CN110191759B - 微流控样品芯片、基于该芯片的分析系统及pcr检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于检测生物样品、尤其用于PCR型和/或荧光测定的空心块体形式的微流控样品芯片，所述空心块体具有至少一个腔室，所述至少一个腔室由上壁(44)、下壁(42)和至少一个侧壁(43)界定，所述至少一个腔室中可引入样品进行检测。根据本发明，所述块体的所述下壁(42)由具有高导热率的材料制成，所述上壁由具有低导热率的材料制成并另外优选可透过可见光谱在400nm和700nm之间的辐射，所述块体具有至少两个开口(290、291)，可通过所述至少两个开口将所述样品引入所述腔室的至少一个(45)中，且在引入所述样品时，可通过所述至少两个开口排空所述腔室(45)中存在的空气。

Description

微流控样品芯片、基于该芯片的分析系统及PCR检测方法
背景技术
根据第一方面，本发明涉及一种用于可变温度循环的热化的微流控芯片，所述芯片由其中有可包含至少一种流体的空腔的块体材料形成，该空腔包括至少一个入口孔和至少一个出口孔，所述流体入口孔连接至至少两个流体注入通道。
根据该第一方面，其还涉及一种用于使用该热化芯片来使包含DNA的样品快速改变热交换温度的系统，以及一种用于检测样品中的DNA序列的PCR方法。
根据第二方面，本发明还涉及一种用于测试生物样品、尤其用于PCR型和/或荧光类型分析的具有中空块体形状的微流控样品芯片，所述中空块体包括至少一个腔室，所述至少一个腔室由上壁、下壁和至少一个侧壁界定，所述至少一个腔室中可引入待测试的样品。
根据该第二方面，其还涉及一种用于包含在样品芯片的腔室中的PCR型样品的分析系统，以及一种用于使用所述芯片和使用用于所述样品的荧光测量的系统来检测DNA序列的PCR方法。
根据所述第一方面，例如，与通过使用需要重复温度循环的反应(以下称为DNA样品的热“循环”，用于进行“聚合酶链反应”或更简单地“热循环”)来检测液体样品中的DNA序列的各种方法和装置有关的现有技术的详细技术在如下专利中有所说明：专利申请WO2009/105499。
在这些热循环方法中，一些方法有利地使用在样品附近循环的传热液体以控制其温度。使用传热液体可获得所述样品的非常均匀的热化温度，这是因为对流限制了液体中温度梯度的出现，这与基于局部加热或利用热电元件的局部热泵的解决方案不同，而后者可在局部产生温度梯度。使用传热液体还实现到样品的非常有效的热传递，这是因为其仅取决于样品与传热液体的热接近程度和传热液体的对流系数，这些条件在这种液体在小尺寸的管道(微流控通道)中运输时是非常重要的。此外，使用传热液体可快速获得对于具有大体积(优于1微升)的样品的精确和均匀的温度控制(无论其大小如何)，且当样品放置在附近时，其温度很快趋向于传热液体的温度，者与基于热能注入的系统不同，比如焦耳效应加热，而后者则难以仅通过控制注入的功率来均匀地控制温度。
US-A-5508197说明了以下方案：通过使传热液体在不同温度下预先“热化”(即达到精确和均匀的温度)来使具有非常薄的壁并包含PCR样品的阱孔热化，以通过使用一系列阀门连续地在阱孔周围循环，其中这些阀门将液体从热化储罐重新引导至多个样品。该系统实现了在约8秒内来改变样品温度，但该系统由于通过阱孔传递热量和15μl样品的体积而使速度受到限制，样品的该几何构型和尺寸无法实现更快速的传递。在该系统中，用于热化样品的液体体积很重要(约150mL)，以便使液体流速很重要(约10L/min)，而液体中的液体体积必须很重要(约25L)，以确保良好的温度稳定性。这些体积限制使得该系统体积庞大且能量密集。另外，该系统由于其尺寸而难以进行运输。
EP-A-2415855说明以下方案：通过在不同温度下连续循环两种传热液体以使由薄铝板制成的阱孔中的样品热化来进行PCR反应，从而使得可利用具有扁平形状的阱孔来获得非常快速的温度变化(高达0.3s)该系统中使用的液体体积仍然保持很大(大约几十毫米)，以及流速(超过60mL/min)很大，从而使系统变得笨重且耗能。
WO2011/138748说明了以下方案：一种微流控芯片和一种用于调节样品温度的系统，包括包括多个设置在具有平行六面体形状的空腔的底部的微流控通道，并包括低导热率的下壁以避免在使用过程中导致热量损失，以及包括在其上沉积待分析的样品的高导热率的上壁，从而在通道中循环的传热液体与样品之间实现良好的热交换。
传热液体通过入口孔注入微流控通道中，并通过微流控通道另一端的出口孔回收。传热液体的温度在外部和远离芯片的入口孔的上游得到调节。一种用于制造该类型的芯片的方法的一个示例如ELVESYS公司的网站www.elveflow.com所述，其中文章题为“micro-fluidics and micro-fluidic chips：a Review”。
该类型的芯片已由作者Houssin等人在2016年“The royal society ofchemistry2016”中公开的文章“Ultrafast sensor and large volume on-chip realtime PCR for the molecular diagnosis of bacterial and viral infections”中使用，在该文章中，他们说明了实施热“循环”方法以进行不完全令人满意的PCR反应：通过在微流控芯片中交替循环来实现样品的温度变化，该微流控芯片包含与样品的热交换区、两种已通过使用两个热电模块(珀耳帖效应装置)预先热化的传热液体。芯片和样品之间的热交换使得能够进行液体样品的温度交替，从而使得可扩增样品中的DNA序列。
如果该系统能够以低液体流速(约10mL/min或160μL/s)来进行快速热化(也约2s)，则该系统的性能仍受到供应芯片的管道的体积和热化的限制。的确，当液体不在芯片中流动时，具有小的体积并因此具有低的热惯性的管道的温度(微流控管道的直径从一微米到几百微米不等)则在几秒钟内趋向于室温。当液体再次循环时，首先要在接近室内温度的温度下排出所有液体(根据发明人进行的实验约为0.5秒)，然后使管道热化，也就是说使其达到稳定的温度，这取决于发明人从几秒到几十秒进行的实验。在达到这种稳定性之前，注入芯片中的液体的温度受到向管道传递热量的干扰。因此，实现95％的所需温度变化需要大约两秒钟，但根据条件变化，在较长时间内(一般约十秒)可观察到高达几度的温度漂移。由于温度漂移因取决于施加的温度变化之前的管道的温度而不可再生，所以不可能通过该系统来快速准确地控制小流量的样品温度，而这样是可实现系统的小型化并从而使其易于运输的。
US2006/188979公开了一种用于在相同温度下在多个平行通道中同时使多种试剂与样品反应的系统，该通道的数量等于意图在该系统中使用的试剂的数量。
因此，现有技术中目前提出的通过使用传热液体来快速改变温度的各种解决方案无法实现样品的温度(即少于约5秒)的控制，而这样可具有快速、准确、均匀、可重复和低能量的特点并使用了紧凑的设备。
尽管如此，当前需要快速测试来定向诊断需要诸如在光和低能量装置中进行几分钟的PCR的反应，该装置可能是现场操作的，即该装置一方面具有小尺寸，而另一方面则可由电池供电。
由于PCR型分析需要30到40个温度循环，所以每个周期的最短持续时间约为8秒，在样品温度变化的持续时间内获得的每秒则在这种类型的测试的总持续时间e上是显著的增益。
此外，基于PCR、特别是对于多重检测的分子检测试剂盒的复杂性对循环的不同阶段的温度施加了精确控制，以便正常运行。
发明内容
根据本发明的第一方面所述的微流控热化芯片、系统和方法使得可解决因此产生的问题。
根据本发明所述的微流控热化芯片由块体材料形成的微流控热化芯片，其中所述块体中依次设置有：
-流体注入区，所述流体注入区包括至少一个用于流体注入的微流控通道，
-平行六面体形空腔，所述平行六面体形空腔具有上侧，所述上侧包括热交换区，所述热交换区在所述空腔的所述上侧处设有表面热化区S，所述热化区包括至少一个用于所述流体循环的微流控通道，该空腔设有至少一个来自所述流体注入区的流体入口孔和至少一个流体出口孔，所述热交换区在所述至少一个流体入口孔和至少一个流体出口孔之间延伸，其特征在于，其优选包括单个流体入口孔、优选一个流体出口孔，并还包括用于绕过所述空腔的至少一个微流控通道，所述至少一个微流控通道在第一端连接至用于所述流体注入的所述微流控通道中的至少一个，所述旁路通道在所述流体注入通道处的连接处与所述空腔的所述流体入口孔相距距离L，每个连接处与所述流体入口孔之间的距离L如下：
L＜S/a
S是所述空腔的所述上侧的所述热化区的表面，以m2表示
a是等于0.005m的校正系数。
优选地，L将小于或等于0.02m，而每个流体注入通道将优选连接至至少一个旁路通道。
所述芯片将优选包括至少两个微流控流体注入通道。
根据一个优选实施例，所述芯片将具有相同数量的、优选两个注入通道和旁路通道，每个旁路通道连接至单个注入通道。
有利地，所述空腔将包括多个流体循环通道，所述多个流体循环通道平行设置以防止气泡的形成。
在另一个实施例中，所述芯片的特征在于，所述空腔还包括位于所述微流控通道中的所述入口孔和所述流体入口之间的输入均化区，所述输入均化区进入对应于所述热交换区的所述流体循环通道中，以便特别是在将所述流体注入所述流体循环通道之前，将所述流体的速度均化。
例如，所述输入均化区可包括均化树，所述均化树创建用于所述入口孔和所述流体入口之间的流体的多个流动路径，这些路径具有基本相同的长度。
根据另一个变例，所述芯片将由平行六面体形的块体材料形成，所述块体材料的空腔由相对于所述空腔的侧壁而一体或独立的上板封闭，所述上板具有旨在与所述样品接触的上侧并优选具有小于0.002m的厚度。所述上板或与所述芯片集成在一起、或在使用期间中独立地添加至所述芯片中。
例如，所述上板可由玻璃和/或金属制成。
根据又一个变例，所述空腔还可包括位于所述微流控通道的所述流体出口和所述空腔的所述流体出口孔之间的输出均化区，以便特别是在将所述流体注入所述流体出口孔之前，将所述流体的温度均化。
根据一个优选实施例，所述输出均化区将包括均化树，所述均化树创建用于所述微流控通道的所述流体出口与所述空腔的所述流体出口孔之间的流体的多个流动路径，这些路径具有基本相同的长度。
优选地，所述平行六面体形空腔的厚度小于0.001m，优选小于或等于500微米。
根据又一个变例，所述芯片将包括至少一个阀门，所述至少一个阀门布置在其注入通道和/或旁路通道中的至少一个中。
优选地，三通3/2分配阀位于所述空腔的所述入口处，用于在不同温度下切换进入两个液体入口之间的所述空腔的液体源，而所述两个旁路通道上的两个2/2型阀门能够在一个通道的所述液体朝向所述空腔中的所述热化区域时关闭所述通道。在该构型中，所述3/2阀的通用方向(输出)连接至所述空腔的所述入口，而另外两个方向(入口)则分别连接至所述流体注入通道。可利用相同模式来使用具有与n个2/2阀门相关的n个位置的分配阀(n大于二)，以切换进入所述通道之间的所述空腔的所述液体源。
根据另一个实施例，可使用多个位于所述连接处的3/2阀来用于将所述液体从所述注入通道重新引导至所述空腔或所述旁路通道。在该构型中，每个3/2阀的通用方向连接至对应的液体注入通道，而这些相同的阀门的其他2个方向则在一方面连接至所述空腔，并在另一方面连接至对应的旁路方向。
另一个实施例旨在将2/2阀定位在所述旁路方向和所述热化区与所述连接处之间的通道部分中的每个上，以便将注入的所述液体重新引导进所述热化区或所述旁路通道中。
优选地，所述阀门集成进所述芯片中。为此，安装在底座上的该类型微型阀门(例如制造商SMC的LVM09系列阀门)可直接安装在所述芯片上，或压力或电磁阀可集成进所述芯片中，以使所述热化区和与所述旁路通道的连接处之间的所述流体路径的长度最小化。
本发明还涉及一种微流控系统，所述微流控系统包括如上所述的芯片、具有布置在所述空腔上的第一导热薄膜，以及用于接纳与待分析的DNA样品混合的PCR试剂的样品架，该第一导热薄膜优选通过密封方式来封闭该芯片，并在该芯片上固定住并优选胶粘住。
例如，所述导热材料的薄膜可至少部分地布置在所述芯片的平坦表面上并例如在压力下保持在其上，以在与所述薄膜接触时确保所述传热液体处的密封。
根据一个变例，所述样品架将包括位于其下部的第二导热材料的薄膜，所述第二导热材料的薄膜旨在与所述第一薄膜接触。
优选地，根据本发明所述的系统还将包括装置，所述装置用于在所述通道中在压力下循环至少一种传热流体。
根据一个优选实施例，根据本发明所述的系统将包括装置，所述装置用于在所述注入通道和所述旁路通道中在不同温度下循环多种、优选两种传热液体，并用于交替地向所述空腔供应这些液体中的一种，同时其他传热液体，优选仅一种液体则将在所述注入通道中向上循环至所述连接处，然后在相关的旁路通道中流动。
一般来说但不是必须的，所述向空腔交替地供应不同的传热液体将通过改变所述传热液体的相应压力来进行。
根据一个变例，所述向空腔交替地供应不同的传热液体将通过布置在不同管道中的阀门的方式来进行。
本发明还涉及一种用于优选使用如上所述的芯片来进行PCR型反应的方法，所述芯片具有或不具有如上所述的样品架，其中在不同温度下将DNA样品交替地放置成与至少一种第一和第二传热液体间接热接触，所述至少一种第一和第二传热液体在所述微流控通道中循环并交替地供应空腔以实现与所述样品的热交换，在所述方法中，当将所述液体中的一种送至所述空腔时，另一种液体绕过所述空腔，反之亦然，所述两种液体通过具有连接处的供应管交替地进入所述空腔，所述连接处使所述液体可流入所述空腔或绕过所述空腔，所述连接处与所述空腔的所述入口之间的距离小于0.02米。
优选地，该方法将使用如本申请所述的热化芯片和/或系统。
一般来说，所述空腔的所述入口和/或所述出口将在所述热化区(与所述样品进行热交换)的所述入口(和/或所述出口)处包括压力均化网络(均化树)，并包括所述入口和/或所述出口孔与所述流体循环通道的所述流体入口和/或出口之间的一系列通道分区，以便所述流体在所述孔和/或所述流体入口/出口之间行进的所述路径(因此对流体流动的阻力)可在随时流体入口和/或出口孔口之间的整个距离上基本相同。该均化树实现了在整个表面S上具有均匀速度的基本平行的流体流动，从而在整个交换表面S上实现均匀的对流，这也实现了温度变化在空间上均匀的速度，更精确来说实现了温度变化的空间均匀动力学(随时间演变的曲线)。
只要通过机械加工、成型、使用3D打印机等创建必要的通道网络，选择制造芯片的材料就会变得非常多样化。优选地，其尤其可选自聚合物，比如PDMS或聚碳酸酯、陶瓷、玻璃和/或其组合。
在一个优选实施例中，形成所述热化芯片的所述块体将包括至少一个空腔，所述至少一个空腔的壁限定平坦上表面，在所述平坦上表面上有多个优选基本彼此平行、开放且形成所述空腔的通道，而根据一个实施例变例，所述平台表面将由薄板或良好导热材料的薄膜覆盖，所述材料优选为金属或玻璃，以便封闭所述空腔。该板和/或薄膜或与所述空腔的侧壁成一体，或放置在这些壁的上边缘上并在压力和/或重力下保持，以便可移动并与实际芯片分离。
根据另一个实施例变例，所述芯片将包括至少一个阀门，所述至少一个阀门布置在其通道中的至少一个中。优选地，其将包括用于每个液体供应通道的阀门，并包括用于每个旁路通道的阀门。当然，这些阀门不一定集成在所述芯片中，并可位于所述芯片外、所述流体供应管道或所述旁路管道中。
本发明还涉及一种微流控系统，所述微流控系统包括如上所述的芯片、布置在所述空腔上以封闭后者的第一导热薄膜，以及位于所述薄膜(或板)上用于接纳待分析的所述DNA样品的样品架。
根据第一变例，所述向空腔交替地供应不同的传热液体通过改变所述传热液体的相应压力来进行。因此，当在进入所述空腔之前传热液体供应通道交汇时，具有较高压力的液体将迫使所述通道进入该空腔，或使其他液体停止并将其转移至相应的连接处(及这些通道存在时的相关旁路通道)，以实现其连续的循环(需要或不需要返回至传热液体供应储罐)。一般来说，进入所述空腔的所述传热液体将同时在与其相关的所述旁路通道(若存在)中流动。在仅存在一个旁路通道且进入所述空腔的所述传热液体在与绕过所述空腔的通道无关的供应通道中循环的情况下，所述传热液体将停止在该供应通道中循环。因此，应了解，在某些情况下，该解决方案可能比组合供应通道和旁路通道的优选解决方案效率低。
根据本发明第一方面所述的系统的第二变例，所述向空腔交替地供应不同的传热液体将通过布置在各种管道中的阀门的方式来进行。
然后，通常在每个连接处下游的每个传热液体供应通道中设置至少一个阀门，但不是必需的，但是当这些通道在到达所述空腔之前交汇时，则在不同液体供应通道之间的接合处的上游设置所述至少一个阀门。该阀门可选地是位于所述连接处的3/2阀，且其对于每个供应通道，实现了将所述液体引导至所述旁路通道或所述空腔。
所述系统还可优选地包括几种传热液体来源，所述传热液体各自的温度通过控制所述传热液体的温度的装置来独立地进行控制所述传热液体源还包括用于使所述液体循环的装置(压力、泵等)，所述装置可设置在所述温度控制装置的上游或下游。
所述系统还可包括输送管，所述输送管用于将所述传热液体从所述传热液体源输送至所述芯片的所述注入入口。
用于所述传热液体的所述温度控制装置可包括温控液槽或在线温度控制器和温度传感器，所述温控液槽或在线温度控制器同时使用焦耳效应加热系统或热电装置来改变循环液体的温度，所述温度传感器用于通过控制器(例如PID型)来精确控制闭环温度。
优选地，所述液体循环装置设置在所述芯片的上游，以便避免所述循环装置和所述传热液体之间的寄生热传递，而所述寄生热传递可在进入所述交换区之前不可预测地改变所述液体温度。这些循环装置可以是所有液体传热源的共用装置。它们可由压力源形成，用于压缩储罐或泵中的所述传热液体，这有利地实现液体再循环。
所述系统还优选地包括装置，所述装置用于切换所述传热液体所采用的所述路径，以便每种传热液体可通过所述交换区或通过所述旁路通道。
根据所述第一方面，本发明最后还涉及一种用于进行PCR型反应的方法，其中优选使用如上所述的芯片和/或系统。
根据本发明的第二方面，一般在一次性容器中进行所述PCR反应，这是因为在反应结束时，待检测的DNA靶的大规模扩增污染了具有所述待扩增的靶的所述容器的表面，这防止了再次使用所述容器。因此，所述PCR的所述容器是所谓的可消耗容器。
快速循环技术中的一个重要问题是可消耗容器的设计，所述容器接收所述PCR试剂用于良好地将温度传递至所述样品，以便所述样品温度可随所述热循环装置的温度而迅速平衡。
所述PCR的一个具体实施方式是实时PCR，其中在反应期间中通过来自探针的荧光信号测量DNA扩增，所述探针的荧光取决于所述扩增反应的过程。在该情况下，快速循环技术中的一个重要问题是可消耗容器的设计，所述容器接收所述PCR试剂用于良好地将到所述样品的良好的热传输，以便所述样品温度可随所述热循环器的温度而迅速平衡。
在标准PCR的热循环器中，所述PCR试剂存储在为此设置的标准微离心管或多孔板中，这些标准微离心管或多孔板包括用于试剂的容槽，所述容槽包括锥形底部，用于在离心时收集所述管的液体底部。该可消耗容器被引入热化块体(温度循环器)中，所述热化块体的几何构型适于所述可消耗容器的几何构型。在实时PCR的特定情况下，所述可消耗容器必须能够测量所述试剂的荧光。
当所述可消耗容器是多阱塑料板或管时，所述温度通过所述塑料壁来传递，以将所述样品与所述热化块体分开。由于塑料是不良导热体，因此所述样品的热化速度受到限制。此外，所述管的底部的PCR体积的紧凑形式不适于温度的快速变化，这是因为必须传递热量的所述样品的最小尺寸与所述样品体积之间的比例很高，因此这样非常不利。的确，有时需要几十秒才能通过所述样品的厚度来达到热平衡。另一方面，水性试剂上方的空气的存在导致在加热时使其蒸发，导致所述样品的冷却和所述试剂的浓度的变化，这对所述反应是有害的。
这些包装方法在高性能装置中具有速度限制，比如，PCRMax公司的eco48型装置，这使得所述块体的温度变化速度为5.5℃/s，但如果所述样品的温度低于10s则不会使得温度完全改变。
US-A-5958349公开了一种薄的塑料反应室，所述反应室两侧都有薄的塑料壁，以与热化元件进行接触。在该构型中，所述待热化的样品的厚度低，因此特别适于温度的快速变化。此外，所述管的平坦且细长的构型限制了所述样品和所述空气之间的接触表面，包括限制了所述样品的蒸发。但塑料壁的导热系数无法实现小于10s的温度快速变化。
总体上，PCR系统的速度受到两个方面的限制：首先，所述热电元件的温度变化速度使得在小于10秒内难以改变温度，其次，塑料材料中可消耗容器的低导热率可防止温度快速转移(＜10s)到所述样品上。
为了克服这些缺陷，EP2787067公开了一种由薄铝板形成的样品架，其中用于接纳样品的空腔受到冲压。这些样品架直接与通过使用阀门而改变温度的热化液体接触，这实现了比用所述热电元件获得的温度更快的温度变化。该系统实现了小于3s的温度变化，但在使用其中所述样品架直接与所述热化液体接触的构型时有困难，这是因为其特定地可以是热化液体泄漏到环境中的来源。另外，所述样品架的开放构型不会限制所述液体的蒸发。
在该公开中，“Under-Three Minute PCR：Probing the Limits of FastAmplification”，Wheeler等人(Analyst，2011，136，3707)使用一种由铜块形成的样品架，所述铜块包括多孔金属介质，两种不同温度的两种传热液通过所述多孔金属介质交替循环，以实现所述块体的非常快速的温度变化。在该系统中，此处将所述样品放置在由聚丙烯薄片制成的5μL阱孔中，再将其插入所述铜块中并用由取代或未取代的聚酰亚胺制成的加热片覆盖，所述加热片如以商品名“KAPTON”出售的那些加热片，所述加热片都能够限制蒸发并保持所述样品上侧的温度。该构型的优势在于适应的格式，这是因为所述样品不与所述热化液体接触，但该构型的劣势在于使用了由薄塑料薄膜制成的界面，所述界面是脆弱的且很少适于未经训练的人员的日常使用。此外，所述加热聚酰亚胺片必须是电动的，以用作加热元件，这使所述可消耗容器复杂化并增加了其生产成本。
PCR反应的具体示例是所谓的数字PCR，其中在单独的小尺寸体积中进行每个单独的靶DNA链的扩增，以便进行单独鉴定。然后通过具有阳性反应的不同体积的数量来测量靶的数量。其可以是在Stilla Technologies公司销售的Naica平台上进行的液滴PCR或ddPCR(液滴数字PCR)，或如在Fluidigm公司销售的平台EP1上进行的在微孔或微室中所进行的PCR。有利地，也可实时进行这种类型的PCR，这使得可区分寄生扩增或反应体积中多于一种靶标的存在。为了实施该检测，荧光测量必须具有良好的空间分辨率，以检测大量的靶(即大量液滴或大量腔室)，并因此获得高反应动力学，即用于少量和大量靶DNA的计数。
Zongh等人在期刊“Multiplex digital PCR：breaking the one target percolor barrier ofquantitative PCR”(Lab on Chip No.11，pp.2167(2011))”中公布了数字PCR的挑战。
所有这些提供均能够获得快速的温度变化速度或空间分辨的观察，但受到某些限制，即在实现对空间分辨的样品进行光学测量的同时，无法实现快速和精确的温度控制。
另外，现有技术的PCR可消耗容器无法在实现以简单的方式实现用样品和热化装置之间的空间分辨率和/或热交换界面测量样品的荧光的同时来实现快速(＜5s)、准确性、一致性和可重复性。
然而，目前对诊断方向或紧急情况的快速测试需在几分钟内需要诸如PCR之类的反应。
根据本发明第二方面，发明人已注意到，具有空间分辨率的观察具有以下几个优点：一方面，在均化溶液中的PCR中，其实现了控制反应的均匀性，另一方面，其实现了使用含有几个腔室的可消耗容器，以在相同的温度条件下并行地进行多个反应，以便并行测试多个靶或多个样品，最后，其实现了具有以下优势的数字PCR：实现更精确的定量、获得较低的灵敏度阈值和较低的PCR抑制剂和PCR性能的定量灵敏度、反应的实时测量，还实现寄生扩增的更好地区分。
此外，发明人的目标之一是设计低廉的测试。为此，所述可消耗容器必须易于制造，这是销售此类测试的关键问题。
PCR需要30到40个温度循环，其中最小循环持续时间约为8秒，每秒在温度变化时间内获得，因此将反应时间从60秒减少到80秒。此外，基于PCR、特别是对于多重检测的分子检测试剂盒的复杂性要求非常精确地控制循环的不同阶段的温度，以便正确地操作。
另外，这些试验通常需要的大反应体积(约20μL)适于传热液体热化系统，这是因为在温度变化期间加热所述样品所需的瞬时功率是非常重要的，以至于其通常与其他技术的使用不相容。
最后，一种快速、准确、一致和可重复的温度控制对于在无论是人工试剂中，还是在天然的、有生命的、有固体的、液态的或气态的样品中来分析涉及温度的许多其他化学、生物化学和生理反应很有意义。
因此，一种基于传热液体交换的快速(＜5s)、准确、均匀、可重复并结合具有空间分辨率的荧光测量的样品温度控制系统在许多领域都有意义。
根据本发明第二发明的本发明能够再次解决上述各种问题。
根据所述第二方面，本发明涉及一种用于测试生物样品、特别是用于PCR和/或荧光分析的中空块体形式的微流控样品芯片，所述芯片包括由上壁、下壁和至少一个侧壁界定的至少一个腔室，所述至少一个腔室中可引入待测样品，其特征在于，所述块体至少设有彼此平行的第一侧和第二侧，所述第一侧(或下侧)布置在所述下壁下，所述下壁由具有高导热率的材料制成，所述高导热率优选大于1W.m-1·K-1，所述第二侧(或上侧)布置在所述上壁上，所述上壁由具有低导热率的材料制成，此外，所述上壁至少在所述腔室中的一个中可透过波长在300nm和900nm之间的辐射、优选可透过可见光谱在400nm和700nm之间的辐射，所述块体包括至少两个开口，所述至少两个开口用于将所述样品引入所述腔室中的至少一个中并在引入所述样品期间排出所述腔室中的大气。
优选地，所述样品芯片的特征在于，至少一个开口布置在所述第二侧上并穿过所述上壁进入所述腔室中的至少一个中。
根据一个变例，所述芯片的特征在于，至少一个开口布置在至少一个侧壁上并穿过其中以到达所述腔室中的至少一个。
根据一个变例，所述芯片的特征在于，至少一个开口与微流控回路连通，所述微流控回路集成在所述样品芯片的另一个部分中并包括装置，所述装置用于预处理所述样品(例如，在所述PCR处理之前以本身已知的方式过滤或保留所述样品的某些元素)、后处理所述样品(在所述PCR处理后添加添加剂或其他添加剂)或必要或有用的任何其他操作。
优选地，所述块体具有平行六面体或圆柱体的外形，所述上壁和下壁的所述外形的侧面彼此平行。
更优选地，在将所述样品引入至少一个腔室中之后密封所述开口，将所述芯片的不同壁放在一起，以便在不损坏的情况下承受大于或等于500mbar、优选大于或等于1巴的内部和/或外部压力。
根据一个实施例，根据本发明该第二方面所述的芯片的特征在于，其下壁(42)一方面由导热率大于或等于15w.m-1.K-1、优选大于或等于100w.m-1.K-1的材料制成，且另一方面由不是PCR型反应抑制剂的材料制成，比如，特别是纯铝和/或其可能的阳极氧化合金或衍生物，且更特别是6010铝(由国际合金指定系统定义)，其中具有或不具有诸如阳极氧化处理的防腐蚀处理。
根据又一个变例，所述芯片的特征在于，其上壁的导热系数小于或等于1w.m-1.K-1，且其流动性优选小于或等于1000J.m-2.K-1.s-0.5并优选实现大于或等于95℃的温度而不变形(即所述材料的载荷下的挠曲温度(ISO 75)、＞95℃的玻璃化转变温度)。
优选地，所述芯片的上壁由透明塑料材料制成，所述透明塑料材料选自聚碳酸酯及其衍生物和/或聚合物或环烯烃共聚物(通常称为COC和COP)及其衍生物。
根据一个优选构型，所述芯片包括一至四个平行六面体形腔室，所述腔室中的每个优选连接至至少两个开口。
根据所述第二方面，本发明还涉及一种用于分析如本申请所述的样品芯片中的腔室中包含的样品的PCR型系统，所述系统尤其包括：
-热化装置，所述热化装置用于通过热循环来升高或降低所述芯片和其中的所述样品的温度，所述热化装置与所述样品芯片的所述下侧热接触，其特征在于，其还包括：
-装置，所述装置用于封闭所述样品芯片中使用的所述腔室中的所述开口，所述装置用于在所述腔室中保持至少5000帕斯卡(50mbar)、优选至少50000Pa(500mbar)的相对内部压力，所述样品的温度的升高导致所述腔室膨胀并从而改善所述下侧与所述热化装置之间的热接触，
-装置，所述装置用于在所述样品芯片的整个上侧上方保持大于50mbar的外部压力，以在所述芯片的所述下侧与所述热化装置之间提供基本均匀的热接触，所述芯片的所述上壁的透明部分由光线穿过，所述光线位于包含所述样品中的一个的所述腔室中的至少一个上。
根据本发明该第二方面所述的系统优选包括光学测量装置，所述光学测量装置优选用于以空间分辨率来对所述样品进行光学观察。
根据第一变例，所述系统包括导热零件，所述导热零件位于所述样品芯片的所述下侧和所述热化装置之间且厚度小于或等于1mm，优选金属零件，优选铝金属薄膜。
根据另一个变例，所述系统包括快速热化装置，所述快速热化装置能够产生所述样品的大于或等于5℃/s的温度变化。
优选地，所述系统包括装置，所述装置用于在所述样品芯片的所述上侧的至少一部分、优选在整体所述上侧上保持高于1bar的相对外部压力。
根据一个优选实施例，所述系统包括外部加压装置，所述外部加压装置由透明材料的板件、优选玻璃形成，所述板件与框架和弹性装置相关，所述框架布置在所述板件的周边，所述弹性装置如向所述框架施加压力的弹簧。
根据一个变例，所述系统包括外部加压装置，所述外部加压装置由壳体形成，所述壳体的外部尺寸与所述芯片的外部尺寸相同，用于在环境温度下将该芯片引入所述壳体中，在捕获在所述芯片的至少一个腔室中的样品的温度升高期间，所述壳体的壁由于所述腔室的膨胀而在所述芯片的所述上壁和下壁上施加压力。
根据另一个变例，所述系统包括装置，所述装置用于在已经将该芯片定位在所述系统中时将样品注入所述腔室中的至少一个中。
根据又一个变例，所述系统还包括装置，所述装置用于在填充所述腔室中的至少一个之后密封所述芯片的所述开口。
本发明还涉及一种实施本发明的第一和第二方面的装置、系统和方法，即包括根据本发明的第一方面的热循环系统和热化芯片，并结合样品芯片，所述样品芯片的尺寸适于其中插入有所述样品芯片的所述辅助壳体的尺寸，所述辅助壳体包含本发明的第二方面的至少一个透明上壁以及优选用于测量样品荧光的光学系统，所述热循环在不同温度下交替进行，使得能够在整个所述热循环过程中，使保持在压力下的所述样品芯片的所述样品中的DNA倍增。
在整个说明书中，以下术语还具有以下含义：
-样品的热化(或通常“热化”)是指改变温度以使样品温度达到所需温度。
-样品从温度T1到不同于T1的温度T2的温度变化速度是指样品从温度T1变为有效温度T2eff以使得(T2-T2eff)/(T2-T1)＜5％所需的时间。
-如果随着时间的推移的温度变化曲线随温度的两个连续变化的温度变化曲线可叠加，则无论先前的温度变化条件如何，温度的变化都是可重复的(温差在温度轴上的叠加，精度约为5％，或温度变化速度在时间轴上的叠加，精度为5％)。
-均化树是指微流控网络，所述微流控网络通常由通道的一系列分区形成，用于使大腔室的截面的主轴的流速相对于进入该腔室的液体入口(或出口)的尺寸均化。该名称“均化树”将在本说明书和权利要求中使用，以通常用于指定在热化区的入口和/或出口处均化压力的任何装置，特别是由分别并置在热化区202的入口和出口处的平行六面体形体积或任何其他类似形式形成的压力均化区，以便这些体积增加了其入口和出口处的热化区的厚度，与热化区中的流动阻力相比，这些体积中液体流动的阻力较小，使热化区宽度上的压力均化。这些平行六面体形状或类似体积的宽度等于热化区202的宽度，以使整个宽度上的压力均化，作为热化区的通道厚度的2至6倍的厚度和作为热化通道的厚度的2至6倍的长度使它们具有较低的流动阻力。
应注意，均化区或均化树是长度L的一部分(换句话说，表面S的热交换或热化区不包括可能的均化区)。
术语“空腔”表示通常具有平行六面体形状的空腔(尽管在不脱离本发明范围的情况下总是可给其圆柱形截头圆锥形等形状，但空腔的形状(水平截面)基本上取决于用于沉积待进行热循环或其它的样品的板(或芯片)的形状)。
由于具有光学传感器的板通常具有矩形形状，所以包含样品的腔室有利地是矩形的，以便空腔的水平截面通常具有与所用矩形板相同的尺寸，该术语基本上表示这些尺寸与要与其所容纳的空腔一起使用的板的尺寸相比而可变化(主要是出于实际原因)或多或少10％。作为一般规则，所使用的样品架板具有约14mm×14mm的尺寸，例如包含10mm×10mm的腔室。
术语“旁路通道”是指一种通道，该通道使得可能将至少一部分传热液体从注入通道转移并防止其通过空腔，同时确保在这两个通道的连接处上游的注入管中连续循环传热液体。
术语“数字PCR”在以下文献中有所定义和说明：J.F.Hugget等人的文章“Thedigital MIQUE guidelines：minimum information for publication of quantitativedigital PCR equipment-Clinical Chemistry 2013”，以及Brown JF等人的美国专利US6143496。
附图说明
借助于示出本发明的第一和第二方面的以下示例性实施例，将以非限制性方式与附图一起更好地理解本发明，附图中：
图1示出了根据本发明的微流控芯片的一个示例性实施例，
图2a、2b和2c示出了图1中芯片的一个替代性实施例，其中集成有流体切换阀，
图3在图3a、3b、3c中示出了根据本发明的系统的与包含待分析样品的样品架相关的芯片的其他变例，
图4a和4b示出了根据本发明的系统的两个变例，其中各种传热液体通过阀门组件(图4a)或由于液体的压力变化(图4b)进行交替循环，
图5示出了根据本发明的系统的另一个变例，其中旁路通道中的所有液体都在同一个容器中回收，
图6示出了具有用于传热液体的热化系统的通过泵的方式的另一个变例，
图7a至图7d示出了具有热化芯片的另一个变例，所示热化芯片具有三种尺寸并配备有底座安装型的微型阀门，
图8a和8b示出了PCR循环的实现和所得的荧光信号。
图9示出了根据本发明第二方面的样品芯片的截面示意图，
图10示出了根据本发明第二方面的系统的一个示例性实施例，该系统特别包括光学测量装置，
图11示出了单腔室或多腔室样品芯片的各种图示，该样品芯片包含样品或样品液滴。
在所有的附图中，相同的元件具有相同的附图标记。
具体实施方式
图1示意性示出了微流控芯片1，在将传热液体注入芯片和样品(例如，DNA)时，该微流控芯片在该传热液体之间交换热量，其中该芯片和样品未在图中示出并与该芯片接触。芯片1由具有上侧的平行六面体性块体形成，该块体包括热交换区204，该热交换区设有具有表面S(在图中用虚线包围)的热化区(热交换)22，传热液体注入通道4、5会聚在该表面上。
流体注入区201包括具有第一传热液体的管道15，该管道通过第一连接端口2连接至芯片1，而第二管道14则通过第二连接端口3连接至芯片1。输入端口2和3分别连接至供应通道4和5，该供应通道分别向上延伸至连接处8和9，旁路通道6和7也分别连接至该连接处，该旁路通道分别延伸至输出端口16和17，用于分别将传热液体排出进旁路管道18和19中。(该供应通道可以是旁路通道，反之亦然)。
每个连接处8、9分别通过供应通道部分20、21延伸，该供应通道部分在空腔202的入口10处在其其他末端处交汇，用于将传热液体引入入口均化区203中，该入口均化区包括用于液体29a的均化树(以在热化区22的入口处给予其良好的流速均化)。热交换区204本身包括热化区22，该热化区优选由多个平行通道11形成，该多个平行通道在区域22中优选分别均匀分布在芯片的整个宽度上，用于接触待分析的样品。在这些通道11的其他末端处，在热化区22的出口30bis(是热交换区204的一部分)处收集传热液体，然后在通过出口均化区205后，在流体出口区206处通过空腔202的出口30收集该传热液体，该出口均化区包括均化树29b，该均化树优选类似于布置在入口均化区203中的均化树29a，该空腔的出口连接在出口导管13中连接至芯片1的连接端口12(在该示例中，管道13、14、15、18和19不是芯片1的一部分)。
根据一个替代性实施例，提供单独的出口用于不同温度下的液体，例如，通过在连接端口12后的一个或多个阀门的方式，用于将液体指向不同的储罐，以限制不同温度的液体的混合。每个注入通道4、5包括朝向出口16、17的用于额外的液体的连接处8、9，用于将传热液体在芯片1上游的管道18、19中连续循环，并从而用于稳定液体的温度，以避免由于传热液体的温度变化而引起的扰动。
连接处8和9与热化区22之间的距离L取决于芯片的热特性，并必须如下所示：
L＜S/a
S是空腔(202)的上侧的表面，以m2表示，a是等于0.005m的校正系数。
按此方式，围绕热化区上游的热化液体的材料的瞬态效应不足以防止如前所述的温度的可再生变化。
因此，对于约为10ml/min(1.6e-7m3/s)的传热流体流速，连接处8和9与热化区22的流体入口10bis之间的距离L优选小于2cm。
图2A表示图1中芯片的一个替代性实施例，其中集成有液体切换阀23、24、25和26，用于使每种液体可从管道14和15进入为此提供的通道11或在旁路通道6、7中通过。
因此，当关闭切换阀门23并同时打开阀门24时，液体则然后从管道15送入旁路管道18中。如果打开阀门25并关闭阀门26，则来自管道14液体同时(如需要的话)将进入芯片中，并在进行均化后进入通道11中，以进行将接触芯片的DNA样品的热化。
图2B和2C分别表示气动控制阀的示例性实施例的放大细节，该气动控制阀以打开位置(图2B)集成至芯片并在控制信号的作用下处于关闭位置(图2C)。
以本身已知的方式(Unger等人，Science 288：7，113,2000)，例如每个阀门由膜28形成，该膜在静止位置打开(P＝0，图2B)，并在通过注入加压控制气体激活时关闭(图2C)，该气体使该膜28粘在固定其的管道的相对部分27上。
图3A表示图1中芯片的俯视图，在该图上一些另外的实施例细节尤其表示在均化树29a和b上。每个树包括靠近入口10或出口30的第一连接处，以将输出通道的流体入口分成两个侧通道31和32，该两个侧通道在连接处34和35处第二次分开，从而实现沿着入口10bis的大部分和热化区22的出口30bis的液体流速的均化。该均化是由于以下事实而产生：由侧通道形成的树的连接处的每个末端在出口的液体入口之间是等距的，从而给予这些不同路径以等效的流动阻力。
图3b和图3c示出了沿芯片1的线A-A的截面图，该芯片顶置有样品架(图3a中未示出)。
在图3b的第一变例中，芯片1以平行六面体形状的聚合物材料块体40(此处为5mm高)表示，比如聚二甲基硅氧烷(PDMS)，在块体的上部有多个(图中有七个)打开在芯片1的表面上的平行通道11(矩形截面)，在该实施例中深度为100微米，这些通道的宽度优选地在1到2mm之间，每个通道11与相邻通道隔开一段距离，该距离优选低于从芯片表面到样品的距离(即，在该示例中约为170微米，对应于载玻片41的厚度)。将支撑样品的载玻片41(或在使用中的通道11中实现循环的传热液体之间的良好热传递的任何其他材料)施加到通道11上，以优选地以不漏水的方式关闭它们，同时通过使用基于聚乙二醇(PEG)的处理局部来处理该载玻片41的上侧，以防止DNA吸附在玻璃表面上，例如，更特别地，借助于在玻璃上具有良好吸附能力的聚赖氨酸-聚乙二醇共聚物来进行处理。在如此处理的区域42周围延伸硅树脂冠43，以形成样品架45，在引入样品之后，通过例如塑料(此处是100微米厚的聚丙烯薄膜)的薄膜44封闭该样品架。在该版本中，优选密封芯片和样品架组件，在使用后丢弃该组件。
应注意，在根据本发明的所有实施例中，根据本发明的变例，薄膜或壁44(通常是透明的)和限定空腔45的侧壁43可由单件形成，例如，由透明塑料材料模制而成的单件。
在图3c的第二变例中，通道11通过厚度为300微米的铝板41封闭，该铝板上施加有由冠状的夹紧件48形成的样品架，以密封的方式将薄膜41保持在通道上，在其底部放置有支撑由聚碳酸酯制成的样品架件43的铝薄膜42(在该实例中等同于薄膜41)，该样品架设有高度为200微米的空腔，其底部由薄膜42和填充端口47形成，在该示例中，该填充端口由聚酯/硅树脂粘合薄膜46封闭。在填充和测试样品之后，可丢弃组42、43、46，其余的则可重复使用。
传热液体和样品之间的分离薄膜41和42通常由导热材料制成，该导热材料的导热率/厚度比(λ/e)高于1000Wm-2K-1、热扩散率/平方厚度比(D/e2)大于2s-1(例如，500微米的载玻片符合这些标准，这对应于电导率和扩散率方面的合理限制，以在几秒钟内获得温度变化)。
样品热化所需的待热化的每单位面积的传热液体流速(交换区的表面)优选小于30mL.min-1.cm-2。
图4说明了图1至图3中所述的芯片及其系统的用途的两个变例，以通过在芯片的通道11中连续循环的与样品热接触的不同温度的传热液体来进行PCR型分析所需的热“循环”。为此，图4中的系统包括装置，该装置用于切换传热液体所采用的路径，以便每种传热液体可通过热化区22的通道11或通过旁路通道。有几种构型可执行此切换过程。
例如，根据图4a的变例，使用气动切换阀，例如，该气动切换阀集成在芯片中(如图3所示)、设置在热化区22与样品的上游并位于两个循环连接处上，用于引导液体离开传热液体源60、在通道61、在用于传热液体(使液体达到良好的温度)的热化装置62、在通道63中流动，以通过打开的阀门64(和关闭的阀门65)和通道66到达交换区67，即通过打开的阀门65(和在阀门65处连接至连接处69的关闭的阀门64)到达旁路通道68。当阀门64打开以使支路的传热液体循环时，所有其他阀门64关闭(例外情况除外)，而阀门65(阀门64打开的分支)关闭，所有其他阀门65打开以实现芯片1的旁通。这些气动阀将关闭微流控通道，该微流控通道与施加在位于通道上方的可变形膜上的压力下的气体相关(参见图2B和2C)，这是因为其通常用于由弹性体如PDMS制成的微流控芯片中。
根据图4b中的变例，使用单独和可变压力的传热液体源。为此，转移到交换区22的传热液体的压力必须高于其他传热液体的压力。必须以本身已知的方式来确定其他来源的压力，以作为环路的不同分支的流动阻力的函数，以便该压力低至足以避免任何液体从这些来源转移至交换区。然而，该解决方案需要微调不同传热液体的压力以获得适当的操作。
有利地，无论使用何种变例，传热液体均可例如通过泵来单独地为每个来源进行再循环。这使得可通过重新使用预先热化的传热液来限制用于控制每个来源的温度所需的能量消耗。为此，例如，可使用活塞或齿轮正排量泵，这样可确保每个来源的恒定传热液体流速，这样可更容易准确地控制温度(例如，可耐受高温的陶瓷泵)。一般来说，当需要执行PCR型分析时，在本发明的操作室中使用的所有材料和设备通常承受至少100摄氏度的温度(并在该温度下操作)。
为此，每个循环连接处优选进行重定向至原始传热流体源，且交换区的出口可分配至所有来源。芯片的出口也可进行重定向至其原始来源，但在这种情况下，需要添加一个阀门以将液体重定向至储罐。(参见图6)。
还可将储罐插入泵的上游的回路中，以确保用传热液体来良好地填充该回路。在一些构型中，在回路的不同通道中，流速不能进行平衡，有些储罐可比其他储罐更快地进行填充。然后，有利的是，可通过管道121(图6)将储罐彼此连接，以便其水平面平衡，这也具有从单个开口来填充所有储罐的优点。有利地，这些储罐的体积可低于20毫升，且占用空间小、热容量低、热损失低。
现在将参考图5和6描述本发明的两个实施例：
示例1：
在图5中，第一加压气体发生器80产生压缩气体(空气和/或惰性气体，比如氮气和/或氩气)，该气体通过管线84流入第一传热液体89b的储罐87的气体天空89a中。第二加压气体发生器81产生压缩气体(优选与第一发生器相同)，该气体通过管线85流入第二传热液体90b的储罐88的气体天空90a中。通过由各个气态天空施加的压力将两种液体89b和90b分别注入到管道91和92中，直至图1至3中所述类型的芯片1的相应入口93和94。液体流在基本位于交换区95的入口处的连接处98处交汇，其中一种或另一种传热液交替地进行循环。当一种液体的压力大于另一种液体的压力时(至少40％，优选至少42％但小于55％)，以便不产生液体以另一种方式的回流。这些最小值和最大值取决于芯片的几何构型和待注入的液体的温度。这些值通过热成像或建模实验来确定，以便获得如下所述的所需流量，正是这种液体将进入交换区以及与之相关的旁路通道，而另一种液体则继续在与其相关的旁路通道中循环(对于第一液体为96，对于第二液体90b为89b、97)。在管道96和97会聚的芯片输出端的连接处99处，将液体引导至出口端口100并流过管道101朝向包含液体混合物103b的回收容器102。交换区95中的液体的交替和该区域中的温度变化由控制系统83控制。管道96和97使液体能够连续循环。按此方式，根据本发明，连接处98与腔室95的入口之间的距离可小于上面为L定义的值。在根据本发明的系统的本示例中，将压力由计算机控制的气体发生器(例如以商品名“Elveflow OB1 mk3”销售的ELVESYS公司的系统)用作循环装置，以对用热电模块控制温度的两个储罐87和88加压。根据两种构型来设定输送气体的压力，以在两个不同温度下获得DNA样品(或其他)的温度控制。在第一构型中，由第二发生器81输送的气体的压力比由第一发生器80输送的气体的压力高至少1.5倍(通过热成像或建模来实验确定，以获得如下所述的所需流量)，以便包含在储罐87中的液体89b在第一温度下仅在旁路通道96中循环，而包含在储罐88中的液体90b在第二温度下在旁路通道97和交换区95中循环。在该构型中，因此可通过与第二传热流体90b的间接热交换，使得样品非常快地达到第二温度。每个发生器的压力之间的精确比率取决于芯片的精确几何形状、影响其粘度的传热液体的温度以及所选择的方式，以在交换区中进行循环。这些压力的精确值可通过芯片的导热侧的热成像来实验确定，该实验使得可通过导热层分别在通道4、5、95、96和97中对循环液体的温度成像。为此，必须针对可在交换区域中循环的每个液体源(每个温度)调整发生器的压力值(在这种情况下为两个)。当热成像显示交换区95的整个表面处于所需温度下且旁路96或97处于必须通过该液体的液体温度下时，对于每个循环液体源，则实现了良好的压力平衡。还可通过考虑到传热液体温度的粘度的几何参数和依赖性参数的流体动力学模型来预测这些压力。
相反，在第二构型中，由第一发生器80输送的气体的压力(在如上所述的相同条件下)比由第二发生器81输送的气体的压力高，以便包含在储罐88中的液体90b在第二温度下仅在旁路通道97中循环，而包含在储罐87中的液体89b在第一温度下在旁路通道96和交换区95中循环。在该构型中，可通过与第一传热流体89b的间接热交换，使得样品非常快地达到第一温度。
在任何时候，传热液体在管道中循环，特别是在91、92、96、97中，以便即使在使用低传热流体流速时(例如流速小于或等于10ml/min)，热交换区的温度变化也很快(小于5s)、可再生并也可精确控制样品温度
可使用这种系统进行PCR反应，但也可将其用于对活的生物样品进行观察。有利地，使用热电模块可在低于室温的温度下控制样品的温度。这种可能性可用于研究物理、化学或生物现象，比如活细胞内微管的聚合动力学，而这些研究需要在低于5℃的温度下使细胞热化。
根据另一个替代性实施例，注入通道63可在连接处69之前(参见图4)在单个通道中交汇，如图5中的情况。由于微流控芯片中液体的输送是层流的(非湍流)，所以单各通道63中的液体不会混合并可将其各自的温度保持直至连接处69，或可在旁路通道68和引导液体至热化区67的通道66之间将其再次分离。
一般来说，热化区22的高度将低于1毫米，优选为400微米，这实现了高对流系数和芯片中传热液体更新的较短时间，以便使注入芯片的流速变低。
示例2：
在对应于图6的该示例中，用于温度控制的微流控芯片1包括基本上平行六面体形状的空腔，该空腔的上侧对应于热化区22，该上侧具有1cm2的表面和300μm的高度。其包括五个端口2、3、16、17、12(如图1所示)，并用于通过如图1至3所示的四个集成阀23、24、25和26的方式来在热交换区22和两个循环连接处之间以不同温度切换两个传热液112和114。这通过模塑PDMS并通过可光活化的粘合剂(例如，以商品名“Loctite3922”销售的胶水)粘合在300μm厚的铝板上来完成，该铝板上放置有与之热接触的样品架。芯片由传热液体112和114的两个流动箱110和111分别供应，其中每个流动箱连接至正排量泵116、117，无论电路中的压力如何，该正排量泵提供的流速均为10ml/min，且用于传热液体的线上加热装置包括用于在该主体和液体之间进行显著的热交换的铝体、与人体接触的焦耳效应加热陶瓷元件(例如Thorlabs公司销售的那些)、微型温度传感器(例如由Radiospares公司以“PT100”的名称销售)，以及用于控制温度的电子卡，该电子卡配备有系统控制PID，用于通过温度传感器来控制主体温度。
两个储罐110和111分别设置在泵116、117的上游，以用作液体供应。可通过连通容器的系统来相对于彼此调节储罐的液位。另外，“3/2”型阀118使得可在控制系统的控制下将通过管道13离开芯片的液体重定向至供应热化区22的内容物的储罐110或111，该阀门未在图中示出，并通过计算机根据液体和所需的注射持续时间对不同的阀门进行排序来进行控制。
为了使用如图6所述的系统进行PCR分析，优选使用由平行六面体形状的20μl微流体室组成的盒体，该盒体的表面为1cm2、高度为200微米，例如模塑在聚碳酸酯件中(在微通道11处)粘合在200μm厚的铝板上：该腔室中填充有PCR试剂混合物和待分析的样品(有关所述程序的更多细节，请参见上述Houssin等人的文章)。将该盒体压在热化芯片的铝板上以实现良好的热接触。也可通过在芯片下放置用于接收试剂的腔室并同时测量荧光来在与Houssin等人的文章相同的条件下进行实时PCR分析。通过线上温度控制器以在95℃下循环热化的传热液体来在在95℃下热化该样品30秒，同时在65℃下将热化的传热液体重新引导至循环连接处。为此，关闭95℃下位于传热液体源的循环连接处上的阀门24和用于在65℃将液体从来源111传送至交换区的阀门25。另一方面，打开65℃下位于传热液体源的循环连接处上的阀门26和用于在95℃将液体从来源传送至交换区的阀门23。将用于重定向离开交换区的液体的阀门118定位，以将离开腔室的液体重新引导至95℃下位于热化系统上游的管道120和储罐110。
然后，在95℃和65℃之间进行温度变化的40个循环，交替进行5s，以通过PCR反应来扩增样品中含有的DNA。为此，将阀门23、24、25、26和118的状态每5秒反转一次。
示例3：
在对应于图7a至图7d的该示例中，用于温度控制的微流控微芯片1包括与示例2中相同几何构型的空腔。其包括4个端口2、3、16、17，并可通过四个集成阀23、24、36和26的方式来在热交换区22和两个循环连接处之间以不同温度切换两个传热液112和114。其由两个微机械加工(CNC)聚碳酸酯件夹层而成的聚碳酸酯件制成、然后通过热熔或通过塑料工业中众所周知的方法辅助溶剂进行粘合，这使得可在聚碳酸酯件内部形成通道，同时可避免其与铝层接触，而该接触则会限制热交换与热化区(22)的寄生。在空腔202上的该聚碳酸酯件的表面上通过压制来固定(优选胶合)厚度为500μm的铝片41，这使得可密封空腔并确保了与样品的热交换。有利地，该铝板优选不覆盖芯片的整个表面，而仅覆盖热化区22(略微从其中突出)，以通过沿片材传导来限制热损失。所使用的阀门24、26、36、37是直接固定在芯片上的底座安装式微型阀，以防止任何内容从芯片中流出。根据与示例2中相同的模式，芯片由两个储罐和两个泵供应，除了以下情况：示例2中的阀门118由集成在芯片中的阀门37代替，且再循环通道119和120部分地集成在芯片中，这样就会具有体积小、实现成本低、限制热损失和通过减少流体连接器的数量来提高系统可靠性的优点。
另外，代替示例2中的阀门23和25的“3/2”阀36使得可切换通过入口2和3进入芯片并朝向热化区22的液体源，这使得可通过使用最靠近流体10的入口孔定位的单个节省空间的阀门来使距离L最小化。通过计算机根据液体和所需的注入持续时间而对不同的阀门进行排序来控制该组件。
为了使用如图7所述的系统来进行PCR分析，优选使用盒体，如示例2所述。通过线上温度控制器以在95℃下循环热化的传热液体来在在95℃下热化该样品30秒，同时在65℃下将热化的传热液体重新引导至循环连接处。为此，将阀门36定位，以将来自传热液体源的液体在95℃下循环通过入口2进入，同时阀门24处于关闭位置，以通过旁通方式阻止液体在95℃下再循环。同时，打开阀门26，使液体在65℃下通过旁通通道再循环，并将阀门37定位成使得可将来自热化区22的液体重新引导至95℃下位于热化系统的上游的管道120和储罐110。
然后，在95℃和65℃之间进行温度变化的40个循环，交替进行5s，以通过PCR反应来扩增样品中含有的DNA。为此，将图6中(图7a中的24、26、36、37)的阀门23、24、25、26和118的状态每5秒反转一次。
图8a示出了使用热成像摄像头测量的并表示为总温度变化的百分比的结果：其中发现，约1.5秒后，样品温度达到设定温度值的95％。
40次循环之后，根据本发明的系统被配置为使得可在热化区22中使传热液体114在65℃下连续循环，然后随着时间的推移，将来源的液体114的温度逐渐升高(直到85℃)，以实现这种分析中的技术人员通常称之为“熔化曲线”的曲线，即建立样品的温度和荧光水平之间的对应关系的曲线。该曲线使得可检查扩增序列的杂交温度，该信息用作PCR反应的质量控制。所获得的荧光信号如图8b所示，其中荧光信号随时间的逐渐扩增清晰可见，然后是熔化曲线。
如图9所示，根据本发明的第二方面的系统包括用于执行快速实时PCR反应的可消耗容器或微流控样品芯片。样品芯片可包含一个或多个腔室(图11)，其中进行实时PCR反应。其包括两个具有平行外侧的壁42和44，其中一个42(下侧)旨在实现对样品及其放置在反应室45中的最终试剂的温度的控制，而另一个44(上侧)则旨在进行光学测量，包括荧光。为了在热化装置41与样品和试剂之间进行良好的温度转移，优选满足下列条件中的至少一种(优选几种、更优选全部)：
1.将可消耗容器在大于或等于5000Pa(50mBar)的压力下保持与热化装置接触，但优选在大于或等于100000Pa(1Bar)(接触表面上的平均压力)下，以及
2.将反应室密封，以承受至少等于50000Pa(500mbar)的压力，优选承受大于或等于100000Pa(1bar)的压力，并通过人工(外部)加压装置将其保持在大于或等于5000Pa(50mBar)的压力下，优选在大于或等于50000Pa(500mBar)的压力下。按此方式，样品和热化装置之间的热传递可在良好的条件下进行。
3.使试剂和热化装置之间的导热层具有足够的导电性，即大于或等于15w.m-1.K-1，优选大于或等于100w.m-1.K-1，并使其不是由PCR抑制材料制成，例如铝或其衍生物。
4.旨在进行光学测量的样品芯片的壁和上侧由一种材料制成，该材料的导热率优选小于或等于1w.m-1.K-1，且流动性优选小于或等于1000J.m-2.K-1.s-0.5，该材料优选可透过波长、优选耐受大于或等于95℃的温度而不变形并不是PCR抑制剂，该抑制剂可以是例如塑料材料，该塑料材料选自聚碳酸酯和/或聚合物和/或环烯烃共聚物COP、环烯烃共聚物COC及其衍生物。所有这些材料都是微流控领域的技术人员所熟知的(例如，参见K.Jena等人的文章“Cyclic olefin copolymer based micro-fluidic devices for biochipsapplications：...”)。
5.使试剂和热化装置之间的导热层足够薄(＜＝500μm，优选＜＝300μm)，以便其表面在效应压力下特别在热化室中，可与热化装置的表面一致。
有利地，热化装置1可使用实现快速温度转移(小于或等于5s)的传热液体。特别地，如本发明的第一方面所述。
用于热化装置1上的芯片的加压装置213可由例如透明玻璃片(293)形成，该玻璃片通过由框架(294、295、296)支撑的弹簧并在芯片上施加足够的压力(参见图10)而压在芯片上。例如，提供滑动机构(未示出)以提升框架并因此提供对芯片所提供的空间的通路，以便在实施反应之前或在其实施之后将其放置。
但是，该加压装置现在也可以是在芯片周边上保持压力的框架(如果其足够刚性)，以避免在反应室中的压力作用下产生变形。
样品芯片可包括单个腔室45(图11a)：在该实施方式下，使用装置210和光源211的光学测量可使用简单的雪崩二极管型传感器制成，来自腔室45的光重新聚焦在该传感器上。该构型具有以下优点：即使不是在腔室中荧光分布的情况下，例如当低拷贝数的靶DNA最初存在时，在腔室的所有表面上也实现了以相同的灵敏度进行测量、传感器产生的信号也与腔室中荧光的增加成比例，可使用摄像头作为传感器，该传感器测量腔室中的荧光均化性以用于聚焦目的或用于控制腔室表面上的反应均化性。在该情况下，所用的传感器将有利地采用sCMOS技术，该技术在低曝光时间内提供高灵敏度和低信噪比，以在必要时实时跟踪荧光信号。通过此处所示的透明上壁44中的开口47来将样品和试剂引入反应室45中：但是，这些开口中的至少一个可制成穿过样品芯片的侧壁43，该侧壁可具有矩形或方向或圆柱形平行六面体形状。在引入样品后，优选使用密封粘合剂来关闭开口47。
图10示意性示出了形成根据本发明的第二方面的系统的并如下示例4所述的装置和芯片。
图11b中的样品芯片包括四个腔室(如果需要，可包括更多腔室)；每个腔室可特别地包含不同的PCR试剂，可在相同的温度条件下比较不同腔室中的各种测试条件。在该情况下，可使用具有与腔室相同的空间组织的传感器矩阵来执行检测，在该传感器矩阵上可重新聚焦腔室的图像(图11b中的四个传感器)或摄像头传感器，如上所述。
图11c示出了另一个实施方式，其中单个腔室用于对样品液滴进行PCR以执行所谓的“数字”PCR。然后，使用摄像头来拍摄液滴中的反应。
在所有的图11a至图11c中，黑色区域表示存在荧光，表明PCR反应呈阳性。
以下示例性实施例使得可特别地说明上述本发明的第二方面：
示例4
在该第四示例中，包含在微流控样品芯片中的样品的温度控制装置是微流控热化芯片，其中如上所述并通过图4a中的方式来使两种具有两种不同温度(通常为65℃和95℃)的传热液体交替循环。
在图10中，样品芯片289包括例如单个腔室45，该腔室可通过例如移液管的两个开口(用于样品和试剂的入口端口290和空气出口端口291-或反之亦然-参见图3b、3c和7d)来进行填充。其由其下壁及其导热下侧的厚度为41至200μm的铝膜和透明的聚碳酸酯件44形成，该聚碳酸酯件中钻出有用于填充的端口290和291(图3c中的47)。
在填充后，使用硅树脂/聚酯粘合剂来密封样品芯片的开口290、291，以在其中保持压力。然后，将样品芯片放置在壳体中(图10)，该壳体由布置在根据本发明第一方面和如上参考图3c所述的热化芯片1上方的热化界面41(金属膜)上方的固定框架48来横向限定。例如，使用杠杆系统(未示出)来降下框架296，在该框架固定有安装在四个弹簧294、295上的玻璃件293，一旦系统接合(相当于100000Pa(1巴))，该杠杆系统将在样品芯片289的表面上施加受控且均匀分布的20N压力。将透明弹性体的薄层292(所谓的软层)固定在玻璃件293下面，以使芯片表面上的压力均化并避免密封粘合剂在开口290和291中脱离。
在框架296上安装光学检测器，该光学检测器包括：
-在图中向右移动的LED二极管297，其中波长适于通常使用(并添加到样品中)的嵌入元件Cybergreen的荧光激发波长，以用于实时PCR的测量。将该LED 297指向芯片的反应室45。
-透镜298，该透镜用于准直LED发出的光并在腔室45的表面上产生均化的激发。
-激发滤光器299，该激发滤光器用于将LED发出的光的光谱限制到所需值。
-光学传感器300，该光学传感器放置在腔室45上、具有方形形状、是上方通过两个平凸透镜301和302聚焦腔室的图像的3×3mm的MPPC型(Hamamatsu公司)的，并定位成使得腔室的投影图像可不延伸超出传感器300的表面。
-发射滤光器303，该发射滤光器适于测量嵌入元件Cybergreen的荧光并可与激发滤光器299传递的光谱兼容，该发射滤光器303位于两个透镜301和302之间。
数据采集系统(图中未示出)使得可实时测量传感器300传递的荧光信号。实施该系统以进行40个温度循环，交替5s，从而通过PCR反应来扩增样品中含有的DNA。
40次循环后，该系统被配置为随时间以线性方式逐渐升高温度。这在PCR术语中产生了“熔化曲线”(图8)，即样品的温度和荧光水平之间的对应关系。该曲线使得可检查扩增序列的杂交温度，本领域技术人员使用该信息来控制PCR反应的质量。获得的荧光信号如图8b所示。
示例5：
该示例性实施例在所有方面与示例4相同，芯片样品包括四个腔室，而传感器由相同类型的2x2传感器阵列代替。
示例6：
在该示例中，芯片包括单个腔室45，传感器是Hamamatsu C13770-50UsCMOS摄像头，用于使用高空间分辨率来观察PCR腔室。在Fluorinert FC-40油(Sigma-aldrich)中的10nL试剂的微滴中进行PCR，该试剂通过合适的微流控装置(例如液滴发生器组件Elveflow)产生并被注入腔室45中。可通过摄像头实时观察每个液滴中的扩增状况。所得结果与图8中获得的结果类似。
这些各种示例显示了同时施加在芯片上和芯片中的压力(通过试剂温度升高自然引起的压力或通过试剂加压主动施加的压力)可实现包含样品的芯片的铝板与热化芯片的铝板之间的良好热接触。特别是由于这种良好的接触，使得可进行快速PCR。

Claims (24)

1.一种用于在样品芯片中分析腔室中包含的PCR型样品的系统，其中：
所述样品芯片(289)是一种用于检测生物样品的空心块体形式的微流控样品芯片，所述样品芯片包括由上壁(44)、下壁(42)和至少一个侧壁(43)界定的至少一个腔室(45)，所述至少一个腔室中可引入待检测样品；
所述块体至少设有彼此平行的第一侧和第二侧，所述第一侧布置在所述下壁(42)上，所述下壁由具有高导热率的材料制成，所述第二侧布置在所述上壁(44)上，所述上壁由具有低导热率的材料制成；
所述上壁至少在所述腔室中的一个中可透过波长在300nm和900nm之间的辐射，所述块体包括至少两个开口(47)，所述至少两个开口用于将所述样品引入所述腔室中的至少一个中并在引入所述样品期间排出所述腔室中的大气；和
所述系统包括：
热化装置，用于通过热循环来升高或降低所述样品芯片和其中的所述样品的温度，所述热化装置与所述样品芯片的所述下侧热触；
封闭装置，用于封闭所述样品芯片中使用的所述腔室(45)中的所述开口(47)，所述封闭装置用于在所述腔室中保持至少5000Pa(50mbar)的相对内部压力，所述样品的温度的升高导致所述腔室膨胀并从而改善所述下侧与所述热化装置之间的热接触；
加压装置，用于在所述样品芯片的整个上侧上方保持大于5000Pa(50mbar)的相对外部压力，以在所述样品芯片的所述下侧与所述热化装置之间提供基本均匀的热接触，透明弹性体的薄层(292)固定在透明材料的板件(293)下面，所述样品芯片的所述上壁(44)的透明部分由光线穿过，所述光线位于包含所述样品中的一个的所述腔室中的至少一个上；和
光学测量装置(210)，包括摄像头(300)，用于以空间分辨率来对所述样品进行光学观察。
2.根据权利要求1所述的系统，其中：
所述样品芯片(289)用于PCR或荧光分析；
所述下壁由导热率大于15W·m-1·K-1的材料制成；
所述上壁至少在所述腔室中的一个中可透过可见光谱在400nm和700nm之间的辐射；
所述封闭装置用于在所述腔室中保持至少50000Pa(500mbar)的相对内部压力；和
所述加压装置用于在所述样品芯片(289)的整个上侧上方保持大于或等于50000Pa(500mbar)的相对外部压力。
3.根据权利要求1所述的系统，其中：至少一个开口(47)布置在所述第二侧上并穿过所述上壁(44)进入所述腔室(45)中的至少一个中。
4.根据权利要求1所述的系统，其中：所述热化装置能为所述样品带来高于或等于5℃/s的温度变化。
5.根据权利要求1所述的系统，其中：至少一个开口(47)布置在至少一个侧壁(43)上并穿过其中以到达所述腔室中的至少一个。
6.根据权利要求1所述的系统，其中：所述块体具有平行六面体或圆柱体的外形，所述上壁(44)和下壁(42)的所述外形的侧面彼此平行。
7.根据权利要求1所述的系统，其中：在将所述样品引入至少一个腔室(45)中之后密封所述开口(47)，将所述样品芯片(289)的不同壁放在一起，以便在不损坏的情况下承受大于或等于50000Pa(500mbar)的内部或外部压力。
8.根据权利要求7所述的系统，其中：在将所述样品引入至少一个腔室(45)中之后密封所述开口(47)，将所述样品芯片(289)的不同壁放在一起，以便在不损坏的情况下承受大于或等于100000Pa(1bar)的内部或外部压力。
9.根据权利要求1所述的系统，其中所述下壁由：
导热率大于或等于15w·m-1·K-1的材料制成；和
非PCR型反应抑制剂的材料制成。
10.根据权利要求9所述的系统，其中：所述下壁由导热率大于或等于100w·m-1·K-1的材料制成。
11.根据权利要求9所述的系统，其中：所述下壁由至少一种下列材料制成：纯铝、阳极氧化铝合金和阳极氧化铝衍生物。
12.根据权利要求1所述的系统，其中所述上壁(44)的：
导热系数小于或等于1w·m-1·K-1；和
流动性小于或等于1000J·m-2·K-1·s-0.5。
13.根据权利要求12所述的系统，其中：所述上壁可实现大于或等于95℃的温度而不变形，即所述材料的在载荷下的挠曲温度及玻璃化转变温度大于或等于95℃。
14.根据权利要求1所述的系统，其中：所述上壁(44)由透明塑料材料制成，所述透明塑料材料选自聚碳酸酯及其衍生物和/或环烯烃聚合物或共聚物及其衍生物。
15.根据权利要求1所述的系统，其中：所述空心块体包括一至四个平行六面体形腔室。
16.根据权利要求15所述的系统，其中：所述腔室中的每个连接至至少两个开口。
17.根据权利要求1所述的系统，其中：所述热化装置使用传热液体以为所述样品带来高于或等于5℃/s的温度变化。
18.根据权利要求1所述的系统，其中：所述加压装置用于在所述样品芯片的所述上侧的至少一部分上方保持高于100000Pa(1bar)的相对外部压力。
19.根据权利要求18所述的系统，其中：所述加压装置用于在所述样品芯片的所述上侧的整体上方保持高于100000Pa(1bar)的相对外部压力。
20.根据权利要求1所述的系统，其中：
所述透明材料的板件(293)由玻璃形成；
所述板件与框架(294)和弹性装置(295、296)相关；
所述框架(294)设置在所述透明材料的板件(293)的周边；和
所述弹性装置(295、296)如向所述框架(294)施加压力的弹簧。
21.根据权利要求1所述的系统，其中：
所述加压装置由具有所述样品芯片的外部尺寸的壳体形成，用于在室温下将所述样品芯片引入壳体中；和
所述壳体的壁在所述样品芯片的至少一个腔室中捕获的样品的温度上升期间对所述样品芯片的所述上壁和所述下壁施加压力。
22.根据权利要求1所述的系统，还包括注入装置，用于在已经将所述样品芯片定位在所述系统中时将样品注入所述腔室中的至少一个中。
23.根据权利要求1所述的系统，还包括密封物，用于在填充所述腔室中的至少一个之后密封所述样品芯片的所述开口。
24.一种应用根据前述权利要求中任一项所述的系统实施PCR的方法，其中：所述PCR包括数字PCR(dPCR)或数字液滴PCR(ddPCR)。
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