CN113583832B - 核酸检测设备 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种锁相检测装置，其包括激励源模块和探测模块，激励源模块包括用于生成设定波形的周期性信号的信号发生器和激光器；探测模块包括依次级联的光电探头、放大电路、滤波电路和测频锁相放大器；光电探头用于探测扩增反应室的光信号；所述测频锁相放大器用于在其内部生成分别具有不同预定相位的多个参比信号，基于被测信号与这些参比信号的相关性对被测信号进行高精度快速频谱分析，进而在估测频率范围内搜索到被测信号的准确频点，再根据所得到的频点计算出被测信号的相位和幅值；并且所述激励源模块与所述测频锁相放大器电学上分离。本发明还提供了相应的核酸检测设备。本发明可以帮助对样本的检测结果进行早期预判，从而缩短检测时间。

Description

核酸检测设备

技术领域

本发明涉及微弱信号探测、荧光探测、核酸检测、气溶胶检测等技术领域，具体地说，本发明涉及一种微弱信号锁相检测装置及相应的核酸检测设备。

背景技术

核酸检测是目前用于检测新冠病毒和确诊新冠肺炎(COVID-19)的主要方法。用于识别新冠病毒的核酸检测方法主要包括两类，一类是测序法，另一类是RT-PCR法。测序法通常耗时1-2天，而RT-PCR法一般不少于3-6小时。可以看出，目前的核酸检测方案耗时过长，尚难以满足疫情精准防控的需要。并且，这两种目前在用方法必需由医护人员对患者或疑似患者进行取样，取样过程中医护人员面临巨大的感染风险。下文中将对这些现存问题做更具体地阐述。

测序法是指对样本中所提取的核酸进行基因组测序，通过测序结果来识别样本中是否含有病毒颗粒。相比RT-PCR法，测序法通常需要较长的时间，难以实现新冠病毒的快速检测。RT-PCR的全称为Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction。RT指反转录，又称为逆转录。PCR指聚合酶链式扩增。RT-PCR法是将RNA的反转录和cDNA的聚合酶链式扩增（即PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用，从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，在DNA聚合酶作用下扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，目前已用于检测细胞中基因表达水平、细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。新冠病毒属于RNA病毒，因此可将RT-PCR法用于新冠病毒的检测。

进一步地，荧光定量PCR是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测定聚合酶链式反应（即PCR）循环后产物总量的方法。传统定量PCR方法包括内参照法和竞争法。内参照法的原理如下：在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成，而上游引物用荧光标记，下游引物不标记。在模板扩增的同时，内标也被扩增。在PCR产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。竞争法的原理如下：选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。上述两种传统定量PCR方法中， DNA（或逆转录得到的cDNA）扩增反应耗时较长，均难以实现对病毒的快速识别，难以满足疫情精准防控的需要。

进一步地，在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测，可以实时荧光定量PCR。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值（Ct全称为Cycle threshold，Ct值可译为循环阈值）和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以可以成为对病毒进行定量检测的依据。其原理是，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过所检测到的实时扩增曲线来对未知模板（例如病毒核酸）进行定量分析。然而，PCR扩增反应的初期，荧光信号十分微弱信号，难以进行准确地探测。尤其是，当样本的病毒浓度较低时，荧光信号更加微弱，在环境和仪器所带来的各种干扰因素的作用下，荧光探测装置有可能无法将低浓度病毒样本与阴性对照样本的荧光信号区分开，从而造成假阴性问题。因此，低浓度病毒样本往往需要经过较长时间的循环扩增反应，将拷贝数积累到一定量后，才能较为准确地识别出来。也就是说，即便采用实时荧光定量PCR技术，病毒识别仍然需要相当长的时间。或者说，现有的实时荧光定量PCR技术难以在保证高灵敏度（这里灵敏度可以理解为针对病毒浓度的灵敏度，可探测到的病毒浓度越低，则灵敏度越高）的前提下缩短病毒检测时间。而新冠肺炎具有较长的潜伏期，并且新冠肺炎的轻症甚至无症状感染者均可能成为病毒的传播者，快速准确地识别处于潜伏期的、轻症甚至无症状的感染者，恰恰是精准防控疫情的最为迫切的需求。据推测，处于潜伏期的、轻症甚至无症状的感染者的样本中，病毒浓度可能不会很高，所以现有的实时荧光定量PCR技术仍然难以缩短病毒检测时间，难以满足当前疫情精准防控的需要。

除前文所述的核酸检测法外，胶体金法也被用于病毒检测。胶体金是一种常用的标记技术，是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种免疫标记技术。胶体金法在医学检验中的应用主要是免疫层析法和快速免疫金渗滤法，它们被用于检测 HBsAg、HCG和抗双链DNA抗体等。虽然胶体金法可以被用于病毒检测，然而该方法的灵敏度与RT-PCR法等核酸检测方法相比，还存在一定的差距。对于新冠肺炎来说，现有的胶体金法主要适于对发病3-7天的患者的病毒检测，当样本病毒含量较低时（例如处于潜伏期的、轻症甚至无症状的感染者的样本），可能存在假阴性的问题。因此，胶体金法难以用于高灵敏度的快速病毒检测。另外，胶体金法往往需基于凝胶电泳技术来实现分析鉴定DNA分子。DNA分子的相对质量（分子量）、凝胶（例如琼脂糖）的浓度、DNA分子的构象（例如线状、开环和超螺旋等不同构象）等多方面因素都可能会影响到鉴定结果。例如相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的，这导致不同分子量不同构象的DNA分子有一定几率恰好移动速度一致，使得不同分子量不同构象的DNA分子恰好处于试纸的同一谱线上。也就是说，如果样本中存在某种分子，该分子的分子量和构象使得它的电泳移动速度恰好与目标DNA分子一致，则试纸上的对应谱线可能显示阳性，从而造成假阳性的问题。所以相对于RT-PCR法，胶体金法的可靠性仍有不足。

另一方面，在当前的疫情防控中，降低医护人员的感染风险也是亟待解决的重要问题之一。现有的PCR检测设备往往需要由医护人员对患者或疑似患者进行取样，例如通过鼻拭子（鼻咽拭子）、咽拭子（口咽拭子）、抽吸物等方式取样。这些取样过程容易造成患者不适，导致取样困难。如果取样时间过长，医护人员将面临巨大的感染风险。因此人们迫切期待一种能够由患者自助地进行检测的PCR检测设备，从而降低医护人员的暴露风险。

再者，已有证据表明，新冠病毒可存在于气溶胶中，并且可借助气溶胶进行传播。人们还迫切期待一种可对空气中的气溶胶是否存在病毒以及可检测空气中的病毒含量的检测设备，以便用于环境空气监测和报警。

发明内容

本发明的目的在于，克服现有技术的不足，提供可实现微弱信号探测以及高灵敏度的快速核酸检测的解决方案。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种锁相检测装置，其包括：激励源模块，其包括用于生成设定波形的周期性信号的信号发生器和用于基于所述周期性信号输出激光的激光器；以及 探测模块，其包括依次级联的光电探头、放大电路、滤波电路和测频锁相放大器；其中，所述光电探头用于探测核酸扩增反应装置的扩增反应室的光信号；所述测频锁相放大器用于在其内部生成分别具有不同预定相位的多个参比信号，基于被测信号与这些参比信号的相关性对被测信号进行高精度快速频谱分析，进而在估测频率范围内搜索到被测信号的频点，再根据所得到的频点计算出被测信号的相位和幅值；并且所述激励源模块与所述测频锁相放大器电学上分离。

其中，所述信号发生器的频率可调。

根据本发明的另一方面，还提供了一种核酸检测设备，其包括：前文所述的任一锁相检测装置；以及核酸扩增反应装置，其包括至少一个扩增反应室和连接该扩增反应室的输入输出流道。

其中，所述激励源模块中，所述信号发生器设置成输出单一频率的方波；所述探测模块中，所述测频锁相放大器在所设置的频率的邻近区域内进行扫描，进而得出荧光信号的频点、相位和幅值。

其中，所述核酸扩增反应装置设置多个所述扩增反应室，每个所述扩增反应室对应于一个特定频率的激光；所述激励源模块中，所述信号发生器输出多个频率的方波，并使每个频率的激光照射一个对应于该频率的所述扩增反应室；所述测频锁相放大器在所述信号发生器所设置的每个频率的邻近区域内分别进行扫描，进而获得不同扩增反应室的荧光信号的频点、相位和幅值。

其中，所述锁相检测装置用于根据所探测到的所述扩增反应室的荧光信号生成实时扩增曲线，并在实时扩增曲线进入指数扩增段的早期对所测样本的Ct值进行预判；其中，对所测样本的Ct值进行预判包括：在扩增产物的量尚未到达荧光阈值所对应的量时，将扩增反应的前N个循环探测出来，并基于所述的前N个循环来拟合扩增曲线，再根据所述拟合扩增曲线预先计算出达到所述荧光阈值所需的循环数是多少；其中N为不小于3的自然数。

其中，所述锁相检测装置还用于：在预判Ct值的基础上，继续测量实时扩增曲线，录得实际测量的Ct值，以评估预判Ct值与实测Ct值的匹配程度，当该匹配程度达到或高于预设标准时，直接根据预判Ct值输出核酸检测结果。

其中，所述锁相检测装置还用于：根据预判Ct值来得出阴性或阳性的检测结果；或者根据预判Ct值给出定量检测结果，所述定量检测结果为待测样本的病毒核酸浓度。

其中，所述核酸扩增反应装置还包括阴性对照反应室；所述锁相检测装置还用于：根据所探测到的所述扩增反应室的荧光信号生成实时扩增曲线，根据所探测到的阴性对照反应室的荧光信号生成阴性对照扩增曲线；基于所述阴性对照扩增曲线来判断当前待测样本的实时扩增曲线是否进入指数扩增段，基于所述指数扩增段进行数学拟合得到对应的指数扩增函数，根据拟合的所述指数扩增函数来判断当前待测样本是否为阳性，或者根据拟合的所述指数扩增函数给出样本的病毒核酸浓度。

其中，所述扩增反应室与所述光电探头之间设置滤光片。

与现有技术相比，本申请具有下列至少一个技术效果：

1.本发明可以通过源探分离的锁相检测装置获得高灵敏度的实时扩增曲线，进而帮助对样本的检测结果进行早期预判，从而缩短检测时间。

2.相对于目前常见的荧光检测装置，本发明所采用的荧光信号锁相检测装置可以将测量精度提高，并基于高精度的数据对检测结果进行预判，从而将检测响应时间缩短。对于现有PCR荧光检测装置，通常难以在30分钟内观测到明显的指数扩增曲线，因此检测响应时间通常超过30分钟，而本发明的锁相检测装置有能力将检测响应时间缩短到30分钟以下。

3.相对于现有技术，本发明的核酸检测设备可以具有更短的检测时间和更高的灵敏度。

4.本发明的核酸检测设备可以帮助快速准确地识别处于潜伏期的、轻症甚至无症状的感染者，以满足疫情精准防控的需要。

5.本发明的核酸检测设备可适用于新冠病毒的核酸检测，也可以适用于流感病毒或其它病原体的核酸检测。

附图说明

图1示出了本发明一个实施例所提供的基于锁相检测装置的核酸检测设备的方框示意图；

图2示出了在图1基础上标记了激励源模块和荧光探测模块的核酸检测设备的方框示意图；

图3示出了本发明一个实施例的送样模块的原理示意图；

图4示出了RT-PCR反应体系的一个实时扩增曲线的示例；

图5示出了在模拟测量实验中利用本发明的源探分离的锁相检测装置在多个时间点测出的数据与利用传统的荧光检测装置所测得的实时扩增曲线的对比；

图6示出了在模拟测量实验中利用本发明的源探分离的锁相检测装置在多个时间点测出的数据以及所拟合的指数扩增曲线。

具体实施方式

为了更好地理解本申请，将参考附图对本申请的各个方面做出更详细的说明。应理解，这些详细说明只是对本申请的示例性实施方式的描述，而非以任何方式限制本申请的范围。在说明书全文中，相同的附图标号指代相同的元件。表述“和/或”包括相关联的所列项目中的一个或多个的任何和全部组合。

应注意，在本说明书中，第一、第二等的表述仅用于将一个特征与另一个特征区分开来，而不表示对特征的任何限制。因此，在不背离本申请的教导的情况下，下文中讨论的第一主体也可被称作第二主体。

在附图中，为了便于说明，已稍微夸大了物体的厚度、尺寸和形状。附图仅为示例而并非严格按比例绘制。

还应理解的是，用语“包括”、“包括有”、“具有”、“包含”和/或“包含有”，当在本说明书中使用时表示存在所陈述的特征、整体、步骤、操作、元件和/或部件，但不排除存在或附加有一个或多个其它特征、整体、步骤、操作、元件、部件和/或它们的组合。此外，当诸如“...中的至少一个”的表述出现在所列特征的列表之后时，修饰整个所列特征，而不是修饰列表中的单独元件。此外，当描述本申请的实施方式时，使用“可以”表示“本申请的一个或多个实施方式”。并且，用语“示例性的”旨在指代示例或举例说明。

如在本文中使用的，用语“基本上”、“大约”以及类似的用语用作表近似的用语，而不用作表程度的用语，并且旨在说明将由本领域普通技术人员认识到的、测量值或计算值中的固有偏差。

除非另外限定，否则本文中使用的所有用语（包括技术用语和科学用语）均具有与本申请所属领域普通技术人员的通常理解相同的含义。还应理解的是，用语（例如在常用词典中定义的用语）应被解释为具有与它们在相关技术的上下文中的含义一致的含义，并且将不被以理想化或过度正式意义解释，除非本文中明确如此限定。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步地描述。

图1示出了本发明一个实施例所提供的基于锁相检测装置的核酸检测设备的方框示意图。图2示出了在图1基础上标记了激励源模块和荧光探测模块的核酸检测设备的方框示意图。根据本发明的一个实施例，提供了一种基于锁相检测装置的核酸检测设备，该核酸检测设备包括核酸扩增反应装置和用于通过荧光信号来检测扩增产物的荧光信号锁相检测装置（为便于描述，下文中有时将其简称为锁相检测装置）。具体来说，核酸扩增反应装置包括微流控芯片5，该微流控芯片5至少一个扩增反应室3和连接该扩增反应室3的输入输出流道4。扩增反应室3可以是一个，也可以是多个。当具有多个扩增反应室时，可以对多个样本进行多通道检测以提高检测通量，或者对单个样本进行多通道检测以提高检测的准确度。参考图1和图2，本实施例中，锁相检测装置包括激励源模块1和荧光探测模块2。其中激励源模块1包括电源、方波发生器、快速开关电路和激光器6。电源为快速开关电路和激光器6提供能源，方波发生器用于输出方波作为快速开关电路的控制信号，使得激光器可以快速启动、关闭，从而以设定的频率输出激光。激光器6的输出端对应于所述的核酸扩增反应装置的扩增反应室3，以便照射扩增产物。当扩增产物中含有目标核酸（或称为目标核酸片段）时，目标核酸的荧光标记物会在激光照射的激励下发出闪烁的荧光。所述荧光探测模块2用于探测扩增产物所发出的荧光。具体来说，荧光探测模块2可以包括光电探头7（即光电传感器）、放大电路（也可以称为放大器或前置放大器）、滤波电路和锁相放大器。本实施例中，所述锁相放大器是测频锁相放大器（也可以称为测频锁相电路）。其中光电探头7设置在靠近所述扩增反应室3的位置，用于探测荧光信号并将其转换成电信号。光电探头7的输出端连接放大器的输入端，放大器的输出端连接滤波电路的输入端，滤波电路的输出端连接测频锁相放大器的被测信号输入端。由于光电探头所探测的信号通常十分微弱，难以直接作为测频锁相放大器的输入信号，所以本实施例中先对光电探头所探测的信号进行前置放大，然后对其滤波以滤除杂波（例如高频杂波）的影响，再将放大和滤波后的信号提供给测频锁相放大器。需注意，现有技术中，锁相放大器通常具有一个参比信号连接端和一个被测信号输入端，而本实施例中，激励源模块的信号不会作为参比信号提供给锁相放大器，而是由锁相放大器内部生成多个参比信号，再基于高精度快速频谱分析来准确测定被测信号的频率，并同时得出被测信号的幅值和相位。具体地，本实施例中，锁相放大器可以内部生成多个参比信号，所述多个参比信号分别具有不同的预定相位；然后在估测频率范围内的每个频点处，计算被测信号与所述多个参比信号的相关性，以确定所述被测信号的幅度值；接着基于所述多个频点的值以及与其对应的所述被测信号的幅度值，拟合所述被测信号的幅度频谱的函数形式；再确定与所述估测频率范围最接近的、所述函数形式的与极大值点对应的频率值，作为所述被测信号的测量频率；最后在所述被测信号的测量频率处，计算所述被测信号与所述参比信号之间的相关性，以确定所述被测信号的相位和幅度。概括地说，本实施例的锁相放大器可以内部生成分别具有不同预定相位的多个参比信号，基于被测信号与这些参比信号的相关性对被测信号进行高精度快速频谱分析，进而在估测频率范围内搜索到被测信号的准确频点（即频率值），再根据所得到的频点计算出被测信号的相位和幅值。需注意，本实施例中，获得被测信号的幅值即可得到荧光信号的强度，进而根据荧光信号的强度得出核酸检测结果。所述锁相放大器更具体的实现方案，可以参考中国专利CN201710707180.0记载的方案，本文中不再赘述。

在本发明的另一个实施例中，所述锁相放大器可以基于中国专利CN201110380805.X记载的方案实现，以便获得被测信号的频率（指频率点，可简称为频点）、相位和幅值，该方案也利用了锁相放大器内部生成的具有不同预定相位的多个参比信号，基于高精度快速频谱分析来得出被测信号的准确频点（即频率值），再根据所得到的频点计算出被测信号的相位和幅值。本实施例中，激励源模块与测频锁相放大器在电学上是分离的。

本发明与现有技术的一个区别就在于锁相检测装置是源探分离的，即激励源模块与测频锁相电路在电学上是分离的。在传统的锁相放大技术中，锁相放大器或锁相电路通常具有一个参比信号连接端，该参比信号连接端连接激励源模块的高频驱动信号，以便将高频驱动信号与所探测到的待测输入信号进行混叠，实现相位锁定，进而精确测量被测输入信号的频率、幅值和相位。然而，发明人深入研究发现：在核酸检测领域中，有时（例如当样本的病毒浓度较低时）扩增反应室中可探测到的荧光信号十分微弱，在环境和仪器所带来的各种干扰因素的作用下，荧光探测装置有可能无法将低浓度病毒样本与阴性对照样本的荧光信号区分开，从而造成假阴性问题。而这些干扰因素包括激励源接入参比信号输入端而带来的同频干扰。具体来说，由于来自于激励源的驱动信号并不总是处于理想状态，其本身会带来一定噪声干扰，而该驱动信号与所探测的荧光信号的频率是相同的，当荧光信号本身十分微弱时，这种同频干扰与荧光信号混叠后可能导致荧光信号被遮盖而无法检出。换句话说，当来自参考输入端的同频干扰与荧光信号混叠在一起时，在锁相装置的输出端，可能难以将来自于光电探头的光信号和来自于激励源的同频干扰区分开，从而造成微弱的荧光信号无法检出，不利于缩短核酸检测设备的检测时间。这里，检测时间也可以称为检测响应时间。示例性地，在一些例子中，检测响应时间可以被定义为从扩增反应开始到获得检测结果的响应时间，或者可以被定义为从核酸提取到获得检测结果的响应时间。下文中还会结合多个实施例对核酸扩增反应装置做更加详细的描述，在这些描述中，可以对上述响应时间有更为清楚的理解。本实施例中，由于采用了源探分离的锁相检测装置，其激励源模块与测频锁相电路在电学上是分离的，因此可以避免激励源模块对来自于光电探头的光信号造成同频干扰，从而提高锁相检测装置的灵敏度，使其能够探测到更加微弱的荧光信号。这样，病毒浓度较低的扩增反应室的实时扩增曲线可以更快地与阴性对照通道的实时扩增曲线区分开，从而帮助缩短检测响应时间。另外，由于源探分离可以使锁相检测装置的灵敏度增加，因此也有助于准确地检测病毒浓度更低的样本，从而帮助发现处于潜伏期的、轻症甚至是无症状的感染者。

进一步地，仍然参考图1和图2，在本发明的一个实施例中，基于锁相检测装置来检测扩增反应室的荧光信号，进而检测扩增反应室的扩增产物的量。锁相检测装置的光电探头7可以设置在靠近扩增反应室3的位置，并且扩增反应室3与光电探头7之间还可以设置滤光片8，以滤除用于激发荧光的激励激光的干扰。

进一步地，在本发明的一个实施例中，所述激励源模块的方波发生器可以设置成输出单一频率的方波，相应地，所述荧光探测模块的测频锁相电路可以在所设置的频率的邻近区域内进行扫描，进而准确探测荧光信号的频率（指探测出频率点）、相位和幅值。

在本发明的另一个实施例中，所述激励源模块的方波发生器还可以输出多个频率的方波（即方波发生器的频率可调），每个频率可以对应于一个扩增反应室。例如核酸扩增反应装置可以设置多个扩增反应室，每个扩增反应室对应于一个特定频率的激光。另一方面，测频锁相电路可以在方波发生器所设置的每个频率的邻近区域内分别进行扫描，进而获得不同扩增反应室的荧光信号的频率（指探测出频率点）、相位和幅值。利用本实施例的方案，可以使用单个荧光探测模块（例如可以仅使用一个光电探头）来探测多个检测通道的扩增反应室的荧光闪烁，可以提高检测通量，同时有助于压缩设备体积，降低成本。

需注意，本发明并不限于使用方波发生器。上述实施例中的方波发生器可以被替换为其它波形的能够提供具有固定波形的周期信号的信号发生器。上述实施例中，激励源模块也可以具有其他变形的实现方式，一般来说，激励源模块包括用于生成设定波形的周期性信号的信号发生器和用于基于所述周期性信号输出激光的激光器。

进一步地，在本申请的一个实施例中，所述核酸检测设备还可以包括采样模块、和送样模块。其中采样模块可以是呼出气采集装置，例如呼出气冷凝液收集器。呼出气冷凝液收集器可以包括波纹管（或者其它气体管道）以及呼气面罩，该波纹管可以具有呼气嘴以便于患者（或受试者）进行呼气。在气泵的帮助下，呼出气通过波纹管进入采集管。采集管中可以具有病毒保存缓冲液（Virus storage buffer）。病毒保存缓冲液可以将气溶胶中的病毒颗粒采集到液体中，从而形成液相的含病毒样品（下文中有时将其称为样本液）。并且这种采集过程可以避免病毒颗粒的核酸被破坏或污染，从而保证检测结果的准确性。需注意，本发明的采样模块并不限于呼出气冷凝液收集器，采样模块只要可以接收呼出气并通过采集液（例如病毒保存缓冲液）将呼出气所携带的生物气溶胶收集，形成液相的含病毒样品即可。进一步地，本实施例中，送样模块用于对采样模块所采集的样品液进行预处理和预混合，然后将混合液输送至核酸扩增反应模块。其中，对样品液进行预处理可以包括：灭活处理、核酸提取处理，预混合包括将完成核酸提取的样品液与反应液进行混合。进一步地，所述送样模块还可以用于为核酸扩增反应模块提供和输送阳性对照混合液与阴性对照混合液。在具体实施中，送样模块可以包括用于容纳各类液体的多个容器、多个混合池，连接所述的多个容器和多个混合池的软管，以及驱动所述软管内液体流动的多个蠕动泵。

进一步地，本实施例中，核酸扩增反应装置可以基于微流控生物芯片（下文中有时称为微流控芯片）实现。送样模块所提供的待测样品混合液（即样品液进行预处理和预混合后得到的混合液）通过软管注入所述微流道生物芯片中，并在该生物芯片的反应室（可将其称为扩增反应室）内进行核酸扩增反应。锁相检测装置用于检测扩增反应室的荧光信号，进而根据所述荧光信号实时获得所述扩增反应室中扩增产物的量。

进一步地，图3示出了本发明一个实施例的送样模块的原理示意图。参考图3，本实施例中，送样模块包括核酸提取池、反应液池、阳性液池、阴性液池、阳性对照池、阴性对照池、待测样品池、用于在不同容器（池）之间输送液体的多个软管，以及驱动所述软管内液体流动的多个蠕动泵。其中，采样模块可以具有一个样品液池（或其他种类的样品液容器），该样品液池通过软管与核酸提取池连通，核酸提取池可以具有或注入核酸提取液，该核酸提取液与样品液在核酸提取池中充分混合。本实施例中，核酸提取液可以是去离子水或其它专门的对应于目标病毒的提取液。样本液与核酸提取液混合，经过一定时间的高温处理（例如，对于新冠病毒可以是约95℃、10分钟的高温处理），可以从病毒颗粒中提取出核酸，进而得到适于进行扩增反应的核酸释放的样本液。扩增反应池可以分别与核酸提取池和反应液池连通，使得核酸释放的样本液与反应液在扩增反应池中混合，得到用于进行扩增反应的待测样本。阳性对照池可以分别与反应液池和阳性液池连通，从而在阳性对照池中得到阳性对照液。阴性对照池可以分别与阴性液池和反应液池连通，从而在在阴性对照池中得到阴性对照液。需注意，阳性对照液、阴性对照液的选择方式并不是唯一的。上述不同容器之间的连通可以均由软管实现，并由蠕动泵控制各个软管中液体的流动方向和流量。

需注意，上述实施例中，虽然采用了去离子水作为核酸提取液，但本发明并不限于此。例如，在本发明的另一个实施例中，所述核酸提取液可以包括裂解液，该裂解液与样本液混合后，可以将病毒颗粒的包膜和/或衣壳等结构裂解，从而释放出核酸，同时起到病毒灭活的作用。样本液与裂解液混合后，可以再经过萃取、洗脱（例如将裂解液洗脱）等步骤，得到适于进行扩增反应的核酸释放的样本液。

进一步地，在一个实施例中，所述送样模块还可以进一步包括一提取液池，该提取液池可以用于容纳核酸提取液。该提取液池可以与所述核酸提取池连通，以便向所述核酸提取池输送核酸提取液。在另一个实施例中，当核酸提取包括裂解、萃取、洗脱等多个步骤时，所述送样模块还可以进一步包括裂解液池、萃取液池、洗脱液池等，并且裂解液池、萃取液池、洗脱液池可以分别与所述核酸提取池连通。

上述实施例中，反应液可以包括对应于目标核酸的引物和酶（例如可以包括逆转录酶和聚合酶等）。阳性液可以含有目标核酸且浓度已知，阳性对照液在核酸检测设备中可以提供阳性对照通道的实时扩增曲线。阳性对照通道可以设置在微流控芯片中。阴性对照混合液可以注入微流控芯片中的阴性反应室，以提供阴性对照通道的实时扩增曲线。测得阳性对照通道和阴性对照通道的实时扩增曲线，可以对样品的病毒浓度进行更加准确的定量测量或者对核酸检测设备进行校正。在另一个实施例中，也可以直接将阴性液（即不与反应液混合）注入微流控芯片中的阴性反应室，以提供阴性对照通道的实时扩增曲线。

进一步地，在本发明的一个实施例中，所述核酸检测设备还可以包括加热模块，该加热模块用于提供核酸提取以及恒温扩增反应所需的温度。其中，核酸提取所需的温度可以是95℃。恒温扩增反应所需的温度可以是60℃。更进一步地，所述核酸检测设备还可以包括制冷模块，该制冷模块用于提供适于保存提取液、反应液和阳性液的温度。在一个实施例中，适于保存提取液、反应液和阳性液的温度可以是0-4℃。

上述实施例中，所述核酸检测设备可以自动完成样本采集、核酸提取以及恒温扩增等步骤，进而实现扩增曲线的实时荧光探测，然而这并非本发明所必须的，例如在本发明的其他一些实施例中，可以由人工操作来实现样本采集等操作。样本采集的人工操作可以是鼻式子采样、咽拭子采样或痰液采样等等。采集的样本可以注入试管中待用。在这些实施例中，采集管可以被省略。在另一些实施例中，核酸提取也可以由人工操作来完成，例如在装有样本的试管中人工注入核酸提取液，混匀并将混合液置于预设的温度。完成核酸提取的样本液可以输入核酸扩增反应装置，与反应液混合，进而获得基于荧光探测的实时扩增曲线。类似地，本发明还可以具有基于不同自动化程度的多个变形的实施例，这些变形的实施例中，核酸检测设备（或核酸扩增反应装置）可以省略部分部件，只要核酸扩增反应装置包括至少一个扩增反应室，并且具有连通该扩增反应室的输入输出流道，即可利用本发明的锁相检测装置对注入扩增反应室中的混合液进行实时荧光探测，并得到高精度的实时扩增曲线。这些变形的实施例中，虽然对核酸扩增反应装置做了一些精减，但这些变形的实施例均采用源探分离的锁相检测装置，可以避免激励源模块对来自于光电探头的光信号造成同频干扰，从而提高锁相检测装置的灵敏度，使其能够探测到更加微弱的荧光信号。这样，病毒浓度较低的扩增反应室的实时扩增曲线可以更快地与阴性对照通道的实时扩增曲线区分开，从而帮助缩短检测响应时间。另外，由于源探分离可以使锁相检测装置的灵敏度增加，因此也有助于准确地检测病毒浓度更低的样本，从而帮助发现处于潜伏期的、轻症甚至是无症状的感染者。

上述实施例的核酸扩增反应装置中，所述微流道芯片均具有检测通道（检测通道包括扩增反应室和连接扩增反应室的输入输出流道）、阴性对照通道和阳性对照通道。需注意，本发明的微流道芯片并不限于此。例如在本发明的一些实施例中，微流道芯片可以仅具有检测通道，或者仅具有检测通道和阴性（或阳性）对照通道。在这些实施例中，阴性对照实时扩增曲线和/或阳性对照实时扩增曲线可以预先测量和标定，然后存储在核酸检测设备中。而在待测样本进行扩增反应的过程中，从检测通道所测出的荧光信号可以得出待测样本的实时扩增曲线，将其与已存储的预先标定的阴性对照实时扩增曲线和/或阳性对照实时扩增曲线进行比对，可以得出阳性或阴性的检测结果，或者得出病毒浓度的定量检测结果。

进一步地，本发明的一个实施例中，所述扩增反应为RT-PRC扩增反应，即反转录-聚合酶链式扩增反应。本实施例中，在从样本中提取核酸片段后，首先经反转录酶的作用，基于所提取的核酸片段的RNA合成cDNA（即进行反转录），再以cDNA为模板（可将其称为cDNA模板或模板cDNA），在PCR反应体系中加入荧光基团，在引物和DNA聚合酶作用下扩增合成cDNA长链（可将其称为扩增产物）。该扩增产物中含有大量循环排列的cDNA模板（即由原核酸片段反转录得到的cDNA模板）。在扩增反应过程中，用激光照射扩增反应室中的扩增产物，可以使得大量cDNA模板所携带的荧光探针（或其它类型的荧光标记）发出闪烁的荧光，利用本实施例的源探分离的锁相检测装置，可以在扩增反应的早期准确地探测这种荧光信号，从而快速获得核酸检测结果。在本实施例中，可以先设定一个荧光阈值。例如，可以将扩增反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省（或默认）设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。当扩增产物的荧光信号达到所述荧光阈值时，可以通过所检测到的实时扩增曲线来得到Ct值，进而通过Ct值得到原核酸片段的浓度信息。Ct值可译为循环阈值，其定义是：达到预设荧光阈值时的扩增反应轮次数（轮次数即循环次数）。对于每个样本来说，该样本对应的Ct值与其含有的初始核酸片段的数目（或者称为起始拷贝数）的对数存在线性关系。起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可得到标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样本的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样本的起始拷贝数。本实施例中，目标核酸片段为新冠病毒的具有特异性的核酸片段，因此该核酸片段的浓度信息可以反映样本中新冠病毒的载量。

进一步地，本发明的一个实施例中，可以基于源探分离的锁相检测装置来提升荧光探测的灵敏度，从而根据实时扩增曲线来预判所检测样本的Ct值。具体来说，实时扩增曲线的横坐标为时间，纵坐标为荧光强度（这里荧光强度可以是以a.u.为单位的相对强度，其代表横坐标对应时刻下的实时扩增产物的量）。图4示出了RT-PCR反应体系的一个实时扩增曲线的示例。参考图4，在RT-PCR反应体系中，实时扩增曲线通常呈“S”形，所以可以将其分为起始段10、指数扩增段20和平台段30。起始段10对应于RT-PCR反应体系的起始阶段，此时待测通道的扩增产物较少，可能难以与阴性对照扩增曲线区分开，而指数扩增段20对应于RT-PCR反应体系的指数扩增阶段，此阶段样本的cDNA模板循环复制，呈指数扩增状态。平台段30对应于RT-PCR反应体系的终止阶段，由于反应物耗尽或各种实验环境条件的限制，扩增反应将快速减缓并基本停止，扩增产物的量趋于稳定。本实施例中，可以在实时扩增曲线进入指数扩增段的早期对所测样本的Ct值进行预判。此时，扩增产物的量可能尚未到达荧光阈值所对应的量，但由于源探分离的锁相检测装置具有极高的灵敏度，可以将扩增反应的前三个（也可以是前N个循环，N为不小于3的自然数）循环探测出来，并基于这三个（或N个）循环来拟合扩增曲线，从而对Ct值进行预判，即可以预先计算出达到荧光阈值所需的循环数是多少。这样便能显著缩短检测时间。进一步地，在预判Ct值的基础上，还可以继续测量实时扩增曲线，录得实际测量的Ct值，以评估预判Ct值与实测Ct值的匹配程度。当该匹配程度达到或高于预设标准时，可以直接根据预判Ct值输出核酸检测结果，从而加快核酸检测的速度。本实施例中，可以根据预判Ct值来得出阴性或阳性的检测结果。例如可以设置一个阳性阈值（例如30），当预判Ct值大于阳性阈值时，判断当前样本核酸检测结果为阴性，当预判Ct值小于等于阳性阈值时，判断当前样本核酸检测结果为阳性。进一步地，还可以根据预判Ct值给出定量检测结果，即得出样本的病毒核酸浓度（例如得出样本的每毫升病毒核酸个数或者拷贝数）。进一步地，图5示出了在模拟测量实验中利用本发明的源探分离的锁相检测装置在多个时间点测出的数据与利用传统的荧光检测装置所测得的实时扩增曲线的对比。其中锁相检测装置的每个数据的测量窗口可以设置为约1秒，即图5中每个圆点是锁相检测装置在对应的测量时间点1秒范围内（例如测量时间点±0.5秒的范围内）。为清楚显示，图5进一步给出了起始段的放大对比图，可以看出，相对于传统的荧光检测装置，本发明的源探分离的锁相检测装置的灵敏度可以提高约三个数量级（图5中显示，源探分离的锁相检测装置的探测灵敏度可以达到10^-5，而传统的实时扩增曲线带有背底信号，其探测灵敏度约为10^-2。由于源探分离的锁相检测装置的探测灵敏度显著提高，因此可以更准确地探测低浓度样本的早期荧光强度，进而对Ct值进行准确预判，从而缩短核酸检测的检测时间（主要是指检测响应时间）。

进一步地，本发明的一个实施例中，可以基于源探分离的锁相检测装置来提升荧光探测的灵敏度，基于阴性对照扩增曲线来判断当前待测样本的实时扩增曲线是否进入指数扩增段，该指数扩增段可以进行数学拟合得到对应的指数扩增函数，根据拟合的指数扩增函数来判断当前待测样本是否为阳性。进一步地，还可以根据拟合的指数扩增函数给出样本的病毒核酸浓度（例如得出样本的每毫升病毒核酸个数或者拷贝数）。总的来说，样本的初始病毒核酸浓度越高，对应的实时扩增曲线越早进入指数扩增段，初始病毒核酸浓度越低，对应的实时扩增曲线越晚进入指数扩增段。预先用浓度已知的标准品对核酸检测设备进行标定，即可对未知样本的病毒核酸浓度进行定量测量。进一步地，本实施例中，可以设定一个曲线分离阈值，如果待测样本的实时扩增曲线与阴性对照扩增曲线的高度差（即纵坐标指之差）超过该曲线分离阈值，则判断该实时扩增曲线进入指数扩增段。在指数扩增段，可以以三个循环（三个循环可以分别对应于2倍、4倍和8倍的荧光强度）来获取指数扩增数据，进而通过拟合获得对应的指数扩增函数。

进一步地，图6示出了在模拟测量实验中利用本发明的源探分离的锁相检测装置在多个时间点测出的数据以及所拟合的指数扩增曲线。在模拟测量实验中，以对数模型对30分钟内的一系列时间点的数据进行拟合，可以得到与模拟实验中的实测数据高度一致的函数曲线。模拟实验中设置的样本Ct值为40，而拟合函数中的参数x0代表的就是Ct值，可以看出，拟合所得的Ct值与模拟实验所设置的样本Ct值高度一致。换句话说，本发明的源探分离的锁相检测装置有能力在30分钟以内完成高度准确的指数扩增曲线拟合，进而对样本的Ct值进行预判，因此本发明的锁相检测装置和核酸检测设备有能力将检测响应时间缩短到30分钟以下（这里的检测响应时间是指从扩增反应开始到获得检测结果的响应时间）。而对于现有的PCR荧光检测装置，实时扩增曲线的前30分钟通常处于平缓的起始段，在本底信号及各种干扰的影响下，难以准确地提取出指数扩增信息，因此现有的PCR荧光检测装置的检测响应时间往往超过30分钟。图6中，Model为模型，Equation为方程，A1、A2、X0、P是方程中的各项参数。Reduced Chi-Sqr是卡方检验中用于评估拟合优劣的一项参数，可将其理解为残差均方，其取值越小，代表拟合准确度越高。图中Plot项目则代表仪器数据表的栏目号，图中信息反映的是数据表的B栏，此项目与本段落讨论的问题无直接关联，可以忽略。

基于前文描述，可以看出，基于源探分离的锁相检测装置所带来的高灵敏度，可以通过预判（预判Ct值或根据指数扩增函数来预判定性或定量检测结果）来有效地缩短核酸检测的时间，但需要注意，预判Ct值或预判定性或定量检测结果的方式并不限于上述两个实施例。

进一步地，本发明的一个实施例中，所述扩增反应可以是LAMP反应。LAMP全称为Loop-mediated isothermal amplification，可译为环介导等温扩增。当目标核酸是RNA病毒核酸（例如新冠病毒核酸）时，样本需要进行反转录，使之成为可以进行LAMP反应的cDNA模板。相对于PCR反应体系，LAMP反应体系可以具有更快的扩增速度。在LAMP反应体系中，可以针对靶基因（本实施例中靶基因可以是目标病毒核酸）的6个区域设计4种特异引物，在链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)的作用下，60-65℃恒温扩增，15-60分钟左右即可实现高倍数的核酸扩增，具有操作简单、特异性强、产物易检测等特点。本实施例中，基于源探分离的锁相检测装置可以对反应室中的LAMP扩增产物的荧光信号进行高精度测量，从而得到对应的实时扩增曲线，进而得出待测样本的定性或定量检测结果。进一步地，还可以基于前文所述的预判Ct值或者预判定性或定量检测结果的方法，来进一步加快样本的核酸检测速度。

进一步地，本发明的一个实施例中，所述扩增反应可以是CAMP反应。CAMP全称为Competitive annealing mediated isothermal amplification，可译为基于竞争性互补配对的等温扩增。当目标核酸是RNA病毒核酸（例如新冠病毒核酸）时，样本需要进行反转录，使之成为可以进行LAMP反应的cDNA模板。相对于PCR反应体系，CAMP反应体系可以具有更快的扩增速度。相对于LAMP反应体系，CAMP反应体系具有引物设计难度降低，对目标核酸要求低等优势。本实施例中，基于源探分离的锁相检测装置可以对反应室中的CAMP扩增产物的荧光信号进行高精度测量，从而得到对应的实时扩增曲线，进而得出待测样本的定性或定量检测结果。进一步地，还可以基于前文所述的预判Ct值或者预判定性或定量检测结果的方法，来进一步加快样本的核酸检测速度。

本发明的核酸检测设备可以适用于新冠病毒的核酸检测，也可以适用于流感病毒或其它病原体的核酸检测。在对RNA病毒进行检测时，先将目标核酸逆转录为cDNA再进行等温扩增。其中，在对DNA病毒进行检测时，省略逆转录步骤。具体来说，针对DNA病毒的PCR反应体系与针对RNA病毒的RT-PCR反应体系基本一致，通常来说，省略逆转录步骤即可，因此对于针对DNA病毒的PCR反应体系，本文中不再赘述。

进一步地，本发明的一些实施例的核酸检测设备还可以用于检测其它各种生物基因组、DNA或RNA进行核酸检测。

最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制。尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，都不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (8)

1.一种核酸检测设备，其包括锁相检测装置和核酸扩增反应装置，其特征在于，所述锁相检测装置包括：

激励源模块，其包括用于生成设定波形的周期性信号的信号发生器和用于基于所述周期性信号输出激光的激光器；以及

探测模块，其包括依次级联的光电探头、放大电路、滤波电路和测频锁相放大器；

其中，所述光电探头用于探测核酸扩增反应装置的扩增反应室的光信号；所述测频锁相放大器用于在其内部生成分别具有不同预定相位的多个参比信号，基于被测信号与这些参比信号的相关性对被测信号进行高精度快速频谱分析，进而在估测频率范围内搜索到被测信号的频点，再根据所得到的频点计算出被测信号的相位和幅值；并且所述激励源模块与所述测频锁相放大器电学上分离；

所述核酸扩增反应装置包括至少一个扩增反应室和连接该扩增反应室的输入输出流道，所述锁相检测装置用于根据所探测到的所述扩增反应室的荧光信号生成实时扩增曲线，并在实时扩增曲线进入指数扩增段的早期对所测样本的Ct值进行预判；

其中，对所测样本的Ct值进行预判包括：在扩增产物的量尚未到达荧光阈值所对应的量时，将扩增反应的前N个循环探测出来，并基于所述的前N个循环来拟合扩增曲线，再根据所述拟合扩增曲线预先计算出达到所述荧光阈值所需的循环数是多少；其中N为不小于3的自然数。

2.根据权利要求1所述的核酸检测设备，其特征在于，所述信号发生器的频率可调。

3.根据权利要求1所述的核酸检测设备，其特征在于，所述激励源模块中，所述信号发生器设置成输出单一频率的方波；

所述探测模块中，所述测频锁相放大器在所设置的频率的邻近区域内进行扫描，进而得出荧光信号的频点、相位和幅值。

4.根据权利要求1所述的核酸检测设备，其特征在于，所述核酸扩增反应装置设置多个所述扩增反应室，每个所述扩增反应室对应于一个特定频率的激光；

所述激励源模块中，所述信号发生器输出多个频率的方波，并使每个频率的激光照射一个对应于该频率的所述扩增反应室；

所述测频锁相放大器在所述信号发生器所设置的每个频率的邻近区域内分别进行扫描，进而获得不同扩增反应室的荧光信号的频点、相位和幅值。

5.根据权利要求1所述的核酸检测设备，其特征在于，所述锁相检测装置还用于：在预判Ct值的基础上，继续测量实时扩增曲线，录得实际测量的Ct值，以评估预判Ct值与实测Ct值的匹配程度，当该匹配程度达到或高于预设标准时，直接根据预判Ct值输出核酸检测结果。

6.根据权利要求1所述的核酸检测设备，其特征在于，所述锁相检测装置还用于：根据预判Ct值来得出阴性或阳性的检测结果；或者根据预判Ct值给出定量检测结果，所述定量检测结果为待测样本的病毒核酸浓度。

7.根据权利要求1所述的核酸检测设备，其特征在于，所述核酸扩增反应装置还包括阴性对照反应室；

所述锁相检测装置还用于：根据所探测到的所述扩增反应室的荧光信号生成实时扩增曲线，根据所探测到的阴性对照反应室的荧光信号生成阴性对照扩增曲线；基于所述阴性对照扩增曲线来判断当前待测样本的实时扩增曲线是否进入指数扩增段，基于所述指数扩增段进行数学拟合得到对应的指数扩增函数，根据拟合的所述指数扩增函数来判断当前待测样本是否为阳性，或者根据拟合的所述指数扩增函数给出样本的病毒核酸浓度。

8.根据权利要求1所述的核酸检测设备，其特征在于，所述扩增反应室与所述光电探头之间设置滤光片。

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