CN112175787B - 利用pcr反应系统进行pcr反应的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出了利用PCR反应系统进行PCR反应的方法，该方法包括：将所述活塞进行第一移动处理；将所述活塞进行第二移动处理，以便使进入注射室的所述稀释液与裂解冻干粉和样本进行第一混合处理；将第一混合处理产物进行裂解处理；将所述活塞进行第三移动处理；将所述活塞进行第四移动处理，以便使进入注射室的所述裂解处理产物与剩余部分稀释液进行第二混合处理；将所述活塞进行第五移动处理，以便使第二混合处理产物进入所述注射室；将所述活塞进行第六移动处理，以便使进入注射室的所述第二混合处理产物与反转录酶和PCR原料冻干粉进行第三混合处理；以及将第三混合处理产物进行PCR温度循环扩增处理。

Description

利用PCR反应系统进行PCR反应的方法

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地，本发明涉及利用PCR反应系统进行PCR反应的方法。

背景技术

传统的PCR反应过程一般都是分开进行的，即先通过核酸提取试剂盒提取所需要的核酸，然后再将提取出的核酸和试剂混合添加到PCR反应管中，最后再将PCR反应管放入PCR仪器中进行PCR扩增反应，才能得出最终结果。传统的PCR反应过程操作步骤繁琐，工作效率低。

因此，简便高效的PCR反应过程还需要进一步研究开发。

发明内容

本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：

传统的PCR反应过程操作步骤繁琐，工作效率低。究其原因，发明人发现，主要在于传统的PCR反应过程中的每一步一般都需要专业人士进行操作，并且这些操作一般都需要通过不同的仪器如核酸纯化仪、全自动工作站等分别进行，另外，整个过程的操作也需要在标准的PCR实验室环境下才能进行。基于上述问题，发明人通过微流控管路将核酸的提取、核酸和试剂的混合以及最终PCR的反应全部整合到了一个系统中，利用该系统进行PCR反应的方法实现了真正的全自动化操作，解决了传统PCR实验过程需要在专业实验环境下由专业人士进行操作的难题，减少了人为操作带来的误差，极大地提高了PCR反应的工作效率，大大节约了人力资源成本。

为此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种利用PCR反应系统进行PCR反应的方法。根据本发明的实施例，所述PCR反应系统包括：样本容纳单元，所述样本容纳单元内设置有裂解冻干粉和样本，并且所述样本容纳单元具有第一液体出/入口；稀释液容纳单元，所述稀释液容纳单元内设置有稀释液，并且所述稀释液容纳单元具有稀释液出口；PCR反应单元，所述PCR反应单元内设置有反转录酶和PCR原料冻干粉，并且所述PCR反应单元具有PCR反应液出口和裂解后的样本混合液入口；以及活塞单元，所述活塞单元包括注射室和活塞，所述注射室具有第二液体出/入口，所述第二液体出/入口通过第一管路与所述第一液体出/入口相连，所述第二液体出/入口通过第二管路与所述稀释液出口相连，所述第二液体出/入口通过第三管路与所述裂解后的样本混合液入口相连，所述PCR反应液出口通过第四管路与所述稀释液出口相连；所述方法包括：将所述活塞进行第一移动处理，以便使部分稀释液进入所述注射室，所述稀释液设置在所述稀释液容纳单元内；将所述活塞进行第二移动处理，以便使进入注射室的所述稀释液与裂解冻干粉和样本进行第一混合处理，所述裂解冻干粉和所述样本设置在所述样本容纳单元内，所述第一混合处理是在所述样本容纳单元中进行的；将第一混合处理产物进行裂解处理，所述裂解处理是在所述样本容纳单元中进行的；将所述活塞进行第三移动处理，以便使裂解处理产物进入所述注射室；将所述活塞进行第四移动处理，以便使进入注射室的所述裂解处理产物与剩余部分稀释液进行第二混合处理，所述第二混合处理是在所述稀释液容纳单元中进行的；将所述活塞进行第五移动处理，以便使第二混合处理产物进入所述注射室；将所述活塞进行第六移动处理，以便使进入注射室的所述第二混合处理产物与反转录酶和PCR原料冻干粉进行第三混合处理，所述反转录酶和PCR原料冻干粉设置在所述PCR反应单元内，所述第三混合处理是在所述PCR反应单元中进行的；以及将第三混合处理产物进行PCR温度循环扩增处理，所述PCR温度循环扩增处理是在所述PCR反应单元中进行的。

根据本发明实施例的PCR反应系统通过微流控管路将样本容纳单元、稀释液容纳单元、PCR反应单元以及活塞单元相互连接在一起；同时，各单元又分别为独立设置的单元，以便使各单元在使用前存放不同的反应物，有利于反应物在不使用的情况进行长久保存。例如，样本容纳单元的独立设置有利于样本的单独添加，使样本的添加操作简单化，同时也有利于样本的长久保存。首先，将活塞向外拉动到一定位置，从而使稀释液容纳单元中的部分稀释液流向注射室；之后往复移动活塞，使注射室中的稀释液进入样本容纳单元，同时与样本容纳单元中的裂解冻干粉以及样本混合均匀；之后对样本容纳单元进行加热升温到设定温度，使样本容纳单元中的样本在设定的温度下进行充分裂解；裂解完成后，再次将活塞向外拉动到一定位置，从而使样本容纳单元中已裂解的样本混合液流向注射室；之后往复移动活塞，使注射室中已裂解的样本混合液返回稀释液容纳单元，同时与稀释液容纳单元中剩余的稀释液混合均匀，从而将已裂解的样本混合液进行稀释，将其中的杂质浓度降低；之后，再次将活塞向外拉动到一定位置，从而使稀释液容纳单元中稀释后的样本混合液流向注射室；随后往复移动活塞，使注射室中稀释后的样本混合液进入PCR反应单元，同时与PCR反应单元中的反转录酶以及PCR原料的冻干粉混合均匀；最后对PCR反应单元进行PCR温度加热控制，以便最终完成PCR扩增反应。根据本发明实施例的方法实现了真正的全自动化操作，解决了传统PCR实验过程需要在专业实验环境下由专业人士进行操作的难题，减少了人为操作带来的误差，极大地提高了PCR反应的工作效率，大大节约了人力资源成本。

根据本发明的实施例，上述方法还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述PCR温度循环扩增处理包括：将所述第三混合处理产物进行恒温处理；以及将恒温处理产物进行温度循环处理。

根据本发明的实施例，所述PCR反应系统进一步包括：样本控制阀，在所述第一管路上设置所述样本控制阀，用于控制所述第一液体出/入口与所述第二液体出/入口的连通状态；稀释控制阀，在所述第二管路上设置所述稀释控制阀，用于控制所述稀释液入口与所述第二液体出/入口的连通状态；第一PCR控制阀，在所述第三管路上设置所述第一PCR控制阀，用于控制所述裂解后的样本混合液入口与所述第二液体出/入口的连通状态；以及第二PCR控制阀，在所述第四管路上设置所述第二PCR控制阀，用于控制所述稀释液出口与所述PCR反应液出口的连通状态；所述方法进一步包括：在所述第一移动处理前，关闭所述样本控制阀、所述第一PCR控制阀以及所述第二PCR控制阀，开启所述稀释控制阀；在所述第一移动处理后以及所述第二移动处理前，关闭所述稀释控制阀，开启所述样本控制阀；在所述第三移动处理后以及所述第四移动处理前，关闭所述样本控制阀，开启所述稀释控制阀；在所述第五移动处理后以及所述第六移动处理前，关闭所述稀释控制阀，开启所述第一PCR控制阀以及所述第二PCR控制阀；在所述恒温处理后以及温度循环处理前，关闭所述第一PCR控制阀以及所述第二PCR控制阀。由此，根据本发明实施例的方法在密闭的环境下进行，减少了对系统环境的污染，提高了实验的可信度，且操作更加简便。

根据本发明的实施例，所述PCR反应系统进一步包括：缓冲单元，所述缓冲单元具有PCR反应液入口和通气口，在所述第四管路上设置所述缓冲单元，所述第二PCR控制阀与所述PCR反应液入口相连，所述稀释液出口与所述通气口相连。由此，根据本发明实施例的方法可以解决PCR试剂在高温膨胀时的溢出问题，且所述方法在密闭的环境下进行，减少了对系统环境的污染，提高了实验的可信度，操作更加简便。

根据本发明的实施例，所述PCR反应系统进一步包括：样本容纳单元密封件，在所述第一液体出/入口表面设置所述样本容纳单元密封件，用于将所述样本容纳单元进行第一密封处理；稀释液容纳单元密封件，在所述稀释液出口表面设置所述稀释液容纳单元密封件，用于将所述稀释液容纳单元进行第二密封处理；所述方法进一步包括：预先刺穿处理，所述预先刺穿处理包括预先将所述样本容纳单元密封件进行第一刺穿处理，将所述稀释液容纳单元密封件进行第二刺穿处理。发明人发现，样本容纳单元密封件和稀释液容纳单元密封件不仅可以隔绝各独立单元内的反应物，便于不使用的情况下长时间保存，大大提高了各单元中各反应物的存储时间，而且避免了各反应物对PCR反应系统造成的污染，提高了PCR反应系统的使用寿命。进而，当样本容纳单元添加了样本后，只需要将样本容纳单元密封件和稀释液容纳单元密封件刺穿，以便使样本容纳单元以及稀释液容纳单元与微流控管路之间处于连通状态，系统便可以开始工作。由此，根据本发明实施例的方法操作更加简便。

根据本发明的实施例，所述第一刺穿处理是通过样本容纳单元密封件刺穿装置进行的，所述第二刺穿处理是通过稀释液容纳单元密封件刺穿装置进行的。

根据本发明的实施例，所述稀释液容纳单元密封件和所述样本容纳单元密封件的至少之一为密封膜。

根据本发明的实施例，所述密封膜是由锡箔纸、塑封膜、牛皮纸的至少之一形成。

根据本发明的实施例，所述密封膜的厚度为0.01~0.2mm，如为0.03 mm、0.05 mm、0.07 mm、0.09 mm、0.1 mm、0.13 mm、0.15 mm、0.17 mm或0.19 mm。发明人发现，若密封膜的厚度过小，则可能渗透，若密封膜的厚度过大，又难以刺穿。在一些实施例中，所述密封膜的厚度为0.05~0.1mm。

附图说明

图1是根据本发明实施例的利用PCR反应系统进行PCR反应的方法流程示意图；

图2是根据本发明另一实施例的利用PCR反应系统进行PCR反应的方法流程示意图；

图3是根据本发明另一实施例的利用PCR反应系统进行PCR反应的方法流程示意图；

图4是根据本发明另一实施例的利用PCR反应系统进行PCR反应的方法流程示意图；

图5是根据本发明实施例的PCR系统结构示意图；

图6是根据本发明另一实施例的PCR系统结构示意图；

图7是根据本发明另一实施例的PCR系统结构示意图。

附图标记：

100：样本容纳单元；

110：第一液体出/入口；

200：稀释液容纳单元；

210：稀释液出口；

300：PCR反应单元；

310：裂解后的样本混合液入口；

320：PCR反应液出口；

400：活塞单元；

410：注射室；

411：第二液体出/入口；

420：活塞；

500：缓冲单元；

510：PCR反应液入口；

520：通气口；

610：样本容纳单元密封件；

620：稀释液容纳单元密封件；

710：样本容纳单元密封件刺穿装置；

720：稀释液容纳单元密封件刺穿装置；

810：样本控制阀；

820：稀释控制阀；

830：第一PCR控制阀；

840：第二PCR控制阀；

910：第一管路；

920：第二管路；

930：第三管路；

940：第四管路。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

利用PCR反应系统进行PCR反应的方法

在本发明的第一方面，本发明提出了一种利用PCR反应系统进行PCR反应的方法。根据本发明的实施例，参考图5，该PCR反应系统包括：样本容纳单元100，所述样本容纳单元100内设置有裂解冻干粉和样本，并且所述样本容纳单元100设置有第一液体出/入口110；稀释液容纳单元200，所述稀释液容纳单元200内设置有稀释液，并且所述稀释液容纳单元200内设置有稀释液出口210；PCR反应单元300，所述PCR反应单元300内设置有反转录酶和PCR原料冻干粉，并且所述PCR反应单元300设置有裂解后的样本混合液入口310和PCR反应液出口320，所述PCR反应液出口320与所述稀释液出口210通过第四管路940相连；以及活塞单元400，所述活塞单元包括注射室410和活塞420，所述注射室410设置有第二液体出/入口411，所述第二液体出/入口411与所述第一液体出/入口110通过第一管路910相连，所述第二液体出/入口411与所述稀释液出口210通过第二管路920相连，所述第二液体出/入口411与所述裂解后的样本混合液入口310通过第三管路930相连；

参考图1，该方法包括：将所述活塞420进行第一移动处理S100，以便使部分稀释液进入所述注射室410，所述稀释液设置在所述稀释液容纳单元200内；将所述活塞420进行第二移动处理S200，以便使进入注射室410的所述稀释液与裂解冻干粉以及样本进行第一混合处理，所述裂解冻干粉以及所述样本设置在所述样本容纳单元100内，所述第一混合处理是在所述样本容纳单元100中进行的；将第一混合处理产物进行裂解处理S300，所述裂解处理是在所述样本容纳单元100中进行的；将所述活塞420进行第三移动处理S400，以便使裂解处理产物进入所述注射室410；将所述活塞420进行第四移动处理S500，以便使进入注射室410的所述裂解处理产物与剩余部分稀释液进行第二混合处理，所述第二混合处理是在所述稀释液容纳单元200中进行的；将所述活塞420进行第五移动处理S600，以便使第二混合处理产物进入所述注射室410；将所述活塞420进行第六移动处理S700，以便使进入注射室410的所述第二混合处理产物与反转录酶及PCR原料冻干粉进行第三混合处理，所述反转录酶及PCR原料冻干粉设置在所述PCR反应单元300内，所述第三混合处理是在所述PCR反应单元300中进行的；以及将第三混合处理产物进行PCR温度循环扩增处理S800，所述PCR温度循环扩增处理是在所述PCR反应单元300中进行的。

根据本发明实施例的PCR反应系统通过微流控管路将样本容纳单元100、稀释液容纳单元200、PCR反应单元300以及活塞单元400相互连接在一起；同时，各单元又分别为独立设置的单元，以便使各单元在使用前存放不同的反应物，有利于反应物在不使用的情况进行长久保存。例如，样本容纳单元100的独立设置有利于样本的单独添加，使样本的添加操作简单化，同时也有利于样本的长久保存。参考图1和图5，首先，将活塞420向外拉动到一定位置，从而使稀释液容纳单元200中的部分稀释液流向注射室410；之后往复移动活塞420，使注射室410中的稀释液进入样本容纳单元100，同时与样本容纳单元100中的裂解冻干粉以及样本混合均匀；之后对样本容纳单元100进行加热升温到设定温度，使样本容纳单元100中的样本在设定的温度下进行充分裂解；裂解完成后，再次将活塞420向外拉动到一定位置，从而使样本容纳单元100中已裂解的样本混合液流向注射室410；之后往复移动活塞420，使注射室410中已裂解的样本混合液返回稀释液容纳单元200，同时与稀释液容纳单元200中剩余的稀释液混合均匀，从而将已裂解的样本混合液进行稀释，将其中的杂质浓度降低；之后，再次将活塞420向外拉动到一定位置，从而使稀释液容纳单元200中稀释后的样本混合液流向注射室410；随后往复移动活塞420，使注射室410中稀释后的样本混合液进入PCR反应单元300，同时与PCR反应单元300中的反转录酶以及PCR原料的冻干粉混合均匀；最后对PCR反应单元300进行PCR温度加热控制，以便最终完成PCR扩增反应。根据本发明实施例的PCR反应系统中，所述PCR反应液出口与所述稀释液出口通过第四管路相连，形成了PCR反应液出口与稀释液出口的压力系统连通，从而使得PCR反应单元内过多的反应液可以顺利通过反应液出口流出到第四管路。进一步地，根据本发明实施例的PCR反应系统中，可以在微流控管路的合适位置灵活设计阀门或者其他开关，以便控制活塞单元400与样本容纳单元100、稀释液容纳单元200或PCR反应单元300的连通状态。另外，活塞的移动以及各阀门或其他开关的控制也可以灵活设计其他机械装置来实现自动化。根据本发明实施例的PCR反应方法中，将已裂解的样本混合液返回稀释液容纳单元，与稀释液容纳单元中剩余的稀释液混合均匀，可以将已裂解的样本混合液进行稀释，将其中的杂质浓度显著降低，从而避免裂解后产生的杂质对后续PCR扩增反应造成不利影响，有利于PCR反应的自动化。需要说明的是，本领域技术人员可以根据实际需求设计两部分稀释液的具体用量比例。由此，根据本发明实施例的PCR反应方法实现了从样本核酸提取到与试剂混合，最后再到PCR反应的全自动过程，解决了传统PCR实验过程需要在专业实验环境下由专业人士进行操作的难题，无需专业人士即可完成，且减少了人为操作带来的误差，极大地提高了PCR反应的工作效率，大大节约了人力资源成本。

下面参考附图，对根据本发明实施例的方法进行进一步详细描述：

根据本发明的另一实施例，参考图2，该PCR温度循环扩增处理S800包括：将所述第三混合处理产物进行恒温处理S810；以及将恒温处理产物进行温度循环处理S820。

根据本发明的另一实施例，参考图6，该PCR反应系统进一步包括：样本控制阀810，所述样本控制阀810设置在所述第一管路910上，用于控制所述第二液体出/入口411与所述第一液体出/入口110的连通状态；稀释控制阀820，所述稀释控制阀820设置在所述第二管路920上，用于控制所述第二液体出/入口411与所述稀释液出口210的连通状态；第一PCR控制阀830，所述第一PCR控制阀830设置在所述第三管路930上，用于控制所述第二液体出/入口411与所述裂解后的样本混合液入口310的连通状态；以及第二PCR控制阀840，所述第二PCR控制阀840设置在所述第四管路940上，用于控制所述PCR反应液出口320与所述稀释液出口210的连通状态；

参考图3，该方法进一步包括：S910：在所述第一移动处理前，将所述样本控制阀、所述第一PCR控制阀以及所述第二PCR控制阀进行关闭处理，将所述稀释控制阀进行开启处理；S920：在所述第一移动处理后以及所述第二移动处理前，将所述稀释控制阀进行关闭处理，将所述样本控制阀进行开启处理；S930：在所述第三移动处理后以及所述第四移动处理前，将所述样本控制阀进行关闭处理，将所述稀释控制阀进行开启处理；S940：在所述第五移动处理后以及第六移动处理前，将所述稀释控制阀进行关闭处理，将所述第一PCR控制阀以及所述第二PCR控制阀进行开启处理；S950：在所述恒温处理后以及温度循环处理前，将所述第一PCR控制阀以及所述第二PCR控制阀进行关闭处理。

根据本发明的实施例，参考图3和图6，首先，关闭第一PCR控制阀830、第二PCR控制阀840以及样本控制阀810，打开稀释控制阀820；然后将活塞420向外拉动到一定位置，从而使稀释液容纳单元200中的部分稀释液流向注射室410；之后关闭稀释控制阀820，打开样本控制阀810；之后往复移动活塞420，使注射室410中的稀释液进入样本容纳单元100，同时与样本容纳单元100中的裂解冻干粉以及样本混合均匀；之后对样本容纳单元100进行加热升温到设定温度，使样本容纳单元100中的样本在设定的温度下进行充分裂解；裂解完成后，再次将活塞420向外拉动到一定位置，从而使样本容纳单元100中已裂解的样本混合液流向注射室410；之后，关闭样本控制阀810，打开稀释控制阀820；之后往复移动活塞420，使注射室410中已裂解的样本混合液返回稀释液容纳单元200，同时与稀释液容纳单元200中剩余的稀释液混合均匀，从而将已裂解的样本混合液进行稀释，将其中的杂质浓度降低；之后，再次将活塞420向外拉动到一定位置，从而使稀释液容纳单元200中稀释后的样本混合液流向注射室410；之后，关闭稀释控制阀820，打开第一PCR控制阀830和第二PCR控制阀840；随后往复移动活塞420，使注射室410中稀释后的样本混合液进入PCR反应单元300，同时与PCR反应单元300中的反转录酶以及PCR原料的冻干粉混合均匀；最后对PCR反应单元300进行PCR温度加热控制，包括激活酶的前期恒温阶段以及温度循环控制阶段，在进行温度循环控制之前，关闭第一PCR控制阀830和第二PCR控制阀840，以便最终完成PCR扩增反应。根据本发明实施例的PCR反应系统中各单元与各阀门完美配合，协同发挥作用，使得实验产物对环境的污染以及环境对实验过程的污染均减少，有利于实现全自动化，无需专业人员进行人工操作。由此，根据本发明实施例的PCR反应方法在密闭环境下进行，减少了对系统环境的污染，提高了实验的可信度，且操作更加简便易行。

根据本发明的另一实施例，参考图3和图7，该PCR反应系统进一步包括：缓冲单元500，所述缓冲单元500设置有PCR反应液入口510和通气口520，所述缓冲单元500设置在所述第四管路940上，所述PCR反应液入口510与所述第二PCR控制阀840相连，所述通气口520与所述稀释液出口210相连。

根据本发明的实施例，参考图3和图7，首先，关闭第一PCR控制阀830、第二PCR控制阀840以及样本控制阀810，打开稀释控制阀820；然后将活塞420向外拉动到一定位置，从而使稀释液容纳单元200中的部分稀释液流向注射室410；之后关闭稀释控制阀820，打开样本控制阀810；之后往复移动活塞420，使注射室410中的稀释液进入样本容纳单元100，同时与样本容纳单元100中的裂解冻干粉以及样本混合均匀；之后对样本容纳单元100进行加热升温到设定温度，使样本容纳单元100中的样本在设定的温度下进行充分裂解；裂解完成后，再次将活塞420向外拉动到一定位置，从而使样本容纳单元100中已裂解的样本混合液流向注射室410；之后，关闭样本控制阀810，打开稀释控制阀820；之后往复移动活塞420，使注射室410中已裂解的样本混合液返回稀释液容纳单元200，同时与稀释液容纳单元200中剩余的稀释液混合均匀，从而将已裂解的样本混合液进行稀释，将其中的杂质浓度降低；之后，再次将活塞420向外拉动到一定位置，从而使稀释液容纳单元200中稀释后的样本混合液流向注射室410；之后，关闭稀释控制阀820，打开第一PCR控制阀830和第二PCR控制阀840；随后往复移动活塞420，使注射室410中稀释后的样本混合液进入PCR反应单元300，同时与PCR反应单元300中的反转录酶以及PCR原料的冻干粉混合均匀；最后对PCR反应单元300进行PCR温度加热控制，在PCR扩增中激活酶的前期恒温段，PCR反应单元300的混合液会因为高温而产生膨胀，膨胀过程中的液体溢出可以流入缓冲单元500中，恒温段结束后，关闭第一PCR控制阀830和第二PCR控制阀840，开始对PCR反应单元300进行温度循环控制，以便最终完成PCR扩增反应。由此，根据本发明实施例的PCR反应方法可以解决PCR试剂在高温膨胀时的溢出问题，且PCR反应在密闭环境下进行，减少了对系统环境的污染，提高了实验的可信度，操作更加简便易行。

根据本发明的另一实施例，参考图7，该PCR反应系统进一步包括：样本容纳单元密封件610，所述样本容纳单元密封件610设置在所述第一液体出/入口110表面，用于将所述样本容纳单元100进行第一密封处理；以及稀释液容纳单元密封件620，所述稀释液容纳单元密封件620设置在所述稀释液出口210表面，用于将所述稀释液容纳单元200进行第二密封处理；

参考图4，该方法进一步包括：预先刺穿处理S1000：所述预先刺穿处理包括预先将所述样本容纳单元密封件进行第一刺穿处理，将所述稀释液容纳单元密封件进行第二刺穿处理。

根据本发明的实施例，参考图4和图7，初始状态下，样本容纳单元100中含有以冻干粉状存在的裂解原料，PCR反应单元300中含有以冻干粉状存在的反转录酶和PCR原料，稀释液容纳单元200中含有适当的稀释液。样本容纳单元100以及稀释液容纳单元200在与微流控管路连通之处用样本容纳单元密封件610和稀释液容纳单元密封件620密封住，使样本容纳单元100的裂解原料与稀释液容纳单元200的稀释液以及PCR反应单元300的反转录酶及PCR原料相互隔绝，同时活塞420处于注射室410的最顶端（即注射室处于被活塞填满的状态）。需要说明的是，PCR反应系统在具有样本容纳单元密封件和稀释液容纳单元密封件的前提下，不需要再设置PCR反应密封装置，也已经可以起到各单元隔绝设置的作用，并且即使PCR反应单元中的反应物有少量进入管路中，对整体反应也影响不大。样本容纳单元密封件和稀释液容纳单元密封件不仅可以隔绝各独立单元内的反应物，便于不使用的情况下长时间保存，大大提高了各单元中各反应物的存储时间，而且避免了各反应物对PCR反应系统造成的污染，提高了PCR反应系统的使用寿命。进而，当样本容纳单元添加了样本后，只需要将样本容纳单元密封件和稀释液容纳单元密封件刺穿，以便使样本容纳单元以及稀释液容纳单元与微流控管路之间处于连通状态，系统便可以开始工作。由此，根据本发明实施例的方法操作更加简便。

根据本发明的实施例，参考图4和图7，所述第一刺穿处理是通过样本容纳单元密封件刺穿装置710进行的，所述第二刺穿处理是通过稀释液容纳单元密封件刺穿装置720进行的。

根据本发明的实施例，所述样本容纳单元密封件和所述稀释液容纳单元密封件的至少之一为密封膜。

根据本发明的实施例，所述密封膜是由锡箔纸、塑封膜、牛皮纸的至少之一形成。

根据本发明的实施例，所述密封膜的厚度为0.01~0.2mm，如为0.03 mm、0.05 mm、0.07 mm、0.09 mm、0.1 mm、0.13 mm、0.15 mm、0.17 mm或0.19 mm。发明人发现，若密封膜的厚度过小，则可能渗透，若密封膜的厚度过大，又难以刺穿。在一些实施例中，所述密封膜的厚度为0.05~0.1mm。

下面通过具体的实施例对本发明作出进一步描述。

实施例1

系统的结构：

参考图7，该系统的结构包括：设计为样本室的样本容纳单元100，设计为稀释室的稀释液容纳单元200，注射室410，活塞420，设计为PCR室的PCR反应单元300，设计为缓冲室的缓冲单元500，设计为样本密封膜的样本容纳单元密封件610，设计为稀释密封膜的稀释液容纳单元密封件620，微流控管路，样本控制阀810，稀释控制阀820，第一PCR控制阀830，第二PCR控制阀840，各单元通过微流控管路连接形成一个相关联的回路。

系统的工作原理：

参考图7，初始状态下，样本室含有以冻干粉状存在的裂解原料，PCR室含有以冻干粉状存在的反转录酶和PCR原料，稀释室含有适当稀释液。样本室及稀释室在与微流控管路连通之处用样本密封膜和稀释密封膜密封住，使样本室的裂解原料与稀释室的稀释液以及PCR室的反转录酶及PCR原料相互隔绝。活塞处于注射室的最顶端(注射室处于活塞填满状态)。

当样本室添加了样本后，该系统开始工作。首先，通过刺穿装置710/720将样本密封膜和稀释密封膜刺穿，从而使各单元和微流孔管路之间处于连通状态。第二，关闭样本控制阀、第一PCR控制阀、第二PCR控制阀，移动活塞向外拉动到一定位置，从而使稀释室的稀释液通过稀释控制阀流向注射室。第三，关闭稀释控制阀，打开样本控制阀，往复移动活塞，将注射室的部分稀释液通过样本控制阀进入到样本室，在往复移动活塞的过程中，充分将样本室的裂解冻干粉与稀释液及加入的样本混合均匀。第四，开始对样本室进行加热升温到设定温度，使得样本室中的样本在设定的温度下进行充分裂解。第五，裂解完成后，移动活塞向外拉动到一定位置，从而使样本室的已裂解的样本混合液通过样本控制阀流向注射室。第六，关闭样本控制阀，打开稀释控制阀，往复移动活塞，将注射室中已裂解的样本混合液返回稀释室，在往复移动活塞的过程中，充分将已裂解的样本混合液与稀释室中剩余的稀释液混合均匀，从而将已裂解的样本混合液进行稀释，将其中的杂质浓度降低；第七，再次将活塞向外拉动到一定位置，从而使稀释室中稀释后的样本混合液流向注射室；第八，关闭稀释控制阀，打开第一PCR控制阀与第二PCR控制阀，往复移动活塞，将注射室的样本混合液通过PCR控制阀进入到PCR室，在往复移动活塞的过程中，充分将已稀释的样本混合液与PCR室的反转录酶及PCR原料冻干粉混合均匀。第九，开始对PCR室进行PCR温度加热控制，在PCR扩增中激活酶的前期恒温段，PCR室中的混合液会因为高温而产生膨胀，膨胀过程中的液体溢出可经过第二PCR控制阀流到缓冲室中，恒温段结束后，关闭第一PCR控制阀与第二PCR控制阀，开始对PCR室进行温度循环控制，最终完成PCR扩增实验。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。

在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接或彼此可通讯；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、 “示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (8)

1.一种利用PCR反应系统进行PCR反应的方法，其特征在于，

所述PCR反应系统包括：

样本容纳单元，所述样本容纳单元内设置有裂解冻干粉和样本，并且所述样本容纳单元具有第一液体出/入口，

稀释液容纳单元，所述稀释液容纳单元内设置有稀释液，并且所述稀释液容纳单元具有稀释液出口，

PCR反应单元，所述PCR反应单元内设置有反转录酶和PCR原料冻干粉，并且所述PCR反应单元具有PCR反应液出口和裂解后的样本混合液入口，

活塞单元，所述活塞单元包括注射室和活塞，所述注射室具有第二液体出/入口，

所述第二液体出/入口通过第一管路与所述第一液体出/入口相连，

所述第二液体出/入口通过第二管路与所述稀释液出口相连，

所述第二液体出/入口通过第三管路与所述裂解后的样本混合液入口相连，

所述PCR反应液出口通过第四管路与所述稀释液出口相连，

样本容纳单元密封件，在所述第一液体出/入口表面设置所述样本容纳单元密封件，用于将所述样本容纳单元进行第一密封处理，

稀释液容纳单元密封件，在所述稀释液出口表面设置所述稀释液容纳单元密封件，用于将所述稀释液容纳单元进行第二密封处理；

所述方法包括：

进行第一刺穿处理，所述第一刺穿处理是通过样本容纳单元密封件刺穿装置进行的，

进行第二刺穿处理，所述第二刺穿处理是通过稀释液容纳单元密封件刺穿装置进行的，

将所述活塞进行第一移动处理，以便使部分稀释液进入所述注射室，所述稀释液设置在所述稀释液容纳单元内，

将所述活塞进行第二移动处理，以便使进入注射室的所述稀释液与裂解冻干粉和样本进行第一混合处理，所述裂解冻干粉和所述样本设置在所述样本容纳单元内，所述第一混合处理是在所述样本容纳单元中进行的，

将第一混合处理产物进行裂解处理，所述裂解处理是在所述样本容纳单元中进行的，

将所述活塞进行第三移动处理，以便使裂解处理产物进入所述注射室，

将所述活塞进行第四移动处理，以便使进入注射室的所述裂解处理产物与剩余部分稀释液进行第二混合处理，所述第二混合处理是在所述稀释液容纳单元中进行的，

将所述活塞进行第五移动处理，以便使第二混合处理产物进入所述注射室，

将所述活塞进行第六移动处理，以便使进入注射室的所述第二混合处理产物与反转录酶和PCR原料冻干粉进行第三混合处理，所述反转录酶和PCR原料冻干粉设置在所述PCR反应单元内，所述第三混合处理是在所述PCR反应单元中进行的，以及

将第三混合处理产物进行PCR温度循环扩增处理，所述PCR温度循环扩增处理是在所述PCR反应单元中进行的。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR温度循环扩增处理包括：

将所述第三混合处理产物进行恒温处理；以及

将恒温处理产物进行温度循环处理。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，

所述PCR反应系统进一步包括：

样本控制阀，在所述第一管路上设置所述样本控制阀，用于控制所述第一液体出/入口与所述第二液体出/入口的连通状态，

稀释控制阀，在所述第二管路上设置所述稀释控制阀，用于控制所述稀释液入口与所述第二液体出/入口的连通状态，

第一PCR控制阀，在所述第三管路上设置所述第一PCR控制阀，用于控制所述裂解后的样本混合液入口与所述第二液体出/入口的连通状态，以及

第二PCR控制阀，在所述第四管路上设置所述第二PCR控制阀，用于控制所述稀释液出口与所述PCR反应液出口的连通状态；

所述方法进一步包括：

在所述第一移动处理前，关闭所述样本控制阀、所述第一PCR控制阀以及所述第二PCR控制阀，开启所述稀释控制阀，

在所述第一移动处理后以及所述第二移动处理前，关闭所述稀释控制阀，开启所述样本控制阀，

在所述第三移动处理后以及所述第四移动处理前，关闭所述样本控制阀，开启所述稀释控制阀，

在所述第五移动处理后以及所述第六移动处理前，关闭所述稀释控制阀，开启所述第一PCR控制阀以及所述第二PCR控制阀，

在所述恒温处理后以及温度循环处理前，关闭所述第一PCR控制阀以及所述第二PCR控制阀。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述PCR反应系统进一步包括：

缓冲单元，所述缓冲单元具有PCR反应液入口和通气口，在所述第四管路上设置所述缓冲单元，所述第二PCR控制阀与所述PCR反应液入口相连，所述稀释液出口与所述通气口相连。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述稀释液容纳单元密封件和所述样本容纳单元密封件的至少之一为密封膜。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述密封膜是由锡箔纸、塑封膜、牛皮纸的至少之一形成。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述密封膜的厚度为0.01~0.2mm。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述密封膜的厚度为0.05~0.1mm。

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