JP6075293B2 - 試料分析チップ並びに試料分析方法及び遺伝子解析方法 - Google Patents
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Description
本願は、2011年11月25日に出願された特願2011−257824号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
本発明の第一態様の試料分析チップは、所定の回転中心を内部に含み前記回転中心を中心として回転される試料分析チップであって、基材と、前記基材に設けられた複数のウェルと、前記基材において前記複数のウェルよりも前記回転中心に近い位置に配されて前記複数のウェルの各々に配液される溶液が供給される主流路と、前記主流路の一端に連通され前記溶液の一部を収容可能な第一バッファ部と、前記主流路の他端に連通され前記溶液の一部を収容可能な第二バッファ部と、前記第一バッファ部に一端が連通され他端が大気開放された溶液供給路と、前記第二バッファ部に一端が連通され他端が前記第二バッファ部の上部において大気開放された空気抜き通路とを備え、前記基材に設けられ、前記複数のウェルに繋がる流路と、を備える。
前記第二バッファ部は、前記主流路の前記他端に連通された管路部と、前記管路部と連通され前記主流路及び前記第一バッファ部よりも前記回転中心に近い位置に配され前記空気抜き通路と連通された貯留槽と、を備える。前記試料分析チップは、前記回転中心を中心として前記基材が回転することによって、前記主流路内の前記溶液が前記ウェル内へと移動される。
また、前記担持部を前記基材の外周部に有することが好ましい。
また、前記第一バッファ部及び前記管路部は前記回転中心を中心とする円周方向に延びており、前記第一バッファ部と前記回転中心との距離と前記管路部と前記回転中心との距離とは互いに等しくてもよい。
また、本発明の第二態様の試料分析方法及び第三態様の遺伝子解析方法によれば、分析精度及び再現性の高い分析を行なうことができる。
図1に示すように、試料分析チップ1は、基材101及び第二基材120と、基材101に設けられた複数のウェル102と、ウェル102に溶液を送液するための流路(主流路103及び側路105)とを有する。
山部103aに該当する領域に存在する溶液が少ない方が、配液バラツキが少ないため、山部103aにおける主流路103の断面積は、他の部分の断面積よりも小さい。山部103aにおける主流路103の断面積を小さくするためには、山部103aの流路幅を狭くする、または、山部103aにおける主流路103の深さを浅くすればよい。或いは、山部103aの流路幅を狭くし、かつ、山部103aにおける主流路103の深さを浅くしてもよい。また、山部103aに近づくにつれて主流路103の断面積が漸次小さくなるようにすることが好ましい。
この位置検出構造108は、基材101に設けられており、回転中心を中心とした遠心処理の前後において各ウェルの位置、角度を検出するために用いられる。
具体的に、位置検出構造108は、試料分析チップ1の外周の一部が略矩形形状に切り取られた切り欠きである。
また、位置検出構造108は、光学的被検出部を有してもよい。この場合、光学的被検出部の表面粗さ若しくは光学特性は、基材101において光学的被検出部が設けられていない箇所の表面粗さ若しくは光学特性とは異なる
具体的に、試料分析チップ1の外周において位置検出構造108が設けられていない部分は、サンドブラスト、エッチング、若しくはエンボス加工等によって微細な凹凸を有し、光透過性が低い。これにより、位置検出構造108の位置は、たとえば光センサやレーザーセンサによって光の散乱の程度を検出することにより容易に検出される。また、位置検出構造108の位置を光学的な検出機構により検出することができるので、試料分析チップ1に対して非接触状態で位置検出をすることができる。
図5及び図6に示すように、第一バッファ部110は、溶液供給路107aと主流路103との間において溶液の一部を保持する空間を有する。第一バッファ部110は、主流路103と同様に、基材101において溝状に形成され、第二基材120によって封止されることによって流路状となっている。第一バッファ部110の容積は、試料分析チップ1に供給される溶液が加熱されたときの膨張量に応じて設定されることが好ましい。本実施形態では、第一バッファ部110は、第二バッファ部111における貯留槽113の外側に沿うように湾曲して形成されている。第一バッファ部110において溶液の流通方向に直交する断面形状は、本実施形態では四角形状となっている。
管路部112における溶液の流通方向の長さは、第一バッファ部110における溶液の流通方向の長さよりも短くてよい。
まず、図1に示すように、成形型を使用した成形により、ウェル102及び流路(主流路103及び側路105を含む)を有する基材(第一基材)101を形成する。
図3に示すように、基材101には、チップを貫通する溶液の溶液供給路107aと、注入液がチップに流れ込むための主流路103と、チップの外周部に延びた各ウェルと連通する側路105と、チップの外周部のウェル102とが成形されている。なお図3の断面図は溶液供給路107aからウェル102を介して空気抜き通路107bへと繋がる経路を模式的に示す。主流路103及び側路105の形状は図3に示す構造に限られない。注入される溶液をすべてのウェル102に充満するためには、主流路103の容積は、各ウェル102の容積の合計より大きい必要がある。ただし、ウェル102に後述する試薬301が固定されている場合、試薬301の容量分だけ、ウェル102に入れる液体試料の量が減る。このため、試薬301の容量分だけ、流れ込む流路の容積を減少してもよい。蛍光反応や測定のため、基材101側において基材101を介してウェル102内の検出測定を行なう場合には、ウェル102の凹部が平坦な台形になっていることが好ましい。
図4に示すように、基材101にウェル102が形成された後、ウェル102に反応用の試薬301を固定する。各ウェルで異なる試薬を用いることができる。各ウェル102にそれぞれ異なる試薬を固定することによって、1つ検体(試料)に対して複数の処理を施すことができる。また、実際反応を行うための試薬の一部を各ウェルに固定し、残りの試薬は液体試料と一緒に導入するようにしてもよい。
第二基材120の材料は、基材101の材料として上記した材料の中から適宜選択して採用することができる。
図7A、図8A〜図8Dに示すように、溶液供給路107aから液体X1が主流路103内に供給され、主流路103内は溶液で満たされる。さらに、第一バッファ部110と第二バッファ部111とにも溶液の一部が供給される。
これにより、第一バッファ部110及び管路部112内に残留した溶液によるウェル102内の反応への影響を低く抑えることができる。
試料分析チップ1は、例えば、DNA、たんぱく質等を含む試料溶液を使用した生化学物質の検出や分析に用いることができる。各ウェル102には、試料溶液又は試薬を固定することができる。試料溶液又は試薬を各ウェル102に固定する作業は、試料分析チップ1の製造時に行う。各ウェル102に試薬を固定し、液体試料を各ウェル102に配液すると、各ウェル102で異なる試薬を用いることができる。また、試料を各ウェル102に固定し、液体試薬を各ウェル102に配液すると、各ウェル102で異なる試料を用いることができる。
例えば、各ウェル102に異なるSNPsプローブと酵素を固定する。これによって、多種類のSNPs同定反応を1つの試料分析チップ1の内部で同時に行うことができる。
具体的に、基材101のウェル102にそれぞれ異なるSNPsをピペットで滴下し、基材101を遠心装置で2000〜3000rpm、10分程度遠心し、液面を平坦な状態にして乾燥させることでウェルに固定することができる。その後、基材101と第二基材120とを貼り合わせる。
生殖細胞変異はSNPsの特定によって検出できる。SNPsの特定方法の一つとして、例えば蛍光を用いたPC‐PHFAA(PCR−Preferential Homoduplex Formation Assay)法が利用されている。当該方法によれば、蛍光試薬の発光差によって変異を検出するが、本発明の試料分析チップを用いることで、各ウェルの配液バラツキが少ないので、正確な分析が可能であることから、SNPs検出に好適である。また上記以外のSNPs検出方法としてインベーダー法(登録商標)、等についても同様に試料分析チップを用いることが可能である。
本例においては、上記生殖細胞変異の検出に使用される試料分析チップ1とは異なる試料分析チップ1を使用する。
上記遺伝子変異の検出用のウェル102にはプローブ核酸を含む試薬が固定される。また、プローブ核酸を含んだ前記試薬には、蛍光試薬が含まれている。K‐ras遺伝子の検出は野生型と13種類の変異があるので少なくとも14のウェル102が形成された試料分析チップ1を使用し、当該ウェル102のそれぞれに対応した試薬が固定化されていることが好ましい。
ウェル102を温調し、プローブ核酸を含む試薬に混入された蛍光試薬の発光差によって変異を検出することができる。
本実施例では、試料分析チップ1は、SNPsの解析を行なうSNPs解析チップとして使用される。
SNPs解析チップの基材101として、ポリプロピレン(以下PP)の成型品を採用した。この基材101は、図2に示すような円盤状の外形を持ち、同心円上に波状の主流路103と、谷部103bに連絡口を持つ側路105と、側路105の末端にウェル102を有する。この基材101にはそれぞれ23個のウェル102及び側路105が形成されている。また主流路103は周期的に面積を変え、隣接する山部103aの間の主流路の容積は12μlである。
図10と図12を比較すると、図10が示す本実施例によるチップ内の反応は図12の反応と一致していることから、本実施例では最適な分量比による反応であることが確認できる。これにより、所望した量のサンプルを配液できていることが分かる。
例えば、ウェル102の配置は、必ずしも全てのウェル102が1つの円周上にある必要はない。例えば、ウェル102の供給される溶液にかかる遠心力の大きさを異ならせる目的で、試料分析チップ1における回転中心からウェル102までの距離を互いに異ならせてもよい。
101 基材(第一基材)
102 ウェル
103 主流路
103a 山部
103b 谷部
105 側路
107a 溶液供給路
107b 空気抜き通路
108 切り欠き(位置検出構造)
109 担持部
110 第一バッファ部
111 第二バッファ部
112 管路部
113 貯留槽
115 リップ部
120 第二基材(封止部材)
Claims (25)
- 所定の回転中心を内部に含み前記回転中心を中心として回転される試料分析チップであって、
基材と、
前記基材に設けられた複数のウェルと、
前記基材において前記複数のウェルよりも前記回転中心に近い位置に配されて前記複数のウェルの各々に配液される溶液が供給される主流路と、前記主流路の一端に連通され前記溶液の一部を収容可能な第一バッファ部と、前記主流路の他端に連通され前記溶液の一部を収容可能な第二バッファ部と、前記第一バッファ部に一端が連通され他端が大気開放された溶液供給路と、前記第二バッファ部に一端が連通され他端が前記第二バッファ部の上部において大気開放された空気抜き通路とを備え、前記基材に設けられ、前記複数のウェルに繋がる流路と、
を備え、
前記第二バッファ部は、
前記主流路の前記他端に連通された管路部と、
前記管路部と連通され前記主流路及び前記第一バッファ部よりも前記回転中心に近い位置に配され前記空気抜き通路と連通された貯留槽と、
を備える、
ことを特徴とする試料分析チップ。 - 請求項1に記載の試料分析チップであって、
前記流路は前記基材に溝状に形成されており、
前記基材に固定され前記流路を封止する封止部材をさらに備える
ことを特徴とする試料分析チップ。 - 請求項2に記載の試料分析チップであって、
前記溶液供給路の他端と前記空気抜き通路の他端とは、いずれも前記流路が形成されている面とは反対側の面において大気開放されている
ことを特徴とする試料分析チップ。 - 請求項1から3のいずれか一項に記載の試料分析チップであって、
前記第二バッファ部における前記溶液の流通方向に直交する断面の面積は、前記主流路における前記溶液の流通方向に直交する断面の面積よりも大きい
ことを特徴とする試料分析チップ。 - 請求項1から4のいずれか一項に記載の試料分析チップであって、
前記第二バッファ部の容積は、前記主流路の容積よりも大きい
ことを特徴とする試料分析チップ。 - 請求項1から5のいずれか一項に記載の試料分析チップであって、
前記第二バッファ部の容積は、前記第一バッファ部の容積よりも大きく、
前記第一バッファ部の容積と前記第二バッファ部の容積との合計は、前記主流路の容積よりも大きい
ことを特徴とする試料分析チップ。 - 請求項1から6のいずれか一項に記載の試料分析チップであって、
前記溶液供給路の他端及び前記空気抜き通路の他端を囲む壁状に形成され、前記流路に前記溶液が注入された後、前記溶液供給路の他端及び前記空気抜き通路の他端を閉塞させることを目的とした装置もしくは冶具によって変形され、前記流路を密閉状態に保つことを可能としたリップ部を有する
ことを特徴とする試料分析チップ。 - 請求項1に記載の試料分析チップであって、
前記主流路は、前記回転中心の近くに位置する山部と、前記山部に対して前記ウェルの近くに位置する谷部とを有して蛇行して形成されており、
前記ウェルは、前記谷部と連通している
ことを特徴とする試料分析チップ。 - 請求項8に記載の試料分析チップであって、
前記主流路の路幅は、相対的に前記山部で小さく、前記谷部で大きい
ことを特徴とする試料分析チップ。 - 請求項1から9のいずれか一項に記載の試料分析チップであって、
前記基材が円盤状であり、前記複数のウェルは該基材の中心を中心とする円周上に配置されている
ことを特徴とする試料分析チップ。 - 請求項1から10のいずれか一項に記載の試料分析チップであって、
前記主流路と前記複数のウェルとを連絡する複数の側路を有する
ことを特徴とする記載の試料分析チップ。 - 請求項1から11のいずれか一項に記載の試料分析チップであって、
前記基材を回転させ、遠心力による溶液の送液を行うための担持部が前記基材に設けられている
ことを特徴とする試料分析チップ。 - 請求項12に記載の試料分析チップであって、
前記担持部を前記基材の外周部に有する
ことを特徴とする試料分析チップ。 - 請求項1から13のいずれか一項に記載の試料分析チップであって、
前記基材に設けられ、前記回転中心を中心とした遠心処理の前後において各ウェルの位置又は角度を検出するため位置検出構造を備え、
前記位置検出構造は、切り欠き、穴、若しくは突起からなる機械的被検出部を有する
ことを特徴とする試料分析チップ。 - 請求項1から13のいずれか一項に記載の試料分析チップであって、
前記基材に設けられ、前記回転中心を中心とした遠心処理の前後において各ウェルの位置又は角度を検出するため位置検出構造を備え、
前記位置検出構造は、光学的被検出部を備え、
前記光学的被検出部の表面粗さ若しくは光学特性は、前記基材において、前記光学的被検出部が設けられていない箇所の表面粗さ若しくは光学特性とは異なる
ことを特徴とする試料分析チップ。 - 請求項11に記載の試料分析チップであって、
前記複数の側路の各々が、前記複数のウェルのうち前記側路が接続されたウェルと前記回転中心とを結ぶ直線に対して傾いて形成されていることを特徴とする試料分析チップ。 - 請求項8または請求項9に記載の試料分析チップであって、
前記山部の両側に位置する前記主流路は、非対称に形成されている
ことを特徴とする試料分析チップ。 - 請求項1に記載の試料分析チップであって、
前記複数のウェル及び前記流路が形成された第一基材と、
前記第一基材と貼り合わせた第二基材とを有する
ことを特徴とする試料分析チップ。 - 請求項18に記載の試料分析チップであって、
前記第一基材と前記第二基材との少なくともいずれか一方は光透過性材料で形成されていることを特徴とする試料分析チップ。 - 請求項18に記載の試料分析チップであって、
前記第一基材が光透過性の樹脂材料であり、
前記第二基材が金属材料である
ことを特徴とする試料分析チップ。 - 請求項1に記載の試料分析チップであって、
前記回転中心を中心として前記基材が回転することによって、前記主流路内の前記溶液が前記ウェル内へと移動される
ことを特徴とする試料分析チップ。 - 請求項1から21のいずれか一項に記載の試料分析チップであって、
前記第一バッファ部及び前記管路部は前記回転中心を中心とする円周方向に延びており、前記第一バッファ部と前記回転中心との距離と前記管路部と前記回転中心との距離とは互いに等しい
ことを特徴とする試料分析チップ。 - 試料分析方法であって、
請求項1から22のいずれか一項に記載の試料分析チップを用いて、前記主流路に前記溶液を注入する工程と、
前記基材を回転させて前記溶液を前記複数のウェルの各々に配液する工程と、
を有することを特徴とする試料分析方法。 - 請求項23に記載の試料分析方法において、
前記ウェルに前記溶液を配液する工程の後に、ミネラルオイルを前記各ウェルに配液する工程を有する
ことを特徴とする試料分析方法。 - 請求項23又は24に記載の試料分析方法を用いる
ことを特徴とする遺伝子解析方法。
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