:1, 약 5.5:1, 약 6:1, 약 6.5:1, 약 7:1, 약 7.5:1, 약 8:1, 약 8.5:1, 약 9:1, 약 9.5:1, 약 10:1일 수 있다.
일 실시예에서, 농축 입자를 포함하는 샘플 유체는 처리 세그먼트의 후단부에 도달할 때까지 비교적 느린 속도로 유체 채널을 통과하며, 후단부에서 유속은 2배 이상 증가한다. 바람직한 실시예에서, 샘플 유체의 유속은 처리 세그먼트의 후단부에서 적어도 4배만큼 증가한다. 일부 경우에, 샘플 유체는 본원에 기술된 바와 같이 자석 링 또는 상부 및 하부 자석의 쌍에 의해 생성된 자기장에 노출된다. 일부 경우에, 샘플 유체는 자기장에 노출되지 않는다.
분취부 또는 분획부는 튜브 또는 플레이트와 같은 수집 챔버 또는 용기 내로 전환될 수 있다. 분획부 또는 분취부는 추가 처리, 분석 또는 반응을 받을 수 있다. 일 실시예에서, 수집 챔버, 플레이트, 웰 및/또는 튜브는 사전 결정된 양의 필요 재료 또는 후속 처리 단계를 포함하여, 사용자가 세포를 농축시킬 뿐만 아니라, 세포를 하나의 배지로부터 다른 배지로 이송하거나 시약을 추가할 수 있게 한다. 예시적인 시약은 RNA 단리, DNA 단리, mRNA 단리, 단백질 단리, 성장 배지, 배양 배지 및 고정액(fixative)을 위한 시약을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 단리된 분취부 및/또는 분획부는 자기 부상 및 분리, 화학적 또는 생화학적 분석, 분획, 유도체화, 시퀀싱 샘플 조제, 질량 스펙트럼 분석, NMR 분석, 현미경 분석, FACS 분류 및 분석, X선 회절 분석을 포함하는 추가 처리를 받을 수 있다. 생물학적 세포는 진단 또는 치료 절차에서 자연적으로 수집된 상태로 수집 및 사용되거나, 유전적 또는 생화학적 변형을 받을 수 있다.
입구, 처리 또는 출구 채널에서의 체류 동안, 입자는 속도, 밀도, 생물학적, 화학적, 유전적, 분류, 구성, 생존율, 농도 또는 배향을 포함하는 특성에 대해 조사될 수 있다. 조사는 입구, 처리, 출구 채널, 또는 이들의 조합, 및 수집 챔버, 웰, 플레이트 또는 튜브 내에 있거나 그에 인접하거나 그에 조사적으로 연결된 하나 이상의 센서 또는 센서 어레이에 의해 수행될 수 있다. 검출된 특성은 독립적인 분석을 위해 사용될 수 있고, 시스템 제어기 구성요소에 의해 시스템 작동을 제어하거나 자동화하는 데 이용될 수 있다. 제어 하에 있는 시스템 구성요소 및 파라미터는 샘플 배지 유량, 자기장 강도, 전환, 수집, 분획 및 후속 반응 조건을 위한 밸브 작동을 포함한다. 입구 채널 내의 센서는 일 실시예에서, 시약 유체 또는 가스를 입구 채널 내의 샘플 스트림 내로 자동으로 도입하기 위해 시스템 제어기에 작동적으로 연결되도록 통합된다.
도 11은 본 발명의 장치를 이용한 입자의 농축을 도시한다. 입자는 입구 채널을 통과하는 샘플 배지의 유동을 통해 처리 채널에 도입된다. 침강 및/또는 자기 척력은 유동 스트림의 하부 층에 입자를 농축시키고, 농축된 입자는 하부 출구 채널을 통해 수집된다. 입자 고갈 층은 상부 출구 채널을 통해 수집된다. 이러한 방법은, (i) 처리 채널, 입구 채널 및 복수의 출구 채널을 갖는 저용량 유체 장치를 제공하는 단계, (ⅱ) 적어도 입자 농후 층 및 입자 고갈 층을 갖는 샘플 유동 스트림을 생성하는 조건 하에서 입자 함유 샘플을 상기 입구 채널을 통해 상기 처리 채널 내로 유동시키는 단계, (ⅲ) 입자 농후 유동 스트림을 생성하기 위해 상기 입자 농후 층을 제1 출구 채널을 통해 유동시키는 단계, (ⅳ) 입자 고갈 유동 스트림을 생성하기 위해 상기 입자 고갈 층을 제2 출구 채널을 통해 유동시키는 단계, 및 (v) 상기 출구 채널 중 하나 이상으로부터 상기 유동 스트림 중 하나 이상을 수집하는 단계를 포함한다.
도 12는 유동 지원 입자 농축 방법을 예시하는데, 여기서 입구 채널은 각도 세타(θ)로 각진 부분에서 연결되는, 처리 채널에 대해 실질적으로 선형인 부분 및 처리 채널에 대해 비선형으로 정렬된 부분으로 추가로 구성된다. 입자 함유 샘플 배지는, 입구 채널의 비선형 정렬된 부분 내에서의 침강이 입구 채널 내의 입자를 농축시킬 수 있게 하기에 충분한 유량으로 입구 채널을 통해 유동된다. 처리 채널 내로의 입자 함유 샘플의 유동은, 유동 스트림의 입자 농후 층 및 입자 고갈 층을 형성하기 위해 선택적으로 입자의 자기 척력에 의해 연속 또는 추가 침강을 제공하도록 유지된다. 유동 스트림의 각각의 층은 각자의 출구 채널에서 수집된다. 어떤 이론에도 얽매이지 않고, 입자의 농축은 아마도, 입자가 현탁되는 액체(예를 들어, 물, 용매)보다 큰 밀도를 갖는 입자가 중력의 존재 하에서 침전되는 경향뿐만 아니라, 자기장으로부터의 척력의 조합으로 인한 것이다. 입자는 1분 이상, 2분 이상, 5분 이상, 10분 이상, 20분 이상, 30분 이상, 또는 60분 이상 동안 침강되게 할 수 있다. 입자는 10초 이상, 20초 이상, 30초 이상, 40초 이상, 50초 이상, 60초 이상, 100초 이상, 또는 200초 이상 동안 침강되게 할 수 있다. 일부 실시예에서, 농축된 입자는 50 μL/분(분당 마이크로리터) 이하, 40 μL/분 이하, 30 μL/분 이하, 20 μL/분 이하, 10 μL/분 이하, 5 μL/분 이하, 또는 2 μL/분 이하의 유량으로 유체 채널을 통과한다. 일부 실시예에서, 농축된 입자는 약 20 μL/분의 유량으로 유체 채널을 통과하며, 이는 액체가 유동 장치를 통과하게 하지만 입자가 자기장 외부에 축적될 수 있게 할 것이다. 일부 실시예에서, 농축된 입자는 약 10 μL/분의 유량으로 유체 채널을 통과하며, 이는 액체가 유동 장치를 통과하게 하지만 입자가 자기장 외부에 축적될 수 있게 할 것이다. 플로우셀을 통과하는 액체는 수집 챔버로 이어지는 출구 채널 중 하나를 통해 퇴적될 것이다. 대부분의 액체가 장치를 통과하고 입자가 플로우셀에 진입하는 것이 확인되면, 현탁 입자(예를 들어, 현탁 세포)를 갖는 액체는 관심 입자를 수집하도록 특정된 수집 챔버로 이어지는 제2 출력 채널 내로 보다 높은 유량으로 통과될 것이다.
도 13은 처리 채널 내에서의 입자 농축 분획부의 유동 지원 형성을 도시한다. 농축된(입자 농후화) 분획부는 하부 출구 채널을 통해 수집되어 입자의 고도로 농후화된 분취부를 제공한다. 유동 스트림의 입자 농축 부분은 처리 채널 내의 입자를 관찰하는 이미징 센서와 같은 센서에 의해 식별되거나, 처리 채널 내의 분획 패턴이 특성화되는 샘플에 대한 분획부의 시간적 수집을 통해 일시적으로 식별될 수 있다.
도 14는 처리 채널 내로 진입하기 전에 입자에 자기 척력을 인가함으로써 입구 채널 내의 입자를 사전 농축하는 것을 도시한다. 처리 채널 내로의 입자의 진입은 채널 내의 자기 척력을 중단 또는 감소시킴으로써, 또는 자기 척력을 극복하도록 유동 스트림을 조절함으로써, 또는 자기력 감소와 유동 스트림 조절의 조합에 의해 달성된다. 유동 스트림의 조절은, 샘플 배지 유동 스트림의 유량을 증가시키는 것, 또는 입자를 처리 채널 내로 도입하기 위해, 예컨대 펄스형 입구 채널 압력을 수행함으로써, 유동 스트림을 변동시키는 것을 포함할 수 있다.
도 15는 처리 채널의 X-축을 따라 정렬된 자기 구성요소가 처리 채널 내로 입자의 진입을 억제하기 위해 입구 채널 내로 자기 척력을 확장하도록 제공되는 입자 농축 방법을 도시한다. 유량은 입구 채널 내의 입자의 농축을 제공하도록 유지된다. 충분한 입자 사전 농축 시에, 자기 척력이 극복되고, 입자가 처리 채널 내로 도입된다. 사전 농축의 정도는 샘플 배지의 유량에 의해 조절된다. 처리 채널에 진입하는 입자는 처리 채널 유동 스트림의 입자 농후 층 내로 침강되고/자기적으로 반발되거나 끌어당겨지고, 출구 채널에 수집된다.
도 16에 따른 방법의 일 실시예에서, 가스 기포 또는 비혼화성 액적(1601)은 처리 채널 내로의 샘플 배지의 진입 후에 도입된다. 기포 또는 액적은 처리 채널에서 샘플 배지 후방으로 유동되어, 처리 채널로부터 출구 채널까지 잔류하는 입자 농후 층 및 입자 고갈 층을 실질적으로 플러싱(flushing)한다. 이것은 샘플 분획부의 실질적으로 완전한 단리를 허용하고 별개의 샘플 또는 샘플 분획부의 처리를 제공한다. 공기의 도입 빈도는 보다 효율적인 처리를 위해 큰 초기 샘플 체적을 보다 작은 단위로 나누도록 조정될 수 있다.
본 발명의 방법의 일 실시예는 전혈 샘플 또는 희석된 혈액 샘플을 제공하는 단계, 및 본원에 기술된 바와 같은 샘플 농축 방법을 샘플에 행하고, 전혈 또는 희석된 혈액 샘플로부터 혈장 및/또는 혈액 세포를 단리하는 단계를 포함하는, 혈액 샘플을 분획하는 방법이다. 혈액 샘플은 약 50 μL 내지 약 50 mL, 50 μL 내지 약 20 mL, 50 μL 내지 약 10 mL, 또는 약 50 μL 내지 약 5 mL의 체적을 갖는 말초 혈액 샘플, 제대혈 샘플, 태아 혈액 샘플 또는 동맥혈 샘플로부터의 전체 또는 희석 샘플일 수 있다. 상기 방법에 따르면, 분리된 혈장 분획부는 혈액 샘플 내의 혈액 세포의 약 1% 미만 내지 약 0.01% 미만을 함유하거나, 혈액 세포가 실질적으로 없을 수 있다. 단리된 혈액 샘플 분획부는 효소 면역분석, 화학발광 면역분석, 혈구 응집/입자 응집 분석, 핵산 증폭 기술 분석, 약물 분석, 법의학적 분석, 또는 유전 형질 분석과 같은 진단 분석에 사용될 수 있다.
혈액 세포 농축/혈장 분리의 예로서, 본 발명의 입자 농축 장치 및 방법에서 제대혈 샘플이 혈장 및 세포 분획부로 분획되었다. (10 mL) 혈액 샘플이 얻어졌고, 100 mM의 최종 농도를 얻기 위해 가도부트롤(gadobutrol)의 상자성 배지가 첨가되었다. 처리 채널(치수 X×Y×Z가 50×1.9×1 ㎜임)의 상부의 X-축을 따라 실질적으로 정렬된 단일 자석 구성요소와 함께 구성된 처리 채널의 입구 채널을 통해 500 마이크로리터의 총 샘플 체적이 도입되고, 평형을 위해 약 5분을 허용한 후에, 20 마이크로리터/분의 시작 유량으로 유동되었다. 20 마이크로리터/분의 복합 유량은 하부 수집 채널로 유동하는 10 마이크로리터/분과 상부 수집 채널로 유동하는 10 마이크로리터/분을 포함한다. 실시간 이미징을 사용하여 분리를 모니터링한 후에, 유량은 50 마이크로리터/분으로 증가된 후에, 100 마이크로리터/분으로 증가되었다. 각각 상부 수집 채널 및 하부 수집 채널 내로의 유량 비율은 1:1로부터 4:1로 조정된 후에, 10:1(10은 하부 수집 채널에 대한 것이고, 1은 상부 수집 채널에 대한 것임)을 초과하는 비대칭으로 조정되어, 보다 높은 비율의 유체를 하부 채널 내로 흡인하고, 이에 의해 고순도를 유지하였다. 혈액 세포 농후화 층의 농축은 유동 스트림의 하부 층 내에 일어나고, 수집은 하부 출구 채널을 통해 수행되었다. 도 16은 하부 혈액 세포 층 및 상부 혈장 층의 상당한 농축 및 단리를 보여주는 샘플 스플리터 및 전방 영역에서의 처리 채널의 현미경 사진(스케일: 유동 채널 높이가 1.9 ㎜임)이다.
Ⅵ. 플로우셀 카트리지
정밀도, 정확도 및 재현성은 과학 장치의 요건이다. 추가적인 고려 사항에는 사용 편의성과 제조 가능성이 포함된다. 본 발명의 플로우셀은, 불가능하거나 또는 때로는 매우 길고 및/또는 복잡하고 비용이 많이 드는 절차에 의해서만 달성 가능하였던 과학적 실험 및 개발을 가능하게 하는, 사용 가능한 장치의 모든 필요 특징을 갖는다.
본 발명의 플로우셀 카트리지는, 평면 기판을 포함하고, 평면 기판은 상부 표면과 하부 표면, 이미징 표면을 형성하는 제1 종방향 측면, 조명 표면을 형성하는 제2 종방향 측면, 제1 및 제2 횡방향 측면, 상부 표면 상의 입구 웰, 입구 채널, 입구 채널과 유체 연통하고 종방향 측면에 실질적으로 평행하게 배치되는 샘플 처리 채널, 상기 처리 채널 내의 샘플 스플리터, 상기 처리 채널과 유체 연통하는 복수의 출구 채널, 및 복수의 출구 채널 각각과 유체 연통하는 복수의 수집 웰을 포함하며, 상기 기판은 광학적으로 투명한 재료를 선택적으로 포함하고, 상기 처리 채널은 공간적으로 상기 이미징 표면에 편향되도록 기판의 평면 내에서 오프셋된다. 평면형 구성은 필요한 모든 플로우셀 기능이 카트리지에 통합되는 것을 허용하고, 실험실 또는 임상 환경에서 성능과 재현성을 증가시킨다. 작동 시, 처리 채널을 통과하여 출구 채널에 들어가는 유동이 가능한 한 난류가 없는 것으로 되는 것은, 성능 향상에 있어서 중요하다. 공기와 액체 사이의 압축성 차이의 영향, 유동을 제한할 수 있거나, 샘플 용액 메니스커스와 상호 작용하거나, 또는 그렇지 않으면 난류를 유발할 수 있는 채널 구성이, 입자 분리의 성능을 감소킬 것이다. 처리 채널에 들어가기 이전의 샘플의 유동 조건의 최소화는, 샘플 손실을 줄일 수 있고, 플로우셀의 채널 내에서의 입자 클럼핑 및/또는 샘플 부착의 기회뿐만 아니라 샘플 세포 또는 유기체의 생존율을 취급하는 샘플의 영향을 줄일 수 있다. 본 발명의 특징들은 상기한 그리고 그 밖의 영향을 최소화하여 성능 및 재현성을 향상시킨다. 플로우셀 내의 이미징이 요망되는 경우, 평면 기판은 광학적으로 투명한 재료를 포함한다. 유리, 플라스틱, 또는 환형 올레핀 폴리머(COP) 또는 환형 올레핀 코폴리머(COC)를 포함하는 폴리머 재료는 이러한 용례의 요건과 양립 가능하다. COP 또는 COC는 정밀 사출 성형을 통해 이용될 수 있다. 사출 성형, 에칭, 레이저 삭박, 기계 가공, 또는 3D 인쇄를 통해 카트리지를 형성할 수 있는 다른 재료가 이용될 수 있다. 평면 기판의 통상적인 치수는 길이가 적어도 50 ㎜, 폭이 20 ㎜, 두께가 적어도 1.5 ㎜일 수 있다. 선택적인 범위는 길이가 적어도 100 ㎜, 폭이 35 ㎜, 두께가 약 2 내지 약 6 ㎜이다. 카트리지의 종방향 측면은 조명 및 이미징을 위한 도파관의 역할을 한다. 이러한 이유로, 처리 채널은 기판의 평면에서 오프셋되어 있으며, 기판의 이미징 종방향 측면에 평행하고 인접해 있다. 이미징 측벽으로부터의 거리는 약 0.5 ㎜ 내지 약 10 ㎜, 바람직하게는 약 0.5 ㎜ 내지 약 5 ㎜, 선택적으로 약 1 ㎜ 내지 약 3.5 ㎜일 수 있다. 일 실시예에서, 이미징 측벽으로부터 처리 채널의 간격은 약 2 ㎜이다. 처리 채널에 대한 채널 치수는 본원에 전술된 실시예들 중의 임의의 것일 수 있다. 처리 채널의 체적은 약 10 μL 내지 약 800 μL, 바람직하게는 약 50 μL 내지 약 600 μL, 선택적으로 100 μL 내지 약 400 μL 또는 약 150 μL 내지 약 300 μL로 구성될 수 있다. 일부 실시예에서, 체적은 적어도 약 150 μL, 적어도 약 200 μL, 적어도 약 250 μL, 또는 적어도 약 300 μL이다. 출구 채널의 통합 체적은 처리 채널의 체적보다 커야 한다. 2개의 출구 채널 사이에서의 유동 체적 분할은 균등 분할일 수 있거나, 또는 약 4:1 내지 약 1:4, 약 3:1 내지 약 1:3, 또는 약 2:1 내지 약 1:2의 범위일 수 있거나, 시스템 실시예에서 작동 시에는 1:1로부터 약 50% 이하, 약 40% 이하, 약 30% 이하, 약 15% 이하만큼 벗어날 수 있다.
본 발명의 플로우셀은 선택적으로 평면 기판 상의 수집 웰을 포함한다. 수집 웰은 출구 채널과 유체 연통하는 입구를 특징으로 하는데, 상기 입구는 제1 웰 높이에 있고, 입구 포트 개구로부터 웰의 바닥으로 전이하는 단차부를 갖게 구성되어 있다. 이는, 샘플 분획부의 웰로의 유동을 위한 전이 표면을 제공하고, 샘플 분획부의 출구 채널로의 역사이펀(back siphoning)과 수집 웰 내에서의 기포 형성을 억제할 수 있다. 수집 웰 내의 출구 채널에는 개구가 마련되어 있는데, 이 개구는 입구 채널의 개구보다 높은 수집 웰의 바닥의 높이에 있다. 내부 출구가 유동 조절기와 연통 관계로 배치될 수 있고, 일부 경우에 유동 조절기는 플로우셀을 통한 유동을 제공하는 개별 펌프이다. 작동 시, 밀폐된 시스템을 제공하여 플로우셀을 통한 샘플 및 샘플 분획부의 유동 또는 펌핑을 제공하도록 수집 웰은 필름 또는 재료의 층으로 밀봉된다. 플로우셀 층들의 조립 시 그리고 접착제가 사용될 때, 생체적합성 접착제를 제공하는 것이 중요하다. 정확한 접착제 선택은, 접착제 성분이 용액에 침출하는 것, 용액으로부터의 결합 분자 또는 세포에 들러붙는 것, 자가 형광성이 되는 것, 표면적을 그리고 이에 따라 세포에 대한 영향을 증가시키는 텍스처를 갖는 것, 및 지나치게 친수성 또는 소수성이 되는 것을 최소화하거나 방지하는 데 필요하다. 바람직한 접착제는 실리콘 또는 실리콘-기반 접착제이다.
Ⅶ. 세포 분리 시스템
본 발명의 세포 분리 시스템은, 플로우셀 카트리지를 유지하기 위한 수용 블록과, 광학 센서, 렌즈 및 조명원을 포함하는 광학 시스템, 그리고 복수의 유동 조절 구성요소를 포함하고, 상기 수용 블록은 상기 광학 시스템과 광학 정렬 관계로 상기 플로우셀 카트리지를 분리 가능하게 배치하고, 상기 플로우셀의 처리 채널에 인접하게 자기 구성요소를 분리 가능하게 결합하며, 상기 복수의 유동 조절 구성요소와 유체 연통 관계로 상기 플로우셀 카트리지의 복수의 출구 채널을 분리 가능하게 배치한다. 광학 시스템은 전술한 플로우셀 카트리지의 처리 채널의 현미경 이미징을 제공하도록 구성된다. 선택적으로, 광학 시스템은 선택적인 자외선 여기 장치 모듈로 형광 방출물에 대한 이미징을 제공하도록 구성 및 배열된다. 광학 시스템은 평면 기판 내의 처리 채널을 통한 광 투과를 제공하도록 구성 및 배열된 가시 광 조명원을 포함할 수 있다. 이미징 광학기기들이 평면 카트리지의 이미징 측면과 정렬되고 가시광 방출기가 평면형 플로우셀 카트리지의 조명 측면을 조명하는 배향의 관계에 있게 하기 위하여, 수용 블록은 평면형 플로우셀 카트리지를 광학 시스템에 대한 배향의 관계로 유지하도록 구성 및 배열된다. 선택적으로 광학 시스템은, 카트리지용 처리 채널 내의 형광체를 여기하도록 평면 카트리지의 이미징 측면에 대해 각을 이루는 배향의 관계로, 선택적으로는 474 ㎚ 및/또는 560 ㎚ 파장의, 자외선 조명을 배치하도록 구성 및 배열된 하나 이상의 자외선 조명원을 추가적으로 포함할 수 있다.
처리 채널 내부의 형광 개체의 이미징을 위해, 광학 시스템은 바람직하게는 약 524 ㎚ 및 628 ㎚ 파장에 중심이 맞춰진 대역의 방출 광선을 통과시키는 듀얼 대역 통과 필터를 선택적으로 포함한다.
수용 블록의 선택적인 특징부는, 플로우셀 카트리지의 상부 또는 하부에 있는 출구와 접하는 일련의 유동 조절기 어댑터이다. 어댑터는 시스템의 펌프와 같은 유동 조절기와의, 또는 수집 웰 출구 채널과 같은 플로우셀의 출구 채널과의 유체 연통을 용이하게 한다. 일단 플로우셀 카트리지가 수용 블록에 삽입되면, 수용 블록은 카트리지를 지지하도록 기계적으로 작동되어, 평면 카트리지의 조명 측면 및 이미징 측면을 광학 이미징 시스템과 정렬하고, 자기 구성요소를 플로우셀 처리 채널 위아래 위치에 정렬하며, 요망되는 경우에는 유동 조절기 어댑터를 플로우셀 카트리지의 대응 출구 채널과 유체 연통 관계로 배치한다.
시스템의 유동 조절기는 플로우셀 카트리지 내의 샘플 및 샘플 분획부에 유동을 제공한다. 유동 조절기에 의해 제공되는 유량은 분리 동안에 최저 분당 1 μL에서 최고 분당 1 mL까지의 범위일 수 있다. 유량은 분당 약 25 μL 이상, 분당 약 50 μL 이상, 분당 약 100 μL 이상, 분당 약 200 μL 이상, 분당 약 250 μL 이상, 분당 약 300 μL 이상, 또는 분당 약 300 μL 내지 분당 약 1 mL일 수 있다. 총 샘플 체적 유량은 약 50 μL/min, 약 75 μL/min, 약 100 μL/min, 약 150 μL/min, 약 200 μL/min 또는 약 300 μL/min일 수 있다. 2개의 출구 채널 사이에서의 유동 체적 분할은 균등 분할일 수 있거나, 또는 약 4:1 내지 약 1:4, 약 3:1 내지 약 1:3, 또는 약 2:1 내지 약 1:2의 범위일 수 있거나, 시스템 실시예에서 작동 시에는 1:1로부터 약 50% 이하, 약 40% 이하, 약 30% 이하, 약 15% 이하만큼 벗어날 수 있다.
시스템의 자기 구성요소는 전술한 바와 같은 재료, 크기 및 강도를 포함할 수 있고, 위에 그리고 아래에 기술된 바와 같은 구성으로 배치될 수 있다.
Ⅷ. 셀과 핵 분리 및 단리
생세포 및 사세포의 혼합물을 분리하는 방법은, 처리 채널과 복수의 출구 채널을 포함하는 상기한 실시예의 플로우셀 카트리지와 같은 플로우셀 카트리지로서, 플로우셀 카트리지의 출구 채널의 통합 체적은 처리 채널보다 큰 체적인 것인 플로우셀 카트리지를 제공하는 단계, 생세포와 사세포를 포함하는 샘플 용액과 상자성 화합물을 처리 채널로 유동시키는 단계, 실질적으로 처리 채널에 평행하게 정렬된 자기장에 플로우셀 카트리지를 배치하는 단계, 처리 채널 내에서 생세포와 사세포를 수직 거리를 두고 분리하기에 충분한 기간 동안 흐름 정지 조건으로 처리 채널과 처리 채널 안의 샘플을 완전히 자기장 내에 유지하는 단계, 및 생세포가 농후한 샘플 분획부와 사세포가 농후한 샘플 분획부를 출구 채널로 동시에 인출하는 단계를 포함한다. 선택적으로 상기 방법은, 샘플 용액을 도입하기 전에 액체 또는 상자성 화합물이 실질적으로 없는 플로우셀 카트리지를 제공하는 단계를 추가적으로 포함한다.
본 발명의 방법에 사용되는 플로우셀 카트리지는, 처리 채널의 단면적보다 작은 단면적을 갖고 촘촘한 경로를 추종하도록 배치되는 출구 채널을 포함할 수 있는데, 출구 채널의 어느 한 예시적인 구성은 사행형 채널이다. 자기장은 처리 채널의 상단 수직면에 인접하고 처리 채널의 하단 수직면에 인접하게 배치되고, 각각의 자기장은 유사한 강도를 갖고 약 0.5 테슬라 내지 약 2.0 테슬라 그리고 선택적으로 약 0.9 테슬라 내지 약 1 테슬라의 표면 자계 강도를 갖는다. 표면 자계 강도는 약 0.5 테슬라, 약 0.6 테슬라, 약 0.7 테슬라, 약 0.8 테슬라, 약 0.9 테슬라 또는 약 1.0 테슬라일 수 있다.
상기 방법은, 약 50 mM 내지 약 200 mM, 선택적으로 약 65 mM 내지 약 175 mM, 그리고 더 선택적으로 약 70 mM 내지 약 150 mM의 농도로 샘플 용액에 상자성 화합물을 제공하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 농도는 약 70 mM, 약 75 mM, 약 80 mM, 약 90 mM, 약 100 mM, 약 110 mM, 약 120 mM, 약 130 mM, 약 140 mM, 약 150 mM, 약 160 mM, 약 170 mM, 약 180 mM, 약 190 mM 또는 약 200 mM일 수 있다.
상기 방법은, 분당 약 75 μL 내지 분당 약 150 μL, 그리고 선택적으로 분당 약 75 μL, 분당 약 90 μL, 분당 약 100 μL, 분당 약 110 μL, 분당 약 120 μL 또는 분당 약 150 μL의 유량으로 샘플 분획부를 출구 채널로 인출하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 방법은 생세포 분획부의 뛰어난 회수율 및 순도를 가져다 준다. 농후한 회수 샘플 분획부는 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80% 또는 적어도 약 90%의 생세포를 포함하고, 농후한 회수 샘플 분획부에서의 생세포의 수율은 샘플의 총 생세포 조성의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75%이다.
서로 다른 플로우셀 구성을 갖는 서로 다른 기구에서 살아있는 Jurkat 세포와 죽은 Jurkat 세포를 분리하는 실험을 수행하였다. 죽은 Jurkat 세포의 군집은 새로운 Jurkat 세포를 70% 에탄올로 처리함으로써 생성되었다. 에탄올을 제거하고 배지 내의 사세포를 세척한 후, 사세포를 원래의 생세포 군집에 다시 혼합함으로써, 혼합 군집이 만들어졌다. 이러한 최종 혼합물에서 사세포의 농도는 약 20%이었다. 각각의 기구 구성에 대해 최적화된 조건을 사용하여 본원에 기술된 플로우셀 및 시스템을 사용해 세포 혼합물의 분취부를 분리하였다. 도 25의 (a) 및 (b)는 본원에 기술된 방법에 의해 얻어지는 생세포 분획부의 생존율과 생세포 수율을 보여준다. 본원에 기술된 방법에 의해 다양한 세포 타입에 효율적인 생세포 분리를 제공하는 능력이 도 2의 (a)와 도 26의 (b)에 입증되어 있다. 생세포 분리 및 농후화는 1차 세포, 인간과 동물의 조직으로부터 단리된 1차 세포, 종양으로부터 해리된 세포, 배향된 세포, 및 본원에 기술된 바와 같은 그 밖의 세포에서 수행되었다.
핵 또는 입자의 단리는 FACS 또는 세척/원심분리와 같은 다른 세척 및/또는 분리 기술과 관련된 응력을 핵에 가하지 않고서 신속하게 달성된다. 핵의 신속 단리는, 세포 핵을 포함하는 샘플과 상자성 화합물 또는 강자성 유체를 포함하는 샘플 배지를 분리 채널에 장입하는 단계, 분리에 영향을 미치도록 적어도 하나의 자석으로 샘플에 자기력을 가하는 단계, 세포 핵을 포함하는 분리된 샘플의 적어도 하나의 분획부를 추가적인 원심분리 없이 수집하는 단계, 및 선택적으로 분리 이전, 분리 동안, 및/또는 분리 이후에 샘플의 핵을 이미징하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수행된다. 이러한 방법에서, 샘플은 약 50개 내지 약 10,000,000개의 핵을 포함할 수 있다. 분리를 위한 총 시간은 약 1분 내지 약 20분의 범위일 수 있다. 신속 분리 방법에서, 관심 세포 핵의 농도는 용액에서 또는 용액의 일부분 내에서 적어도 약 100:1, 90:1, 80:1, 70:1, 60:1, 50:1, 40:1, 30:1, 20:1, 10:1, 5:1, 3:1, 2:1, 1.5:1 또는 1.1:1의 비만큼 증가된다. 복수 타입의 입자를 함유하는 용액 내의 세포 핵은, 용액을 처리한 후에, 다른 타입의 입자의 농도에 대한 관심 세포 핵의 비율이 증가되는 경우, 또는 다른 타입의 입자의 농도에 대한 세포 핵의 농도의 비율이 적어도 약 10%, 50%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900% 또는 1000% 증가되는 경우, 또는 용액에 있어서의 비핵 입자의 농도가 적어도 약 20%, 15%, 10%, 8%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 0.5% 감소되는 경우에, "분리된" 것으로 간주될 수 있다. 세포 핵 농후화 방법의 바람직한 실시예에서, 샘플의 농후화된 수집 부분에 있어서의 단리된 세포 핵의 무결성은 원심분리를 포함하는 방법에 의해 단리된 유사한 세포 핵의 무결성의 30%보다 크다. 바람직하게는, 샘플의 농후화된 수집 부분에 있어서의 단리된 세포 핵의 무결성은 원심분리를 포함하는 방법에 의해 단리된 유사한 세포 핵의 무결성의 적어도 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 또는 99%이다. 무결성은 단리된 핵 내에서 상당 비율의 DNA 및 RNA를 보유하는 것을 초래하는 핵 멤브레인의 무결성으로 정의된다. 출발 샘플은 약 50 내지 약 10,000,000개의 세포 핵, 약 500 내지 약 10,000,000개, 약 2,000 내지 10,000,000개, 약 10,000 내지 약 10,000,000개, 약 25,000 내지 약 10,000,000개, 약 50,000 내지 약 10,000,000개, 약 75,000 내지 약 10,000,000개, 약 100,000 내지 약 10,000,000개, 약 150,000 내지 약 10,000,000개, 약 200,000 내지 약 10,000,000개, 또는 약 500,000 내지 약 10,000,000개의 입자를 포함할 수 있다. 분리된 입자의 분획부를 분리하고 수집하는 시간은 20분 이하, 18분 이하, 15분 이하, 12분 이하, 10분 이하, 8분 이하, 5분 이하, 3분 이하, 1분 이하일 수 있다. 상기 방법에 의해 분리되는 세포 핵 타입은 인간 세포, 비인간 동물 세포, 식물 세포, 진핵 세포(예를 들어 면역 세포, 내피 세포, 효모 및 T-세포이지만 이에 제한되지 않음)를 포함할 수 있다. 단리된 핵은 적출 세포의 단핵, 이핵, 다핵으로부터의 것일 수 있다. 복수의 셀 타입은 사세포, 생세포, 건강한 세포, 병리학적 세포, 감염된 세포, 핵산전달 감염된 세포, 또는 유전자 변형된 세포를 포함할 수 있다. 본 개시의 방법에 따라 단리된 세포 핵은 유기체로부터, 또는 번식된 또는 배양된 세포로부터 직접적으로 획득될 수 있다. 신속 고용량 분리 방법의 특정 실시예에서, 생세포는 사세포로부터 분리된다. 단리 방법의 다른 실시예에서, 핵은 생존 가능한 핵산전달 감염된 세포 및/또는 크리스퍼 변형된 또는 다른 방식으로 유전자-편집된 세포로부터 단리된다. 상기 방법의 다른 실시예에서, 세포 핵은 세포, 세포 단편, 및/또는 샘플 파편으로부터 분리된다. 다양한 실시예에서, 상기한 방법들은 본원에 기술된 카트리지 및 시스템을 이용하여 수행된다.
예 1 - 급속-냉동된 폐와 뇌 조직으로부터의 핵의 단리
Nuclei Lysis Buffer(ThermoFisher)로 30분 동안 얼음 상에서 배양함으로써, 핵을 급속-능동된 폐와 뇌 조직으로부터 단리하였다. 그 후에, Nuclei Storage Buffer(1M 수크로오스 포함)에서 재현탁하기 전에, 핵을 0.1% BSA 함유 PBS로 2회 세척하였다. Nuclei Storage Buffer에 수크로오스를 사용하는 것이 핵의 저장을 촉진하는 데 유리하다는 것이 본 발명에 따라 드러났다. 100 mM 부상제를 함유하는 Levitation Buffer에 3e5 핵을 재현탁함으로써 핵을 분리를 위해 준비하였다. 분리 이후에 비교를 위해 샘플을 따로 두었다. 30분 평형 기간을 이용하여 본원에 기술된 바와 같은 분리기 장치(캘리포니아 먼로 파크 소재의 LevitasBio Inc.에서 시판하는 LeviCell)에서 핵을 분리하였다. 출력물을 PI로 착색하고 Echo 현미경을 사용하여 이미징하였다.
핵은 PI로 밝게 착색되지만 세포 파편은 그렇지 않다. LeviCell에서의 착색된 입력물과 출력물의 이미지는 두 조직 샘플 모두에서 미착색 파편의 양의 현저한 감소를 보여준다. 폐 조직이 뇌 조직보다 더 많은 파편을 생성하였지만(도 27의 A 및 C), LeviCell로 분류한 이후에는 두 샘플 모두 파편의 뚜렷한 감소를 보여준다(도 27의 B 및 D).
Jurkat 세포로부터 유래된 분류되지 않은 핵(도 28의 A)과 분류된 핵(도 28의 B)의 흐름 세포 측정 분석이 도시되어 있다. Sony SH800S 분류기에서 분석하기 전에 샘플을 PI와 CellBrite Fix Green으로 15분 동안 실온에서 착색하였다. 분류 이후에 파편과 사세포 군집 모두가 감소되고 핵 군집은 농후화된다(50.81%에서 63.57%로). 추가적으로, 싱글렛 핵 군집은 28.28%에서 43.98%로 농후화된다.
예 2 - Jurkat 세포로부터 핵의 단리
Jurkat 세포(ATCC# TIB-152)를 수일 동안 배지의 교체 없이 숙성시켜 세포의 노화 및 세포 사멸을 유발하였다. 이들 세포를 Nexcelom Spectrum 셀로미터(cellometer)에서 AO/PI를 사용하여 수집 및 계수하였다. 이들 세포의 일부는 총 RNA 입력 제어를 위해 유지되었다. 약 50% 생존율의 8백만 세포로부터의 핵을, RNAse Out RNAse 억제제(Thermo)를 함유하는 핵 EZ 용해 버퍼(sigma)를 사용하여 추출하였다. 100 mM 가돌리늄, 1X PBS, 1% BSA 및 RNAse Out을 함유하는 부상 버퍼에서 핵은 0.2 U/ul로 펠릿화되고 재현탁되었다 - 이 샘플을 이제 입력물이라 한다. 백만개의 추출된 핵이 LeviCell 시스템에서 30' 동안 부상되었다. 핵은 LeviCell 카트리지의 하부 채널로부터, 그리고 이전 단계에서 추출된 핵(입력물)과 병행하여 수집되었고, 초기 샘플에서부터 유지된 전세포는 RNEasy prep 미니 키트(Qiagen)를 사용하여 총 RNA에 대해 처리되었다. 총 RNA를 정규화하고 총 RNA의 10 ng은 gDNA 이레이저 키트(Takara)와 Primescript Rt를 이용하여 cDNA를 만드는 데 사용되었다. 18S, SCARNA5 및 SNHG6을 표적으로 하는 사전 설계 및 검증된 primetime qPCR 프로브 분석(IDT)은 5 μl 2x Primetime 유전자 발현 마스터 믹스(IDT) 및 200 pg 당량의 cDNA를 함유하는 10 μl 반응 체적에서 다중화되었다. 3중 반응은 Quantstudio5 (Thermo) 기구에서 증폭되었다. 증폭 데이터는 ΔΔCT 방법을 사용하여 분석되었고, 18S 내인성 대조군으로 정규화되고 전세포 RNA와 비교된 상대적인 양으로 보고된다.
결과: 도 29에 도시된 바와 같이, LeviCell 시스템에서 처리된 핵은 핵 특정 타겟(SCARNA5)에 대해 보다 고도로 농후화되었고 입력 핵에 비해 오염 세포질 타겟(SNHG6)이 더 적었다. LeviCell 시스템에서 처리된 핵은 전세포에 비해 핵 특정 신호에 대하여 거의 3배 농후화를 나타냈지만, 세포질 타겟의 농후화는 나타나지 않았다. 부상된 샘플은 또한, 입력 핵에 비해 50% 더 큰 핵 특정 신호의 농후화를 나타내었다. 이에 비해, 입력 핵은, 전세포 RNA와 비교할 때, 핵 의존성 타겟 신호의 농후화가 더 적고 오염 세포질 RNA의 양이 더 큰 것을 보여주었다. 이러한 데이터는, 일상적인 방법으로 추출된 핵과 비교할 때, LeviCell 시스템에서 핵의 부상이 핵 및 핵 특정 RNA의 농후화를 가능하게 한다는 것을 보여준다.
Ⅸ. 개시된 실시예는 비제한적임
본 발명의 다양한 실시예가 본원에 도시 및 기술되어 있지만, 이러한 실시예는 단지 예로서 제공된다는 것이 강조된다. 본 발명의 다양한 실시예에서 본 발명으로부터 벗어남이 없이 수많은 변형, 변경 및 대체가 실시될 수 있다. 구체적으로, 임의의 범위가 본원에 기술된 경우, 달리 명확하게 언급되지 않는 한, 해당 범위는 그 안의 모든 값 및 그 안의 모든 하위 범위를 포함한다.
또한, 보다 일반적으로, 본원의 개시, 논의, 예 및 실시예에 따르면, 당해 기술분야의 기술 내에서 통상적인 유체학, 분자 생물학, 세포 생물학, 미생물학 및 재조합 DNA 기술이 이용될 수 있다. 본원에 참조로 원용된 리소스는 그 안에 있는 각각의 내용 및 교시에 대한 것이다. 이러한 원용은, 최소한, 본원에서 참조문헌을 인용할 때 언급될 수 있는 특정 교시 및/또는 다른 목적에 대한 것이다. 특정 교시 및/또는 다른 목적이 그렇게 언급되지 않은 경우, 공개된 리소스는 참조문헌의 제목, 초록 및/또는 요약 중 하나 이상에 의해 나타내어진 교시(들)에 대해 구체적으로 원용된다. 이러한 구체적으로 식별된 교시 및/또는 다른 목적이 그렇게 관련이 없을 수 있는 경우, 본 발명이 속하는 최신 기술을 보다 완전하게 설명하고, 및/또는 적용 가능할 수 있는 바와 같이 당업자에게 일반적으로 알려진 이러한 교시를 제공하기 위해 공개된 리소스가 원용된다. 그러나, 본원에서의 공개된 리소스의 인용은 이러한 것이 본 발명에 대한 종래 기술임을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다는 것이 구체적으로 언급되어 있다. 또한, 정의된 용어, 용어 사용, 설명된 기술 등을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아닌 원용된 공개 리소스 중 하나 이상이 본 출원과 상이하거나 모순되는 경우, 본 출원은 바람직한 실시예로서 대조하며, 임의의 모순은 대안적인 실시예로서 볼 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예가 본원에 도시 및 기술되어 있지만, 이러한 실시예들은 단지 예로서 제공된다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명으로부터 벗어남이 없이 수많은 변형, 변경 및 대체가 이제 당업자에게 떠오를 것이다. 본원에 기술되는 본 발명의 실시예들에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는 데 이용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.

Claims (22)

  1. 세포 핵의 단리 방법으로서,
    세포 핵을 포함하는 샘플 및 상자성 화합물 또는 강자성 유체를 포함하는 샘플 배지를 분리 채널에 장입하는 단계;
    분리에 영향을 미치도록 적어도 하나의 자석으로 샘플에 자기력을 가하는 단계;
    세포 핵을 포함하는 분리된 샘플의 적어도 하나의 분획부를 추가적인 원심분리 없이 수집하는 단계; 및
    선택적으로 분리 이전, 분리 동안, 및/또는 분리 이후에 샘플의 핵을 이미징하는 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 샘플은 약 50개 내지 약 10,000,000개의 세포 핵을 포함하는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 샘플은 생세포, 사세포 또는 세포 파편을 추가적으로 포함하는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 분획부에 있어서의 세포 핵의 농도는 원래의 샘플로부터 적어도 1.1:1만큼 증가되는 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 원래의 샘플에 있어서의 비핵 입자의 농도는 분획부에서 적어도 약 1%만큼 감소되는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플로부터의 분획부에 있어서의 단리된 세포 핵의 무결성이, 원심분리를 포함하는 방법에 의해 샘플로부터의 분획부에서 단리된 세포 핵의 무결성보다 적어도 약 30% 더 큰 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 핵은 인간 세포, 비인간 동물 세포 또는 식물 세포로부터 단리되는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 핵은 건강한 세포, 병든 세포, 감염된 세포, 핵산전달 감염된 세포, 또는 유전자 변형된 세포로부터 단리되는 것인 방법.
  9. 생세포 및/또는 세포 핵, 사세포 및 핵 파편을 포함하는 혼합물로부터 생세포 및/또는 세포 핵을 분리하는 방법으로서:
    A) 유체 샘플 처리 장치로서,
    (i) 처리 채널,
    (ⅱ) 입구 채널,
    (ⅲ) 상기 입구 채널을 상기 처리 채널에 연결하는 입구 연결 영역,
    (ⅳ) 상기 처리 채널의 상부측 및 하부측에서 상기 처리 채널의 X-축을 따라 정렬된 복수의 자기 구성요소,
    (v) 복수의 출구 채널,
    (ⅵ) 상기 처리 채널을 상기 출구 채널에 연결하는 출구 연결 영역,
    (ⅶ) 출구 연결 영역에서 상기 처리 채널의 상부 영역과 유체 연통하는 제1 출구 채널,
    (ⅷ) 출구 연결 영역에서 상기 처리 채널의 하부 영역과 유체 연통하는 제2 출구 채널, 및
    (ⅸ) 제1 출구 채널과 연관된 제1 유동 조절기 및 제2 출구 채널과 연관된 제2 유동 조절기를 포함하는 유체 샘플 처리 장치를 제공하는 단계; 및
    B) 상기 생세포 및/또는 세포 핵이 농후한 제1 회수 샘플 및 상기 생세포 및/또는 세포 핵이 고갈된 제2 회수 샘플을 제공하도록 상기 혼합물을 상기 유체 샘플 처리 장치를 통해 유동시키는 단계
    를 포함하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 제1 회수 샘플은 세포 핵이 농후한 것인 방법.
  11. 제9항에 있어서, 제1 회수 샘플은 생세포가 농후한 것인 방법.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 제1 회수 샘플에 있어서의 생세포의 수율은 혼합물의 총 생세포 조성의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75%이고; 및/또는
    b) 제1 회수 샘플에 있어서의 핵의 수율은 혼합물의 생세포 조성에서의 총 핵의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75%인 것인 방법.
  13. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 출구 연결 영역은 유동 스트림 스플리터 부분을 더 포함하는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 유동 스트림 스플리터 부분은 상기 처리 채널 내로 돌출되고 유동 스트림을 출구 채널에 있어서의 개별 스트림으로 분리하도록 구성 및 배열되는 것인 방법.
  15. 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유체 샘플 처리 장치는 제1 출구 채널과 연관된 제1 유량 센서 및 제2 출구 채널과 연관된 제2 유량 센서를 더 포함하는 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 유량 센서가 유동 조절기에 작동 가능하게 연결되는 것인 방법.
  17. 제9항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유체 샘플 처리 장치는 광학 센서와, 상기 광학 센서에 대향하거나 상기 광학 센서에 각도적으로 인접하게 구성된 조명원을 더 포함하는 것이고; 선택적으로 상기 조명원은 자외선을 방출하는 것인 방법.
  18. 제9항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    광검출기, 다중 픽셀 이미징 검출기, 자기장 검출기, 전기화학적 검출기, 광학 위상 검출기, 산란 검출기, 홀 센서, 자기저항 센서, 볼로메트릭 센서, 표면 탄성파 센서, 바이오센서, 용량성 센서, 전도성 센서, 열 센서, 유량 센서, 초음파 센서, 중량 센서, 자기장 센서 또는 이들의 조합인 것인 센서; 및
    복수의 유동 조절기에 작동 가능하게 연결된 제어기를 포함하는 방법.
  19. 제9항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유체 샘플 처리 장치는 평면 기판을 포함하는 플로우셀 카트리지를 포함하고, 상기 평면 기판은:
    (i) 상부 표면과 하부 표면;
    (ⅱ) 이미징 표면을 형성하는 제1 종방향 측면;
    (ⅲ) 조명 표면을 형성하는 제2 종방향 측면;
    (ⅳ) 제1 및 제2 횡방향 측면;
    (v) 상부 표면 상의 입구 웰;
    (ⅵ) 입구 채널;
    (ⅶ) 입구 채널과 유체 연통하고 종방향 측면에 실질적으로 평행하게 배치되는 샘플 처리 채널;
    (ⅷ) 상기 처리 채널 내의 샘플 스플리터;
    (ⅸ) 상기 처리 채널과 유체 연통하는 복수의 출구 채널; 및
    (ⅹ) 복수의 출구 채널 각각과 유체 연통하는 복수의 수집 웰을 포함하며;
    상기 기판은 광학적으로 투명한 재료를 선택적으로 포함하고, 상기 처리 채널은 공간적으로 상기 이미징 표면에 편향되도록 기판의 평면 내에서 오프셋되는 것인 방법.
  20. 제9항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유체 샘플 처리 장치는 평면 기판을 포함하는 플로우셀 카트리지를 포함하고, 상기 평면 기판은:
    (i) 상부 표면 상의 입구 웰;
    (ⅱ) 입구 채널;
    (ⅲ) 샘플 처리 채널;
    (ⅳ) 상기 처리 채널 내의 샘플 스플리터;
    (v) 상기 처리 채널과 유체 연통하는 복수의 출구 채널; 및
    (ⅵ) 복수의 출구 채널 각각과 유체 연통하는 복수의 수집 웰을 포함하며;
    상기 기판은 광학적으로 투명한 재료를 포함하고, 상기 복수의 출구 채널 각각의 통합 체적은 처리 채널의 체적보다 큰 것인 방법.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 플로우셀 카트리지의 출구 채널은 촘촘한 경로를 추종하고, 예를 들어 출구 채널은 사행형 채널인 것인 방법.
  22. 생세포 및/또는 세포 핵, 사세포 및 핵 파편을 포함하는 혼합물로부터 생세포 및/또는 세포 핵을 분리하는 방법으로서,
    처리 채널과 복수의 출구 채널을 포함하는 플로우셀 카트리지로서, 플로우셀 카트리지의 출구 채널은 처리 채널보다 큰 체적을 갖는 것인 플로우셀 카트리지를 제공하는 단계;
    생세포 및 사세포를 포함하는 샘플 용액과 상자성 화합물을 처리 채널로 유동시키는 단계;
    실질적으로 처리 채널에 평행하게 정렬된 자기장에 플로우셀 카트리지를 배치하는 단계;
    처리 채널 내에서 생세포와 사세포를 수직 거리를 두고 분리하기에 충분한 기간 동안 흐름 정지 조건으로 처리 채널과 처리 채널 안의 샘플을 완전히 자기장 내에 유지하는 단계; 및
    생세포 및/또는 세포 핵이 농후한 샘플 분획부와 사세포 및 핵 파편이 농후한 샘플 분획부를 출구 채널로 동시에 인출하는 단계
    를 포함하는 방법.
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