CN103988082A - 试样分析芯片和试样分析方法以及基因分析方法 - Google Patents

试样分析芯片和试样分析方法以及基因分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明的试样分析芯片(1)具有：基材(101)；设于所述基材的多个加样孔(102)；以及，设于所述基材并相连于所述多个加样孔的流路，该流路具有主流路(103)、第一缓冲部(110)、第二缓冲部(111)、溶液供给路(107a)以及排气通路(107b)，所述主流路(103)设于所述基材的比所述多个加样孔更接近于旋转中心的位置并供给分别向所述多个加样孔所分配的溶液，所述第一缓冲部(110)连通于所述主流路的一端并能够容纳所述溶液的一部分，所述第二缓冲部(111)连通于所述主流路的另一端并能够容纳所述溶液的一部分，所述溶液供给路(107a)的一端连通于所述第一缓冲部且另一端开放于大气，所述排气通路(107b)的一端连通于所述第二缓冲部且另一端开放于大气。

Description

试样分析芯片和试样分析方法以及基因分析方法
技术领域
本发明涉及一种试样分析芯片和试样分析方法以及基因分析方法。
本申请基于2011年11月25日申请的特愿2011-257824号申请主张优先权，并在此援引其内容。
背景技术
以往，例如在DNA反应、蛋白质反应等的生化反应领域中，作为处理微量试样溶液的反应装置，已知的有被称为μ-TAS(全分析系统：TotalAnalysis System)或芯片实验室(Lab-on-Chip)的技术。该技术是向一个芯片或盒提供多个反应室(下称“加样孔”)或流路的技术，能够进行多个被检体的分析或者多个反应。已知这些技术能够通过使芯片和盒小型化而减少药品的使用量，并具有各种优点。
作为上述优点，例如可举出：由于使以往所使用的强酸或强碱药品的用量微量化，因此能够明显降低对人体或环境的影响；另外，使在生化反应等中使用的高额试剂类的消耗量微量化，因此能够降低进行分析、反应所需的成本等。
为了使用芯片或盒进行最有效的生化反应，必须在多个加样孔内分别配置不同种类的药品或被检体、酶，且由一个或多个主导管集中将与这些药品或被检体、酶发生反应的试剂流入到加样孔内，由此进行多个不同的反应。
若使用上述方法，则能够用相同的试剂同时处理多种被检体，或者相反地，能对一种被检体同时实施多个处理，因此可大幅度减少以往所需耗费的时间和劳力、成本。
在使用这种方法时，重要的是将等量的样品溶液输送到多个反应场所的技术和使各加样孔的内装物不相互混杂的技术。作为这种将液体输送到加样孔内的芯片的现有技术，可举出以下技术。
在专利文献1，在利用离心力从液体储存部向加样孔输送液体的芯片中，为了使加样孔独立，对其流路进行变形、密封。
在专利文献2中，通过采用穿插自转+公转的离心方法，解决向各个加样孔的输液量的偏差问题。
在专利文献3中，公开了将液体储存部和具有在离心方向上延伸的流路的加样孔多个加以连接的分析用介质，但在该文献中，并没有关注液体分配(配液性)等，相反地公开了通过与填充在加样孔内的空气之间的推挤来控制流体。
以往技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表2004-502164号公报
专利文献2：日本特许第3699721号公报
专利文献3：日本特开2008-83017号公报
发明内容
发明要解决的课题
但是，专利文献1所记载的芯片中，需要挤碎流路的机构，难以实现自动化。另外，若像以往的离心式输液芯片那样从中央的液体储存部向周围的加样孔进行离心输液，则会在各个加样孔的输液量中发生偏差。
另外，若要使用专利文献2所记载的离心方法，则需要使芯片发生自转且公转的复杂的机构和空间。
另外，专利文献3所记载的分析用介质中，液体储存部和液体储存部之间流路中的液体没有被输送，因此，输送到各个加样孔的液量之间存在较大偏差，在每次反应的结果中都存在偏差。
本发明就是鉴于上述情况而完成的，本发明的目的在于提供一种送液方法简单且各加样孔的液量之间的偏差小、能够适合进行通过加热冷却或加温而进行的化学反应、酶反应并且成本低的试样分析芯片。
解决课题所用的方法
为了解决上述问题，在本发明中提出了如下方案。
本发明的第一方式的试样分析芯片，其具有：基材；设于所述基材的多个加样孔；以及设于所述基材并相连于所述多个加样孔的流路。该流路具有主流路、第一缓冲部、第二缓冲部、溶液供给路以及排气通路，所述主流路设于所述基材的比所述多个加样孔更接近于旋转中心的位置并供给有分别向所述多个加样孔所分配的溶液，所述第一缓冲部连通于所述主流路的一端并能够容纳所述溶液的一部分，所述第二缓冲部连通于所述主流路的另一端并能够容纳所述溶液的一部分，所述溶液供给路的一端连通于所述第一缓冲部且另一端开放于大气，所述排气通路的一端连通于所述第二缓冲部且另一端开放于大气。所述试样分析芯片的特征为，通过所述基材以所述旋转中心作为中心进行旋转，以使所述主流路内的所述溶液向所述加样孔内移动。
另外，优选所述流路在所述基材上形成为沟槽状，进一步具有固定于所述基材并密封所述流路的密封部件。
另外，优选所述溶液供给路的另一端和所述排气通路的另一端均在与形成有所述流路的面相反侧的面上开放于大气。
另外，优选所述第二缓冲部的正交(垂直相交)于所述溶液流通方向的剖面的面积大于所述主流路的正交于所述溶液的流通方向的剖面的面积。
另外，优选所述第二缓冲部的容积大于所述主流路的容积。
另外，优选所述第二缓冲部的容积大于所述第一缓冲部的容积，所述第一缓冲部的容积与所述第二缓冲部的容积之和大于所述主流路的容积。
另外，优选具有凸缘，该凸缘为围绕所述溶液供给路的另一端以及所述排气通路的另一端的壁状，所述溶液注入到所述流路之后，能够通过以堵塞所述溶液供给路的另一端以及所述排气通路的另一端为目的的装置或模具而进行变形，从而使所述流路保持密闭状态。
另外，优选所述主流路具有位于所述基材的旋转中心侧的山部和相对于所述山部而位于所述加样孔侧的谷部，并以蜿蜒方式形成；优选所述加样孔连通于所述谷部。
另外，优选所述主流路的路径宽度，在所述山部相对小，在所述谷部相对大。
另外，对所述山部而言，将所述山部的顶点夹于中间的所述山部的一侧和另一侧可以构成非对称形状。
另外，优选所述基材为圆盘状、并将所述多个加样孔配置成与所述基材呈同心圆状。
另外，优选具有连通于所述主流路和所述多个加样孔的多个侧路。
另外，优选本发明的试样分析芯片中在所述基材上设有使所述基材旋转并在离心力作用下进行溶液输送的承载部。
另外，优选在所述基材的外周部具有所述承载部。
另外，所述基材上设有位置检测构造，该位置检测构造用于检测以所述旋转中心为中心进行的离心前后的各个加样孔位置、角度。优选所述位置检测构造具有由切口、孔或突起所构成的机械被检测部。另外，优选所述位置检测构造具有光学被检测部，且所述光学被检测部的表面粗糙度或光学特性不同于所述基材中未设有所述光学被检测部的部位的表面粗糙度或光学特性。
另外，优选所述多个侧路分别以倾斜于所述多个加样孔中连有所述侧路的加样孔与所述基材的旋转中心相连接的直线的方式来形成。
另外，所述主流路也可以相对于旋转中心方向以倾斜的方式形成。
另外，优选所述试样分析芯片具有形成有所述多个加样孔和所述流路的第一基材、以及贴合所述第一基材的第二基材。
另外，优选所述第一基材和所述第二基材的至少一者由光透过性材料形成。
另外，优选所述第一基材为光透过性树脂材料、所述第二基材为金属材料。
本发明的第二方式的试样分析方法，是使用了本发明的试样分析芯片的试样分析方法，该试样分析方法包括：向所述主流路注入所述溶液的工序；以及旋转所述基材并向所述多个加样孔中的各个加样孔分配所述溶液的工序。
另外，优选在向所述加样孔分配所述溶液的工序之后具有向所述各个加样孔分配矿物油的工序。
本发明的第三方式的基因分析方法，使用了本发明的试样分析方法。
发明效果
基于本发明的第一方式的试样分析芯片，输送液体的方法简单且各加样孔的液量偏差小，能够适合实施基于加热冷却或加温进行的化学反应、酶反应，且能够实现低成本。
另外，基于本发明的第二方式的试样分析方法以及第三方式的基因分析方法，能够进行分析准确度高和重复性高的分析。
附图说明
图1是表示本发明的第一实施方式的试样分析芯片的俯视图。
图2是相同的试样分析芯片的分解立体图。
图3是沿着图1的A-A线的剖面图。
图4是相同的试样分析芯片的示意性剖面图。
图5是相同的试样分析芯片的俯视图，其显示了溶液的流通路经。
图6是沿着图5所示的流通路经展开相同的试样分析芯片的展开图。
图7A是用于说明相同试样分析芯片的作用的说明图。
图7B是用于说明相同试样分析芯片的作用的说明图。
图7C是用于说明相同试样分析芯片的作用的说明图。
图7D是用于说明相同试样分析芯片的作用的说明图。
图8A是表示使用相同试样分析芯片时溶液移动的示意性俯视图。
图8B是表示使用相同试样分析芯片时溶液移动的示意性俯视图。
图8C是表示使用相同试样分析芯片时溶液移动的示意性俯视图。
图8D是表示使用相同试样分析芯片时溶液移动的示意性俯视图。
图8E是表示使用相同试样分析芯片时溶液移动的示意性俯视图。
图9A是表示使用相同试样分析芯片时溶液移动的示意性俯视图。
图9B是表示使用相同试样分析芯片时溶液移动的示意性俯视图。
图9C是表示使用相同试样分析芯片时溶液移动的示意性俯视图。
图9D是表示使用相同试样分析芯片时溶液移动的示意性俯视图。
图9E是表示使用相同试样分析芯片时溶液移动的示意性俯视图。
图10是表示本发明实施例的分析结果的曲线图。
图11是表示本发明实施例的分析结果的曲线图。
图12是表示本发明实施例的分析结果的曲线图。
具体实施方式
根据附图说明本发明的第一实施方式的试样分析芯片。图1是表示本实施方式的试样分析芯片的一种方式的俯视图。图2是表示本实施方式的试样分析芯片结构的一种形态的分解立体图。
如图1所示，试样分析芯片1具有：基材101和第二基材120、设于基材101上的多个加样孔102以及用于向加样孔102输送溶液的流路(主流路103和侧路105)。
试样分析芯片1整体上形成为圆板形状，通过未图示的分析装置等使其以圆板的中心点为旋转中心进行旋转。试样分析芯片1中，主流路103和侧路105配置为与多个加样孔102相比更靠上述中心点侧。通过旋转试样分析芯片1，主流路103内的溶液在离心力作用下向各个加样孔102移动。
在主流路103的一端(主流路第一端)设有能够容纳向主流路103供给的溶液的一部分的第一缓冲部110。另外，在主流路103的另一端(主流路第二端)设有能够容纳向主流路103供给的溶液的一部分的第二缓冲部111。而且，基材101上形成有溶液供给路107a和排气通路107b，该溶液供给路107a的一端(溶液供给路第一端)连通于第一缓冲部110且另一端(溶液供给路第二端)开放于大气，该排气通路107b的一端(排气通路第一端)连通于第二缓冲部111且另一端(排气通路第二端)开放于大气。
主流路103形成为具有一个在相邻的加样孔102之间朝向中心点方向突出的山部103a。在此，相邻的加样孔102是指，从主流路103至加样孔102的送液流路呈前后关系的加样孔。另外，朝中心点方向突出的山部103a是指具有朝着中心点方向的最大点的曲线形状。如此地，在相邻的加样孔之间形成具有朝中心方向的一个山，从而在芯片旋转时注入到主流路103处的液体在山部103a中自然地中断，因此可以减少朝向各个加样孔102的配液量(溶液分配量)偏差。
另外，主流路103的路径宽度在山部103a处窄，在谷部103b处宽。虽然在相当于山部103a的区域内存在的溶液少，但是溶液分配的偏差小，因此在山部103a的主流路103的剖面面积小于其他部分的剖面面积。为了减小在山部103a的主流路103的剖面面积，可以使山部103a的流路宽度变窄，或者使山部103a中的主流路103的深度变浅。或者，也可以使山部103a的流路宽度变窄并且使山部103a中的主流路103的深度变浅。另外，优选使主流路103的剖面面积随着靠近山部103a逐渐变小。
另外，通过调整谷部103b的路径宽度能够设定朝向各个加样孔102的配液量。如此地，位于相互邻接的两个山部103a之间的主流路103作为腔室C发挥作用，该腔室C用于针对一个加样孔102分配规定容量的溶液。本实施方式中，通过从山部103a至邻接的山部103a的主流路103构成的所述腔室C与各个加样孔102构成一对一的对应关系，该腔室C设置成与加样孔102的数目相同的数目。各个腔室C是相同的形状且相同的大小，各个腔室C的容积相等。因此，通过将容纳于各个腔室C中的溶液分配于各个加样孔102，使各个加样孔102中均等地分配有同量的溶液。
侧路105具有连通主流路103的谷部103b和加样孔102的管路状的形状。侧路105相对于连接中心点和加样孔102的直线构成呈倾斜的直线状。如此地，通过侧路105倾斜，施加离心力时使加样孔102的空气沿着侧路105的内侧(中心点侧的内面)朝向主流路103方向移动，使溶液沿着侧路105的外侧(加样孔102侧的内面)朝着加样孔102方向移动，因此能够顺利地向加样孔102内移动溶液。作为倾斜的角度，优选中心点方向和侧路105构成的角度为10度至80度之间。若在10度以下，则存在发生来自加样孔102的排气和朝向加样孔102的溶液浸入进行干涉而阻止溶液的浸入的情况；若超过80度，则存在朝向侧路105方向的离心力变弱而溶液不向加样孔102移动的情况。
加样孔102和主流路103的连接部位，即主流路103和侧路105的连接部位为主流路103的谷部103b。由此，能够减少溶液分配时移向主流路103的溶液的残余。这是因为，谷部103b是在主流路103的相邻山部103a之间距中心点距离最远的地方。
另外，主流路103和加样孔102的连接口，构成为在旋转芯片前的阶段溶液不浸入加样孔102的程度的宽度和剖面面积。主流路103和加样孔102的连接口的宽度和剖面面积，是基于溶液的表面张力大小设定为适当的大小。例如，若溶剂为水，则所述连接口的形状优选高度为2mm以下且宽度为2mm以下的矩形形状。另外，若溶剂为水，则连接口的剖面面积优选4mm2以下。
另外，为了在加样孔102内不残留空气，在加样孔102中距中心点距离最近的点上连接侧路105和加样孔102。
另外，加样孔102的容积优选1μl以上且100μl以下。当加样孔102的容积小于1μl时，离心力不会充分地起到作用，难以向加样孔102输送液体。另外，加样孔102的容积大于100μl时，可能会发生试剂的混合性降低或者加样孔102内的温度的均匀性降低的现象。
试样分析芯片1的外周部上形成有位置检测构造108。位置检测构造108形成在试样分析芯片1的外周的一个部位，并且以使位置检测构造108的位置与各个加样孔102的位置之间的关系成为预先规定的关系的方式构成。例如，在本实施方式中，位置检测构造108形成在溶液的流通方向上距离第一缓冲部110最近的加样孔102的附近。
该位置检测构造108设于基材101上，用于检测以旋转中心作为中心进行的离心处理前后的各个加样孔的位置、角度。
本实施方式中，位置检测构造108具有由切口、孔或突起所构成的机械被检测部。
具体地，位置检测构造108是试样分析芯片1的外周的一部分被切割成大致矩形形状的切口。
另外，位置检测构造108可以具有光学被检测部。此时，光学被检测部的表面粗糙度或光学特性不同于所述基材101的未设有所述光学被检测部的部位的表面粗糙度或光学特性。
具体地，试样分析芯片1的外周的未设有位置检测构造108的部分具有通过喷砂、蚀刻或模压加工等形成的微细的凹凸，其光透过性低。由此，通过例如光传感器、激光传感器检测光散射的程度而容易检测到位置检测构造108的位置。另外，位置检测构造108的位置能够通过光学检测机构检测，因此，能够在非接触状态下对试样分析芯片1进行位置检测。
此外，由于位置检测构造108为切口，因此还能够使用接触开关进行机械检测来代替使用光传感器或激光传感器进行的光学检测。此时，虽然不适合试样分析芯片1在高速旋转时的位置检测，但是能够以低成本构成用于进行试样分析芯片1的位置检测的仪器。
另外，在试样分析芯片1的外周部分上，以圆周上120度为间隔形成有共计三个承载部109。承载部109是对用于使试样分析芯片1旋转的仪器进行限位的凹部。该仪器能够通过将例如爪部件等限位于承载部109上而保持试样分析芯片1。对应于该仪器的构成而设定承载部109的形状、数量以及设置。只要沿着试样分析芯片1的周方向相邻的承载部109以试样分析芯片1的中心点为中心呈小于180度的角度，则不限定承载部109的数量。另外，承载部109也可以是在厚度方向上贯通基材101的贯通孔，此时承载部109也可以是两个。
图5是试样分析芯片1的俯视图，显示了溶液的流通路经。图6是沿着图5所示的流通路经展开试样分析芯片1而成的展开图。
如图5和图6所示，第一缓冲部110具有保持溶液供给部107a和主流路103之间的溶液的一部分的空间。第一缓冲部110与主流路103相同，在基材101上形成沟槽状，并通过由第二基材120进行密封而成的流路状。优选根据向试样分析芯片1供给的溶液被加热时的膨胀量而设定第一缓冲部110的容积。本实施方式中，第一缓冲部110是以沿着第二缓冲部111中的储存槽113的外侧的方式进行弯曲而形成。在第一缓冲部110中与溶液的流通方向正交的剖面形状在本实施方式中呈四方形。
第二缓冲部111具有管路部112和连通于管路部112的储存槽113，其中，管路部112构成为与第一缓冲部110相同的剖面形状。
管路部112的一端连通于主流路103。溶液从主流路103流入至管路部112。管路部112以沿着储存槽113的外侧的方式进行弯曲而形成，并且从试样分析芯片1的中心点至管路部112的距离，相同于从该中心点至第一缓冲部110的距离。由此，试样分析芯片1沿着中心点周边进行旋转动作时，位于管路部112内的溶液受到与位于第一缓冲部110内的溶液相同大小的离心力。
管路部112中溶液的流通方向的长度，可以短于第一缓冲部110中溶液的流通方向的长度。
储存槽113在与管路部112连接的部分，形成为正交于溶液的流通方向的剖面面积大于管路部112中的相应的剖面面积。另外，储存槽113的容积和管路部112的容积的合计大于主流路103的容积。在储存槽113的内部，储存有主流路103内的溶液的一部分以及后述的油的一部分。另外，储存槽113的高度尺寸(从第二基材120中朝向基材101侧的面出发在垂直于该面的方向上测定的尺寸)大于管路部112的高度尺寸(从第二基材120中朝向基材101侧的面出发在垂直于该面的方向上测定的尺寸)。因此，在储存槽113内储存有比重大的溶液(例如，试样水溶液等)的状态下，当比该溶液比重小的溶液(例如，矿物油等)通过管路部112流入到储存槽113时，比重小的溶液移动到比重大的溶液之上，从而覆盖比重大的溶液。
接着，针对本发明的试样分析芯片的制造方法进行说明。
首先，如图1所示，通过使用成型模进行成型来形成具有加样孔102以及流路(含有主流路103和侧路105)的基材(第一基材)101。
基材101在厚度方向的第一面上形成由制造后的加样孔102、主流路103、侧路105、溶液供给路107a、排气通路107b、第一缓冲部110、以及第二缓冲部111构成的沟槽状结构。在此，溶液供给部107a、排气通路107b也开口于基材101的厚度方向的第二面上。另外，在所述第二面上，一体化形成有凸缘部115，该凸缘部115具有围绕溶液供给部107a、排气通路107b的连续的壁状形状。
另外，若基材101的厚度为10μm～300μm的范围，则能够适宜地满足基材101的热传导性和密封性两方面。若基材101的厚度大于300μm，则有可能使热容量变大、热敏性降低。
作为基材101的材料，优选使用具有光透过性的树脂。另外，针对加样孔102内的溶液进行光学分析(荧光测定、比色测定等)时，优选基材101的透明性高。例如，基材101的材料，只要是不影响试样的材料就没有特别限定。然而，特别是使用含有聚丙烯、聚碳酸酯、丙烯酸中的任一种树脂材料，能够确保良好的可视光透过性。作为聚丙烯，可以使用均聚聚丙烯或者聚丙烯与聚乙烯的无规共聚物。另外，作为丙烯酸，可以使用聚甲基丙烯酸甲酯、或者甲基丙烯酸甲酯与其他甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯、苯乙烯等单体的共聚物。另外，若使用这些树脂材料，则能够确保芯片的耐热性、强度。作为树脂材料以外的材料，可例举有铝、铜、银、镍、黄铜、金等的金属材料。若使用金属材料，则进一步在热传导率和密封性能方面优异。
此外，通过使基材101的加样孔102的底部透明化，能够从外部进行荧光等的检测、分析。此外，本发明的“透明”和“光透过性”是指在形成时的可视光域(波长350～780nm)的总平均透过率为70％以上。
作为基材101的加工方法，在树脂材料的情况下，可以使用注射成型、真空成型等各种树脂成型法、机械切削等。在金属材料的情况下，可以通过施加针对厚基材进行利用的磨削加工或蚀刻、针对薄金属板进行的冲压加工或拉拔加工而形成。
另外，作为基材101特别是在使用含有聚丙烯、聚碳酸酯、丙烯酸中的任一种树脂材料时，能够确保良好的光透过性、耐热性、强度。另外，若基材101的厚度为50μm～3mm范围，则能够确保良好的光透过性、耐热性、强度，能够确实地进行凹部的加工。
图3是本实施方式的试样分析芯片1的剖面图。
如图3所示，基材101上成型有：贯通芯片的溶液的溶液供给部107a、用于使注入液流入至芯片的主流路103、在芯片的外周部上延伸的与各个加样孔连通的侧路105、芯片的外周部的加样孔102。此外，图3的剖面图示意性显示了从溶液供给部107a经由加样孔102向排气通路107b连接的路经。主流路103以及侧路105的形状并不限定于图3所示的结构。为了向加样孔102充满注入的溶液的全部，主流路103的容积需要大于各个加样孔102的容积的合计。但是，若在加样孔102上固定有后述的试剂301，则进入加样孔102内的液体试样的量减少试剂301的容量份。因此，可以将流入的流路的容积减少试剂301的容量份。为了荧光反应或测定，在基材101侧经由基材101而进行加样孔102内的检测测定时，优选加样孔102的凹部构成为平坦的梯形(台形)。
图4是本实施方式的试样分析芯片1的剖面图。
如图4所示，基材101上形成加样孔102之后，加样孔102上固定反应用试剂301。各个加样孔中可以使用不同的试剂。通过在各个加样孔102上分别固定不同的试剂，可以针对一个被检体(试样)实施多种处理。另外，将用于进行实际反应的试剂的一部分固定于各个加样孔，并将余量的试剂与液体试样一起导入也可。
接着，在基材101的形成有上述沟槽状结构的上述第一面上，贴合圆板形状的第二基材120(参考图2)。第二基材120为平板状，其构成对应基材101在所述第一面上所形成的沟槽的盖子。通过将第二基材120贴合于基材101，对形成于基材101上的沟槽的开口部分进行密封。
第二基材120的材料，可以从作为基材101的材料的上述材料中进行适当选择使用。
作为基材的贴合方法，可以举出在一基材上设置作为粘接层的树脂涂层并熔融树脂涂层而粘接两基材的方法。树脂涂层优选设置在热传导率高的金属材料基材上并进行熔融粘接。作为树脂涂层的材料，可以使用聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)或聚缩醛、聚酯或聚丙烯等的树脂材料。
在基材101和第二基材120的贴合工序中，基材101优选使用易于进行细微加工并适合进行荧光测定的光透过性树脂材料，第二基材120优选使用通过熔融粘接容易贴合于基材101的材料。作为第二基材120的材料，优选使用热传导率高且具有用于熔融粘接的树脂涂层的金属材料。通过在金属材料的表面上形成树脂涂层，在选定材料时可以不考虑金属材料自身的耐药品性。
另外，在第二基材120中金属材料的表面上形成树脂涂层时，作为树脂涂层的基底而形成锚定层时，可以用激光进行熔融。适于使用激光进行熔融的锚定层，优选混合有吸收激光波长光的炭黑(光吸收性材料)。此时，在激光照射下锚定层发热，从而能够熔融粘接树脂涂层。
另外，可以在树脂涂层中添加炭黑、或者将树脂涂层的表面涂装成黑色以代替锚定层中添加炭黑。例如，即使是照射波长900nm左右的红外光敏二极管的光，也能够有效熔融树脂涂层。激光熔接与热熔接不同，无需加热试样分析芯片1的整体，因此能够对试样分析芯片1、固定在试样分析芯片1的试剂几乎不产生影响地进行基材101和第二基材120的贴合。
接着，针对本实施方式的试样分析芯片1的作用进行说明。图7A、图7B、图7C以及图7D是用于说明试样分析芯片1的作用的说明图。图8A、图8B、图8C、图8D以及图8E是表示使用试样分析芯片1时溶液的移动的示意性俯视图。图9A、图9B、图9C、图9D以及图9E是表示使用试样分析芯片1时溶液的移动的示意性俯视图。
如图7A、图8A～图8D所示，液体X1从溶液供给路107a供给至主流路103内，溶液充满在主流路103内。进而，还向第一缓冲部110和第二缓冲部111中供给有溶液的一部分。
如图7B以及图8E所示，本实施方式的试样分析芯片1通过旋转该试样分析芯片1而产生的离心力，将供给于主流路103内的溶液分配于各个加样孔102中。试样分析芯片1是圆盘状且各个加样孔102以同心圆状的方式进行设置，因此溶液在相同大小的离心力作用下分配于各个加样孔102。此外，各个加样孔102沿着一个圆周进行设置，因此针对多个加样孔102中的一个加样孔来设定分析区域时，通过以试样分析芯片1的中心点作为旋转中心进行旋转，能够对全部加样孔102依次进行分析。
在此，位于两个山部103a之间的主流路103(腔室C)内的溶液在离心力作用下向加样孔102移动时，从一个腔室C的相邻位置的另一个腔室C向该腔室C少量地移动溶液。通过将与此少量溶液之和相当的量的溶液，预先分成两份而配置于第一缓冲部110和管路部112，能够补充从位于主流路103两端的腔室C移动至加样孔102的溶液的不足量。
此时，存在离心处理结束后溶液的一部分(液体X2、X3)残留于第一缓冲部110以及管路部112内的情况(参考图7B和图8E)。若离心处理结束后残留的溶液在此后进入加样孔102，则可能影响该加样孔102的分析精度。因此，实施将第一缓冲部110和管路部112内残留的溶液挤出至储存槽113的操作。
如图7C以及图9A、图9B以及图9C所示，为了将残留于第一缓冲部110以及管路部112内的溶液挤出至储存槽113，从溶液供给部107a向主流路103内供给不影响加样孔102中的反应的液体Y1。作为不影响加样孔102中的反应的液体的例子，例如在加样孔102内进行PCR反应时优选矿物油。
如图9D所示，残留于第一缓冲部110以及管路部112内的溶液挤出至储存槽113之后，即使旋转试样分析芯片1，储存槽113内的液体仅被挤压在储存槽113或管路部112的内壁，不会向主流路103逆流。即使离心处理结束后，如图9E所示，没有能够致使挤出至储存槽113内的溶液返回至主流路103的空隙，主流路103内被所述矿物油等液体所填充。
由此，能够将第一缓冲部110以及管路部112内残留的溶液对加样孔102内的反应产生的影响控制至很低。
接着，针对本发明的第一实施方式的试样分析方法，以使用本实施方式的试样分析芯片1的情况为例进行说明。
试样分析芯片1能够应用于例如使用含有DNA、蛋白质等的试样溶液的生物化学物质的检测或分析。各个加样孔102中能够固定试样溶液或试剂。在制造试样分析芯片1时，进行将试样溶液或试剂固定于各个加样孔102中的操作。在各个加样孔102中固定试剂并向各个加样孔102分配液体试样时，各个加样孔102中可以使用不同的试剂。另外，在各个加样孔102中固定试样并将液体试剂分配给各个加样孔102时，各个加样孔102中可以使用不同的试样。
下面，示出使用含有DNA的试样进行的SNPs分析的例子。
例如，在各个加样孔102中固定不同的SNPs探针和酶。由此，能够在一个试样分析芯片1的内部中同时进行多种SNPs鉴定反应。
具体地，通过移液管分别向基材101的加样孔102滴加不同的SNPs，并通过离心装置将基材101以2000～3000rpm离心10分钟左右，使液面形成平坦的状态并进行干燥，从而能够固定于加样孔中。然后，贴合基材101和第二基材120。
接着，将试剂等的溶液从溶液供给路107a注入到主流路103。在此阶段中，只有主流路103充满着溶液，而如上所述地，溶液不浸入侧路105。其原因在于，溶液的表面张力，以及因加样孔102侧上没有排气孔而存在的来自加样孔侧的空气压。此外，向主流路103注入溶液的操作可以是手控操作，也可以是由分配机器人进行的自动控制。
接着，以中心点为旋转中心使试样分析芯片1以规定的旋转速度进行旋转。此时，作为旋转试样分析芯片1的装置，可以使用例如旋转速度为1000rpm以上且3000rpm以下的低速离心机。此外，可以使用旋转速度超过3000rpm的离心机。
另外，作为旋转试样分析芯片1的装置，可以使用设置有爪的装置，该爪对应于本实施方式的试样分析芯片1的承载部109的位置以及形状。此时，能够稳定地进行试样分析芯片1的旋转。
通过使试样分析芯片1旋转的装置，以沿着经过试样分析芯片1的中心点的试样分析芯片1的垂直方向延伸的轴线作为旋转轴，使试样分析芯片1旋转。作为旋转速度，需要施加于溶液的离心力大于前述的空气压和表面张力并使溶液向加样孔102中流入的旋转速度。虽然芯片的形状也是原因，但是优选约1000rpm以上。若芯片的旋转速度小于1000rpm，则会发生溶液不流入加样孔102的情况，有可能会使液量达不到一定量。
在离心力作用下分配试样之后，为了防止各个加样孔102的液体混杂或污染，采用相同的工序向各个加样孔分配不妨碍试样、试剂发生反应的油(矿物油)。油需要使用比重小于在先分配的溶液的物质。其原因在于，使试样分析芯片1旋转并在离心力作用下进行分配时，油在侧路105侧起到各个加样孔102的塞子的作用。若油的比重小于在先分配的溶液的比重，则在使试样分析芯片1旋转时，油位于接近旋转中心的一侧，在先分配的溶液停留于远离旋转中心的一侧。
在加样孔102中混合试剂和试样。然后，例如，加热加样孔102内的溶液而使DNA变性，进一步冷却加样孔102内的溶液而使DNA和SNPs探针结合。此时，通过未图示的模具等以挤压凸缘部115的方式使其变形，通过该模具密封溶液供给路107a以及排气通路107b，从而可以防止加热试样分析芯片1时溶液膨胀或者发生气泡的情况下发生溶液溢出的现象。
此外，在本例中，试样分析芯片1内的液体通过加热发生膨胀时，通过膨胀从主流路103溢出的液体储存于第一缓冲部110和第二缓冲部111中，因此，能够防止溶液从溶液供给路107a以及排气通路107b溢出。
若在加样孔102内使DNA和SNPs探针结合，则能够通过荧光检测等方法分析出加样孔102内的溶液的反应状态。实施荧光检测等的装置是，通过光传感器或激光传感器检测在试样分析芯片1的外周部所设有的位置检测构造108，能够检测多个加样孔102中应测定的加样孔102的位置。该装置能够通过使试样分析芯片1旋转而测定规定的加样孔102内的溶液中的反应状态。
如上所述，通过具有各个工序中作用于试样分析芯片的机构，构成了节省空间并容易进行试样分析的试样分析装置。
此外，还能够在试样分析芯片1的加样孔102内进行PCR反应。此时，通过使用与基材101和第二基材120相接的未图示的加热冷却装置来进行PCR反应。此外，当基材101为光透过性树脂材料、第二基材120为金属板时，主要是经过第二基材120控制加样孔102内的溶液温度。
接着，通过使用本实施方式的试样分析方法的具体例子，针对试样分析方法的详细内容进行说明。
作为基因分析的一个例子，例如，可以举出K-ras基因突变的检测、生殖细胞突变的检测。对于K-ras基因突变的判定，期望构建用于癌症治疗的判定方法；对于生殖细胞突变的判定，认为能够应用于药效的推定等。
·生殖细胞突变的检测
通过SNPs的判定能够检测生殖细胞突变。作为SNPs的判定方法之一，可利用例如对荧光加以使用的PC-PHFAA(PCR-Preferential HomoduplexFormation Assay：PCR-同源双链优先形成试验)方法。基于该方法，虽然根据荧光试剂的发光差来检测突变，但通过使用本发明的试样分析芯片，各个加样孔的溶液分配的偏差小，因此能够进行正确的分析，从而适于SNPs检测。另外，对于作为上述以外的SNPs检测方法的侵染检测方法(Invader法、注册商标)等，也可同样地使用试样分析芯片。
纯化从血液等中取得的被检体核酸以作为溶液试样。在注入到本实施方式的试样分析芯片1之前或注入后进行溶液分配之前，进行被检体核酸的扩增。例如，对于VKORC1、CYP2C9﹡3、CYP2C9﹡2以及阳性对照，通过多重PCR扩增样品内的基因片段。输送样品溶液，并进行PCR。
上述的检测方法中，为了判断一个SNP需要两个检测用加样孔102，因此，对一个被检体试样使用形成有十个以上的加样孔102的试样分析芯片1即可，对各个加样孔102固定SNP检测用试剂。
将通过上述PCR扩增核酸的试样溶液分配于各个加样孔102中。对各个加样孔102进行调温，并根据混入到加样孔102内的SNP(单核苷酸多态性)检测用试剂中的荧光试剂的发光差来检测突变。对一个SNP而言，若两个加样孔102中只有一个显示阳性反应则判断为同源(homo)，若有两个显示为阳性则判断为异源(hetero)。
·K-ras基因突变的检测
在本例中，使用了与上述生殖细胞突变的检测中所用的试样分析芯片1不同的试样分析芯片1。
上述基因突变的检测用加样孔102中固定着含有探针核酸的试剂。另外，在含有探针核酸的上述试剂中，含有荧光试剂。对K-ras基因的检测而言，由于有野生型和13种突变，因此优选使用至少形成有14个加样孔102的试样分析芯片1，且在各加样孔102中固定对应的试剂。
采集大肠癌等的癌细胞，并纯化被检体核酸以用作溶液试样。在注入到本发明的试样分析芯片1之前或者注入后进行溶液分配之前，进行被检体核酸的扩增。输送样品溶液，并进行PCR。
将通过上述PCR扩增核酸而成的试样分配于各个加样孔102中。
对加样孔102进行调温，能够根据混入到含有探针核酸的试剂中的荧光试剂的发光差来检测突变。
实施例
下面，虽示出了本发明的实施例，但本发明并不局限于这些示例。
＜实施例1＞SNPs分析芯片
在本实施例中，试样分析芯片1用作实施SNPs分析的SNPs分析芯片。
作为SNPs分析芯片的基材101，采用了聚丙烯(下称PP)的成型品。此基材101具有如图2所示的圆盘状外形，并具有同心圆上的波状主流路103、在谷部103b有连接口的侧路105、侧路105末端的加样孔102。该基材101上分别形成有23个加样孔102和侧路105。另外，主流路103周期性地改变面积，邻接的山部103a之间的主流路的容积是12μl。
作为与上述聚丙烯制的基材101贴合的第二基材102，使用了被涂布有聚丙烯树脂作为树脂涂层的铝板基材。对树脂涂层而言，使用了厚度约为0.07mm的材料。树脂涂层的熔点是120度左右，若在铝侧加热则以熔融的方式被涂布于该铝基材上。
进一步地，在铝层和聚丙烯树脂层之间设置有混合了碳的锚定层，并且形成即使是激光照射下的发热也会使聚丙烯层熔融的结构。
在聚丙烯制的基材101上的加样孔102中，固定下述表1的试剂类表的SNPs探针试剂，另外，在其他的加样孔102中以移液管滴加用于进行各自PCR反应的酶以及用于SNPs的荧光检测的侵染反应用酶(参照表1)，并使其干燥固定。
表1
将聚丙烯制基材101和铝制第二基材120重叠，并在第二基材120侧施加130度以上的热，从而使涂布于第二基材120上的该树脂层熔融并使该聚丙烯制基材101和铝制第二基材120熔接。
针对上述工序中制造的SNPs分析芯片，通过移液管输送混合有表1记载的缓冲溶液和纯化的基因组的溶液试样，使其填充于主流路103。在此阶段，试样未浸入加样孔102以及侧路105中。
作为对SNPs分析芯片施加离心力的装置，制作了针对化学、生物反应中的试剂分离等所用的小型台式离心机加以利用的简易离心装置，并使用了该装置。通过旋转速度测定器测定并调整离心时的旋转速度。该简易离心装置为具有卡合于承载部109的爪的离心机。利用该离心机以5000rpm进行离心时，向各个加样孔102中输送11μl的试样。
此外，关于离心时的SNPs分析芯片的旋转方向，可以确定下述情况：对于侧路的倾斜方向进行任意方向的旋转时，虽然旋转速度的增加过程中会影响SNPs分析芯片内的液体的动态，但不会影响加样孔的溶液分配的偏差。
接着，通过同样的方法输送对反应没有妨碍的表1中记载的矿物油时，试样填满了加样孔102，剩余的溶液填满了侧路105的一半左右，油填满了侧路105的剩余一半和谷部103b的八成。
此外，本实施例中，在22个加样孔102中，作为反应用试剂固定了侵染反应用探针。另外，为了判断反应结果的成功与否，在一个部位设定了阴性对照并在一个芯片上进行反应实验，以作为是否存在污染的确认。
对于加样孔102通过油而处于独立状态的SNPs分析芯片，以95℃和68℃交替进行35个循环，通过PCR反应扩增了样品的基因组。接着，在63℃温度下进行30分钟调温，由此在加样孔102内通过酶反应产生荧光检测反应。
此时，通过未图示的装置从上部挤碎凸缘部115，由此能够防止SNPs分析芯片内部的溶液或油因热而体积膨胀导致流向外部的现象。
另外，此时SNPs分析芯片的聚丙烯基材(基材101)侧为透明，因此通过聚丙烯基材从外部进行荧光检测。在本实施例中，通过组合光电倍增管和光纤而成的荧光检测装置来测定上述荧光反应。
图10至图12是通过本实施例检测的由荧光反应产生的SNPs的分析结果的曲线图。各个曲线图的纵轴是所检测的光强度，以荧光的强度来表示。横轴是时间轴。
图10是进行了反应的一个加样孔102的结果，确认在规定时间内产生基于混合的试剂类引起的荧光检测反应。
图11是预先未固定试剂类的加样孔，因而未检测到荧光反应。因此，可以确认未发生来自相邻两侧的污染。
另外，图12是通过聚丙烯制的管由一般的方法以最适宜的用量比混合试剂类和样品而得到的检测数据(阳性对照)。
比较图10和图12时，根据图10所示的本实施例在管内的反应与图12的反应一致，因此可以确认到本实施例是根据最适宜的用量比进行的反应。由此可知，能够分配所需量的样品溶液。
如本实施例1所示，本发明中选定适合与贴合的基材反应的材质，由此可以更加简易地且在短时间内有效地实施反应工序。
以上，针对本发明的实施方式，参照附图并结合实施例而进行了详细说明，但是，具体的构成并不限定于该实施方式，还包括不脱离本发明要旨的范围的设计变更等。
例如，对加样孔102的设置而言，无需所有的加样孔102一定设置于一个圆周上。例如，基于使针对供给于加样孔102的溶液施加的离心力的大小不同的目的，可将从试样分析芯片1中的旋转中心至加样孔102的距离设置成相互不同的距离。
另外，只要能够保持旋转时的重量平衡，试样分析芯片1可以是圆盘状以外的形状。
另外，主流路103中，山部103a可以是将山部103a的顶点夹于中间的一侧和另一侧为非对称形状。也就是说，位于山部103a的两侧的主流路103可以形成为非对称。
工业实用性
本发明的反应芯片，例如能够用来检测或分析核酸等试样中的生化物质。特别是，由于能够检测SNP的突变，因此可应用于检测癌等的基因、生殖细胞或体细胞基因的突变的检测方法中。另外，也可以用作混合多种溶液的容器、反应容器。
附图标记的说明
1：试样分析芯片
101：基材(第一基材)
102：加样孔
103：主流路
103a：山部
103b：谷部
105：侧路
107a：溶液供给路
107b：排气通路
108：切口(位置检测构造)
109：承载部
110：第一缓冲部
111：第二缓冲部
112：管路部
113：储存部
115：凸缘部
120：第二基材(密封部件)

Claims (24)

1.一种试样分析芯片，其特征在于，具有：
基材；
设于所述基材的多个加样孔；以及
设于所述基材并相连于所述多个加样孔的流路，该流路具有主流路、第一缓冲部、第二缓冲部、溶液供给路以及排气通路，所述主流路设于所述基材的比所述多个加样孔更接近于旋转中心的位置并供给分别向所述多个加样孔所分配的溶液，所述第一缓冲部连通于所述主流路的一端并能够容纳所述溶液的一部分，所述第二缓冲部连通于所述主流路的另一端并能够容纳所述溶液的一部分，所述溶液供给路的一端连通于所述第一缓冲部且另一端开放于大气，所述排气通路的一端连通于所述第二缓冲部且另一端开放于大气。
2.如权利要求1所述的试样分析芯片，其特征在于，
所述流路在所述基材上形成为沟槽状，
进一步具有固定于所述基材并密封所述流路的密封部件。
3.如权利要求2所述的试样分析芯片，其特征在于，
所述溶液供给路的另一端和所述排气通路的另一端，均在与形成有所述流路的面相反侧的面上开放于大气。
4.如权利要求1～3中任一项所述的试样分析芯片，其特征在于，
所述第二缓冲部的正交于所述溶液的流通方向的剖面的面积，大于所述主流路的正交于所述溶液的流通方向的剖面的面积。
5.如权利要求1～4中任一项所述的试样分析芯片，其特征在于，所述第二缓冲部的容积大于所述主流路的容积。
6.如权利要求1～5中任一项所述的试样分析芯片，其特征在于，
所述第二缓冲部的容积大于所述第一缓冲部的容积，
所述第一缓冲部的容积与所述第二缓冲部的容积之和大于所述主流路的容积。
7.如权利要求1～6中任一项所述的试样分析芯片，其特征在于，
具有凸缘，该凸缘形成为围绕所述溶液供给路的另一端以及所述排气通路的另一端的壁状，所述溶液注入到所述流路之后，能够通过以堵塞所述溶液供给路的另一端以及所述排气通路的另一端为目的的装置或模具而进行变形，从而使所述流路保持密闭状态。
8.如权利要求1所述的试样分析芯片，其特征在于，
所述主流路具有位于所述基材的旋转中心附近的山部和相对于所述山部而位于所述加样孔附近的谷部，并以蜿蜒方式形成，
所述加样孔连通于所述谷部。
9.如权利要求8所述的试样分析芯片，其特征在于，所述主流路的路径宽度，在所述山部相对小，在所述谷部相对大。
10.如权利要求1～9中任一项所述的试样分析芯片，其特征在于，所述基材为圆盘状，所述多个加样孔配置成与所述基材呈同心圆状。
11.如权利要求1～10中任一项所述的试样分析芯片，其特征在于，具有连通于所述主流路和所述多个加样孔的多个侧路。
12.如权利要求1～11中任一项所述的试样分析芯片，其特征在于，在所述基材上设置用于使所述基材旋转并在离心力作用下进行溶液输送的承载部。
13.如权利要求12所述的试样分析芯片，其特征在于，在所述基材的外周部上具有所述承载部。
14.如权利要求1～13中任一项所述的试样分析芯片，其特征在于，
具有位置检测构造，该位置检测构造设于所述基材上并用于检测以所述旋转中心作为中心进行的离心处理前后的各个加样孔位置、角度，
所述位置检测构造具有由切口、孔或突起所构成的机械被检测部。
15.如权利要求1～13中任一项所述的试样分析芯片，其特征在于，
具有位置检测构造，该位置检测构造设于所述基材上并用于检测以所述旋转中心作为中心的离心处理前后的各个加样孔位置、角度，
所述位置检测构造具有光学被检测部，
所述光学被检测部的表面粗糙度或光学特性，不同于所述基材中未设有所述光学被检测部的部位的表面粗糙度或光学特性。
16.如权利要求11所述的试样分析芯片，其特征在于，所述多个侧路分别以倾斜于所述多个加样孔中连有所述侧路的加样孔与所述基材的旋转中心相连接的直线的方式来形成。
17.如权利要求8或9所述的试样分析芯片，其特征在于，位于所述山部的两侧的所述主流路以非对称形式构成。
18.如权利要求1所述的试样分析芯片，其特征在于，具有：形成有所述多个加样孔和所述流路的第一基材；以及贴合所述第一基材的第二基材。
19.如权利要求18所述的试样分析芯片，其特征在于，所述第一基材和所述第二基材中的至少一者由光透过性材料形成。
20.如权利要求18所述的试样分析芯片，其特征在于，所述第一基材为光透过性树脂材料，所述第二基材为金属材料。
21.如权利要求1所述的试样分析芯片，其特征在于，所述基材以所述旋转中心作为中心进行旋转，由此使所述主流路内的所述溶液向所述加样孔内移动。
22.一种试样分析方法，其特征在于，包括：
通过使用权利要求1～21中任一项所述的试样分析芯片来向所述主流路注入所述溶液的工序；以及
旋转所述基材并分别向所述多个加样孔中的各个加样孔分配所述溶液的工序。
23.如权利要求22所述的试样分析方法，其特征在于，包括：
在向所述加样孔分配所述溶液的工序之后，向所述各个加样孔分配矿物油的工序。
24.一种基因分析方法，其特征在于，采用了权利要求22或23所述的试样分析芯片。
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