CN105803062A - 一种核酸（dna/rna）实时恒温基因扩增检测的方法 - Google Patents

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陈苏红
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Abstract

本发明公开了一种核酸(DNA/RNA)实时恒温基因扩增检测的方法，该方法以酶标仪检测为核心，快速高效的等温扩增检测新方法。具体实施方法如下：将待测样本DNA/RNA模板加入含一定中性红浓度的15～25μl LAMP扩增体系中，然后放入温度为60～65℃的酶标仪中实时检测反应体系吸光度的改变，从而间接的监测反应的进行。反应信号以曲线的形式表达，曲线在30～60min内进入对数期表示检测样本为阳性，曲线一直延伸没有进入对数期表示为阴性。本发明简单、快捷、方便为以后的基层推广起到极大的推动作用，比较传统的PCR检测方法，实现了基因快速、安全检测，为阻断传播途径、有效控制并追踪传染源、有效控制超级细菌的爆发及流行方面具有重要意义。

Description

一种核酸（DNA/RNA）实时恒温基因扩增检测的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种核酸(DNA/RNA)实时恒温基因扩增检测的方法。
背景技术
目前，对于病原菌的检测方法主要有：病原体分离法、免疫学方法、和基于核酸水平的PCR检测方法。病原体分离方法是临床诊断的金标准，但其存在耗时长，操作繁琐等不足；免疫学方法也因为其非特异扩增和敏感性低等原因而没有被广泛使用；PCR检测方法可以从核酸水平直接进行检测，具有高特异性和敏感性，但其存在需要昂贵的实验仪器和稳定的实验环境、耗材成本高等缺陷、受限于检测人员的操作技术等原因，因此还有待于进一步完善。近年来随着分子生物学的飞速发展，核酸研究的进展日新月异，新的核酸扩增模式也不断涌现，以满足不同研究目的的需求，根据核酸反应过程答题可以分为两类：一类需要不同温度的循环，另一类不需要温度循环即很稳扩增。
环介导等温扩增技术(Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)是一种新的核酸扩增技术，因其操作简单。快速、特异性高、成本低等优点、成为可以替代PCR的新的核酸扩增技术。它针对靶基因的6个区域设计4种特异性的引物，在BST大片段聚合酶的作用下因其自循环链置换反应，60～65℃范围80min内，大量合成目标DNA的同时伴随着大量的H+的产生。由于LAMP扩增过程中依赖识别靶序列6个独立区域，所以反应特异性很强，并且核酸扩增过程是在恒温条件下进行，普通水浴锅或者有稳定热源的设备就能满足反应要求，检测成本大大降低。由于LAMP反应简单、快速、高效、经济等特征，因而其具有极为广泛的应用前景。自LAMP检测技术建立15年以来，该技术已经广泛应用于对病毒、细菌、寄生虫、真菌等病原体的检测研究，相关的检测技术也接踵而至，例如浊度仪检测、肉眼观测颜色变化等，但用酶标仪来检测体系中中性红的颜色变化的报道还没有。传统的恒温扩增检测技术主要包括电泳检测、浊度仪检测、肉眼观测法。传统的检测的方法在等温扩增的发展历程重起到重要的做用，但是存在许多不可忽视的缺点。电泳检测：只能定性判断是否扩增，并且每次检测要开盖，难免会污染环境为后来实验的进行带来了一系列的麻烦，耗时、耗力；浊度仪检测：也仅仅能定性，成本高，一台普通的浊度仪也将近20万左右。肉眼观测法，无非就是观测反应后的体系颜色的变化、浊度变化，但是这种方法主观性太高，不同的人有不同的判断。然而酶标仪实时检测LAMP体系里中性红颜色的变化可以很好的解决以往技术的难题，不仅可以定性，也可以定量，而且整个过程中不需要开盖，能够很好的解决污染问题，最重要的是酶标仪是一种趋于成熟的产品造价低廉大大的降低了检测成本，为等温扩增技术应用到基层起到了极大的推动作用。
发明内容
发明目的：针对现有技术中检测成本高、易污染、主观性强、不能定量的问题，本发明的目的是提供一种新的检测方法来解决以上问题。
技术方案：为了实现上述发明的目的，本发明采用的技术方案为：
1.一种核酸(DNA/RNA)实时恒温基因扩增检测的方法：一种恒温扩增检测的方案，其特征在于：用(温控酶标仪)实时检测添加颜色信号指示剂的等温扩增体系的等温扩增反应。
2.1所述的温控酶标仪：单通道酶标仪、多通道酶标仪
3.1所述的颜色反应信号指示剂具体如下：甲酚紫、甲酚红、羟基萘酚蓝、中性红
4.1所述的等温扩增方法具体如下：
NASBA(NucleicAcidSequenceBasedAmplification)；
SDA(StrandDisplacementAmplification)；
RCA(RollingCirclesAmplification)；
LAMP(Loop-mediatedisothermalamplification)；
HDA(Helicase-DependentAmplification)；
RPA(Recombinasepolymeraseamplification)
5.1所述的方案在恒温扩增检测中的应用。
一种核酸(DNA/RNA)实时恒温基因扩增检测的方法，其特征在于：在含有一定浓度中性红的等温扩增体系中加入待检样本的DNA/RNA模板，然后放入酶标仪中实时检测扩增反应的变化，曲线在30～60min内进入对数期表示检测为阳性，曲线一直延伸没有进入对数期表示为阴性。
5所述的一种核酸(DNA/RNA)实时恒温基因扩增检测的方法，其特征在于：提取待检样本的DNA/RNA，取1～5ulDNA/RNA溶液，加入15～25μlLAMP扩增体系中进行LAMP(条件：60℃～65℃，30～60min)，最后观察并分析扩增曲线的变化趋势。
本发明的检测方法，包括试剂盒提取待检样本的DNA/RNA，以提取的DNA/RNA为模板，利用酶标仪检测恒温扩增体系吸光度的改变(中性红的颜色改变引起体系吸光度的改变)；中性红属于PH指示剂的一种，中性红是H+的指示剂，其颜色随着溶液PH变化而改变，因此可以通过LAMP反应体系的吸光度改变(H+浓度的变化引起的颜色变化即反应体系的吸光度的改变)来实现反应的实施检测，酶标仪以S型曲线的形式表达体系吸光度的动力学变化过程。反应前将中性红加入反应体系中，反应液呈淡黄色(体系初始PH约为8.8)，反应过程中dNTP在与模板互补配对的过程中会释放H+，从而使体系逐渐偏酸。进而中性红的颜色由淡黄色变成淡红色。在酶标仪中表达为体系吸光度的改变，通过数据动力学处理吸光度的改变可以得到相应的曲线，如果反应时间足够长曲线会趋于S型。对数期是反应阶段，平台期是反应终止阶段。如果反应进入对数期说明检测为阳性，相反为阴性。
有益效果
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果表现在：
1)操作方便：本发明提供的一种核酸(DNA/RNA)实时恒温基因扩增检测的方法克服了现有技术中样本检测所需周期长、耗时费力、繁琐、特异性差的问题及PCR检测技术需要热循环仪器，无法快速检测样本的问题。本发明在60℃～65℃等温条件下，能快速、方便、高效、高特异性地检测样本，不需要复杂的仪器，能很好的满足现场检测。
2)无污染：由于传统的检测技术一般需要开盖，为气溶胶的形成提供有利条件。从而大大增加了假阳性检出的几率。然而该检测法方法从反应开始到结束实现实时检测的目的，无需开盖、转移。实现了快速实时无污染检测的目的。
3)准确度高：传统检测技术大部分需要主管判断反应的发生与否，需要肉眼识别颜色的变化、浊度的变化。该检测方法应用酶标仪准确的读取反应液的吸光度变化，并且实时以曲线的形式报告反应的变化进程，大大提高了检测的准确度。
4)实用性好：传统检测要达到实时检测的目的，仪器设备成本高。该检测方法只需要一台酶标仪，价格低廉、技术成熟，为等温扩增检测技术向基层的推广奠定了基础。
本发明为等温扩增检测提供了新的技术平台，可用于样本高灵敏度快速检测，同时为等温扩增技术的推广起到了重要意义。
附图说明
图1是本发明一种核酸(DNA/RNA)实时恒温基因扩增检测方法特异性检测结果；9种HBV核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的临床症状、采样部位正常寄生或易并发的其他微生的阴性对照均无扩增，5个HBV阳性对照吸光度上升曲线。
图2是本发明一种核酸(DNA/RNA)实时恒温基因扩增检测方法敏感性检测结果；原始样本浓度为8.1×107copies/μl，LAMP法检测限约为8.1copies/体系，而PCR法检测限一般为102copies/体系。
图3是加入颜色指示剂后肉眼观察结果；左管为以双蒸水为模板的阴性对照，右管为以HBV待检样本为模板的阳性对照。
图4是本发明HBVDNA定量标准曲线；将不同标准样品的浓度的吸光度对应时间绘制成的标准曲线，将对应时间的吸光度变化代入标准曲线方程，即可求出各时间的待检样本拷贝数。
具体实施方式
以下实施将结合附图对本发明做进一步说明。
一种HBVDNA实时LAMP检测的方法
1、材料的准备
HBV血清样本均为中国人民解放军第302医院提供。LAMP法DNA扩增试剂盒购自北京蓝谱生物科技有限公司。
2、LAMP引物设计与合成
根据GenBank中的HBV特异性保守基因序列，利用LAMP法引物辅助设计软件PrimerExplorerV4软件设计一套LAMP引物，其中F3、B3为外引物，FIP、BIP为内引物，LF、LB为环引物；B4、B5为HBVLAMP检测引物，其中
F3TCCTCACAATACCGCAGAGT
R3GAGGCATAGCAGCAGGATG
FIPTTGGGGACTGCGAATTTTGGCTTTTTAGACTCGTGGTGGACTTCT
BIPTCACTCACYAACCTCCTGTCCTTTTTAAAACGCCGCAGACACAT
LFGGTGATCCCCCTAGAAAATTGAG
LBAATTTGTCCTGGTTATCGCTGG
3、样本的前处理
磁珠法提取推荐使用北京金麦格生物技术有限公司的自动核酸提取仪器，提取试剂为病毒DNA/RNA提取试剂盒(磁珠法)。
4、LAMP反应体系建立
按照试剂盒说明书，按25μl体系配置：
LAMP反应在以酶标仪(BioTek美国伯腾仪器有限公司)进行全程密闭监控的形式监测本方法的检出情况，通过酶标仪实时监测扩增情况，可以绘制标准曲线，将未知样品吸光度的变化为0.1OD时的时间值带入标准曲线，即可从标准曲线上读出该样品的起始拷贝数，反应温度以试剂盒推荐的63℃为基准。
5、一种核酸(DNA/RNA)实时恒温基因扩增检测
1)特异性检测
选择与HBV核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的临床症状、采样部位正常寄生或易并发的其他微生物，包括甲型肝炎病毒(HepatitisAvirus，HAV)、丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus，HCV)、戊型肝炎病毒(hepatitisEvirus，HEV)、人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，HIV)、巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)、EB病毒(Ebolavirus，EBV)，单纯疱疹病毒2型(herpessimplexvirus-II，HSV-II)、甲型流感病毒、金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus，SA)9种病原样本，提取后作为模板进行各样本的LAMP扩增，检测LAMP方法的特异性。
2)敏感性检测
将提取好并通过荧光定量的HBV样本10倍倍比稀释至107～1008个梯度作为待检样本，取各梯度样本2μl作为模板进行LAMP扩增。
3)可见光可视化检测
根据酶标仪监控优化的条件，加入颜色反应信号指示剂，指示剂在反应前加入，加入的指示剂为中性红商用PH指示剂，63℃下反应30分钟后，用肉眼观测，不采用琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像，从而避免跑电泳造成的气溶胶污染。
实施例1一种核酸(DNA/RNA)实时恒温基因扩增检测的特异性结果
对9种HBV核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的临床症状、采样部位正常寄生或易并发的其他微生物阴性对照进行LAMP扩增，结果如图1所示，5个HBV样本反应管在30分钟左右出现扩增曲线的上升趋势，为阳性结果，9种阴性对照样本反应管扩增曲线均无上升趋势，为阴性结果。
实施例2一种核酸(DNA/RNA)实时恒温基因扩增检测方法的敏感性结果
荧光定量起始HBV样本的浓度为8.1x107copies/μl。取10倍倍比稀释后的样本为模板进行检测，结果如图2所示，该方法的检测限为8.1copies/体系，而PCR法检测限一般为102copies/体系。
实施例3一种核酸(DNA/RNA)实时恒温基因扩增检测方法的可见光可视化检测结果
根据酶标仪监控优化的条件，加入颜色指示剂，63℃反应30分钟后，肉眼观测，图3为观察结果，左管为阴性对照，右管为以HBV样本的DNA为模板的反应，左管反应后淡黄色，右管反应后为棕红色，该方法肉眼可见有利于基层使用，只需使用配套试剂盒并设计相关Lamp引物，加入待检样品后，使用价格低廉的水浴锅63℃反应30min，即可快速观察结果，且无需开盖，避免了污染。
实施例4HBVDNA定量标准曲线的绘制
设置对照：浓度分别为8.1×1O6copies/μl、8.1×105copies/μl、8.1×104copies/μl、8.1×103copies/μl、8.1×102copies/μl、8.1×101copies/μl的标准待检样品，因为浓度的对数值与吸光度变化为0.1OD的时间值成线性关系，所以可以将酶标仪读取的值与时间值做成标准曲线，获得标准曲线方程，如图4所示。从标准曲线方程来看相关系数R2为0.9975，呈良好的线性关系。以时间为X值，可求出Y值即浓度的对数值。如某实验样品达到吸光度变化值为0.1OD的时间为20min时，带入所建立的标准曲线方程，求出Y等于10.163，则浓度为1010.163，再乘以基数8.1，即为该实验样品的浓度，从而达到定量。
时间 28 31 33 36 38
标准值(LOG) 6.908 5.908 4.908 3.908 2.908

Claims (7)

1.一种核酸(DNA/RNA)实时恒温基因扩增检测的方法，其特征在于：用(温控酶标仪)实时检测添加颜色反应信号指示剂的等温扩增体系的等温扩增反应。
2.权利要求书1所述的温控酶标仪：单通道酶标仪、多通道酶标仪。
3.权利要求书1所述的颜色反应信号指示剂具体如下：甲酚紫、甲酚红、羟基萘酚蓝、中性红。
4.权利要求书1所述的等温扩增方法具体如下：
NASBA(NucleicAcidSequenceBasedAmplification)；
SDA(StrandDisplacementAmplification)；
RCA(RollingCirclesAmplification)；
LAMP(Loop-mediatedisothermalamplification)；
HDA(Helicase-DependentAmplification)；
RPA(Recombinasepolymeraseamplification)。
5.权利要求书1所述的方案在恒温扩增检测中的应用。
6.一种核酸(DNA/RNA)实时恒温基因扩增检测的方法，其特征在于：在含有一定浓度中性红的等温扩增体系中加入待检样本的DNA/RNA模板，然后置于酶标仪中实时检测扩增反应的变化，扩增反应的变化以曲线的形式表达：曲线在一定时间内进入对数期表示检测为阳性，曲线一直延伸没有进入对数期表示为阴性。
7.根据权利要求6所述的一种核酸(DNA/RNA)实时恒温基因扩增检测的方法，其特征在于：提取待检样本的DNA/RNA，取1～5μlDNA/RNA为模板，加入15～25μlLAMP扩增体系中进行LAMP(条件：60℃～65℃，30～60min)，最后观察并分析扩增曲线的变化趋势。
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