CN108686727A - 快速定量检测PLGF和sFLT-1的微流控芯片 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了快速定量检测PLGF和sFLT‑1的微流控芯片，包括芯片基板和芯片盖板，包括芯片基板与芯片盖板通过键合而成，芯片基板上设有对称设置的2个微流控通道，芯片基板上包括依次连通的加样区、反应区、检测区、废液区，芯片盖板上设有加样孔，加样孔的位置与加样区相对应，反应区包被有荧光微球标记的PLGF抗体I或荧光微球标记的sFLT‑1抗体I，检测区内固定包被有不同表位的PLGF抗体II或sFLT‑1抗体II；本发明具有灵敏度高、可重复性好的优点，所需样本量极少，检测时间短，操作简便，检测全自动，可同时对PLGF和sFLT‑1进行检测，能够快速帮助医生预测子痫前期患病风险，对高危人群进行早期识别并干预，从而保障妊娠期母婴安全。

Description

快速定量检测PLGF和sFLT-1的微流控芯片
技术领域
本发明涉及医学检验领域，具体涉及快速定量检测PLGF和sFLT-1的微流控芯片。
背景技术
可溶性血管内皮生长因子受体1(sVEGFR-1),也称可溶性fms样酪氨酸激酶-1(sFLT-1)，最初被发现于人类脐静脉内皮细胞，是一种具有酪氨酸激酶活性的糖蛋白；胎盘生长因子(PLGF)是由胎盘分泌的血管生长因子，能够促进血管内皮细胞的增殖，是一种主要的血管生成因子，并增加内皮细胞的通透性；作为妊娠期特有的严重并发症之一，子痫前期发生率约为所有妊娠的3-5％，15％的早产和42％的孕妇死亡由子痫前期导致，对母婴健康造成严重威胁。在发病早期对有子痫前期风险的孕妇进行及时、准确的诊断有利于临床对患者进行密切监测、及时进行有效护理以控制病情、延长孕周，对于降低子痫前期发病率与死亡率、保障母婴安全具有重要意义。目前，已有大量研究证明sFLT-1和PLGF浓度的改变明显早于子痫前期发病，sFLT-1/PLGF比值可以更好地反映胎盘血管的生长情况，在评估蛋白尿和血压的基础上，联合检测sFLT-1/PLGF比值能够帮助临床更好地预测子痫前期患病风险，帮助医生对高危人群进行早期识别并干预，从而保障妊娠期母婴安全。
微流控芯片技术是把生物、化学、医学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上，自动完成分析全过程；能够极大地简化了操作流程，降低了样品和试剂消耗，并且不需要配备昂贵的仪器，使现场即时检测成为可能，具有可预见的巨大的经济价值和社会价值；因此，建立一种检测PLGF和sFLT-1的微流控芯片技术平台具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供快速定量检测PLGF和sFLT-1的微流控芯片，能够快速帮助医生预测子痫前期患病风险，对高危人群进行早期识别并干预，从而保障妊娠期母婴安全。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：快速定量检测PLGF和sFLT-1的微流控芯片，包括芯片基板和芯片盖板，包括芯片基板与芯片盖板通过键合而成，芯片基板上设有对称设置的2个微流控通道，芯片基板上包括依次连通的加样区、反应区、检测区、废液区，芯片盖板上设有加样孔，加样孔的位置与加样区相对应，加样孔位于加样区上方，反应区包被有荧光微球标记的PLGF抗体I或荧光微球标记的sFLT-1抗体I，检测区内固定包被有不同表位的PLGF抗体II或sFLT-1抗体II。
上述一种快速定量检测PLGF和sFLT-1的微流控芯片，其中，所述芯片基板、芯片上盖的截面为圆形结构。
上述一种快速定量检测PLGF和sFLT-1的微流控芯片，其中，所述微流控通道沿芯片基板的半径方向设置，2个微流控通道到芯片基板的距离相等。
上述一种快速定量检测PLGF和sFLT-1的微流控芯片，其中，所述加样区靠近芯片基板的中心。
上述一种快速定量检测PLGF和sFLT-1的微流控芯片，其中，所述加样区与反应区通过第一通道相连通，第一通道内设有过滤垫，过滤垫为全血分离膜，膜中大孔能够通过物理方式截留全血中的红细胞、白细胞，血浆从膜下游面的小孔流出，可快读分离全血中的血浆而无溶血现象，避免红细胞对检测结果的影响；所述反应区与检测区通过第二通道相连通，第二通道内设有限流柱，限流柱可有效控制流体在第二通道内的时间，从而使待测流体与抗体反应充分、完全，检测区与废液区通过第三通道相连通，第三通道内设有限位杆，限位杆靠近检测区，限位杆可以阻挡废液区中的废液返回检测区，限位杆朝向废液区的一侧设有齿状凸起，便于引流，使得检测区的流体能顺利流入废液区。
上述一种快速定量检测PLGF和sFLT-1的微流控芯片，其中，所述限流柱包括一体设计的第一限流段、第二限流段、第三限流段，第二限流段位于第一限流段、第三限流段之间，第一限流段、第三限流段的截面为长条形结构，第二限流段的截面为s形结构，限流柱的数量为2条，2条限流柱平行设置，第二通道与限流柱之间形成导流槽。
上述一种快速定量检测PLGF和sFLT-1的微流控芯片，其中，所述芯片基板、芯片上盖选用聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯、聚四氟乙烯中的一种。
上述一种快速定量检测PLGF和sFLT-1的微流控芯片，其中，所述加样区的截面为等腰梯形结构，反应区、检测区的截面为圆形结构，废液区的截面为等腰三角形结构。
上述一种快速定量检测PLGF和sFLT-1的微流控芯片，其中，所述废液区的体积大于加样区、反应区、检测区的总体积之和。
本发明还提供一种制备上述微流控芯片的方法，包括如下步骤：
(1)将过滤垫固定于第一通道中靠近加样区的一侧；
(2)将荧光微球用0.05mol/L MES缓冲液(pH＝7.2)洗涤，洗涤后，加入碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，室温反应2h,得到荧光微球溶液，将抗体I溶于0.05mol/L的PBS缓冲液(pH＝7.2)，得到抗体I溶液，将荧光微球溶液加入抗体I溶液中，室温反应2h,离心过滤，用0.01mol/L的PBS缓冲液(pH＝7.2)洗涤3-5次，得到荧光微球标记的抗体I，将荧光微球标记的抗体I滴涂于反应区；
(3)将抗体II固定包被于检测区。
检测原理：将全血样本从加样孔中加进加样区，在离心力的驱动下，全血样本经过第一通道内的过滤点，去除红细胞、白细胞，随后进入反应区；样本中的抗原与荧光微球标记的抗体反应形成，形成抗原-抗体-荧光微球复合物，在离心力的驱动下，反应区中的抗原-抗体I-荧光微球复合物从第二通道的导流槽中进入检测区，抗原-抗体I-荧光微球复合物与检测区固定的抗体II发生特异性免疫反应，形成荧光微球-抗体I-抗原-抗体II的双抗体夹心复合物，并固定在检测区；在离心力的驱动下，没有固定的样本进入废液区，通过加样孔加入清洗液，清洗微流控通道，最后将微流控芯片通过荧光检测仪进行检测。
本发明具有有益效果：本发明提供了一种快速定量检测PLGF和sFLT-1的微流控芯片，灵敏度高、可重复性好，所需样本量极少，检测时间短，操作简便，检测全自动，可同时对PLGF和sFLT-1进行检测，能够极大地简化了操作流程，降低了样品和试剂消耗，并且不需要配备昂贵的仪器，使现场即时检测成为可能，具有巨大的经济价值和社会价值；同时能够快速帮助医生预测子痫前期患病风险，对高危人群进行早期识别并干预，从而保障妊娠期母婴安全。
附图说明
图1为本发明芯片基板结构示意图；
图2为微流控通道结构示意图；
图3为图2中A处放大图；
图中：1-芯片基板，2-第一微流控通道，3-第二微流控通道，4-加样区，5-反应区，6-检测区，7-废液区，8-第一通道，9-第二通道，10-第三通道，11-过滤垫，12-限流柱，13-第一限流段，14-第二限流段，15-第三限流段，16-限位杆。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1
本实施例详细阐述了微流控芯片的结构；
如图1-2所示，快速定量检测PLGF和sFLT-1的微流控芯片，包括芯片基板1和芯片盖板，包括芯片基板与芯片盖板通过键合而成，芯片基板上设有对称设置的2个微流控通道，芯片基板上包括依次连通的加样区4、反应区5、检测区6、废液区7，芯片盖板上设有加样孔，加样孔的位置与加样区4相对应，加样孔位于加样区上方，反应区宝贝有荧光微球标记的PLGF抗体I或荧光微球标记的sFLT-1抗体I，检测区内固定包被有不同表位的PLGF抗体II或sFLT-1抗体II，
上述一种快速定量检测PLGF和sFLT-1的微流控芯片，其中，所述芯片基板1、芯片上盖的截面为圆形结构。
上述一种快速定量检测PLGF和sFLT-1的微流控芯片，其中，所述微流控通道沿芯片基板的半径方向设置，2个微流控通道到芯片基板的距离相等。
上述一种快速定量检测PLGF和sFLT-1的微流控芯片，其中，所述加样区靠近芯片基板的中心。
上述一种快速定量检测PLGF和sFLT-1的微流控芯片，其中，所述加样区与反应区通过第一通道8相连通，第一通道内设有过滤垫11，过滤垫为全血分离膜，膜中大孔能够通过物理方式截留全血中的红细胞、白细胞，血浆从膜下游面的小孔流出，可快读分离全血中的血浆而无溶血现象，避免红细胞对检测结果的影响；所述反应区与检测区通过第二通道相连通，第二通道9内设有限流柱12，限流柱可有效控制流体在第二通道内的时间，从而使待测流体与抗体反应充分、完全，检测区与废液区通过第三通道10相连通，第三通道内设有限位杆，限位杆靠近检测区，限位杆可以阻挡废液区中的废液返回检测区，限位杆16朝向废液区的一侧设有齿状凸起，便于引流，使得检测区的流体能顺利流入废液区。
上述一种快速定量检测PLGF和sFLT-1的微流控芯片，其中，所述限流柱12包括一体设计的第一限流段13、第二限流段14、第三限流段15，第二限流段位于第一限流段、第三限流段之间，第一限流段、第三限流段的截面为长条形结构，第二限流段的截面为s形结构，限流柱的数量为2条，2条限流柱平行设置，第二通道与限流柱之间形成导流槽。
上述一种快速定量检测PLGF和sFLT-1的微流控芯片，其中，所述芯片基板、芯片上盖选用聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯、聚四氟乙烯中的一种。
上述一种快速定量检测PLGF和sFLT-1的微流控芯片，其中，所述加样区的截面为等腰梯形结构，反应区、检测区的截面为圆形结构，废液区的截面为等腰三角形结构。
上述一种快速定量检测PLGF和sFLT-1的微流控芯片，其中，所述废液区的体积大于加样区、反应区、检测区的总体积之和。
实施例2
本实施例中详细阐述了定量检测PLGF的微流控芯片的制备方法；
芯片基板上设有第一微流控通道、第二微流控通道，其中第一微流控通道用于定量检测PLGF，具体包括如下步骤：
(1)将过滤垫固定于第一通道中靠近加样区的一侧；
(2)将荧光微球用0.05mol/L MES缓冲液(pH＝7.2)洗涤，洗涤后，加入碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，室温反应2h,得到荧光微球溶液，将PLGF抗体I溶于0.05mol/L的PBS缓冲液(pH＝7.2)，得到PLGF抗体I溶液，将荧光微球溶液加入PLGF抗体I溶液中，室温反应2h,离心过滤，用0.01mol/L的PBS缓冲液(pH＝7.2)洗涤3-5次，得到荧光微球标记的PLGF抗体I，将荧光微球标记的PLGF抗体I滴涂于反应区；
(3)将PLGF抗体II固定包被于检测区。
本发明所有试剂均事先固定于芯片中，省却了传统试剂盒大量试管的使用，并省却反复取样操作，节省了人力物力；
检测时：将全血样本从加样孔中加进加样区，在离心力的驱动下，全血样本经过第一通道内的过滤点，去除红细胞、白细胞，随后进入反应区；样本中的抗原与荧光微球标记的PLGF抗体反应形成，形成抗原-PLGF抗体-荧光微球复合物，在离心力的驱动下，反应区中的抗原-PLGF抗体I-荧光微球复合物从第二通道的导流槽中进入检测区，抗原-PLGF抗体I-荧光微球复合物与检测区固定的PLGF抗体II发生特异性免疫反应，形成荧光微球-PLGF抗体I-抗原-PLGF抗体II的双抗体夹心复合物，并固定在检测区；在离心力的驱动下，没有固定的样本进入废液区，通过加样孔加入清洗液，清洗微流控通道，最后将微流控芯片通过荧光检测仪进行检测，检测荧光微球的发光强度，荧光强度与待测物浓度呈相关性。
实施例3
本实施例中详细阐述了定量检测sFLT-1的微流控芯片的制备方法；
芯片基板上设有第一微流控通道、第二微流控通道，其中第二微流控通道用于定量检测sFLT-1，具体包括如下步骤：
(1)将过滤垫固定于第一通道中靠近加样区的一侧；
(2)将荧光微球用0.05mol/L MES缓冲液(pH＝7.2)洗涤，洗涤后，加入碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，室温反应2h,得到荧光微球溶液，将sFLT-1抗体I溶于0.05mol/L的PBS缓冲液(pH＝7.2)，得到sFLT-1抗体I溶液，将荧光微球溶液加入sFLT-1抗体I溶液中，室温反应2h,离心过滤，用0.01mol/L的PBS缓冲液(pH＝7.2)洗涤3-5次，得到荧光微球标记的sFLT-1抗体I，将荧光微球标记的sFLT-1抗体I滴涂于反应区；
(3)将sFLT-1抗体II固定包被于检测区。
检测时：将全血样本从加样孔中加进加样区，在离心力的驱动下，全血样本经过第一通道内的过滤点，去除红细胞、白细胞，随后进入反应区；样本中的抗原与荧光微球标记的sFLT-1抗体反应形成，形成抗原-sFLT-1抗体-荧光微球复合物，在离心力的驱动下，反应区中的抗原-sFLT-1抗体I-荧光微球复合物从第二通道的导流槽中进入检测区，抗原-sFLT-1抗体I-荧光微球复合物与检测区固定的sFLT-1抗体II发生特异性免疫反应，形成荧光微球-sFLT-1抗体I-抗原-sFLT-1抗体II的双抗体夹心复合物，并固定在检测区；在离心力的驱动下，没有固定的样本进入废液区，通过加样孔加入清洗液，清洗微流控通道，最后将微流控芯片通过荧光检测仪进行检测，检测荧光微球的发光强度，荧光强度与待测物浓度呈相关性。
将实施例3中通过荧光强度换算的sFLT-1浓度与实施2中通过荧光强度换算的PLGF浓度换算成sFLT-1/PLGF比值，sFLT-1/PLGF比值能够帮助临床更好地预测子痫前期患病风险，帮助医生对高危人群进行早期识别并干预，从而保障妊娠期母婴安全。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (9)

1.快速定量检测PLGF和sFLT-1的微流控芯片，其特征在于，包括芯片基板和芯片盖板，包括芯片基板与芯片盖板通过键合而成，芯片基板上设有对称设置的2个微流控通道，芯片基板上包括依次连通的加样区、反应区、检测区、废液区，芯片盖板上设有加样孔，加样孔的位置与加样区相对应，加样孔位于加样区上方，反应区包被有荧光微球标记的PLGF抗体I或荧光微球标记的sFLT-1抗体I，检测区内固定有不同表位的PLGF抗体II或sFLT-1抗体II。
2.如权利要求1所述的快速定量检测PLGF和sFLT-1的微流控芯片，其特征在于，所述芯片基板、芯片上盖的截面为圆形结构。
3.如权利要求1所述的快速定量检测PLGF和sFLT-1的微流控芯片，其特征在于，所述微流控通道沿芯片基板的半径方向设置，2个微流控通道到芯片基板的距离相等。
4.如权利要求1所述的快速定量检测PLGF和sFLT-1的微流控芯片，其特征在于，所述加样区靠近芯片基板的中心。
5.如权利要求1所述的快速定量检测PLGF和sFLT-1的微流控芯片，其特征在于，所述加样区与反应区通过第一通道相连通，第一通道内设有过滤垫，过滤垫为全血分离膜，所述反应区与检测区通过第二通道相连通，第二通道内设有限流柱，检测区与废液区通过第三通道相连通，第三通道内设有限位杆，限位杆靠近检测区，限位杆朝向废液区的一侧设有齿状凸起。
6.如权利要求5所述的快速定量检测PLGF和sFLT-1的微流控芯片，其特征在于，所述限流柱包括一体设计的第一限流段、第二限流段、第三限流段，第二限流段位于第一限流段、第三限流段之间，第一限流段、第三限流段的截面为长条形结构，第二限流段的截面为s形结构，限流柱的数量为2条，2条限流柱平行设置，第二通道与限流柱之间形成导流槽。
7.如权利要求1所述的快速定量检测PLGF和sFLT-1的微流控芯片，其特征在于，所述芯片基板、芯片上盖选用聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯、聚四氟乙烯中的一种。
8.如权利要求1所述的快速定量检测PLGF和sFLT-1的微流控芯片，其特征在于，所述加样区的截面为等腰梯形结构，反应区、检测区的截面为圆形结构，废液区的截面为等腰三角形结构。
9.如权利要求1所述的快速定量检测PLGF和sFLT-1的微流控芯片，其特征在于，所述废液区的体积大于加样区、反应区、检测区的总体积之和。
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