WO2013077391A1 - 試料分析チップ並びに試料分析方法及び遺伝子解析方法 - Google Patents

試料分析チップ並びに試料分析方法及び遺伝子解析方法 Download PDF

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WO2013077391A1
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小澤　知之
朋子 岸本
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凸版印刷株式会社
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    • B01L7/00—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices
    • B01L7/52—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples

Definitions

  • the present invention relates to a sample analysis chip, a sample analysis method, and a gene analysis method.
  • This application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2011-257824 for which it applied on November 25, 2011, and uses the content here.
  • reaction apparatuses for processing a small amount of sample solution.
  • This is a single chip or cartridge provided with a plurality of reaction chambers (hereinafter referred to as wells) and channels, and can analyze a plurality of specimens or perform a plurality of reactions.
  • the merit is, for example, that the amount of strong acid and strong alkali chemicals that have been used in the past is very small, so that the impact on the human body and the environment is significantly reduced, and the expensive used for biochemical reactions, etc. Since the consumption of reagents is very small, the cost for analysis and reaction can be reduced.
  • Patent Document 1 in a chip that sends liquid from a liquid reservoir to a well using centrifugal force, the flow path is deformed and sealed in order to make the well independent.
  • Patent Document 2 variation in the amount of liquid fed to each well is solved by interweaving rotation + revolution of the centrifugation method.
  • Patent Document 3 an analysis medium in which a plurality of wells each having a liquid reservoir and a channel extending in the centrifugal direction are connected is disclosed.
  • this document does not pay attention to the liquid distribution and the like. In other words, it is disclosed that the fluid is controlled by pressing against air clogged in the well.
  • Patent Document 1 requires a mechanism for crushing the flow path and is difficult to automate.
  • the centrifugal liquid feeding is performed from the central liquid reservoir to the surrounding wells as in the conventional centrifugal liquid feeding chip, the liquid feeding amount to each well varies.
  • the present invention has been made in view of the above-described circumstances, and its purpose is that the liquid feeding method is simple and there is little variation in the amount of liquid in each well, and it is suitable for chemical reactions and enzyme reactions by heating and cooling or heating. It is possible to provide a low-cost sample analysis chip.
  • the sample analysis chip according to the first aspect of the present invention includes a base material, a plurality of wells provided on the base material, and the plurality of wells provided in the base material at positions closer to the center of rotation than the plurality of wells.
  • An air vent passage that is opened, and a flow path that is provided in the base material and is connected to the plurality of wells.
  • the sample analysis chip is characterized in that the solution in the main channel is moved into the well as the substrate rotates around the rotation center.
  • the flow path is formed in a groove shape on the base material, and further includes a sealing member that is fixed to the base material and seals the flow path.
  • the other end of the solution supply path and the other end of the air vent path are open to the atmosphere on the surface opposite to the surface on which the flow path is formed.
  • an area of a cross section orthogonal to the flow direction of the solution in the second buffer portion is larger than an area of a cross section orthogonal to the flow direction of the solution in the main channel.
  • the volume of the second buffer part is preferably larger than the volume of the main channel.
  • the volume of the second buffer unit is larger than the volume of the first buffer unit, and the sum of the volume of the first buffer unit and the volume of the second buffer unit is larger than the volume of the main flow path. It is preferable.
  • it is a wall shape surrounding the other end of the solution supply path and the other end of the air vent passage, and after the solution is injected into the flow path, the other end of the solution supply path and the other end of the air vent path It is preferable to have a lip portion that can be deformed by an apparatus or a jig intended to close the flow path and keep the flow path in a sealed state.
  • the main flow path is formed by meandering having a peak portion located on the rotation center side of the base material and a valley portion located on the well side with respect to the peak portion, Is preferably in communication with the valley.
  • the width of the main channel is relatively small at the peak and large at the valley.
  • the mountain portion may have an asymmetric shape on one side and the other side sandwiching the apex of the mountain portion.
  • the base material has a disc shape, and the plurality of wells are arranged concentrically with the base material.
  • a support for rotating the substrate and feeding the solution by centrifugal force is provided on the substrate.
  • the said support part in the outer peripheral part of the said base material.
  • the base material is provided with a position detection structure for detecting the position and angle of each well before and after centrifugation around the rotation center. It is preferable that the position detection structure has a mechanically detected portion including a notch, a hole, or a protrusion. Alternatively, the position detection structure includes an optically detected portion, and the surface roughness or optical characteristic of the optically detected portion is a surface of a portion of the substrate where the optically detected portion is not provided. It is preferably different from roughness or optical properties.
  • each of the plurality of side paths is formed to be inclined with respect to a straight line connecting a well connected to the side path among the plurality of wells and a rotation center of the base material.
  • the main channel may be formed to be inclined with respect to the rotation center direction.
  • the sample analysis chip preferably includes a first base material on which the plurality of wells and the flow path are formed, and a second base material bonded to the first base material.
  • At least one of the first base material and the second base material is formed of a light transmissive material.
  • the first base material is a light-transmitting resin material and the second base material is a metal material.
  • the sample analysis method of the second aspect of the present invention is a sample analysis method using the sample analysis chip of the present invention, the step of injecting the solution into the main flow path, and rotating the base material to remove the solution. Distributing the liquid to each of the wells.
  • the sample analysis method of the present invention is used for the gene analysis method of the third aspect of the present invention.
  • the liquid feeding method is simple and the liquid amount variation of each well is small, and chemical reaction and enzyme reaction by heating and cooling or heating can be suitably performed, and Low cost can be realized.
  • analysis with high analysis accuracy and reproducibility can be performed.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view taken along line AA in FIG. It is a typical sectional view of the sample analysis chip. It is a top view of the sample analysis chip
  • FIG. 6 is a development view in which the sample analysis chip is developed along the distribution path shown in FIG. 5. It is explanatory drawing for demonstrating the effect
  • FIG. 1 is a plan view showing a uniform state of the sample analysis chip of the present embodiment.
  • FIG. 2 is an exploded perspective view showing a uniform state of the structure of the sample analysis chip of the present embodiment.
  • the sample analysis chip 1 includes a base material 101 and a second base material 120, a plurality of wells 102 provided in the base material 101, and a flow path (for supplying a solution to the well 102 ( Main passage 103 and side passage 105).
  • the sample analysis chip 1 is formed in a disc shape as a whole, and is rotated by an analysis device (not shown) with the center point of the disc as the center of rotation.
  • the main channel 103 and the side channel 105 are arranged closer to the center point than the plurality of wells 102. As the sample analysis chip 1 is rotated, the solution in the main channel 103 moves to each well 102 by centrifugal force.
  • a first buffer unit 110 capable of accommodating a part of the solution supplied to the main channel 103 is provided at one end of the main channel 103 (main channel first end).
  • the other end of the main channel 103 (main channel second end) is provided with a second buffer unit 111 that can store a part of the solution supplied to the main channel 103.
  • the base material 101 has one end (solution supply path first end) communicating with the first buffer unit 110 and the other end (solution supply path second end) opened to the atmosphere, and one end (air venting).
  • An air vent passage 107b is formed in which the first end of the passage is communicated with the second buffer portion 111 and the other end (the second end of the air vent passage) is opened to the atmosphere.
  • the main channel 103 is formed so as to have one peak portion 103a that protrudes between adjacent wells 102 toward the center point.
  • the adjacent wells 102 mean wells in which the liquid supply flow path from the main flow path 103 to the well 102 moves back and forth.
  • the peak 103a protruding in the direction of the center point means a curved shape having a maximum point in the direction of the center point. In this way, the liquid injected into the main flow path 103 is naturally interrupted at the peak portion 103a when the chip is rotated by forming a single peak between the adjacent wells toward the center point. Variation in the amount of liquid distributed to the well 102 can be reduced.
  • the road width of the main flow path 103 is narrow at the peak portion 103a and wide at the valley portion 103b. Since the liquid distribution variation is smaller when the amount of the solution present in the region corresponding to the peak portion 103a is smaller, the cross-sectional area of the main channel 103 in the peak portion 103a is smaller than the cross-sectional area of other portions. In order to reduce the cross-sectional area of the main channel 103 in the peak part 103a, the channel width of the peak part 103a may be reduced, or the depth of the main channel 103 in the peak part 103a may be reduced. Or you may narrow the flow path width of the peak part 103a, and make the depth of the main flow path 103 in the peak part 103a shallow. In addition, it is preferable that the cross-sectional area of the main flow path 103 gradually decreases as it approaches the peak portion 103a.
  • the amount of liquid distributed to each well 102 can be set by adjusting the width of the valley 103b.
  • the main channel 103 located between the two adjacent crests 103 a functions as a chamber C for distributing a predetermined volume of solution to one well 102.
  • the chamber C formed by the main flow path 103 from the crest 103 a to the adjacent crest 103 a has a one-to-one correspondence with each well 102 and is provided in the same number as the number of wells 102.
  • Each chamber C has the same shape and size, and the volume of each chamber C is equal to each other. Therefore, the solution stored in each chamber C is distributed to each well 102, so that the same amount of solution is equally distributed to each well 102.
  • the side path 105 has a tubular shape that communicates the valley 103 b of the main flow path 103 and the well 102.
  • the side path 105 is a straight line inclined with respect to a straight line connecting the center point and the well 102. Since the side passage 105 is inclined in this way, when centrifugal force is applied, the air in the well 102 moves in the direction of the main flow passage 103 along the inner side of the side passage 105 (inner surface on the center point side). Moves in the direction of the well 102 along the outside of the side path 105 (the inner surface on the well 102 side), so that the solution can be smoothly moved into the well 102.
  • an angle formed by the direction of the center point and the side path 105 is between 10 degrees and 80 degrees. If it is 10 degrees or less, the exhaust from the well 102 and the entry of the solution into the well 102 may interfere and prevent the solution from entering, and if it exceeds 80 degrees, the centrifugal force in the direction of the side path 105 is weak. The solution may not move to the well 102.
  • the connecting point between the well 102 and the main channel 103 that is, the connecting point between the main channel 103 and the side channel 105 is a valley 103 b of the main channel 103.
  • the valley portion 103 b is the farthest distance from the center point between adjacent mountain portions 103 a of the main flow path 103.
  • the communication port between the main channel 103 and the well 102 has a width and a cross-sectional area so that the solution does not enter the well 102 before the chip is rotated.
  • the width and cross-sectional area of the communication port between the main channel 103 and the well 102 are set to suitable sizes based on the size of the surface tension of the solution.
  • the shape of the communication port is preferably a rectangular shape having a height of 2 mm or less and a width of 2 mm or less.
  • the cross-sectional area of the communication port is preferably 4 mm 2 or less.
  • the side passage 105 and the well 102 are connected at a point closest to the center point of the wells 102.
  • the volume of the well 102 is preferably 1 ⁇ l or more and 100 ⁇ l or less. If the volume of the well 102 is smaller than 1 ⁇ l, the centrifugal force does not work sufficiently and the liquid feeding to the well 102 is difficult. If the volume of the well 102 is larger than 100 ⁇ l, there may be a phenomenon that the mixing property of the reagent is lowered or the uniformity of the temperature in the well 102 is lowered.
  • a position detection structure 108 is formed on the outer periphery of the sample analysis chip 1.
  • the position detection structure 108 is formed at one place on the outer periphery of the sample analysis chip 1, and the relationship between the position of the position detection structure 108 and the position of each well 102 is configured to have a predetermined relationship in advance.
  • the position detection structure 108 is formed in the vicinity of the well 102 closest to the first buffer unit 110 in the solution flow direction.
  • the position detection structure 108 is provided on the base material 101 and is used to detect the position and angle of each well before and after the centrifugal process around the rotation center.
  • the position detection structure 108 has a mechanically detected portion made of a notch, a hole, or a protrusion.
  • the position detection structure 108 is a cutout in which a part of the outer periphery of the sample analysis chip 1 is cut into a substantially rectangular shape.
  • the position detection structure 108 may have an optically detected part. In this case, the surface roughness or optical characteristics of the optically detected portion are different from the surface roughness or optical characteristics of the portion where the optically detected portion is not provided in the base material 101.
  • the sample analysis chip 1 The portion where the position detection structure 108 is not provided on the outer periphery of the surface has fine irregularities due to sandblasting, etching, embossing, or the like, and has low light transmittance. Thereby, the position of the position detection structure 108 is easily detected by detecting the degree of light scattering by, for example, an optical sensor or a laser sensor. Further, since the position of the position detection structure 108 can be detected by an optical detection mechanism, the position can be detected in a non-contact state with respect to the sample analysis chip 1.
  • the position detection structure 108 is a notch, mechanical detection using a contact switch can be performed instead of optical detection by an optical sensor or a laser sensor. In this case, although it is not suitable for position detection when the sample analysis chip 1 is rotating at a high speed, an apparatus for detecting the position of the sample analysis chip 1 can be configured at low cost.
  • the carrier 109 is a recess in which a device that rotates the sample analysis chip 1 is locked.
  • the apparatus can hold the sample analysis chip 1 by, for example, engaging a claw member with the holding unit 109.
  • the shape, quantity, and arrangement of the carrier 109 are set according to the configuration of the device.
  • the number of the supporting portions 109 is not limited as long as the supporting portions 109 adjacent in the circumferential direction of the sample analysis chip 1 have an angle of less than 180 degrees with the center point of the sample analysis chip 1 as the center.
  • the supporting portion 109 may be a through-hole penetrating the base material 101 in the thickness direction. In this case, the supporting portion 109 may be two.
  • FIG. 5 is a plan view of the sample analysis chip 1 and shows a solution flow path.
  • FIG. 6 is a development view in which the sample analysis chip 1 is developed along the distribution path shown in FIG.
  • the first buffer unit 110 has a space for holding a part of the solution between the solution supply path 107 a and the main flow path 103.
  • the first buffer unit 110 is formed in a groove shape in the base material 101 and is formed in a channel shape by being sealed by the second base material 120 similarly to the main flow path 103.
  • the volume of the first buffer unit 110 is preferably set according to the amount of expansion when the solution supplied to the sample analysis chip 1 is heated.
  • the 1st buffer part 110 is curving and formed so that the outer side of the storage tank 113 in the 2nd buffer part 111 may be met.
  • the cross-sectional shape orthogonal to the solution flow direction is a quadrangular shape in the present embodiment.
  • the second buffer unit 111 includes a pipe line part 112 having a cross-sectional shape similar to that of the first buffer part 110, and a storage tank 113 communicated with the pipe line part 112.
  • One end of the pipe line portion 112 is in communication with the main flow path 103.
  • the solution flows from the main flow path 103 into the pipe line portion 112.
  • the pipe section 112 is curved along the outside of the storage tank 113, and the distance from the center point of the sample analysis chip 1 to the pipe section 112 is the same as the distance from the center point to the first buffer section 110. equal.
  • the solution located in the duct portion 112 is subjected to a centrifugal force having the same magnitude as the solution located in the first buffer portion 110.
  • the length in the flow direction of the solution in the conduit portion 112 may be shorter than the length in the flow direction of the solution in the first buffer portion 110.
  • the storage tank 113 is formed so that the cross-sectional area orthogonal to the flow direction of the solution is larger than the cross-sectional area in the pipe line portion 112 at the connection portion with the pipe line portion 112. Further, the sum of the volume of the storage tank 113 and the volume of the pipe line portion 112 is larger than the volume of the main flow path 103. In the storage tank 113, a part of the solution in the main flow path 103 and a part of oil to be described later are stored. In addition, the height dimension of the storage tank 113 (the dimension measured in the direction perpendicular to the surface from the surface directed to the base material 101 side in the second base material 120) is the height dimension (the second base material 120).
  • a solution for example, mineral oil
  • a solution having a specific gravity lower than that of the solution flows into the storage tank 113 through the pipe line portion 112 while a solution having a high specific gravity (for example, an aqueous sample solution) is stored in the storage tank 113. Then, the solution having a small specific gravity moves onto the solution having a large specific gravity and covers the solution having a large specific gravity.
  • a base material (first base material) 101 having a well 102 and a flow path (including a main flow path 103 and a side path 105) is formed by molding using a molding die.
  • the base material 101 has a well 102, a main channel 103, a side channel 105, a solution supply channel 107a, an air vent channel 107b, a first buffer unit 110, and a second buffer unit 111 on the first surface in the thickness direction.
  • a groove-like structure is formed.
  • the solution supply path 107 a and the air vent path 107 b are also opened on the second surface in the thickness direction of the substrate 101.
  • a lip portion 115 having a continuous wall shape surrounding the solution supply path 107a and the air vent path 107b is integrally formed on the second surface.
  • both the thermal conductivity and the sealing property of the base material 101 can be preferably satisfied.
  • the thickness of the base material 101 is larger than 300 ⁇ m, the heat capacity becomes large and the thermal responsiveness may be lowered.
  • the material of the base material 101 As the material of the base material 101, a resin having optical transparency can be suitably used. In addition, when optical analysis (fluorescence measurement, colorimetric measurement, etc.) is performed on the solution in the well 102, it is preferable that the substrate 101 has high transparency.
  • the material of the base material 101 is not particularly limited as long as it does not affect the sample. However, if a resin material containing any of polypropylene, polycarbonate, and acrylic is used, good visible light transmission is ensured. can do.
  • polypropylene homopolypropylene or a random copolymer of polypropylene and polyethylene can be used.
  • the copolymer of monomers such as polymethyl methacrylate or methyl methacrylate, and other methacrylic acid ester, acrylic acid ester, styrene, can be used.
  • tip can also be ensured.
  • the material other than the resin material include aluminum, copper, silver, nickel, brass, and gold. When a metal material is used, in addition, it is excellent in thermal conductivity and sealing performance.
  • transparent and “light transmissive” indicate that the total average transmittance in the visible light region (wavelength 350 to 780 nm) when formed is 70% or more.
  • the processing method of the substrate 101 in the case of a resin material, various resin molding methods such as injection molding and vacuum molding, machine cutting, and the like can be used.
  • a metal material it can be formed by grinding or etching using a thick base material, or pressing or drawing a thin metal sheet.
  • the base material 101 when a resin material including any of polypropylene, polycarbonate, and acrylic is used as the base material 101, good light transmittance, heat resistance, and strength can be ensured. Further, when the thickness of the substrate 101 is in the range of 50 ⁇ m to 3 mm, good light transmission, heat resistance, and strength can be ensured, and the recess can be processed reliably.
  • FIG. 3 is a cross-sectional view of the sample analysis chip 1 of the present embodiment.
  • the base material 101 communicates with a solution supply path 107a for a solution penetrating the chip, a main flow path 103 through which the injected solution flows into the chip, and each well extending to the outer periphery of the chip.
  • a side path 105 and a well 102 on the outer periphery of the chip are formed.
  • the cross-sectional view of FIG. 3 schematically shows a path that leads from the solution supply path 107a to the air vent path 107b through the well 102.
  • the shapes of the main channel 103 and the side channel 105 are not limited to the structure shown in FIG.
  • the volume of the main channel 103 needs to be larger than the sum of the volumes of the wells 102.
  • the amount of the liquid sample to be placed in the well 102 is reduced by the amount of the reagent 301. For this reason, you may reduce the volume of the flow path which flows in by the capacity
  • FIG. When the detection measurement in the well 102 is performed via the base material 101 on the base material 101 side for fluorescent reaction or measurement, the concave portion of the well 102 is preferably a flat trapezoid.
  • FIG. 4 is a cross-sectional view of the sample analysis chip 1 of the present embodiment.
  • the reaction reagent 301 is fixed to the well 102. Different reagents can be used in each well. By fixing different reagents in each well 102, a plurality of treatments can be performed on one specimen (sample). Further, a part of the reagent for actually performing the reaction may be fixed to each well, and the remaining reagent may be introduced together with the liquid sample.
  • the disk-shaped second base material 120 is bonded to the first surface of the base material 101 where the groove-like structure is formed (see FIG. 2).
  • the second substrate 120 has a flat plate shape and serves as a lid for the groove formed on the first surface of the substrate 101. By bonding the second base material 120 to the base material 101, the opening of the groove formed in the base material 101 is sealed.
  • the material of the second substrate 120 can be appropriately selected from the materials described above as the material of the substrate 101 and employed.
  • a resin coating layer is provided as an adhesive layer on one base material, and the resin coating layer is melted to bond both base materials.
  • the resin coating layer is preferably provided on a metal material substrate having high thermal conductivity and melt bonded.
  • a resin material such as polyethylene terephthalate (PET), polyacetal, polyester, or polypropylene can be used.
  • a light-transmitting resin material that is easy to finely process and is suitable for fluorescence measurement is used for the base material 101, and is bonded to the base material 101 by melt adhesion.
  • a material that can be easily combined is preferably used for the second substrate 120.
  • a metal material having a high thermal conductivity and having a resin coating layer for fusion bonding can be suitably used as the material of the second base material 120. By forming the resin coating layer on the surface of the metal material, it is not necessary to consider the chemical resistance of the metal material itself when selecting the material.
  • the resin coating layer is formed on the surface of the metal material in the second base material 120, if an anchor layer is formed as a base of the resin coating layer, fusion using a laser is possible.
  • the anchor layer suitable for fusing using a laser is preferably incorporated with carbon black (light absorbing material) that absorbs laser wavelength light. In this case, by irradiating the laser beam, the anchor layer generates heat and the resin coating layer can be melt bonded.
  • carbon black may be added to the resin coating layer, or the surface of the resin coating layer may be painted black.
  • the resin coating layer can be efficiently melted by irradiating light of an infrared photodiode laser having a wavelength of about 900 nm.
  • Laser welding unlike thermal welding, does not require heating of the entire sample analysis chip 1, and therefore has little effect on the sample analysis chip 1 and the reagent fixed to the sample analysis chip 1, and the substrate 101 and the base material 101 are not affected. Bonding with the two base materials 120 can be performed.
  • FIGS. 7A and 8A to 8D are schematic plan views showing the movement of the solution when the sample analysis chip 1 is used.
  • 9A, 9B, 9C, 9D, and 9E are schematic plan views showing the movement of the solution when the sample analysis chip 1 is used.
  • the liquid X1 is supplied from the solution supply path 107a into the main flow path 103, and the main flow path 103 is filled with the solution. Further, part of the solution is also supplied to the first buffer unit 110 and the second buffer unit 111.
  • the sample analysis chip 1 distributes the solution supplied in the main flow path 103 to each well 102 by centrifugal force generated by rotating the sample analysis chip 1. Liquid. Since the sample analysis chip 1 has a disc shape and the wells 102 are concentrically arranged, a solution is distributed to each well 102 by centrifugal force having the same magnitude. Further, since each well 102 is arranged along one circumference, if an analysis region is set for one of the plurality of wells 102, the center point of the sample analysis chip 1 is rotated about the rotation center. By doing so, it is possible to sequentially analyze all the wells 102.
  • part of the solution (liquids X2 and X3) may remain in the first buffer 110 and the pipe line part 112 after the end of the centrifugation (see FIGS. 7B and 8E). If the solution remaining after the end of the centrifugation process subsequently enters the well 102, the analysis accuracy in the well 102 may be affected. For this reason, operation which pushes out the solution which remained in the 1st buffer part 110 and the pipe line part 112 to the storage tank 113 is performed.
  • the reaction in the well 102 is affected.
  • the liquid Y1 which does not reach is supplied from the solution supply path 107a into the main flow path 103.
  • the liquid that does not affect the reaction in the well 102 for example, when performing PCR reaction in the well 102, mineral oil is preferable.
  • the liquid in the storage tank 113 can be rotated even if the sample analysis chip 1 is rotated. Is only pressed against the inner wall of the storage tank 113 or the pipe section 112 and does not flow back to the main flow path 103. Even after the end of the centrifugal treatment, as shown in FIG. 9E, there is no gap in which the solution pushed into the storage tank 113 can return to the main flow path 103, and the main flow path 103 has a liquid such as the mineral oil. Is filled by. Thereby, the influence on the reaction in the well 102 by the solution remaining in the first buffer part 110 and the pipe line part 112 can be suppressed low.
  • the sample analysis chip 1 can be used, for example, for detection and analysis of biochemical substances using a sample solution containing DNA, protein, and the like.
  • a sample solution or a reagent can be fixed to each well 102.
  • the operation of fixing the sample solution or reagent to each well 102 is performed when the sample analysis chip 1 is manufactured.
  • a reagent is fixed to each well 102 and a liquid sample is distributed to each well 102, a different reagent can be used in each well 102.
  • a sample is fixed to each well 102 and a liquid reagent is distributed to each well 102, a different sample can be used for each well 102.
  • a solution such as a reagent is injected into the main channel 103 from the solution supply channel 107a.
  • a solution such as a reagent is injected into the main channel 103 from the solution supply channel 107a.
  • the main channel 103 is filled with the solution, and the solution does not enter the side channel 105 as described above. This is because there is air pressure from the well side due to the surface tension of the solution and the absence of air holes on the well 102 side.
  • the operation for injecting the solution into the main channel 103 may be manual operation or automatic control by a dispensing robot.
  • the sample analysis chip 1 is rotated around the center point at a predetermined rotation speed.
  • a device for rotating the sample analysis chip for example, a low-speed centrifuge having a rotation speed of 1000 rpm to 3000 rpm can be used. A centrifuge having a rotation speed exceeding 3000 rpm can also be used.
  • a device for rotating the sample analysis chip 1 a device provided with a claw corresponding to the position and shape of the holding portion 109 of the sample analysis chip 1 of the present embodiment may be used. In this case, the rotation of the sample analysis chip 1 can be stabilized.
  • the sample passes through the central point of the sample analysis chip 1 and the axis extending in the vertical direction of the sample analysis chip 1 (in the present embodiment in the thickness direction of the second base material 120) is the rotation axis.
  • the analysis chip 1 is rotated.
  • the rotation speed the rotation speed at which the centrifugal force applied to the solution becomes larger than the above-described air pressure and surface tension and the solution flows into the well 102 is required.
  • it depends on the shape of the chip, it is preferably about 1000 rpm or more. If the rotation speed of the chip is less than about 1000 rpm, the well 102 into which the solution does not flow may be generated, and the liquid amount may not be constant.
  • oil that does not inhibit the reaction of the sample / reagent is dispensed to each well in the same process. It is necessary to use oil having a lighter specific gravity than the previously dispensed solution. This is because when the sample analysis chip 1 is rotated and distributed by centrifugal force, it serves as a plug for each well 102 on the side path 105 side. If the specific gravity of the oil is smaller than the specific gravity of the solution distributed first, when the sample analysis chip 1 is rotated, the oil is located on the side closer to the rotation center, and the previously distributed solution is on the side farther from the rotation center. Stay on.
  • the reagent and the sample are mixed. Thereafter, for example, the solution in the well 102 is heated to denature the DNA, and the solution in the well 102 is further cooled to bind the DNA and the SNP probe. At this time, the lip portion 115 is deformed so as to be crushed by a jig or the like (not shown), and the solution supply path 107a and the air vent path 107b are sealed by the jig, so that the solution is obtained when the sample analysis chip 1 is heated. The phenomenon that the solution overflows when it expands or bubbles are generated can be prevented.
  • the liquid in the sample analysis chip 1 expands due to heating, the liquid overflowing from the main flow path 103 due to the expansion is stored in the first buffer unit 110 and the second buffer unit 111. It is possible to prevent the solution from overflowing from the passage 107a and the air vent passage 107b.
  • the reaction state of the solution in the well 102 can be analyzed by a technique such as fluorescence detection.
  • the apparatus that performs fluorescence detection detects the position of the well 102 to be measured among the plurality of wells 102 by detecting the position detection structure 108 provided on the outer periphery of the sample analysis chip 1 with an optical sensor or a laser sensor. I can do it.
  • the apparatus can measure the reaction state of the solution in a predetermined well 102 by rotating the sample analysis chip 1.
  • a PCR reaction can also be performed in the well 102 of the sample analysis chip 1.
  • the PCR reaction is performed using a heating / cooling device (not shown) in contact with the base material 101 and the second base material 120.
  • the substrate 101 is a light transmissive resin material and the second substrate 120 is a metal plate
  • the temperature of the solution in the well 102 is mainly controlled via the second substrate 120. .
  • Examples of gene analysis include detection of K-ras gene mutation and detection of germline mutation.
  • the identification of K-ras gene mutation is desired to establish a specific method for cancer treatment, and the identification of germ cell mutation is considered to be usable for estimation of drug efficacy.
  • Germline mutations can be detected by identifying SNPs.
  • identifying SNPs for example, a PC-PHFAA (PCR-Preference Modulation Formation Assay) method using fluorescence is used. According to the method, mutation is detected by the difference in luminescence of the fluorescent reagent.
  • PC-PHFAA PCR-Preference Modulation Formation Assay
  • mutation is detected by the difference in luminescence of the fluorescent reagent.
  • sample analysis chip of the present invention since there is little liquid distribution variation in each well, accurate analysis is possible. Suitable for detection.
  • a sample analysis chip can be used for the Invader method (registered trademark) as a method for detecting SNPs other than the above.
  • Specimen nucleic acid obtained from blood, etc. is purified to obtain a solution sample.
  • the sample nucleic acid is amplified before or after injection into the sample analysis chip 1 of this embodiment.
  • gene fragments in the sample are amplified by multiplex PCR using VKORC1, CYP2C9 * 3, CYP2C9 * 2, and positive control. Transfer sample and perform PCR.
  • the sample analysis chip 1 in which 10 or more wells 102 are formed for each specimen sample.
  • a reagent for SNP detection is fixed to the well 102 of the cell.
  • the sample in which the nucleic acid is amplified by the PCR is distributed to each well 102.
  • Each well 102 is temperature-controlled, and a mutation is detected by a difference in luminescence of the fluorescent reagent mixed in the SNP detection reagent in the well 102. If only one of the two wells 102 is positive for one SNP, it can be determined to be homo, and if two are positive, it can be determined to be hetero.
  • the sample analysis chip 1 different from the sample analysis chip 1 used for the detection of the germ cell mutation is used.
  • a reagent containing a probe nucleic acid is fixed to the well 102 for detecting the gene mutation. Further, the reagent containing the probe nucleic acid contains a fluorescent reagent. Since there are 13 types of mutations in the wild-type detection and K-ras gene detection, the sample analysis chip 1 in which at least 14 wells 102 are formed is used, and reagents corresponding to each of the wells 102 are immobilized. Is preferred.
  • Collect cancer cells such as colorectal cancer, purify the sample nucleic acid, and use it as a solution sample.
  • the sample nucleic acid is amplified before or after the injection into the sample analysis chip 1 of the present invention. Transfer sample and perform PCR.
  • the sample in which the nucleic acid is amplified by the PCR is distributed to each well 102.
  • the temperature of the well 102 is controlled, and the mutation can be detected by the difference in luminescence of the fluorescent reagent mixed in the reagent containing the probe nucleic acid.
  • sample analysis chip 1 is used as a SNPs analysis chip which analyzes SNPs.
  • the base material 101 of the SNP analysis chip a molded product of polypropylene (hereinafter referred to as PP) was adopted.
  • the base material 101 has a disk-like outer shape as shown in FIG. 2, a corrugated main channel 103 on a concentric circle, a side channel 105 having a communication port in a valley 103 b, and a well 102 at the end of the side channel 105.
  • PP polypropylene
  • an aluminum sheet substrate coated with polypropylene resin as a resin coating layer was used as the second substrate 120 to be bonded to the polypropylene substrate 101.
  • a resin coating layer having a thickness of about 0.07 mm was used as the second substrate 120 to be bonded to the polypropylene substrate 101.
  • the resin coating layer has a melting point of around 120 degrees, and is coated on the aluminum base so that it melts when heat is applied to the aluminum side.
  • an anchor layer in which carbon is kneaded is provided between the aluminum layer and the polypropylene resin layer, and the polypropylene layer is melted even by heat generated by laser light irradiation.
  • the SNPs probe reagent in the reagent table shown in Table 1 below is fixed to the well 102 on the polypropylene substrate 101, and the other well 102 is used for fluorescence detection of the enzyme for performing the PCR reaction and SNPs, respectively.
  • An enzyme for invader reaction (see Table 1) was dropped with a pipette and fixed by drying.
  • the base material 101 made of polypropylene and the second base material 120 made of aluminum are overlapped, and the resin layer coated on the second base material 120 is formed by applying heat of 130 degrees or more to the second base material 120 side.
  • the base material 101 made of polypropylene and the second base material 120 made of aluminum were welded by melting.
  • a solution sample in which the buffer solution shown in Table 1 and the purified genome were mixed was pipetted into the SNP analysis chip prepared in the above step and filled into the main channel 103. At this stage, the sample did not enter the well 102 and the side passage 105.
  • a simple centrifuge using a desktop small centrifuge used for separation of reagents in chemical and biological reactions was created and used.
  • the rotational speed during centrifugation was measured and adjusted with a rotational speed measuring device.
  • the simple centrifuge is a centrifuge having a claw that engages with the support 109. When this centrifuge was used to centrifuge at 5000 rpm, 11 ⁇ l of the sample was sent to each well 102.
  • probes for invader reaction were immobilized on 22 wells 102 as reaction reagents. Further, in order to determine the success or failure of the reaction result, a negative control was set at one place as a confirmation of the presence or absence of contamination, and a reaction test was performed on one chip.
  • the sample 102 was subjected to 35 cycles alternately at 95 ° C. and 68 ° C. on the SNPs analysis chip in which the well 102 was independent by oil, and the sample genome was amplified by PCR reaction. Subsequently, the temperature was adjusted at 63 ° C. for 30 minutes to cause a fluorescence detection reaction in the well 102 by an enzyme reaction.
  • the polypropylene substrate (substrate 101) side of the SNP analysis chip is transparent, fluorescence detection was performed from the outside through the polypropylene substrate.
  • the fluorescence reaction was measured by a fluorescence detection apparatus combining a photomultiplier tube and an optical fiber.
  • 10 to 12 are graphs showing the analysis results of SNPs by the fluorescence reaction detected by this example.
  • the vertical axis of each graph is the intensity of detected light and indicates the intensity of fluorescence.
  • the horizontal axis is the time axis.
  • FIG. 10 shows the result of one well 102 in which the reaction was performed, and it was confirmed that a fluorescence detection reaction was caused by the reagents mixed within a predetermined time.
  • FIG. 11 shows wells in which reagents are not fixed in advance, and thus no fluorescence reaction was detected. This confirmed that there was no contamination from both sides.
  • FIG. 12 shows detection data obtained by mixing the reagent and sample in a polypropylene tube at an optimum ratio by a general method (positive control). Comparing FIG. 10 and FIG. 12, since the reaction in the chip according to this example shown in FIG. 10 is the same as the reaction of FIG. 12, it can be confirmed that this example is a reaction with an optimal quantity ratio. . Thus, it can be seen that a desired amount of sample can be distributed.
  • Example 1 it was possible to perform the reaction process more simply and efficiently in a short time by selecting the base material to be bonded with a material suitable for the reaction.
  • the arrangement of the wells 102 does not necessarily require that all the wells 102 be on one circumference.
  • the distance from the rotation center to the well 102 in the sample analysis chip 1 may be made different for the purpose of making the centrifugal force applied to the solution supplied to the well 102 different.
  • sample analysis chip 1 may have a shape other than a disk shape as long as the weight balance at the time of rotation is maintained.
  • the mountain portion 103a may have an asymmetric shape on one side and the other side sandwiching the apex of the mountain portion 103a. That is, the main flow path 103 located on both sides of the peak portion 103a may be formed asymmetrically.
  • the reaction chip of the present invention can be used for detection and analysis of biochemical substances in samples such as nucleic acids.
  • SNP mutations can be detected, it can be used in methods for detecting mutations in genes such as cancer, germ cells and somatic cells. Further, it can be used as a container or a reaction container for mixing a plurality of solutions.
  • Sample analysis chip 101 Base material (first base material) 102 well 103 main flow path 103a peak 103b valley 105 side path 107a solution supply path 107b air vent path 108 notch (position detection structure) 109 carrying part 110 first buffer part 111 second buffer part 112 pipeline part 113 storage tank 115 lip part 120 second base material (sealing member)

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Abstract

　本発明の試料分析チップ（１）は、基材（１０１）と、前記基材に設けられた複数のウェル（１０２）と、前記基材において前記複数のウェルよりも回転中心に近い位置に配されて前記複数のウェルの各々に配液される溶液が供給される主流路（１０３）と、前記主流路の一端に連通され前記溶液の一部を収容可能な第一バッファ部（１１０）と、前記主流路の他端に連通され前記溶液の一部を収容可能な第二バッファ部（１１１）と、前記第一バッファ部に一端が連通され他端が大気開放された溶液供給路（１０７ａ）と、前記第二バッファ部に一端が連通され他端が大気開放された空気抜き通路（１０７ｂ）とを備え、前記基材に設けられ、前記複数のウェルに繋がる流路とを備える。

Description

試料分析チップ並びに試料分析方法及び遺伝子解析方法
　本発明は、試料分析チップ並びに試料分析方法及び遺伝子解析方法に関する。
　本願は、２０１１年１１月２５日に出願された特願２０１１－２５７８２４号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　従来、例えばＤＮＡ反応、たんぱく質反応等の生化学反応の分野において、微量の試料溶液を処理する反応装置として、μ－ＴＡＳ（Ｔｏｔａｌ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ）やＬａｂ－ｏｎ－Ｃｈｉｐと呼ばれる技術が知られている。これは、１個のチップやカートリッジに複数の反応室（以下、ウェル）や流路を供えたものであり、複数の検体の解析、あるいは複数の反応を行うことができる。これらの技術はチップ及びカートリッジを小型化することで扱う薬品を少量にすることが出来、様々なメリットがあることが知られている。
　そのメリットとは例えば従来使用していた強酸や強アルカリ薬品の分量が微量であることで人体への影響や環境への影響が格段に低くなること、また、生化学反応等に用いられる高額な試薬類の消費量が微量であるために、分析、反応に費やすコストを低減できること、などが挙げられる。
　チップやカートリッジを用いて生化学反応を最も効率よく行うためには、複数のウェルにそれぞれ異なる種類の薬品や検体、酵素を配置し、これら薬品や検体、酵素と反応を起こす試薬を一本ないし数本の主導管からまとめてウェルに流し入れ、異なった複数の反応を生じさせる必要がある。
　この手法を用いれば、複数種の検体を同じ試薬で同時に処理をしたり、また逆に一種類の検体に同時に複数の処理を施したりすることが出来、従来かかっていた時間や手間、コストを大幅に減らすことが可能である。
　この種の手法を用いる際、複数の反応場に等量のサンプルを送液する技術と、各ウェルの中身を混ざり合わないようにする技術が重要となる。このようなウェルへの送液を行うチップについての先行技術としては以下のものが挙げられる。
　特許文献１では、液溜めから遠心力を用いてウェルへの送液を行うチップにおいて、ウェルを独立させるために流路を変形、密封している。
　特許文献２では、遠心方法を自転＋公転を織り交ぜることで各ウェルへの送液量にばらつきを解決している。
　特許文献３では液体貯留部と遠心方向に伸びる流路を有するウェルを複数連結させた分析用媒体が公開されているが、この文献では液の配液性などには注視しておらず、逆にウェルに詰まった空気との押し合いで流体を制御することが開示されている。
日本国特表２００４－５０２１６４号公報 日本国特許第３６９９７２１号公報 日本国特開２００８－８３０１７号公報
　しかしながら、特許文献１に記載のチップでは、流路を押しつぶす機構が必要であり、自動化が困難である。また、従来の遠心送液チップのように中央の液溜りから周囲のウェルに遠心送液を行うと、各ウェルへの送液量にばらつきが生じてしまう。
　また、特許文献２に記載の遠心方法を採用しようとすると、チップを自転させ且つチップを公転させるための複雑な機構とスペースが必要となる。
　また、特許文献３に記載の分析用媒体では、液体貯留部と液体貯留部の間流路の液体は送液されない上、各ウェルに送液される液量は大きくバラつき、反応のたびに結果に差異が生じてしまう。
　本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、その目的は、送液方法が簡易でかつ各ウェルの液量ばらつきが少なく、加熱冷却や加温による化学反応、酵素反応を好適に行なうことができ且つ低コストの試料分析チップを提供することである。
　上記課題を解決するために、この発明は以下の手段を提案している。
　本発明の第一態様の試料分析チップは、基材と、前記基材に設けられた複数のウェルと、前記基材において前記複数のウェルよりも回転中心に近い位置に配されて前記複数のウェルの各々に配液される溶液が供給される主流路と、前記主流路の一端に連通され前記溶液の一部を収容可能な第一バッファ部と、前記主流路の他端に連通され前記溶液の一部を収容可能な第二バッファ部と、前記第一バッファ部に一端が連通され他端が大気開放された溶液供給路と、前記第二バッファ部に一端が連通され他端が大気開放された空気抜き通路とを備え、前記基材に設けられ、前記複数のウェルに繋がる流路とを備える。前記試料分析チップは、前記回転中心を中心として前記基材が回転することによって、前記主流路内の前記溶液が前記ウェル内へと移動されることを特徴とする。
　また、前記流路は前記基材に溝状に形成されており、前記基材に固定され前記流路を封止する封止部材をさらに備えることが好ましい。
　また、前記溶液供給路の他端と前記空気抜き通路の他端とは、いずれも前記流路が形成されている側の面とは反対側の面において大気開放されていることが好ましい。
　また、前記第二バッファ部における前記溶液の流通方向に直交する断面の面積は、前記主流路における前記溶液の流通方向に直交する断面の面積よりも大きいことが好ましい。
　また、前記第二バッファ部の容積は、前記主流路の容積よりも大きいことが好ましい。
　また、前記第二バッファ部の容積は、前記第一バッファ部の容積よりも大きく、前記第一バッファ部の容積と前記第二バッファ部の容積との合計は、前記主流路の容積よりも大きいことが好ましい。
　また、前記溶液供給路の他端及び前記空気抜き通路の他端を囲む壁状であって、前記流路に前記溶液が注入された後、前記溶液供給路の他端及び前記空気抜き通路の他端を閉塞させることを目的とした装置もしくは冶具によって変形し、前記流路を密閉状態に保つことを可能としたリップ部を有することが好ましい。
　また、前記主流路は、前記基材の回転中心側に位置する山部と、前記山部に対して前記ウェル側に位置する谷部とを有して蛇行して形成されており、前記ウェルは、前記谷部と連通していることが好ましい。
　また、前記主流路の路幅は、相対的に前記山部で小さく、前記谷部で大きいことが好ましい。
　また、前記山部は、前記山部の頂点を間に挟んだ一方側と他方側とが非対称形状であってもよい。
　また、前記基材が円盤状であり、前記複数のウェルは前記基材と同心円状に配置されていることが好ましい。
　また、前記主流路と前記複数のウェルとを連絡する複数の側路を有することが好ましい。
　また、本発明の試料分析チップは、前記基材を回転させ、遠心力による溶液の送液を行うための担持部が前記基材に設けられていることが好ましい。
　また、前記担持部を前記基材の外周部に有することが好ましい。
　また、前記基材には、前記回転中心を中心とした遠心の前後において各ウェルの位置、角度を検出するため位置検出構造が設けられている。前記位置検出構造は、切り欠き、穴、若しくは突起からなる機械的被検出部有することが好ましい。または、前記位置検出構造は、光学的被検出部を備え、前記光学的被検出部の表面粗さ若しくは光学特性は、前記基材において、前記光学的被検出部が設けられていない箇所の表面粗さ若しくは光学特性とは異なることが好ましい。
　また、前記複数の側路の各々が、前記複数のウェルのうち前記側路が接続されたウェルと前記基材の回転中心とを結ぶ直線に対して傾いて形成されていることが好ましい。
　また、前記主流路が、回転中心方向に対して傾いて形成されていてもよい。
　また、上記試料分析チップは、前記複数のウェル及び前記流路が形成された第一基材と、前記第一基材と貼り合わせた第二基材とを有することが好ましい。
　また、前記第一基材と前記第二基材との少なくともいずれかは光透過性材料で形成されていることが好ましい。
　また、前記第一基材が光透過性の樹脂材料であり、前記第二基材が金属材料であることが好ましい。
　本発明の第二態様の試料分析方法は、本発明の試料分析チップを用いた試料分析方法であって、前記主流路に前記溶液を注入する工程と、前記基材を回転させて前記溶液を前記各ウェルに配液する工程と、を有する。
　また、前記ウェルに前記溶液を配液する工程の後に、ミネラルオイルを前記各ウェルに配液する工程を有することが好ましい。
　本発明の第三態様の遺伝子解析方法は、本発明の試料分析方法を用いる。
　本発明の第一態様の試料分析チップによれば、送液方法が簡易でかつ各ウェルの液量ばらつきが少なく、加熱冷却や加温による化学反応、酵素反応を好適に行なうことができ、且つ低コストを実現できる。
　また、本発明の第二態様の試料分析方法及び第三態様の遺伝子解析方法によれば、分析精度及び再現性の高い分析を行なうことができる。
本発明の一実施形態の試料分析チップを示す平面図である。 同試料分析チップの分解斜視図である。 図１のＡ－Ａ線における断面図である。 同試料分析チップの模式的な断面図である。 同試料分析チップの平面図であり、溶液の流通経路を示している。 図５に示す流通経路に沿って同試料分析チップを展開した展開図である。 同試料分析チップの作用を説明するための説明図である。 同試料分析チップの作用を説明するための説明図である。 同試料分析チップの作用を説明するための説明図である。 同試料分析チップの作用を説明するための説明図である。 は、同試料分析チップの使用時における溶液の移動を示す模式的な平面図である。 は、同試料分析チップの使用時における溶液の移動を示す模式的な平面図である。 は、同試料分析チップの使用時における溶液の移動を示す模式的な平面図である。 は、同試料分析チップの使用時における溶液の移動を示す模式的な平面図である。 は、同試料分析チップの使用時における溶液の移動を示す模式的な平面図である。 は、同試料分析チップの使用時における溶液の移動を示す模式的な平面図である。 は、同試料分析チップの使用時における溶液の移動を示す模式的な平面図である。 は、同試料分析チップの使用時における溶液の移動を示す模式的な平面図である。 は、同試料分析チップの使用時における溶液の移動を示す模式的な平面図である。 は、同試料分析チップの使用時における溶液の移動を示す模式的な平面図である。 本発明の実施例における分析結果を示すグラフである。 本発明の実施例における分析結果を示すグラフである。 本発明の実施例における分析結果を示すグラフである。
　本発明の一実施形態の試料分析チップについて図面に基づいて説明する。図１は、本実施形態の試料分析チップの一様態を示した平面図である。図２は、本実施形態の試料分析チップの構造の一様態を示した分解斜視図である。
　図１に示すように、試料分析チップ１は、基材１０１及び第二基材１２０と、基材１０１に設けられた複数のウェル１０２と、ウェル１０２に溶液を送液するための流路（主流路１０３及び側路１０５）とを有する。
　試料分析チップ１は、全体として円板形状に形成されており、円板の中心点を回転中心として、図示しない分析装置等によって回転される。試料分析チップ１において、主流路１０３及び側路１０５は、複数のウェル１０２よりも上記中心点側に配置されている。試料分析チップ１が回転されることにより、主流路１０３内の溶液が遠心力により各ウェル１０２へと移動する。
　主流路１０３の一端（主流路第一端）には、主流路１０３に供給される溶液の一部を収容可能な第一バッファ部１１０が設けられている。また、主流路１０３の他端（主流路第二端）には、主流路１０３に供給される溶液の一部を収容可能な第二バッファ部１１１が設けられている。さらに、基材１０１には、一端（溶液供給路第一端）が第一バッファ部１１０に連通され他端（溶液供給路第二端）が大気開放された溶液供給路１０７ａと、一端（空気抜き通路第一端）が第二バッファ部１１１に連通され他端（空気抜き通路第二端）が大気開放された空気抜き通路１０７ｂとが形成されている。
　主流路１０３は、隣り合うウェル１０２の間で中心点方向へ突出する一つの山部１０３ａを有するように形成されている。ここで、隣り合うウェル１０２とは、主流路１０３からウェル１０２への送液流路が前後しているウェルを意味する。また、中心点方向へ突出する山部１０３ａとは、中心点方向への極大点を持つ曲線形状であることを意味している。このように、隣り合うウェルの間で中心点方向に向く一つの山を有するように形成することで、主流路１０３に注入された液体が、チップ回転時に山部１０３ａで自然と途切れるため、各ウェル１０２への配液量のバラツキを低減することができる。
　また、主流路１０３の路幅は、山部１０３ａで狭く、谷部１０３ｂで広い。
山部１０３ａに該当する領域に存在する溶液が少ない方が、配液バラツキが少ないため、山部１０３ａにおける主流路１０３の断面積は、他の部分の断面積よりも小さい。山部１０３ａにおける主流路１０３の断面積を小さくするためには、山部１０３ａの流路幅を狭くする、または、山部１０３ａにおける主流路１０３の深さを浅くすればよい。或いは、山部１０３ａの流路幅を狭くし、かつ、山部１０３ａにおける主流路１０３の深さを浅くしてもよい。また、山部１０３ａに近づくにつれて主流路１０３の断面積が漸次小さくなるようにすることが好ましい。
　また、谷部１０３ｂの路幅を調整することによって、各ウェル１０２への配液量を設定することができる。このように、互いに隣接する２つの山部１０３ａの間に位置する主流路１０３は、１つのウェル１０２に対して所定の容量の溶液を配液するためのチャンバＣとして機能している。本実施形態では、山部１０３ａから隣接する山部１０３ａまでの主流路１０３による上記チャンバＣは、各ウェル１０２と一対一で対応しており、ウェル１０２の数と同じ数だけ設けられている。各チャンバＣは同形同大であり、各チャンバＣの容積は互いに等しい。従って、各チャンバＣに収容された溶液が各ウェル１０２に配液されることにより、各ウェル１０２には同量の溶液が均等に配液される。
　側路１０５は、主流路１０３の谷部１０３ｂとウェル１０２とを連通する管路状の形状を有している。側路１０５は、中心点とウェル１０２とを結ぶ直線に対して傾いた直線状とされている。このように側路１０５が傾斜していることにより、遠心力を掛けたときにウェル１０２の空気が側路１０５の内側（中心点側の内面）に沿って主流路１０３方向へ移動し、溶液は側路１０５の外側（ウェル１０２側の内面）に沿ってウェル１０２方向へ移動するため、スムーズにウェル１０２内へ溶液を移動させることができる。傾斜させる角度としては、中心点の方向と側路１０５との為す角が１０度から８０度の間であることが好ましい。１０度以下だとウェル１０２からの排気とウェル１０２への溶液の浸入が干渉して溶液の浸入を阻んでしまう場合があり、８０度を超えると、側路１０５方向への遠心力が弱く、溶液がウェル１０２へ移動しない場合がある。
　ウェル１０２と主流路１０３との連絡箇所、即ち主流路１０３と側路１０５との接続箇所が、主流路１０３の谷部１０３ｂである。これにより、配液時の主流路１０３への溶液の残留を減らすことができる。これは、谷部１０３ｂは主流路１０３の隣り合う山部１０３ａの間で最も中心点から距離が遠い箇所であるからである。
　また、主流路１０３とウェル１０２との連絡口は、チップを回転させる前の段階では、ウェル１０２に溶液が浸入しない程度の幅及び断面積とされている。主流路１０３とウェル１０２との連絡口の幅及び断面積は、溶液の表面張力の大きさに基づいて好適な大きさに設定される。例えば、溶媒が水である場合、上記連絡口の形状は、高さ２ｍｍ以下、且つ幅２ｍｍ以下の矩形形状であることが好ましい。また、溶媒が水である場合に、連絡口の断面積は４ｍｍ２以下であることが好ましい。
　また、ウェル１０２内に空気を残留させないために、側路１０５とウェル１０２とは、ウェル１０２のうち中心点に最も距離が近い点で連結されている。
　またウェル１０２の容積は１μｌ以上１００μｌ以下であることが好ましい。ウェル１０２の容積が１μｌより小さいと、遠心力が十分に働かず、ウェル１０２への送液が行われ辛い。またウェル１０２の容積が１００μｌよりも大きいと、試薬の混合性が低下したり、ウェル１０２内の温度の均一性が低下したり、といった現象が生じる可能性がある。
　試料分析チップ１の外周部には、位置検出構造１０８が形成されている。位置検出構造１０８は、試料分析チップ１の外周の一箇所に形成されており、位置検出構造１０８の位置と各ウェル１０２の位置との関係は予め所定の関係となるように構成されている。例えば、本実施形態では、位置検出構造１０８は、溶液の流通方向において最も第一バッファ部１１０に近いウェル１０２の近傍に形成されている。
　この位置検出構造１０８は、基材１０１に設けられており、回転中心を中心とした遠心処理の前後において各ウェルの位置、角度を検出するために用いられる。　
　本実施形態では、位置検出構造１０８は、切り欠き、穴、若しくは突起からなる機械的被検出部を有する。
　具体的に、位置検出構造１０８は、試料分析チップ１の外周の一部が略矩形形状に切り取られた切り欠きである。
　また、位置検出構造１０８は、光学的被検出部を有してもよい。この場合、光学的被検出部の表面粗さ若しくは光学特性は、基材１０１において光学的被検出部が設けられていない箇所の表面粗さ若しくは光学特性とは異なる
　具体的に、試料分析チップ１の外周において位置検出構造１０８が設けられていない部分は、サンドブラスト、エッチング、若しくはエンボス加工等によって微細な凹凸を有し、光透過性が低い。これにより、位置検出構造１０８の位置は、たとえば光センサやレーザーセンサによって光の散乱の程度を検出することにより容易に検出される。また、位置検出構造１０８の位置を光学的な検出機構により検出することができるので、試料分析チップ１に対して非接触状態で位置検出をすることができる。
　なお、位置検出構造１０８が切り欠きであるので、光センサやレーザーセンサによる光学的な検出に代えて、接触スイッチを使用した機械的な検出をすることもできる。この場合、試料分析チップ１が高速回転しているときにおける位置検出には不向きではあるが、試料分析チップ１の位置検出をするための機器を低コストで構成することができる。
　また、試料分析チップ１の外周部分には、円周上に１２０度置きに計３つの担持部１０９が形成されている。担持部１０９は、試料分析チップ１を回転させる機器が係止される窪みである。当該機器は、担持部１０９に例えば爪部材を係止させることによって試料分析チップ１を保持することができる。担持部１０９の形状、数量、及び配置は、当該機器の構成に対応して設定される。担持部１０９は、試料分析チップ１の周方向に沿って隣り合う担持部１０９が試料分析チップ１の中心点を中心として１８０度未満の角度となっていれば、その数については限定されない。また、担持部１０９が基材１０１を厚さ方向に貫通する貫通孔であってもよく、この場合には、担持部１０９は２つであってもよい。
　図５は、試料分析チップ１の平面図であり、溶液の流通経路を示している。図６は、図５に示す流通経路に沿って試料分析チップ１を展開した展開図である。
　図５及び図６に示すように、第一バッファ部１１０は、溶液供給路１０７ａと主流路１０３との間において溶液の一部を保持する空間を有する。第一バッファ部１１０は、主流路１０３と同様に、基材１０１において溝状に形成され、第二基材１２０によって封止されることによって流路状となっている。第一バッファ部１１０の容積は、試料分析チップ１に供給される溶液が加熱されたときの膨張量に応じて設定されることが好ましい。本実施形態では、第一バッファ部１１０は、第二バッファ部１１１における貯留槽１１３の外側に沿うように湾曲して形成されている。第一バッファ部１１０において溶液の流通方向に直交する断面形状は、本実施形態では四角形状となっている。
　第二バッファ部１１１は、第一バッファ部１１０と同様の断面形状をなす管路部１１２と、管路部１１２と連通された貯留槽１１３とを備える。
　管路部１１２の一端は、主流路１０３と連通されている。主流路１０３から管路部１１２には溶液が流れ込む。管路部１１２は、貯留槽１１３の外側に沿うように湾曲しており、試料分析チップ１の中心点から管路部１１２までの距離は、当該中心点から第一バッファ部１１０までの距離と等しい。これにより、試料分析チップ１が中心点周りに回転動作しているときには、管路部１１２内に位置する溶液は、第一バッファ部１１０内に位置する溶液と同じ大きさの遠心力をうける。
　管路部１１２における溶液の流通方向の長さは、第一バッファ部１１０における溶液の流通方向の長さよりも短くてよい。
　貯留槽１１３は、管路部１１２との接続部分において、溶液の流通方向と直交する断面積が管路部１１２における当該断面積よりも大きくなるように形成されている。また、貯留槽１１３の容積と管路部１１２の容積との合計は、主流路１０３の容積よりも大きい。貯留槽１１３の内部には、主流路１０３内の溶液の一部及び後述するオイルの一部が貯留される。また、貯留槽１１３の高さ寸法（第二基材１２０において基材１０１側に向けられた面から当該面に垂直な方向に測った寸法）は、管路部１１２の高さ寸法（第二基材１２０において基材１０１側に向けられた面から当該面に垂直な方向に測った寸法）よりも大きい。このため、貯留槽１１３内に比重の高い溶液（例えば試料水溶液など）が貯留されている状態で当該溶液よりも比重が小さな溶液（例えばミネラルオイルなど）が管路部１１２を通じて貯留槽１１３へ流入すると、比重が小さな溶液は比重が大きな溶液の上に移動して比重が大きな溶液を覆う。
　次に本発明の試料分析チップの製造方法について説明する。
　まず、図１に示すように、成形型を使用した成形により、ウェル１０２及び流路（主流路１０３及び側路１０５を含む）を有する基材（第一基材）１０１を形成する。
　基材１０１は、厚さ方向の第一の面に、製造後のウェル１０２、主流路１０３、側路１０５、溶液供給路１０７ａ、空気抜き通路１０７ｂ、第一バッファ部１１０、及び第二バッファ部１１１となる溝状構造が形成されている。ここで、溶液供給路１０７ａ、空気抜き通路１０７ｂは、基材１０１の厚さ方向の第二の面にも開口されている。また、前記第二の面には、溶液供給路１０７ａ、空気抜き通路１０７ｂを囲む一続きの壁状形状を有するリップ部１１５が一体形成される。
　また、基材１０１の厚みが１０μｍ～３００μｍの範囲にある場合、基材１０１の熱伝導性及び封止性の双方を好適に満足することができる。基材１０１の厚みが３００μｍよりも大きいと、熱容量が大きくなり、熱応答性が低下するおそれがある。
　基材１０１の材料としては、光透過性を有する樹脂を好適に使用することができる。また、ウェル１０２内における溶液に対して光学的分析（蛍光測定や比色測定など）をする場合には、基材１０１の透明性が高いことが好ましい。例えば、基材１０１の材料は、試料に影響を与えないものであれば特に制限はないが、特にポリプロピレン、ポリカーボネート、アクリルのいずれかを含む樹脂材料を用いれば、良好な可視光透過性を確保することができる。ポリプロピレンとしては、ホモポリプロピレンやポリプロピレンとポリエチレンとのランダム共重合体を使用することができる。また、アクリルとしては、ポリメタクリル酸メチル、または、メタクリル酸メチルとその他のメタクリル酸エステル、アクリル酸エステル、スチレンなどのモノマーとの共重合体を使用することができる。また、これらの樹脂材料を使用する場合、チップの耐熱性や強度を確保することもできる。樹脂材料以外としては、アルミニウム、銅、銀、ニッケル、真鍮、金等の金属材料を挙げることができる。金属材料を用いた場合、加えて熱伝導率及び封止性能に優れる。
　なお、基材１０１のウェル１０２の底部を透明にすることで、蛍光等の検出・分析を外部から行うことができる。なお本発明における「透明」及び「光透過性」とは、形成した際の可視光域（波長３５０～７８０ｎｍ）の全平均透過率が７０％以上であることを示す。
　基材１０１の加工方法としては、樹脂材料の場合には、射出成形、真空成形等の各種樹脂成形法や、機械切削などを用いることができる。金属材料の場合には、厚手の基材を用いた研削加工やエッチング、薄手の金属シートにプレス加工や絞り加工を施すことで形成することができる。
　また、基材１０１として特にポリプロピレン、ポリカーボネート、アクリルのいずれかを含む樹脂材料を用いた場合、良好な光透過性、耐熱性、強度を確保することができる。また、基材１０１の厚みが５０μｍ～３ｍｍの範囲にある場合、良好な光透過性、耐熱性、強度を確保でき、凹部の加工を確実に行うことができる。
　図３は、本実施形態の試料分析チップ１の断面図である。
　図３に示すように、基材１０１には、チップを貫通する溶液の溶液供給路１０７ａと、注入液がチップに流れ込むための主流路１０３と、チップの外周部に延びた各ウェルと連通する側路１０５と、チップの外周部のウェル１０２とが成形されている。なお図３の断面図は溶液供給路１０７ａからウェル１０２を介して空気抜き通路１０７ｂへと繋がる経路を模式的に示す。主流路１０３及び側路１０５の形状は図３に示す構造に限られない。注入される溶液をすべてのウェル１０２に充満するためには、主流路１０３の容積は、各ウェル１０２の容積の合計より大きい必要がある。ただし、ウェル１０２に後述する試薬３０１が固定されている場合、試薬３０１の容量分だけ、ウェル１０２に入れる液体試料の量が減る。このため、試薬３０１の容量分だけ、流れ込む流路の容積を減少してもよい。蛍光反応や測定のため、基材１０１側において基材１０１を介してウェル１０２内の検出測定を行なう場合には、ウェル１０２の凹部が平坦な台形になっていることが好ましい。
　図４は、本実施形態の試料分析チップ１の断面図である。
　図４に示すように、基材１０１にウェル１０２が形成された後、ウェル１０２に反応用の試薬３０１を固定する。各ウェルで異なる試薬を用いることができる。各ウェル１０２にそれぞれ異なる試薬を固定することによって、１つ検体（試料）に対して複数の処理を施すことができる。また、実際反応を行うための試薬の一部を各ウェルに固定し、残りの試薬は液体試料と一緒に導入するようにしてもよい。
　次に、基材１０１において上記溝状構造が形成された上記第一の面に、円板形状の第二基材１２０が貼り合せられる（図２参照）。第二基材１２０は、平板状であり、基材１０１における上記第一の面に形成された溝に対する蓋となる。第二基材１２０が基材１０１に貼り合せられることにより、基材１０１に形成された溝の開口部分が封止される。
　第二基材１２０の材料は、基材１０１の材料として上記した材料の中から適宜選択して採用することができる。
　基材の貼り合わせ方法としては、一方の基材に接着層として樹脂コーティング層を設け、樹脂コーティング層を溶融させて両基材を接着する方法が挙げられる。樹脂コーティング層は、熱伝導率の高い金属材料基材に設けて溶融接着することが好ましい。樹脂コーティング層の材料としては、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）やポリアセタール、ポリエステルやポリプロピレン等の樹脂材料を用いることができる。
　基材１０１と第二基材１２０との貼り合わせ工程においては、微細加工しやすく、蛍光測定に好適な光透過性の樹脂材料を基材１０１に用い、基材１０１に対して溶融接着による貼り合わせが容易な材料を第二基材１２０に用いることが好ましい。第二基材１２０の材料としては、熱伝導率が高く、溶融接着のための樹脂コーティング層を有する金属材料を好適に採用することができる。金属材料の表面に樹脂コーティング層を形成することにより、材料を選定する際に金属材料自体の耐薬品性は考慮しなくて良い。
　また、第二基材１２０において金属材料の表面に樹脂コーティング層を形成する際、樹脂コーティング層の下地としてアンカー層を形成すると、レーザを用いた融着が可能である。レーザを用いた融着をさせるために好適なアンカー層は、レーザ波長光を吸収するカーボンブラック（光吸収性材料）が練り込まれていることが好ましい。この場合、レーザ光を照射することによりアンカー層が発熱して樹脂コーティング層を溶融接着することができる。
　また、アンカー層にカーボンブラックを添加することに代えて、樹脂コーティング層にカーボンブラックを添加したり、樹脂コーティング層の表面を黒色に塗装しても良い。例えば波長９００ｎｍ程度の赤外光フォトダイオードレーザーの光を照射することによっても樹脂コーティング層を効率良く溶融させることができる。レーザ溶着は、熱溶着と異なり、試料分析チップ１の全体を加熱する必要がないため、試料分析チップ１や試料分析チップ１に固定されている試薬に殆ど影響を与えずに基材１０１と第二基材１２０との貼り合わせをすることができる。
　次に、本実施形態の試料分析チップ１の作用について説明する。図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｃ、及び図７Ｄは、試料分析チップ１の作用を説明するための説明図である。図８Ａ、図８Ｂ、図８Ｃ、図８Ｄ、及び図８Ｅは、試料分析チップ１の使用時における溶液の移動を示す模式的な平面図である。図９Ａ、図９Ｂ、図９Ｃ、図９Ｄ、及び図９Ｅは、試料分析チップ１の使用時における溶液の移動を示す模式的な平面図である。
図７Ａ、図８Ａ～図８Ｄに示すように、溶液供給路１０７ａから液体Ｘ１が主流路１０３内に供給され、主流路１０３内は溶液で満たされる。さらに、第一バッファ部１１０と第二バッファ部１１１とにも溶液の一部が供給される。
　図７Ｂ及び図８Ｅに示すように、本実施形態の試料分析チップ１は、当該試料分析チップ１を回転させることにより生じる遠心力により、主流路１０３内に供給された溶液を各ウェル１０２に配液する。試料分析チップ１が円盤状であり、各ウェル１０２が同心円状に配置されているので、各ウェル１０２には、同じ大きさの遠心力によって溶液が配液される。さらに、各ウェル１０２は１つの円周に沿って配されているので、複数のウェル１０２のうちの１つに対して分析領域を設定すれば、試料分析チップ１の中心点を回転中心として回転させることにより全てのウェル１０２に対して順次分析をすることができる。
　ここで、２つの山部１０３ａの間に位置する主流路１０３（チャンバＣ）内の溶液がウェル１０２へと遠心力により移動されるときに、一のチャンバＣの隣に位置する他のチャンバＣ内から当該一のチャンバＣへと溶液が僅かに移動する。この僅かな量の溶液の和に相当する量の溶液を、第一バッファ部１１０と管路部１１２とに二分して配置しておくことにより、主流路１０３の両端に位置するチャンバＣからウェル１０２へ移動される溶液の不足分を補うことができる。
　このとき、遠心処理の終了後、第一バッファ１１０及び管路部１１２内に、溶液の一部（液体Ｘ２，Ｘ３）が残留する場合がある（図７Ｂ及び図８Ｅ参照）。遠心処理の終了後に残留した溶液がその後にウェル１０２に入り込むと、当該ウェル１０２における分析精度に影響を与える可能性がある。このため、第一バッファ部１１０及び管路部１１２内に残留した溶液を貯留槽１１３へと押し出す操作が行われる。
　図７Ｃ及び図９Ａ、図９Ｂ、及び図９Ｃに示すように、第一バッファ部１１０及び管路部１１２内に残留した溶液を貯留槽１１３へと押し出すためには、ウェル１０２における反応に影響を及ぼさない液体Ｙ１を溶液供給路１０７ａから主流路１０３内へ供給する。ウェル１０２における反応に影響を及ぼさない液体の例としては、例えばウェル１０２内でＰＣＲ反応を行なう場合にはミネラルオイルが好ましい。
　図９Ｄに示すように、第一バッファ部１１０及び管路部１１２内に残留した溶液が貯留槽１１３へと押し出された後は、試料分析チップ１を回転させても、貯留槽１１３内の液体は貯留槽１１３若しくは管路部１１２の内壁に押し付けられるだけで主流路１０３へは逆流しない。遠心処理の終了後であっても、図９Ｅに示すように、貯留槽１１３内に押し出された溶液が主流路１０３に戻ることができる隙間はなく、主流路１０３内は上記ミネラルオイル等の液体によって充填されている。
　これにより、第一バッファ部１１０及び管路部１１２内に残留した溶液によるウェル１０２内の反応への影響を低く抑えることができる。
　次に、本発明の一実施形態の試料分析方法について、本実施形態の試料分析チップ１を用いた場合を例に説明する。
　試料分析チップ１は、例えば、ＤＮＡ、たんぱく質等を含む試料溶液を使用した生化学物質の検出や分析に用いることができる。各ウェル１０２には、試料溶液又は試薬を固定することができる。試料溶液又は試薬を各ウェル１０２に固定する作業は、試料分析チップ１の製造時に行う。各ウェル１０２に試薬を固定し、液体試料を各ウェル１０２に配液すると、各ウェル１０２で異なる試薬を用いることができる。また、試料を各ウェル１０２に固定し、液体試薬を各ウェル１０２に配液すると、各ウェル１０２で異なる試料を用いることができる。
　以下では、ＤＮＡを含んだ試料を用いてＳＮＰｓの分析を行なう例を示す。
　例えば、各ウェル１０２に異なるＳＮＰｓプローブと酵素を固定する。これによって、多種類のＳＮＰｓ同定反応を１つの試料分析チップ１の内部で同時に行うことができる。
具体的に、基材１０１のウェル１０２にそれぞれ異なるＳＮＰｓをピペットで滴下し、基材１０１を遠心装置で２０００～３０００ｒｐｍ、１０分程度遠心し、液面を平坦な状態にして乾燥させることでウェルに固定することができる。その後、基材１０１と第二基材１２０とを貼り合わせる。
　次に、溶液供給路１０７ａから試薬等の溶液を主流路１０３に注入する。この段階では、主流路１０３のみが溶液で満たされ、前述のように側路１０５には溶液は浸入していない。これは、溶液の表面張力と、ウェル１０２側には空気の抜け穴がないことによりウェル側からの空気圧があるためである。なお、主流路１０３に溶液を注入する作業は、手作業でもよいし、分注ロボットによる自動制御でもよい。
　次に、試料分析チップ１を、所定の回転速度で中心点を回転中心として回転させる。このとき、試料分析チップ１を回転させる装置としては、例えば回転速度が１０００ｒｐｍ以上３０００ｒｐｍ以下の低速遠心機を使用することができる。なお、回転速度が３０００ｒｐｍを超える遠心機を使用することもできる。
　また、試料分析チップ１を回転させる装置として、本実施形態の試料分析チップ１の担持部１０９の位置及び形状に対応した爪が設けられた装置を使用してもよい。この場合には、試料分析チップ１の回転を安定させることができる。
　試料分析チップ１を回転させる装置により、試料分析チップ１の中心点を通り試料分析チップ１の垂直方向（本実施形態では第二基材１２０の厚さ方向）に延びる軸線を回転軸として、試料分析チップ１を回転させる。回転速度としては溶液に掛かる遠心力が前述の空気圧と表面張力より大きくなって、ウェル１０２に溶液が流入する回転速度が必要である。チップの形態にも因るが、約１０００ｒｐｍ以上であることが好ましい。チップの回転速度が約１０００ｒｐｍより小さいと、溶液が流入しないウェル１０２が発生する場合があり、液量が一定にならないおそれがある。
　遠心による試料の配液後、各ウェル１０２の混液や汚染を防ぐために、試料・試薬の反応を阻害しないオイル（ミネラルオイル）を同様の工程で各ウェルに配液する。オイルには先に配液した溶液よりも比重が軽いものを用いる必要がある。これは、試料分析チップ１を回転させ、遠心力によって配液した際に、側路１０５側で各ウェル１０２の栓の役割をするためである。オイルの比重が先に配液した溶液の比重より小さいと、試料分析チップ１を回転させたときに、回転中心に近い側にオイルが位置し、先に配液した溶液は回転中心から遠い側にとどまる。
　ウェル１０２では試薬及び試料が混合される。その後、例えばウェル１０２内の溶液を加熱してＤＮＡを変性させ、さらにウェル１０２内の溶液を冷却してＤＮＡとＳＮＰｓプローブとを結合させる。このとき、図示しない冶具等によってリップ部１１５を押しつぶすように変形させ、溶液供給路１０７ａ及び空気抜き通路１０７ｂを当該治具によって封止しておくことにより、試料分析チップ１を加熱した際に溶液が膨張したり気泡が発生したりした場合に溶液があふれ出る現象を防ぐ事が出来る。
　さらに、本例では、加熱により試料分析チップ１内の液体が膨張した場合、膨張することにより主流路１０３から溢れる液体が第一バッファ部１１０及び第二バッファ部１１１に貯留されるので、溶液供給路１０７ａ及び空気抜き通路１０７ｂから溶液が溢れるのを防止できる。
　ＤＮＡとＳＮＰｓプローブとをウェル１０２内で結合させたら、ウェル１０２内の溶液の反応状態を蛍光検出等の手法によって分析することができる。蛍光検出等を行う装置は、試料分析チップ１の外周部に設けられた位置検出構造１０８を光センサやレーザーセンサで検出することで、複数のウェル１０２のうち測定するべきウェル１０２の位置を検出する事ができる。当該装置は、試料分析チップ１を回転させて、所定のウェル１０２内の溶液における反応状態を測定することができる。
　以上のように各工程で試料分析チップに作用させる機構を備えることで、省スペースかつ試料分析の容易な試料分析装置となる。
　なお、試料分析チップ１のウェル１０２内でＰＣＲ反応をさせることもできる。この場合、基材１０１及び第二基材１２０に接する図示しない加熱冷却装置を用いてＰＣＲ反応を行なう。なお、基材１０１が光透過性の樹脂材料であって第二基材１２０が金属板である場合には、主に第二基材１２０を介してウェル１０２内の溶液の温度制御が行なわれる。
　次に、本実施形態の試料分析方法の具体例を用いて試料分析方法の詳細について説明する。
　遺伝子解析の１例としては、例えばＫ‐ｒａｓ遺伝子変異の検出や、生殖細胞変異の検出が挙げられる。Ｋ‐ｒａｓ遺伝子変異の特定はがん治療のために特定方法の確立が望まれており、生殖細胞変異の特定は薬効の推定等に利用できると考えられている。
・生殖細胞変異の検出
　生殖細胞変異はＳＮＰｓの特定によって検出できる。ＳＮＰｓの特定方法の一つとして、例えば蛍光を用いたＰＣ‐ＰＨＦＡＡ（ＰＣＲ－Ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ　Ｈｏｍｏｄｕｐｌｅｘ　Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ａｓｓａｙ）法が利用されている。当該方法によれば、蛍光試薬の発光差によって変異を検出するが、本発明の試料分析チップを用いることで、各ウェルの配液バラツキが少ないので、正確な分析が可能であることから、ＳＮＰｓ検出に好適である。また上記以外のＳＮＰｓ検出方法としてインベーダー法（登録商標）、等についても同様に試料分析チップを用いることが可能である。
　血液などから得られる検体核酸を精製して、溶液試料とする。本実施形態の試料分析チップ１に注入前または注入後配液前に、検体核酸の増幅を行なう。例えば、ＶＫＯＲＣ１、ＣＹＰ２Ｃ９＊３、ＣＹＰ２Ｃ９＊２、及びポジティブコントロールをマルチプレックスＰＣＲにてサンプル内の遺伝子断片を増幅する。サンプルを送液し、ＰＣＲを行う。
　上記の検出方法では、一つのＳＮＰを判定するために２つの検出用のウェル１０２が必要となるので１検体試料につき１０個以上のウェル１０２が形成された試料分析チップ１を使用すると良く、それぞれのウェル１０２にＳＮＰ検出用の試薬を固定する。
　上記ＰＣＲにより核酸が増幅された試料を、各ウェル１０２に配液する。各ウェル１０２を温調し、ウェル１０２内のＳＮＰ検出用試薬に混入された蛍光試薬の発光差によって変異を検出する。一つのＳＮＰに対し２つのウェル１０２のうち一つのみ陽性反応ならばホモ、二つ陽性ならヘテロと判定することができる。
・Ｋ‐ｒａｓ遺伝子変異の検出
　本例においては、上記生殖細胞変異の検出に使用される試料分析チップ１とは異なる試料分析チップ１を使用する。
　上記遺伝子変異の検出用のウェル１０２にはプローブ核酸を含む試薬が固定される。また、プローブ核酸を含んだ前記試薬には、蛍光試薬が含まれている。Ｋ‐ｒａｓ遺伝子の検出は野生型と１３種類の変異があるので少なくとも１４のウェル１０２が形成された試料分析チップ１を使用し、当該ウェル１０２のそれぞれに対応した試薬が固定化されていることが好ましい。
　大腸癌などのがん細胞を採取し、検体核酸を精製して、溶液試料とする。本発明の試料分析チップ１に注入前または注入後配液前に、検体核酸の増幅を行なう。サンプルを送液し、ＰＣＲを行う。
　上記ＰＣＲにより核酸が増幅された試料を、各ウェル１０２に配液する。
　ウェル１０２を温調し、プローブ核酸を含む試薬に混入された蛍光試薬の発光差によって変異を検出することができる。
　次に、本発明における実施例を示すが本発明はこれらに限定されるものではない。
＜実施例１＞ＳＮＰｓ解析チップ
　本実施例では、試料分析チップ１は、ＳＮＰｓの解析を行なうＳＮＰｓ解析チップとして使用される。
　ＳＮＰｓ解析チップの基材１０１として、ポリプロピレン（以下ＰＰ）の成型品を採用した。この基材１０１は、図２に示すような円盤状の外形を持ち、同心円上に波状の主流路１０３と、谷部１０３ｂに連絡口を持つ側路１０５と、側路１０５の末端にウェル１０２を有する。この基材１０１にはそれぞれ２３個のウェル１０２及び側路１０５が形成されている。また主流路１０３は周期的に面積を変え、隣接する山部１０３ａの間の主流路の容積は１２μｌである。
　上記ポリプロピレン製の基材１０１と貼り合わせる第二基材１２０として、樹脂コーティング層としてポリプロピレン樹脂がコーティングされたアルミシート基材を用いた。樹脂コーティング層には、厚みが約０．０７ｍｍのものを使用した。樹脂コーティング層は融点が１２０度前後であり、アルミニウム側に熱を与えれば溶融するように該アルミ基材にコーティングされている。
　さらに、アルミニウム層とポリプロピレン樹脂層の間にカーボンを練りこんだアンカー層が設けられ、レーザ光照射による発熱でもポリプロピレン層が溶融する構成となっている。
　ポリプロピレン製の基材１０１上のウェル１０２には下記表１の試薬類表のＳＮＰｓプローブ試薬を固定し、また別のウェル１０２にはそれぞれＰＣＲ反応を行うための酵素、及びＳＮＰｓの蛍光検出に用いるインベーダー反応用酵素（表１参照）をピペットで滴下し乾燥固定させた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　ポリプロピレン製の基材１０１とアルミ製の第二基材１２０とを重ね合わせ、第二基材１２０側に１３０度以上の熱を加えることで、第二基材１２０にコーティングされた該樹脂層が溶融させて該ポリプロピレン製の基材１０１とアルミ製の第二基材１２０とを溶着させた。
　上記の工程で作製したＳＮＰｓ解析チップに表１記載のバッファ溶液と精製されたゲノムを混合した溶液試料をピペットにて送液し、主流路１０３に充填した。この段階ではウェル１０２及び側路１０５には試料は浸入していなかった。
　ＳＮＰｓ解析チップに遠心力を与える手段として、化学、生物反応における試薬の分離などに用いられる卓上小型遠心機を利用した簡易な遠心装置を作成し、これを用いた。遠心時の回転数は回転数測定器にて測定して調整した。当該簡易な遠心装置は、担持部１０９に係合する爪を有する遠心機である。この遠心機を用いて５０００ｒｐｍにて遠心したところ、各ウェル１０２には、１１μｌの試料が送液された。 
　なお、遠心時のＳＮＰｓ解析チップの回転方向に関しては、側路の傾き方向に対していずれの方向に回転させた場合でも回転数の増加中はＳＮＰｓ解析チップ内の液挙動に影響を及ぼすが、ウェルの配液のばらつきに影響しない事が確認できた。
　続いて、反応に阻害の無い表１記載のミネラルオイルを同様の手法で送液したところ、試料はウェル１０２を満たし、残った溶液で側路１０５の半分程度を満たし、オイルは側路１０５の残り半分と谷部１０３ｂの８割を満たした。
　なお、本実施例では、２２個のウェル１０２に反応用試薬としてインベーダー反応用プローブを固定した。また、反応結果の成否を判定するために、コンタミネーションの有無の確認としてネガティブコントロールを１箇所に設定し、１枚のチップ上で反応試験を行った。
　ウェル１０２がオイルによって独立した状態のＳＮＰｓ解析チップに９５℃と６８℃を交互に３５サイクルかけ、ＰＣＲ反応によってサンプルのゲノムを増幅した。続いて、６３℃で３０ｍｉｎ温調することにより、酵素反応によりウェル１０２内で蛍光検出反応を生じさせた。
このとき、図示しない装置にリップ部１１５を上部から押しつぶさせることで、ＳＮＰｓ解析チップ内部の溶液やオイルが熱による体積膨張で外に流れ出す現象を防ぐ事が出来た。
　また、このときＳＮＰｓ解析チップのポリプロピレン基材（基材１０１）側は透明であることから、蛍光検出をポリプロピレン基材を通して外部から行った。本実施例では光電子増倍管と光ファイバを組み合わせた蛍光検出装置によって上記蛍光反応を測定した。
　図１０ないし１２は本実施例によって検出された蛍光反応によるＳＮＰｓの解析結果のグラフである。各グラフの縦軸は検出された光の強度であり、蛍光の強度を示す。横軸は時間軸である。
　図１０は反応を行った１つのウェル１０２の結果であり、所定の時間内に混合した試薬類による蛍光検出反応が生じていることが確認された。
　図１１は試薬類をあらかじめ固定していないウェルのため、蛍光反応は検出されなかった。これにより両隣からのコンタミネーションは生じていないことが確認された。
　また、図１２はポリプロピレン製のチューブにて一般的な手法で最適の分量比で試薬類とサンプルを混合して得られた検出データである（ポジティブコントロール）。
　図１０と図１２を比較すると、図１０が示す本実施例によるチップ内の反応は図１２の反応と一致していることから、本実施例では最適な分量比による反応であることが確認できる。これにより、所望した量のサンプルを配液できていることが分かる。
　本実施例１のように本発明では貼り合わせる基材を反応に合った材質で選定することで、より簡易に、かつ短時間で効率よく反応工程を行うことが可能であった。
　以上、本発明の実施形態について図面を参照し実施例を交えて詳述したが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。
　例えば、ウェル１０２の配置は、必ずしも全てのウェル１０２が１つの円周上にある必要はない。例えば、ウェル１０２の供給される溶液にかかる遠心力の大きさを異ならせる目的で、試料分析チップ１における回転中心からウェル１０２までの距離を互いに異ならせてもよい。
　また、試料分析チップ１は、回転時の重量バランスがとれていれば、円盤状以外の形状であってもよい。
　また、主流路１０３において、山部１０３ａは、山部１０３ａの頂点を間に挟んだ一方側と他方側とが非対称形状であってもよい。つまり、山部１０３ａの両側に位置する主流路１０３は、非対称に形成されてもよい。
　本発明の反応チップは、例えば核酸等の試料において生化学物質の検出や分析に用いることができる。特にＳＮＰの変異を検出できることから、がんなどの遺伝子、生殖細胞や体細胞遺伝子の変異を検出する手法へ利用することができる。また、複数の溶液を混合する容器、反応容器として利用することが可能である。
　１　試料分析チップ
　１０１　基材（第一基材）
　１０２　ウェル
　１０３　主流路
　１０３ａ　山部
　１０３ｂ　谷部
　１０５　側路
　１０７ａ　溶液供給路
　１０７ｂ　空気抜き通路
　１０８　切り欠き（位置検出構造）
　１０９　担持部
　１１０　第一バッファ部
　１１１　第二バッファ部
　１１２　管路部
　１１３　貯留槽
　１１５　リップ部
　１２０　第二基材（封止部材）

Claims (24)

  1. 　試料分析チップであって、
    　基材と、
    　前記基材に設けられた複数のウェルと、
    　前記基材において前記複数のウェルよりも回転中心に近い位置に配されて前記複数のウェルの各々に配液される溶液が供給される主流路と、前記主流路の一端に連通され前記溶液の一部を収容可能な第一バッファ部と、前記主流路の他端に連通され前記溶液の一部を収容可能な第二バッファ部と、前記第一バッファ部に一端が連通され他端が大気開放された溶液供給路と、前記第二バッファ部に一端が連通され他端が大気開放された空気抜き通路とを備え、前記基材に設けられ、前記複数のウェルに繋がる流路と、
    　を備えることを特徴とする試料分析チップ。
  2. 　請求項１に記載の試料分析チップであって、
    　前記流路は前記基材に溝状に形成されており、
    　前記基材に固定され前記流路を封止する封止部材をさらに備える
    　ことを特徴とする試料分析チップ。
  3. 　請求項２に記載の試料分析チップであって、
    　前記溶液供給路の他端と前記空気抜き通路の他端とは、いずれも前記流路が形成されている面とは反対側の面において大気開放されている
    　ことを特徴とする試料分析チップ。
  4. 　請求項１から３のいずれか一項に記載の試料分析チップであって、
    　前記第二バッファ部における前記溶液の流通方向に直交する断面の面積は、前記主流路における前記溶液の流通方向に直交する断面の面積よりも大きい
    　ことを特徴とする試料分析チップ。
  5. 　請求項１から４のいずれか一項に記載の試料分析チップであって、
    　前記第二バッファ部の容積は、前記主流路の容積よりも大きい
    　ことを特徴とする試料分析チップ。
  6. 　請求項１から５のいずれか一項に記載の試料分析チップであって、
    　前記第二バッファ部の容積は、前記第一バッファ部の容積よりも大きく、
    　前記第一バッファ部の容積と前記第二バッファ部の容積との合計は、前記主流路の容積よりも大きい
    　ことを特徴とする試料分析チップ。
  7. 　請求項１から６のいずれか一項に記載の試料分析チップであって、
    　前記溶液供給路の他端及び前記空気抜き通路の他端を囲む壁状に形成され、前記流路に前記溶液が注入された後、前記溶液供給路の他端及び前記空気抜き通路の他端を閉塞させることを目的とした装置もしくは冶具によって変形し、前記流路を密閉状態に保つことを可能としたリップ部を有する
    　ことを特徴とする試料分析チップ。
  8. 　請求項１に記載の試料分析チップであって、
    　前記主流路は、前記基材の回転中心の近くに位置する山部と、前記山部に対して前記ウェルの近くに位置する谷部とを有して蛇行して形成されており、
    　前記ウェルは、前記谷部と連通している
    　ことを特徴とする試料分析チップ。
  9. 　請求項８に記載の試料分析チップであって、
    　前記主流路の路幅は、相対的に前記山部で小さく、前記谷部で大きい
    　ことを特徴とする試料分析チップ。
  10. 　請求項１から９のいずれか一項に記載の試料分析チップであって、
    　前記基材が円盤状であり、前記複数のウェルは該基材と同心円状に配置されている
    　ことを特徴とする試料分析チップ。
  11. 　請求項１から１０のいずれか一項に記載の試料分析チップであって、
    　前記主流路と前記複数のウェルとを連絡する複数の側路を有する
    　ことを特徴とする記載の試料分析チップ。
  12. 　請求項１から１１のいずれか一項に記載の試料分析チップであって、
    　前記基材を回転させ、遠心力による溶液の送液を行うための担持部が前記基材に設けられている
    　ことを特徴とする試料分析チップ。
  13. 　請求項１２に記載の試料分析チップであって、
    　前記担持部を前記基材の外周部に有する
    　ことを特徴とする試料分析チップ。
  14. 　請求項１から１３のいずれか一項に記載の試料分析チップであって、
    　前記基材に設けられ、前記回転中心を中心とした遠心処理の前後において各ウェルの位置、角度を検出するため位置検出構造を備え、
    　前記位置検出構造は、切り欠き、穴、若しくは突起からなる機械的被検出部を有する
    　ことを特徴とする試料分析チップ。
  15. 　請求項１から１３のいずれか一項に記載の試料分析チップであって、
    　前記基材に設けられ、前記回転中心を中心とした遠心処理の前後において各ウェルの位置、角度を検出するため位置検出構造を備え、
    　前記位置検出構造は、光学的被検出部を備え、
    　前記光学的被検出部の表面粗さ若しくは光学特性は、前記基材において、前記光学的被検出部が設けられていない箇所の表面粗さ若しくは光学特性とは異なる
    　ことを特徴とする試料分析チップ。
  16. 　請求項１１に記載の試料分析チップであって、
    　前記複数の側路の各々が、前記複数のウェルのうち前記側路が接続されたウェルと前記基材の回転中心とを結ぶ直線に対して傾いて形成されていることを特徴とする試料分析チップ。
  17. 　請求項８または請求項９に記載の試料分析チップであって、
    　前記山部の両側に位置する前記主流路は、非対称に形成されている
    　ことを特徴とする試料分析チップ。
  18. 　請求項１に記載の試料分析チップであって、
    　前記複数のウェル及び前記流路が形成された第一基材と、
    　前記第一基材と貼り合わせた第二基材とを有する
    　ことを特徴とする試料分析チップ。
  19. 　請求項１８に記載の試料分析チップであって、
    　前記第一基材と前記第二基材との少なくともいずれか一方は光透過性材料で形成されていることを特徴とする試料分析チップ。
  20. 　請求項１８に記載の試料分析チップであって、
    　前記第一基材が光透過性の樹脂材料であり、
    　前記第二基材が金属材料である
    　ことを特徴とする試料分析チップ。
  21. 　請求項１に記載の試料分析チップであって、
    　前記回転中心を中心として前記基材が回転することによって、前記主流路内の前記溶液が前記ウェル内へと移動される
    　ことを特徴とする試料分析チップ。
  22. 　試料分析方法であって、
    請求項１から２１のいずれか一項に記載の試料分析チップを用いて、前記主流路に前記溶液を注入する工程と、
    　前記基材を回転させて前記溶液を前記複数のウェルの各々に配液する工程と、
    　を有することを特徴とする試料分析方法。
  23. 　請求項２２に記載の試料分析方法において、
    　前記ウェルに前記溶液を配液する工程の後に、ミネラルオイルを前記各ウェルに配液する工程を有する
    　ことを特徴とする試料分析方法。
  24. 　請求項２２又は２３に記載の試料分析方法を用いる
    　ことを特徴とする遺伝子解析方法。
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