TWI582425B - 樣本分析晶片、樣本分析方法及基因解析方法 - Google Patents

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Description

樣本分析晶片、樣本分析方法及基因解析方法
本發明係關於樣本分析晶片、樣本分析方法及基因解析方法。
以往，在例如DNA反應、蛋白質反應等生化反應的領域，作為處理微量樣本溶液之反應裝置，已知有稱為μ-TAS(Total Analysis System)或Lab-on-Chip的技術。此係為在1個晶片或匣體具備多個反應室(以下稱井)或流路，可進行多個檢體的解析或多個反應。已知此技術可藉由將晶片及匣體小型化來減少處理的藥品，且具有各式各樣的優點。
其優點例舉如藉由使以往使用的強酸或強鹼藥品之分量為微量而大幅降低對人體的影響或對環境的影響；及因為用於生化反應等的高額試劑類之消費量為微量，所以可降低花費於分析及反應的成本等。
為了使用晶片或匣體以最高效率進行生化反應，必須在多個井分別配置不同種類的藥品或檢體及酵素，將與此等藥品或檢體及酵素產生反應的試劑從一根至數根主導管匯集並流入井，使其產生不同的多個反應。
若使用此手法，可藉由同樣試劑同時處理多種檢體，或反之可對一種檢體同時實施多個處理，可大幅減少以往花費的時間或工夫及成本。
使用此種手法時，將等量樣本送液至多個反應場所的技術及設法不混合各井的內容物之技術十分重要。作 為關於進行朝此種井送液的晶片之先前技術，係列舉如下的事項。
在日本特表2004-502164號公報(以下稱專利文獻1)，於利用離心力進行從儲存槽往井送液之晶片，為了使井獨立而使流路變形並密封。
在日本專利第3699721號公報(以下稱專利文獻2)，藉由自轉+公轉交錯的離心方法解決往各井的送液量之不均度。
在日本特開2008-83017號公報(以下稱專利文獻3)，雖然公開了連結複數個具有液體儲存部及延伸到離心方向的流路之多個井的分析用媒體，但是在此文獻並未著眼於液體的配送性，而是揭露藉由與蓄積於井的空氣之互相擠壓來控制流體。
然而，在專利文獻1所記載的晶片中，需要有壓縮流路的機構且難以自動化。又，如同以往的離心送液晶片，進行從中央的儲存槽至周圍的井之離心送液時，往各井的送液量會產生不均。
又，若嘗試採用專利文獻2所記載的離心方法，需要有用於使晶片自轉且使晶片公轉的複雜機構及空間。
又，在專利文獻3所記載的分析用媒體，液體儲存部及液體儲存部之間流路的液體不被送液，而且送液至各井的液量十分不均，每次反應的結果都會產生差異。
本發明係鑑於上述狀況而完成者，其目的為使送液方法簡易且減少各井液量的不均度，可適當進行由加熱 冷卻或加溫的化學反應及酵素反應，且提供低成本的樣本分析晶片。
為解決上述課題，此發明提出以下手段。
本發明之第一態樣的樣本分析晶片特徵為具備：基材；多個井，設於前述基材；主流路，於前述基材配置在比前述多個井更靠近旋轉中心的位置且供給被配送至前述多個井之每一者的溶液；第一緩衝部，與前述主流路的一端連通且可容納前述溶液的一部分；第二緩衝部，與前述主流路的另一端連通且可容納前述溶液的一部分；溶液供給路，一端與前述第一緩衝部連通且另一端向大氣敞開；及排氣通路，一端與前述第二緩衝部連通且另一端向大氣敞開；並具備設於前述基材且與前述多個井連接之流路。前述樣本分析晶片特徵為：藉由前述基材以前述旋轉中心為中心旋轉，而使前述主流路內的前述溶液朝前述井內移動。
又，較佳為前述流路於前述基材形成為溝狀，並進一步具備固定於前述基材且密封前述流路的密封構件。
又，較佳為前述溶液供給路的另一端及前述排氣通路的另一端皆在與形成有前述流路之面相反的面向大氣敞開。
又，較佳為與前述第二緩衝部之前述溶液的流通方向垂直相交之剖面的面積大於與在前述主流路之前述溶液的流通方向垂直相交之剖面的面積。
又，較佳為前述第二緩衝部的容積大於前述主流路的容積。
又，較佳為前述第二緩衝部的容積大於前述第一緩衝部的容積，前述第一緩衝部的容積及前述第二緩衝部的容積之合計大於前述主流路的容積。
又，較佳為具有唇部，其形成為包圍前述溶液供給路之另一端及前述排氣通路之另一端的壁狀，且當前述溶液注入至前述流路後，可藉由以閉塞前述溶液供給路之另一端及前述排氣通路之另一端為目的之裝置或治具而變形，以使前述流路保持密閉狀態。
又，較佳為前述主流路具有：山部，位於前述基材之旋轉中心側；及谷部，相對前述山部位於前述井側，並蛇行而形成，且前述井與前述谷部連通。
又，較佳為前述主流路之寬度於前述山部相對較小，於前述谷部相對較大。
又，前述山部亦可為前述山部的頂點為中間而隔著的任一側及另一側呈非對稱形狀。
又，較佳為前述基材係圓盤狀，且前述多個井係配置成與前述基材呈同心圓狀。
又，較佳為具有連結前述主流路及前述多個井之多個側路。
又，較佳為本發明之樣本分析晶片於前述基材設有擔持部，其用於使前述基材旋轉並進行藉由離心力所進行之溶液的送液。
又，較佳為在前述基材的外周圍部具有前述擔持部。
又，於前述基材設有位置檢測構造，其在以前述旋 轉中心為中心之離心處理的前後用於檢測各井之位置及角度。前述位置檢測構造較佳為具有由缺口、井或突起所構成之機械被檢測部。又，較佳為前述位置檢測構造具備光學被檢測部，前述光學被檢測部的表面粗糙度或光學特性係與在前述基材未設有前述光學被檢測部的部位之表面粗糙度或光學特性相異。
又，較佳為前述多個側路的每一者形成為與連結前述多個井之中連接有前述側路之井及前述基材之旋轉中心的直線呈傾斜。
又，前述主流路亦可形成為與旋轉中心方向呈傾斜。
又，上述樣本分析晶片較佳為具有：第一基材，形成有前述多個井及前述流路；及第二基材，與前述第一基材貼合。
又，較佳為前述第一基材及前述第二基材的至少任一者由光穿透性材料形成。
又，較佳為前述第一基材係光穿透性的樹脂材料，前述第二基材係金屬材料。
本發明之第二態樣的樣本分析方法係使用本發明之樣本分析晶片的樣本分析方法，其具有：將前述溶液注入前述主流路之步驟；及使前述基材旋轉並將前述溶液配送至前述各井之步驟。
又，較佳為將前述溶液配送至前述井的步驟之後，具有將礦物油配送至前述各井之步驟。
本發明之第三態樣的基因解析方法係使用本發明的 樣本分析方法。
利用本發明之第一態樣的樣本分析晶片，使送液方法簡易且減少各井的液量的不均度，可適當地進行由加熱冷卻或加溫所產生的化學反應及酵素反應，且可實現低成本。
又，利用本發明之第二態樣的樣本分析方法及第三態樣的基因解析方法，可進行分析精確度及重複性高的分析。
基於圖示說明本發明之一實施形態的樣本分析晶片。第1圖為表示本實施形態之樣本分析晶片的一樣態之俯視圖。第2圖為表示本實施形態之樣本分析晶片構造的一樣態之分解立體圖。
如第1圖所示，樣本分析晶片1係具有：基材101及第二基材120；設於前述基材101的多個井102；及用於將溶液送液至井102的流路(主流路103及側路105)。
樣本分析晶片1全體形成為圓板形狀，以圓板的中心點為旋轉中心，利用未圖示分析裝置等旋轉。在樣本分析晶片1，主流路103及側路105配置於比多個井102更靠近上述中心點側的位置。藉由樣本分析晶片1旋轉，主流路103內的溶液由於離心力往各井102移動。
在主流路103的一端(主流路第一端)，設有第一緩衝部110，其可容納供給至主流路103之溶液的一部分。又，在主流路103的另一端(主流路第二端)，設有第二緩衝部111，其可容納供給至主流路103之溶液的一部分。進 一步，在基材101形成有：溶液供給路107a，其一端(溶液供給路第一端)與第一緩衝部110連通，其另一端(溶液供給路第二端)向大氣敞開；及排氣通路107b，其一端(排氣通路第一端)與第二緩衝部111連通，其另一端(排氣通路第二端)向大氣敞開。
主流路103形成為在相鄰的井102之間具有往中心點方向突出的一山部103a。在此，相鄰的井102係指從主流路103往井102的送液流路之呈前後關係的井。又，往中心點方向突出的山部103a係指具有往中心點方向的極大點之曲線形狀。如此，藉由形成為相鄰的井之間具有朝向中心點方向之一個山，注入主流路103的液體會在晶片旋轉時於山部103a自然中斷，所以可以減少往各井102的配送量之不均度。
又，主流路103的寬度於山部103a較窄，於谷部103b較寬。在相當山部103a之區域存在的溶液較少者，其配送不均度較低，所以山部103a之主流路103的剖面積小於其他部分的剖面積。為了縮小山部103a的主流路103之剖面積，只要縮小山部103a的流路寬度，或者亦可使山部103a的主流路103之深度變淺即可。或者亦可縮小山部103a的流路寬度且使山部103a的主流路103之深度變淺。又，較佳為使其越靠近山部103則主流路103的剖面積逐漸變小。
又，藉由調整谷部103b的寬度，可設定往各井102的配送量。如此，位於彼此鄰接之2個山部103a之間的主流路103作為用於將規定容量的溶液配送給1個井102的 反應室C而發揮作用。本實施形態中，利用從山部103a至鄰接之山部103a的主流路103之上述反應室C係以一對一對應各井102，僅設有與井102的數量相同之數量。各反應室C為同樣形狀同樣大小，各反應室C的容積彼此相等。因此，藉由將容納於各反應室C的溶液配送至各井102，而將同量溶液均勻配送至各井102。
側路105具有連通主流路103的谷部103b及井102的管路狀之形狀。側路105為與連結中心點及井102的直線呈傾斜的直線狀。藉由側路105如此傾斜，施加離心力時，井102的空氣沿著側路105的內側(中心點側的內面)往主流路103方向移動，且溶液沿著側路105的外側(井102側的內面)往井102方向移動，所以可以使溶液往井102內順暢移動。作為傾斜的角度，中心點的方向與側路105形成的角較佳為從10度到80度之間。若為10度以下，從井102的排氣與溶液往井102的滲入有時會干涉而阻止溶液的滲入，若超過80度，有時往側路105方向的離心力較弱，溶液不往井102移動。
井102與主流路103的連結部位，即主流路103與側路105的連接部位係為主流路103的谷部103b。藉此，可減少配送時溶液往主流路103的殘留。此乃因谷部103b係主流路103的相鄰的山部103a之間距離中心點最遠的部位之故。
又，在使晶片旋轉前的階段，主流路103與井102的連結口作成為溶液不會滲入井102之程度的寬度及剖面積。主流路103與井102的連結口之寬度及剖面積係基於 溶液的表面張力之大小而設定為適當大小。例如，溶劑為水時，上述連結口的形狀較佳為高度2mm以下，且寬度2mm以下的矩形形狀。又，溶劑為水時，連結口的剖面積較佳為4mm2以下。
又，為了不使空氣殘留在井102內，側路105與井102係在井102中距離中心點最近點處連結。
又，井102的容積較佳為1μl以上100μl以下。若井102的容積小於1μl，離心力未充分發揮作用，難以進行往井102的送液。又，若井102的容積大於100μl，可能產生試劑的混合性降低或井102內的溫度均勻性降低的現象。
在樣本分析晶片1的外周圍部，形成有位置檢測構造108。位置檢測構造108形成於樣本分析晶片1外周圍的一部位，位置檢測構造108之位置與各井102的位置的關係以成為預先規定的關係之方式構成。例如，本實施形態中，位置檢測構造108形成於溶液的流通方向中最靠近第一緩衝部110的井102附近。
此位置檢測構造108設於基材101，用於在以旋轉中心為中心的離心處理之前後檢測各井的位置及角度。
本實施形態中，位置檢測構造108具有包含缺口、孔洞或突起的機械被檢測部。
具體而言，位置檢測構造108係樣本分析晶片1外周圍的一部分切割為大致矩形形狀的缺口。
又，位置檢測構造108亦可具有光學被檢測部。此時，光學被檢測部的表面粗糙度或光學特性係與在前述基材101中未設有光學被檢測部的部位之表面粗糙度或光 學特性相異。
具體而言，樣本分析晶片1的外周圍中未設有位置檢測構造108的部分係利用噴砂、蝕刻或壓花加工等而具有微細凹凸，且光穿透性低。藉此，位置檢測構造108的位置係使用例如光感測器或雷射感測器檢測光的散射程度而輕易地檢測。又，可利用光學檢測機構檢測位置檢測構造108的位置，所以可在非接觸狀態對樣本分析晶片1進行位置檢測。
尚且，因為位置檢測構造108係為缺口，故可進行使用接觸開關的機械檢測來取代使用光感測器或雷射感測器的光學檢測。此時，雖然樣本分析晶片1不適合在高速旋轉時進行位置檢測，但可以低成本構成機器，以用於樣本分析晶片1的位置檢測。
又，在樣本分析晶片1的外周圍部分，於圓周上每隔120度形成有共3個擔持部109。擔持部109係卡止使樣本分析晶片1旋轉的機器之凹槽。該機器可藉由使例如爪構件卡止到擔持部109而保持樣本分析晶片1。擔持部109的形狀、數量及配置係對應該機器的構造而設定。若擔持部109沿著樣本分析晶片1的周圍方向且相鄰的擔持部109以樣本分析晶片1的中心點為中心成為未滿180度的角度，則不限定其數量。又，擔持部109亦可為在厚度方向貫通基材101的貫通孔，此時，擔持部109亦可為2個。
第5圖為樣本分析晶片1的俯視圖，表示溶液的流通路徑。第6圖為沿著第5圖所示的流通路徑而展開樣本分析晶片1的展開圖。
如第5圖及第6圖所示，第一緩衝部110在溶液供給路107a與主流路103之間具有保有一部分溶液的空間。第一緩衝部110與主流路103同樣在基材101形成為溝狀，藉由利用第二基材120密封而成為流路狀。第一緩衝部110的容積較佳為按照加熱被供給至樣本分析晶片1的溶液時之膨脹量來設定。本實施形態中，第一緩衝部110以沿著第二緩衝部111中儲存槽113的外側之方式彎曲形成。第一緩衝部110中與溶液的流通方向直角相交的剖面形狀在本實施形態中為四角形狀。
第二緩衝部111具備成為與第一緩衝部110同樣的剖面形狀之管路部112，以及與管路部112連通的儲存槽113。
管路部112的一端與主流路103連通。溶液從主流路103流入管路部112。管路部112沿著儲存槽113的外側彎曲，從樣本分析晶片1的中心點至管路部112的距離與從該中心點至第一緩衝部110的距離相等。藉此，樣本分析晶片1在繞著中心點進行旋轉動作時，位於管路部112內的溶液受到與位於第一緩衝部110內的溶液相同大小的離心力。
管路部112中溶液的流通方向之長度短於第一緩衝部110中溶液的流通方向之長度。
儲存槽113在與管路部112的連接部分，形成為與溶液的流通方向垂直相交的剖面積大於在管路部112的該剖面積。又，儲存槽113的容積與管路部112的容積之合計大於主流路103的容積。在儲存槽113的內部，儲存有 主流路103內的溶液之一部分及後述的油之一部分。又，儲存槽113的高度尺寸(在第二基材120，從面向基材101側之面朝與該面垂直之方向量測的尺寸)大於管路部112的高度尺寸(在第二基材120，從面向基材101側之面朝與該面垂直方向量測的尺寸)。因此，在儲存槽113內儲存比重高的溶液(例如樣本水溶液等)之狀態下，比重小於該溶液的溶液(例如礦物油等)通過管路部112流入儲存槽113時，比重小的溶液會在比重大的溶液之上移動並覆蓋比重大溶液。
其次，說明本發明的樣本分析晶片的製造方法。
首先，如第1圖所示，藉由使用成形模具的成形，形成具有井102及流路(包含主流路103及側路105)的基材(第一基材)101。
基材101在厚度方向的第一面，形成有成為製造後的井102、主流路103、側路105、溶液供給路107a、排氣通路107b、第一緩衝部110及第二緩衝部111的溝狀構造。在此，溶液供給路107a、排氣通路107b亦於基材101的厚度方向之第二面開口。又，在前述第二面，一體形成有唇部115，其具有包圍溶液供給路107a及排氣通路107b的連續壁狀形狀。
又，基材101的厚度在10μm~300μm的範圍時，可適當滿足基材101的熱傳導性及密封性兩者。基材101的厚度大於300μm時，有熱容量變大且熱反應性降低之虞。
作為基材101的材料，可適當使用具有光穿透性的樹脂。又，對井102內的溶液進行光學分析(螢光量測或比 色量測等)時，較佳為基材101的透明性高。例如，若基材101的材料為不影響樣本者，則未特別限定，但若特別使用包含聚丙烯、聚碳酸酯及丙烯酸之任一者的樹脂材料，則可確保良好的可見光穿透性。作為聚丙烯，可使用均聚丙烯或聚丙烯及聚乙烯的隨機共聚物。又，作為丙烯酸，可使用聚甲基丙烯酸甲酯或者甲基丙烯酸甲酯及其他甲基丙烯酸脂、丙烯酸酯及苯乙烯等單體的共聚物。又，使用此等樹脂材料時，亦可確保晶片的耐熱性或強度。作為樹脂材料以外，可列舉鋁、銅、銀、鎳、黃銅及金等金屬材料。使用金屬材料時，進一步有優異的熱傳導率及密封性能。
尚且，藉由使基材101的井102之底部為透明，可從外部進行螢光等檢測‧分析。尚且，本發明之「透明」及「光穿透性」係表示形成時的可見光域(波長350~780nm)之全平均穿透率為70%以上。
作為基材101的加工方法，為樹脂材料時，可使用射出成形及真空成形等各種樹脂成形法或機械切削等。為金屬材料時，可藉由施加使用厚質基材的研削加工或蝕刻及對薄質金屬板施加壓製加工或擠壓加工而形成。
又，作為基材101，特別是使用包含聚丙烯、聚碳酸酯及丙烯酸之任一者的樹脂材料時，可確保良好的光穿透性、耐熱性及強度。又，基材101的厚度在50μm~3mm的範圍時，可確保良好的光穿透性、耐熱性及強度，可確實執行凹部的加工。
第3圖為本實施形態的樣本分析晶片1之剖面圖。
如第3圖所示，在基材101成形有：貫通晶片的溶液之溶液供給路107a；用於供注入液流入晶片的主流路103；與延伸至晶片外周圍部之各井連通的側路105；及晶片外周圍部的井102。尚且，第3圖的剖面圖示意性地表示從溶液供給路107a經由井102與排氣通路107b連接的路徑。主流路103及側路105的形狀不限於如第3圖所示的構造。為了使注入的溶液充滿全部的井102，主流路103的容積必須大於各井102的容積之合計。然而，當井102中固定有後述的試劑301時，放入井102之液體樣本的量依據試劑301的容量而減少。因此，亦可依據試劑301的容量而減少流入的流路之容積。為了進行螢光反應或量測，在基材101側，經由基材101進行井102內的檢測量測時，井102的凹部較佳為成為平坦的台形。
第4圖為本實施形態的樣本分析晶片1之剖面圖。
如第4圖所示，在基材101形成有井102之後，於井102固定反應用的試劑301。在各井可使用不同的試劑。藉由在各井102分別固定不同的試劑，可對1個檢體(樣本)實施多個處理。又，亦可設法將用於進行實際反應的試劑之一部分固定於各井，且將剩餘的試劑與液體樣本一起導入。
其次，在基材101中形成有上述溝狀構造的上述第一面，貼合有圓板形狀的第二基材120(參照第2圖)。第二基材120為平板狀，且成為與基材101的上述第一面所形成的溝槽相對之蓋體。藉由將第二基材120貼合在基材101，而密封形成於基材101的溝槽之開口部分。
第二基材120的材料可從作為基材101的材料之上述材料中適當選擇並採用。
作為基材的貼合方法，列舉在一基材設有樹脂塗布層作為黏接層，並使樹脂塗布層熔融並黏接兩基材之方法。樹脂塗布層較佳為設於熱傳導率高的金屬材料基材並進行熔融黏接。作為樹脂塗布層的材料，可使用乙烯對苯二甲酸酯(Polyethylene Terephthalate，PET)或聚縮醛、聚酯或聚丙烯等樹脂材料。
在基材101與第二基材120的貼合步驟，較佳為於基材101使用易於微細加工且適於螢光量測的光穿透性樹脂材料，於第二基材120使用對基材101容易進行使用熔融黏接的貼合之材料。作為第二基材120的材料，可適當採用熱傳導率高且具有熔融黏接用的樹脂塗布層之金屬材料。藉由在金屬材料的表面形成樹脂塗布層，選定材料時亦可不考慮金屬材料本身的耐藥品性。
又，在第二基材120的金屬材料表面形成樹脂塗布層時，若形成錨定層作為樹脂塗布層的基底，可進行使用雷射的熔接。為了進行使用雷射的熔接，適當的錨定層較佳為摻入吸收雷射波長光的碳黑(光吸收性材料)。此時，藉由照射雷射光，錨定層會發熱且可熔融黏接樹脂塗布層。
又，亦可於樹脂塗布層添加碳黑或將樹脂塗布層的表面塗布成黑色，以取代於錨定層添加碳黑。例如即使藉由照射波長900nm左右的紅外光發光二極體雷射的光，也可以高效率熔融樹脂塗布層。雷射熔接與熱熔接不 同，不必加熱全體樣本分析晶片1，因此可在幾乎不會影響樣本分析晶片1或固定於樣本分析晶片1的試劑的情況下貼合基材101及第二基材120。
其次，說明本實施形態的樣本分析晶片1之作用。第7A圖、第7B圖、第7C圖及第7D圖為用於說明樣本分析晶片1之作用的說明圖。第8A圖、第8B圖、第8C圖、第8D圖及第8E圖為表示使用樣本分析晶片1時溶液移動的示意俯視圖。第9A圖、第9B圖、第9C圖、第9D圖及第9E圖為表示使用樣本分析晶片1時溶液移動的示意俯視圖。
如第7A圖、第8A圖~第8D圖所示，液體X1從溶液供給路107a被供給至主流路103內，且主流路103內充滿溶液。進一步，溶液的一部分也被供給至第一緩衝部110及第二緩衝部111。
如第7B圖及第8E圖所示，本實施形態的樣本分析晶片1利用藉由使該樣本分析晶片1旋轉產生的離心力，將供給至主流路103內的溶液配送至各井102。樣本分析晶片1為圓盤狀，且各井102配置呈同心圓狀，因此在各井102利用同樣大的離心力配送溶液。進一步，各井102沿著1個圓周配置，因此若對多個井102中的1個設定分析區域，則可藉由以樣本分析晶片1的中心點為旋轉中心而旋轉，以對全部井102依序分析。
在此，位在2個山部103a之間的主流路103(反應室C)內之溶液藉由離心力往井102移動時，溶液從位在一個反應室C旁邊的其他反應室C內往該一個反應室C稍微移動。藉由將相當於此微量溶液之和的量之溶液預先分成兩 份而配置於第一緩衝部110與管路部112，可補足從位在主流路103兩端的反應室C往井102移動的溶液之不足分量。
此時，離心處理結束後，有時在第一緩衝部110及管路部112內會殘留溶液的一部分(液體X2、X3)(參照第7B圖及第8E圖)。離心處理結束後殘留的溶液隨後進入井102時，可能會影響該井102的分析精確度。因此，進行將第一緩衝部110及管路部112內殘留的溶液往儲存槽113壓出的操作。
如第7C圖及第9A圖、第9B圖及第9C圖所示，為了將第一緩衝部110及管路部112內殘留的溶液往儲存槽113壓出，而將不影響井102的反應之液體Y1從溶液供給路107a往主流路103內供給。作為不影響井102的反應之液體的例，例如在井102內進行PCR反應時，較佳為礦物油。
如第9D圖所示，第一緩衝部110及管路部112內殘留的溶液往儲存槽113被壓出後，即使使樣本分析晶片1旋轉，儲存槽113內的液體僅被壓出到儲存槽113或管路部112的內壁而不往主流路103逆流。即使是離心處理結束後，如第9E圖所示，並無可使壓出到儲存槽113內的溶液返回主流路103的間隙，且主流路103內由上述礦物油等液體填充。
藉此，可壓低第一緩衝部110及管路部112內殘留的溶液對井102內的反應造成之影響。
其次，關於本發明之一實施形態的樣本分析方法， 將以使用本實施形態的樣本分析晶片1的情況為例說明。
樣本分析晶片1可用於使用包含例如DNA及蛋白質等的樣本溶液所得之生化物質的檢測或分析。在各井102，可固定樣本溶液或試劑。在各井102固定樣本溶液或試劑的作業於樣本係於製造分析晶片1時進行。在各井102固定試劑，並將液體樣本配送至各井102時，可在各井102使用不同的試劑。又，在各井102固定樣本，將液體試劑配送至各井102時，可在各井102使用不同的樣本。
以下表示使用包含DNA的樣本並進行SNPs的分析之例。
例如，在各井102固定不同的SNPs探針與酵素。藉此，可在1個樣本分析晶片1的內部同時進行多種SNPs鑑定反應。
具體而言，可藉由利用吸量管在基材101的井102分別滴下不同的SNPs，使用離心裝置以2000~3000rpm對基材101進行10分鐘左右的離心，且使液面呈平坦狀態並將其乾燥而固定在井。之後，將基材101及第二基材120貼合。
其次，從溶液供給路107a將試劑等溶液注入至主流路103。在此階段，僅主流路103充滿溶液，且如前述，溶液未滲入側路105。此係因為有溶液表面張力、以及由於在井102側無排氣孔洞而有來自井側的氣壓之故。尚且，將溶液注入至主流路103的作業可為手動作業，亦可為利用分注機器人的自動控制。
其次，將樣本分析晶片1依照規定的旋轉速度以中心 點為旋轉中心旋轉。此時，作為使樣本分析晶片1旋轉的裝置，可使用例如旋轉速度為1000rpm以上3000rpm以下的低速離心機。尚且，亦可使用旋轉速度超過3000rpm的離心機。
又，作為使樣本分析晶片1旋轉的裝置，亦可使用設有爪的裝置，該爪對應本實施形態的樣本分析晶片1之擔持部109的位置及形狀。此時，可使樣本分析晶片1的旋轉穩定。
利用使樣本分析晶片1旋轉的裝置，將通過樣本分析晶片1的中心點並朝樣本分析晶片1的垂直方向(本實施形態中為第二基材120的厚度方向)延伸之軸線作為旋轉軸，使樣本分析晶片1旋轉。作為旋轉速度，必須有施加於溶液之離心力大於前述的氣壓及表面張力且溶液會流入井102的旋轉速度。雖然與晶片的形態有關，但較佳為約1000rpm以上。晶片的旋轉速度小於約1000rpm時，有時會發生溶液不流入井102的情況，液量有不固定之虞。
使用離心進行樣本的配送後，為了防止各井102的混液或汚染，將不妨礙樣本‧試劑之反應的油(礦物油)以同樣的步驟配送至各井。針對油，必須使用比重比先前配送的溶液輕者。此係為了在使樣本分析晶片1旋轉並藉由離心力配送時，於側路105側扮演各井102之栓的角色之故。若油的比重小於先前配送的溶液之比重，在使樣本分析晶片1旋轉時，油會靠近旋轉中心之側，先前配送的溶液會停留在遠離旋轉中心之側。
在井102混合試劑及樣本。其後，例如加熱井102內 的溶液使DNA變性，並進一步冷卻井102內的溶液使DNA與SNPs探針結合。此時，以利用未圖示之治具等壓碎唇部115的方式使其變形，並藉由利用該治具預先密封溶液供給路107a及排氣通路107b，可在加熱樣本分析晶片1時溶液膨脹或氣泡產生的情況下，防止溶液溢出的現象。
進一步，在本例中，當樣本分析晶片1內的液體因加熱而膨脹時，因膨脹而從主流路103溢出的液體儲存於第一緩衝部110及第二緩衝部111，所以可防止溶液從溶液供給路107a及排氣通路107b溢出。
若在井102內使DNA及SNPs探針結合，可藉由螢光檢測等手法分析井102內的溶液反應狀態。進行螢光檢測等的裝置可藉由使用光感測器或雷射感測器檢測設於樣本分析晶片1的外周圍部之位置檢測構造108，而檢測多個井102中應量測之井102的位置。該裝置可使樣本分析晶片1旋轉並量測規定之井102內的溶液之反應狀態。
如上述，藉由具備在各步驟中作用於樣本分析晶片的機構，而成為節省空間且易於分析樣本的樣本分析裝置。
尚且，也可在樣本分析晶片1的井102內使PCR反應進行。此時，使用接觸基材101及第二基材120之未圖示加熱冷卻裝置進行PCR反應。尚且，當基材101為光穿透性的樹脂材料且第二基材120為金屬板時，主要經由第二基材120進行井102內的溶液之溫度控制。
其次，使用本實施形態的樣本分析方法之具體例說 明樣本分析方法的詳細情形。
作為基因解析之1例，列舉如K-ras基因突變的檢測或生殖細胞突變的檢測。K-ras基因突變之判定因為有助於癌症治療，所以期望確定判定方法，且一般認為生殖細胞突變之判定可利用於藥效的推測等。
‧生殖細胞突變的檢測
生殖細胞突變可利用SNPs之判定來檢測。作為SNPs之一個判定方法，例如利用使用螢光的PC-PHFAA(PCR-Preferential Homoduplex Formation Assay)。根據該方法，係利用螢光試劑的發光差檢測突變，但藉由使用本發明的樣本分析晶片，各井之配送不均度較低，因此可進行正確分析，所以適用於SNPs檢測。又，對於作為上述以外的SNPs檢測方法之侵入法(註冊商標)等，亦可同樣地使用樣本分析晶片。
將從血液等得到的檢體核酸精製並製作成溶液樣本。在注入前或注入後配送前，於本實施形態的樣本分析晶片1進行檢體核酸的放大。例如，對VKORC1、CYP2C9*3、CYP2C9*2及正控制進行多重PCR以將樣本內的基因片段放大。將樣本送液並進行PCR。
上述的檢測方法中，為了判定一個SNP必須有2個檢測用的井102，所以針對每1個檢體樣本，使用形成有10個以上井102的樣本分析晶片1即可，並在井102之每一者固定SNP檢測用試劑。
將利用上述PCR放大核酸的樣本配送至各井102。對各井102調溫並利用混入井102內SNP檢測用試劑的螢光 試劑之發光差來檢測突變。對於一個SNP，若2個井102中僅一個為陽性反應則可判定為同質，若為二個陽性則可判定為異質。
‧K-ras基因突變的檢測
本例中，使用與在上述生殖細胞突變的檢測中使用的樣本分析晶片1不同的樣本分析晶片1。
在上述基因突變檢測用的井102中固定有包含探針核酸的試劑。又，包含探針核酸的前述試劑中，含有螢光試劑。因為K-ras基因的檢測具有野生型及13種突變，所以較佳為使用形成有至少14個井102的樣本分析晶片1，且將對應該井102之每一者的試劑固定化。
採取大腸癌等癌細胞，精製檢體核酸並作成溶液樣本。在注入前或注入後配送前，於本發明的樣本分析晶片1進行檢體核酸的放大。將樣本送液並進行PCR。
將利用上述PCR放大核酸的樣本配送至各井102。
可對各井102調溫並利用混入包含探針核酸之試劑的螢光試劑之發光差來檢測突變。
[實施例]
其次，雖然表示本發明之實施例，但本發明並未限定於此等實施例。
<實施例1>SNPs解析晶片
本實施例中，樣本分析晶片1作為進行SNPs之解析的SNPs解析晶片而使用。
作為SNPs解析晶片的基材101，採用聚丙烯(以下稱PP)的成型品。此基材101具備如第2圖所示的圓盤狀外形 ，具有：在同心圓上的波狀主流路103；在谷部103b具備連結口的側路105；及在側路105末端的井102。在此基材101分別形成有23個井102及側路105。又，主流路103週期性變換面積，鄰接的山部103a之間的主流路之容積為12μl。
作為與上述聚丙烯製基材101貼合之第二基材120，使用塗布聚丙烯樹脂的鋁片基材作為樹脂塗布層。在樹脂塗布層，使用厚度約0.07mm者。樹脂塗布層之融點係為120度左右，若加熱鋁側，則以熔融之方式被塗布於該鋁基材。
進一步，在鋁層及聚丙烯樹脂層之間設有摻入碳的錨定層，並形成藉由雷射光照射所產生的發熱等而使聚丙烯層熔融之構造。
在聚丙烯製基材101上的井102，固定下述表1的試劑類表之SNPs探針試劑，又，在其他井102，分別將用於進行PCR反應之酵素及用於SNPs的螢光檢測之侵入反應用酵素(參照表1)以吸量管滴下並使其乾燥固定。
將聚丙烯製基材101及鋁製的第二基材120重合，藉 由在第二基材120側施加130度以上的熱，使塗布於第二基材120的該樹脂層熔融並使該聚丙烯製基材101及鋁製第二基材120熔接。
以吸量管將混合表1所記載的緩衝溶液及精製過的基因組之溶液樣本送液至在上述步驟製作的SNPs解析晶片，並填充到主流路103。此階段中，樣本不滲入井102及側路105。
作為對SNPs解析晶片施加離心力的手段，作成利用用於化學、生物反應中試劑分離等的桌上小型離心機之簡易離心裝置並使用。離心時的旋轉數，藉由旋轉數量測器量測並調整。該簡易離心裝置係具有卡合擔持部109之爪的離心機。使用此離心機且以5000rpm離心時，11μl的樣本被送液至各井102。
尚且，關於離心時的SNPs解析晶片之旋轉方向，可確認與側路的傾斜方向呈任一方向旋轉時，雖然旋轉數增加會影響SNPs解析晶片內的液體行為，但不影響井的配送之不均度。
其次，將表1所記載之不妨礙反應的礦物油以同樣的手法送液時，樣本會填滿井102，並以剩餘溶液填滿側路105的一半左右，而油會填滿側路105的剩餘一半及谷部103b的8成。
尚且，本實施例中，在22個井102固定侵入反應用探針作為反應用試劑。又，為了判定反應結果的成敗，將負控制設定於1部位並在1片晶片上進行反應測試作為確認有無污染。
井102利用油對呈現獨立狀態的SNPs解析晶片以95℃及68℃交互循環35週期，並利用PCR反應放大樣本的基因組。其次，藉由以63℃進行30min的調溫，利用酵素反應在井102內使螢光檢測反應產生。
此時，可藉由從上方使未圖示裝置壓碎唇部115，防止SNPs解析晶片內部的溶液或油因熱導致體積膨脹而向外流出的現象。
又，此時因為SNPs解析晶片的聚丙烯基材(基材101)側為透明，所以通過聚丙烯基材從外部進行螢光檢測。本實施例中，利用組合光電倍增管及光纖的螢光檢測裝置量測上述螢光反應。
第10至12圖為利用藉由本實施例而檢測的螢光反應之SNPs的解析結果之圖表。各圖表的縱軸為檢測的光強度，表示螢光的強度。橫軸為時間軸。
第10圖為進行反應的1個井102之結果，確認規定的時間內產生利用混合的試劑類之螢光檢測反應。
第11圖係未預先固定試劑類的井，所以未檢測出螢光反應。藉此，確認未產生來自兩側的污染。
又，第12圖為在聚丙烯製管路利用一般手法以最適當分量比混合試劑類及樣本而得到的檢測資料(正控制)。
若比較第10圖及第12圖，則第10圖所表示之根據本實施例的晶片內的反應係與第12圖的反應一致，所以可確認係為本實施例中因最適當分量比所生的反應。藉此，已知可配送期望的量之樣本。
如本實施例1，本發明中，可以符合反應的材質選選定貼合的基材，而可更簡易地且在短時間內高效率地進行反應步驟。
以上，雖然參照圖面並參雜實施例詳述本發明的實施形態，但具體的構造不限於此實施形態，亦包含不脫離本發明要旨之範圍的設計變更等。
例如，井102的配置未必需要所有井102都位在1個圓周上。例如，為了使施加於井102所供給之溶液的離心力大小相異，亦可使從樣本分析晶片1的旋轉中心至井102的距離彼此相異。
又，只要樣本分析晶片1旋轉時取得重量平衡，則亦可為圓盤狀以外的形狀。
又，在主流路103，針對山部103a，以山部103a的頂點為中間隔著的一側及另一側亦可為非對稱形狀。總之，位在山部103a兩側的主流路103亦可形成為非對稱。
本發明的反應晶片亦可用於例如核酸等樣本中生化物質的檢測或分析。特別是因為可檢測SNP的突變，所以可利用為檢測癌症等基因、生殖細胞或體細胞基因的突變之手法。又，亦可作為混合多個溶液的容器及反應容器而利用。
1‧‧‧樣本分析晶片
101‧‧‧基材(第一基材)
102‧‧‧井
103‧‧‧主流路
103a‧‧‧山部
103b‧‧‧谷部
105‧‧‧側路
107a‧‧‧溶液供給路
107b‧‧‧排氣通路
108‧‧‧缺口(位置檢測構造)
109‧‧‧擔持部
110‧‧‧第一緩衝部
111‧‧‧第二緩衝部
112‧‧‧管路部
113‧‧‧儲存槽
115‧‧‧唇部
120‧‧‧第二基材(密封構件)
第1圖為表示本發明之一實施形態的樣本分析晶片之俯視圖。
第2圖為該樣本分析晶片的分解立體圖。
第3圖為第1圖的A-A線的剖面圖。
第4圖為該樣本分析晶片的示意剖面圖。
第5圖為該樣本分析晶片的俯視圖，表示溶液的流通路徑。
第6圖為沿第5圖所示之流通路徑而展開該樣本分析晶片的展開圖。
第7A圖為用於說明該樣本分析晶片的作用之說明圖。
第7B圖為用於說明該樣本分析晶片的作用之說明圖。
第7C圖為用於說明該樣本分析晶片的作用之說明圖。
第7D圖為用於說明該樣本分析晶片的作用之說明圖。
第8A圖為表示在該樣本分析晶片之使用時的溶液之移動的示意俯視圖。
第8B圖為表示在該樣本分析晶片之使用時的溶液之移動的示意俯視圖。
第8C圖為表示在該樣本分析晶片之使用時的溶液之移動的示意俯視圖。
第8D圖為表示在該樣本分析晶片之使用時的溶液之移動的示意俯視圖。
第8E圖為表示在該樣本分析晶片之使用時的溶液之移動的示意俯視圖。
第9A圖為表示在該樣本分析晶片之使用時的溶液之移動的示意俯視圖。
第9B圖為表示在該樣本分析晶片之使用時的溶液之移動的示意俯視圖。
第9C圖為表示在該樣本分析晶片之使用時的溶液之移動的示意俯視圖。
第9D圖為表示在該樣本分析晶片之使用時的溶液之移動的示意俯視圖。
第9E圖為表示在該樣本分析晶片之使用時的溶液之移動的示意俯視圖。
第10圖為表示本發明之實施例的分析結果之圖表。
第11圖為表示本發明之實施例的分析結果之圖表。
第12圖為表示本發明之實施例的分析結果之圖表。
1‧‧‧樣本分析晶片
101‧‧‧基材(第一基材)
102‧‧‧井
103‧‧‧主流路
103a‧‧‧山部
103b‧‧‧谷部
105‧‧‧側路
107a‧‧‧溶液供給路
107b‧‧‧排氣通路
108‧‧‧缺口(位置檢測構造)
109‧‧‧擔持部
110‧‧‧第一緩衝部
111‧‧‧第二緩衝部
112‧‧‧管路部
113‧‧‧儲存槽

Claims (23)

  1. 一種樣本分析晶片，其特徵為具備：基材；多個井，設於前述基材；以及設於前述基材且與前述多個井連接之流路，該流路具有：主流路，於前述基材配置在比前述多個井更靠近旋轉中心的位置且供給被配送至前述多個井之每一者的溶液；第一緩衝部，與前述主流路的一端連通且可容納前述溶液的一部分；第二緩衝部，與前述主流路的另一端連通且可容納前述溶液的一部分；溶液供給路，其一端與前述第一緩衝部連通且另一端向大氣敞開；及排氣通路，其一端與前述第二緩衝部連通且另一端向大氣敞開；與在前述第二緩衝部之前述溶液的流通方向垂直相交之剖面的面積，係大於與在前述主流路之前述溶液的流通方向垂直相交之剖面的面積，前述第二緩衝部具備與前述主流路的前述另一端連通之管路部、以及與前述管路部連通的儲存槽，前述第一緩衝部係以沿著前述第二緩衝部中之前述儲存槽的外側之方式彎曲形成。
  2. 如申請專利範圍第1項之樣本分析晶片，其中前述流路於前述基材形成為溝狀，進一步具備固定於前述基材且密封前述流路的密封構件。
  3. 如申請專利範圍第2項之樣本分析晶片，其中前述溶液 供給路的另一端及前述排氣通路的另一端皆在與形成有前述流路之面相反側的面向大氣敞開。
  4. 如申請專利範圍第1項之樣本分析晶片，其中前述第二緩衝部的容積大於前述主流路的容積。
  5. 如申請專利範圍第1項之樣本分析晶片，其中前述第二緩衝部的容積大於前述第一緩衝部的容積，前述第一緩衝部的容積及前述第二緩衝部的容積之合計大於前述主流路的容積。
  6. 如申請專利範圍第1項之樣本分析晶片，其中具有唇部，其形成為包圍前述溶液供給路之另一端及前述排氣通路之另一端的壁狀，且當前述溶液注入至前述流路後，可藉由以閉塞前述溶液供給路之另一端及前述排氣通路之另一端為目的之裝置或治具而變形，以使前述流路保持密閉狀態。
  7. 如申請專利範圍第1項之樣本分析晶片，其中前述主流路具有：山部，位於前述基材之旋轉中心附近；及谷部，相對於前述山部位於前述井的附近，並蛇行而形成；前述井與前述谷部連通。
  8. 如申請專利範圍第7項之樣本分析晶片，其中前述主流路之路徑寬度於前述山部相對較小，於前述谷部相對較大。
  9. 如申請專利範圍第1項之樣本分析晶片，其中前述基材係圓盤狀，且前述多個井係配置成與前述基材呈同心圓狀。
  10. 如申請專利範圍第1項之樣本分析晶片，其中具有連結前述主流路及前述多個井之多個側路。
  11. 如申請專利範圍第1項之樣本分析晶片，其中於前述基材設有擔持部，其用於使前述基材旋轉並進行藉由離心力所致之溶液的送液。
  12. 如申請專利範圍第11項之樣本分析晶片，其中在前述基材的外周圍部具有前述擔持部。
  13. 如申請專利範圍第1項之樣本分析晶片，其中具備位置檢測構造，其設於前述基材，且在以前述旋轉中心為中心之離心處理的前後用於檢測各井之位置、角度，前述位置檢測構造具有由缺口、孔洞或突起所構成之機械被檢測部。
  14. 如申請專利範圍第1項之樣本分析晶片，其中具備位置檢測構造，其設於前述基材，且在以前述旋轉中心為中心之離心處理的前後用於檢測各井之位置及角度，前述位置檢測構造具備光學被檢測部，前述光學被檢測部的表面粗糙度或光學特性係與在前述基材未設有前述光學被檢測部的部位之表面粗糙度或光學特性相異。
  15. 如申請專利範圍第10項之樣本分析晶片，其中前述多個側路的每一者形成為與連結前述多個井之中連接有前述側路之井及前述基材之旋轉中心的直線呈傾斜。
  16. 如申請專利範圍第7或8項之樣本分析晶片，其中位於前述山部之兩側的前述主流路形成為非對稱。
  17. 如申請專利範圍第1項之樣本分析晶片，其中具有第一 基材，其形成有前述多個井及前述流路；及第二基材，其與前述第一基材貼合。
  18. 如申請專利範圍第17項之樣本分析晶片，其中前述第一基材及前述第二基材的至少任一者是以光穿透性材料形成。
  19. 如申請專利範圍第17項之樣本分析晶片，其中前述第一基材係光穿透性的樹脂材料，前述第二基材係金屬材料。
  20. 如申請專利範圍第1項之樣本分析晶片，其中藉由前述基材以前述旋轉中心為中心旋轉，而使前述主流路內的前述溶液朝前述井內移動。
  21. 一種樣本分析方法，其特徵為具有：使用如申請專利範圍第1項之樣本分析晶片，將前述溶液注入前述主流路之步驟；及使前述基材旋轉並將前述溶液配送至前述多個井的每一者之步驟。
  22. 如申請專利範圍第21項之樣本分析方法，其中具有：將前述溶液配送至前述井的步驟之後，將礦物油配送至前述各井之步驟。
  23. 一種基因解析方法，其特徵為，使用如申請專利範圍第21或22項之樣本分析方法。
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