CN110305984A - 一种非洲猪瘟病毒的可视化lamp检测试剂盒 - Google Patents
一种非洲猪瘟病毒的可视化lamp检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种非洲猪瘟病毒的可视化LAMP检测试剂盒。该试剂盒包含有6条LAMP引物的LAMP反应液构成的检测体系。本发明的试剂盒以中性红染料替代了传统钙黄素，不仅使可视化直观效果更加鲜明，将反应时间缩短至45分钟，而且还实现了由试剂盒直接提供反应预混缓冲液的需求，这样进一步简化了操作程序，更加有效避免污染发生。应用本发明的试剂盒进行检测，能够肉眼直接直观判断，具有良好的特异性、敏感性和稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及一种可视化LAMP试剂盒，具体地说是一种非洲猪瘟病毒的可视 化LAMP检测试剂盒。
背景技术
非洲猪瘟(英文名称：African Swine fever，简称：ASF)是由非洲猪瘟 病毒(英文名称：African Swine fever virus，简称：ASFV)感染家猪和各种 野猪(如非洲野猪、欧洲野猪等)引起一种急性、出血性、烈性传染病。世界 动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物疫病，该病也是我国重点防范的一 类动物疫情。其特征是发病过程短，最急性和急性感染死亡率高达100％，临床 表现为发热(达40～42℃)，心跳加快，呼吸困难，部分咳嗽，眼、鼻有浆液性 或粘液性脓性分泌物，皮肤发绀，淋巴结、肾、胃肠粘膜明显出血，非洲猪瘟临床症状与猪瘟症状相似，只能依靠实验室监测确诊。
传统的实时荧光qPCR检测试剂盒不仅需要昂贵的实时荧光定量PCR仪器， 而且需要依赖仪器的Ct值或者溶解曲线方能够做出结果判断，需要严格培训的 专业技术人员方可以掌握此复杂的操作过程，不利于在基础实验室或者养殖场、 屠宰场等现场使用。其它的一些等温扩增方法，例如重组酶聚合酶扩增(RAA) 法等尽管设备相对简单化一些，但是还都无法实现可视化检测，仍依赖专业技 术人员操作和对结果的分析判断。由于非洲猪瘟疫情紧急，传播渠道众多，更 多是发生在散养户或者小规模猪场(我国规划化养猪场占比尽在15％左右)，这 些场所条件简陋，不具备高要求的设备和专业化的技术人员，再有非洲猪瘟现 在没有商品化疫苗，所以，早期现场诊断对疫情的防控突显十分重要。抗原和 抗体等免疫学监测方法在疫病检测时间上都相对滞后，敏感度也相对核酸检测 低。非洲猪瘟病毒核酸在感染24小时就可以检测出来，故此，开发能够满足现 场病毒核酸检测需求的方法是及时发现疫情的最有效手段。本发明的非洲猪瘟 病毒可视化LAMP检测试剂盒完全能够满足现场检测，尤其是设备相对简陋的小 型猪场或者屠宰场等基础单位的迫切需求。
发明内容
本发明的的目的在于提出一种非洲猪瘟病毒的可视化LAMP检测试剂盒，以 解决上述所述的缺点。
为实现上述目的，本发明所述一种检测非洲猪瘟病毒的LAMP引物组，所述 引物组为以下六条引物：
ASFV-LP-F3-3：5'-CTAAATACTATCAGCCCCCTCTTG-3'，
ASFV-LP-FIP-3：
5'-ATTGCGTCTACTGGGGCGTCCAGTTTTGGCGAGCGCTTTATCACCATA-3'，
ASFV-LP-FLOOP-3：5'-CACCAAATCCTTTTGCGATGC-3'，
ASFV-LP-BIP-3：
5'-CGCTTTAAACCATGGTTTATCCCAGTTTTTCAGGGGTTACAAACAGGTTATTGA-3'，
ASFV-LP-BLOOP-3：5'-GAAATCTCGCTCACGAATAATG-3'，
ASFV-LP-B3-3：5'-GGGTCACCTGCGTTTTATGGA-3'。
本发明所述一种检测非洲猪瘟病毒的LAMP试剂盒，所述试剂盒包括上述引 物组。
所述试剂盒主要由非洲猪瘟病毒可视化LAMP检测试剂盒组成；
所述非洲猪瘟病毒可视化LAMP检测试剂盒其成分如下：1080μlASFV恒温 扩增反应液、60μlBst DNA聚合酶、1ml矿物油、100μl LAMP ASFV阳性对照、 100μlLAMP ASFV阴性对照；
所述恒温扩增反应液中主要包括扩增非洲猪瘟病毒p72基因的LAMP引物、 扩增缓冲液和显色染料；其中扩增非洲猪瘟病毒p72基因的LAMP引物预混液的 终浓度分别为：
0.08μM ASFV-LP-F3/ASFV-LP-B3、0.8μM ASFV-LP-FIP/ASFV-LP-BI、
0.8μM ASFV-LP-FLOOP/ASFV-LP-BLOOP。
4、如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的检测反应条件 为：64℃，45分钟；终止反应。
5、如权利要求2所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：所述试剂盒的使 用方法为：
1)常规样品核酸提取：
本发明所述一种检测非洲猪瘟病毒的LAMP试剂盒的使用方法，具体如下：
1)样品核酸提取：
a、取200μl全血/血清/组织研磨液上清液至1.5ml离心管中；所述全 血/血清/组织研磨液为1克全血/血清/组织：3毫升PBS缓冲液；再依次加入 500μl Buffer MVN和15μl磁珠，加入后振荡混匀；盖上管盖，颠倒混匀5 次后，70℃加热2.5-3min；
b.瞬时离心后放置于磁力架上静置30s，所述离心步骤为2000转/分钟， 2-3秒；待磁珠完全吸附时去除液体；加入700μl Buffer MWP，盖上盖子， 将离心管从磁力架上取下，振荡混匀1min；瞬时离心后放置于磁力架上静置 30s，磁珠完全吸附后，小心吸去液体；将离心管保留在磁力架上，缓慢加入 700μl Buffer MWE，立即吸去液体；
c.将离心管从磁力架上取下，加入50-100μl RNase Free ddH2O，振荡混 匀后70℃加热2.5-3min；
e.将离心管瞬时离心后放置于磁力架上静置30s，待磁珠完全吸附后，小 心将核酸溶液转移至一个新离心管作为非洲猪瘟病毒可视化LMAP检测的模板即 样品DNA模板，待用；
2)非洲猪瘟病毒检测：
a.向对应的反应管中加入制备好的样品DNA模板1μl，然后向阴性对照管 内加入1μl LAMP阴性对照，最后向阳性对照管内加入1μl LAMP阳性对照；
反应体系：
b.将分别加入待检核酸样品、LAMP阴性对照与LAMP阳性对照的反应管加 热；
所述加热反应管采用水浴锅、金属浴或者常规PCR仪中的一种；
所述水浴锅或没有热盖的金属浴则需向每管表面加入20μl矿物油，采用 带热盖的金属浴或者常规PCR仪则无需加入矿物油；
c.预热好相应的仪器，64℃反应45分钟，反应结束后及时取出反应管，或 者保持在室温或者4℃，反应结束后即可直接肉眼观察判定结果；
d.结果判定：
1)阴性对照样品管反应结束后颜色为橘黄或者橘色，阳性对照样品管变 为粉红色，若二者均成立才可判定试验成立，否则试验无效；
2)试验成立时，若待检样品管颜色变为和阳性对照样品管颜色一致或接近 的粉红色则判为阳性。
本发明所述一种检测非洲猪瘟病毒的LAMP试剂盒，其有益效果在于：1、 设备简单：不要昂贵设备，仅是能够提供64℃恒温条件的金属浴或者水浴锅就 可以；2、结果易判：结果直接肉眼观察判断，一目了然，不要专业技术人员； 3、操作简便：操作简便，因为引物、反应缓冲液和显色染料已经加入扩增反应 液中，仅需要加入1μl样品核酸和1μl酶；4、反应快速：45分钟结束扩增， 然后直接观察判断；5、特异性强：不与古典猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征俗 称猪蓝耳病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型或者3型、猪伪狂犬病毒、流 行性乙型脑炎病毒等发生非特异性反应；6、敏感性高：可以检测出100拷贝数 /反应，与实时荧光qPCR相当；7、重复性好：在检出限上时，重复结果稳定。
具体实施方式
实施例1
本发明所述一种检测非洲猪瘟病毒的LAMP试剂盒的使用方法：
1)样品核酸提取步骤：
a.样本的核酸提取步骤参照提供的配套快速磁珠法病毒DNA/RNA提取试剂 盒的说明书进行；
b.取200μl全血/血清/组织研磨液上清液至1.5ml离心管中；
c.向样本中依次加入500μl Buffer MVN和15μl磁珠，不建议将Buffer MVN和磁珠预混，注意：为了确保磁珠彻底重悬，请在使用前振荡混匀；
d.盖上管盖，颠倒混匀5次后，70℃加热2.5-3min；
e.瞬时离心后放置于磁力架上静置30s，待磁珠完全吸附时小心去除液体， 注意：不要触碰到磁珠；
f.加入700μl Buffer MWP，盖上盖子，将离心管从磁力架上取下，振荡 混匀1min；
g.瞬时离心后放置于磁力架上静置30s，磁珠完全吸附后，小心吸去液体, 不要触碰到磁珠；
h.将离心管保留在磁力架上，缓慢加入700μl Buffer MWE,此步不要将离 心管从磁力架上拿下来，MWE漂洗时间不要超过1min，漂洗时不要冲散磁珠， 立即吸去液体；
i.将离心管从磁力架上取下，加入50-100μl RNase Free ddH2O，振荡混 匀后70℃加热2.5-3min；
j.将离心管瞬时离心后放置于磁力架上静置30s，待磁珠完全吸附后，小 心将核酸溶液转移至一个新离心管作为非洲猪瘟病毒可视化LMAP检测的模板即 DNA模板；
k.非洲猪瘟病毒可视化LAMP扩增试剂配制：
| 试剂组分 | 1个反应加入量 |
| 1号管 恒温扩增反应液(ASFV) | 18μl |
| 2号管 Bst DNA聚合酶 | 1μl |
| DNA模板 | 1μl |
| 总体积 | 20μl |
l.向对应的反应管中加入制备好的样品DNA模板1μl，然后向阴性对照管内加入1μl LAMP阴性对照(ASFV)，最后向阳性对照管内加入1μl LAMP阳性对照(ASFV)。加样时， 边加边快速吹打2-3次即可，切勿离心,采用水浴锅加热，每管表面加入20μl矿物油；
m.反应程序：
将反应管至于预热好相应的仪器，64℃反应45分钟，反应结束后及时取出反应管，或者 保持在室温或者4℃，反应结束后即可直接肉眼观察判定结果。
n.结果判定：
1)阴性对照样品管反应结束后颜色为橘黄或者橘色，阳性对照样品管变为粉红色，若二 者均成立才可判定试验成立，否则试验无效；
2)试验成立时，若待检样品管颜色变为和阳性对照样品管颜色一致或接近的粉红色则判 为阳性。
一、检测样本组成：
包括欧盟非洲猪瘟参考实验室提供17份非洲猪瘟病毒分离株基因组；甘肃省疫控送检并 已复核3份阳性非洲猪瘟肌肉组织；中国农业科学院兰州兽医研究所口蹄疫O型扁桃体、肝、 心脏各一份，猪瘟病毒cDNA，猪繁殖与呼吸综合征病毒cDNA各一份；健康猪肾、脾、肝各一 份，淋巴2份，健康猪血清5份及健康猪全血5份，共计40份样本组成，具体见表1。
表1样品盘组成
| 序号 | 样品背景 | 原始结果 |
| 1 | 非洲猪瘟病毒E70基因组 | + |
| 2 | 非洲猪瘟病毒Ba71V基因组 | + |
| 3 | 非洲猪瘟病毒E75基因组 | + |
| 4 | 非洲猪瘟病毒Ss88基因组 | + |
| 5 | 非洲猪瘟病毒Lisbon60基因组 | + |
| 6 | 非洲猪瘟病毒Haiti基因组 | + |
| 7 | 非洲猪瘟病毒Kat67基因组 | + |
| 8 | 非洲猪瘟病毒Ang72基因组 | + |
| 9 | 非洲猪瘟病毒Cv97基因组 | + |
| 10 | 非洲猪瘟病毒Nig01基因组 | + |
| 11 | 非洲猪瘟病毒Moz64基因组 | + |
| 12 | 非洲猪瘟病毒MwLil20/1基因组 | + |
| 13 | 非洲猪瘟病毒Ug03H.1基因组 | + |
| 14 | 非洲猪瘟病毒Ken06.Bus基因组 | + |
| 15 | 非洲猪瘟病毒Ken08Tk.2/1基因组 | + |
| 16 | 非洲猪瘟病毒BF07基因组 | + |
| 17 | 非洲猪瘟病毒Arm07基因组 | + |
| 18 | 非洲猪瘟猪肌肉 | + |
| 19 | 非洲猪瘟猪肌肉 | + |
| 20 | 非洲猪瘟猪肌肉 | + |
| 21 | 口蹄疫O型猪心脏 | - |
| 22 | 口蹄疫O型猪扁桃体 | - |
| 23 | 口蹄疫O型猪肝 | - |
| 24 | 猪瘟病毒cDNA | - |
| 25 | 猪繁殖与呼吸综合征病毒cDNA | - |
| 26 | 健康猪肾 | - |
| 27 | 健康猪脾 | - |
| 28 | 健康猪肝 | - |
| 29 | 健康猪淋巴 | - |
| 30 | 健康猪淋巴 | - |
| 31 | 猪血清 | - |
| 32 | 猪血清 | - |
| 33 | 猪血清 | - |
| 34 | 猪血清 | - |
| 35 | 猪血清 | - |
| 36 | 猪全血 | - |
| 37 | 猪全血 | - |
| 38 | 猪全血 | - |
| 39 | 猪全血 | - |
| 40 | 猪全血 | - |
二、敏感性检验：
a.检测方法：使用20190307435、20190321435、20190403435三批次试剂盒检测，按照 说明书操作；
b.阳性检出率：
用三批不同批次的试剂盒检测20份非洲猪瘟病毒阳性样品，根据阳性检出率的不同，确 定试剂盒的敏感性：
c.最低检出量：
将浓度为1.0×106拷贝/μl的非洲猪瘟阳性质粒，按照10×倍比稀释，用非洲猪瘟病毒 可视化LAMP检测试剂盒检测不同稀释倍数的质粒，以出现阴性结果为界限，确定非洲猪瘟病 毒可视化LAMP检测试剂盒的最低检出量；
d.特异性检测：
使用20190307435、20190321435和20190403435三批次试剂盒检测。按照说明书操作。 选取样品盘中口蹄疫O型阳性样本3份；猪瘟阳性样本1份、猪繁殖与呼吸综合征阳性样本1 份和非洲猪瘟核酸阴性样品15份，共计20份样本；
e.重复性检验：
批间实验使用20190307435、20190321435和20190403435三批次试剂盒检测40份样品， 对比三次检测的判定结果，计算符合率；批内实验使用20190307435、20190321435和20190403435批次的试剂盒检测40份样品，每个样品重复检测三次，比较结果是否一致，计算符合率；
f.符合性检验：
将40份样品使用三批次试剂盒(批号为20190307435、20190321435和20190403435) 进行平行试验，根据与样本背景比对确定试剂盒的符合率；
三、检测结果：
a.敏感性检验：
对20份阳性样本进行非洲猪瘟病毒可视化LAMP检测试剂盒检测的检测结果汇总见表2。
表2 20份阳性样本可视化LAMP敏感性检测结果汇总表
过结果汇总可知，通过对20份非洲猪瘟阳性样品检测，非洲猪瘟病毒可视化LAMP检测试 剂盒检出20份阳性，符合率为100％，表明敏感性好。
将非洲猪瘟阳性质粒倍比稀释，用非洲猪瘟病毒可视化LAMP检测试剂盒检测不同稀释倍 数的质粒，且每个稀释度数平行检测三个，检测结果见表3。
表3不同稀释度质粒的可视化LAMP检测结果汇总表
由结果可知，非洲猪瘟病毒可视化LAMP检测试剂盒在101拷贝/反应的浓度下重复检测3 次时，有两个反应管(第一排和第二排)呈现粉红色，为阳性，第三排相应反应管呈现橘色， 为阴性结果。所以得出结论，非洲猪瘟病毒可视化LAMP检测试剂盒的最低检出限是102拷贝/ 反应。
b.特异性检验
对20份非洲猪瘟阴性样本进行可视化LAMP检测的结果表4。
表4 20份阴性样本可视化LAMP的特异性检测结果汇总表
由表4可知，对于20份非非洲猪瘟的其他病毒核酸样品和非洲猪瘟核酸阴性样品进行检 测，可视化LAMP方法可检出阴性样品数为20个，符合率为100％，表明特异性好。
c.重复性检验：
批间重复性检测实验结果见表5。
表5三批次非洲猪瘟病毒可视化LAMP试剂盒批间重复性检测结果汇总表
批内重复性检测实验结果汇总分析见表6。
表6非洲猪瘟病毒可视化LAMP检测试剂盒检测结果统计
【注：变异系数C.V＝(存在差异的检测份数/总检测份数)×100％】
用三批试剂盒分别检测40份样品，40份样本重复测定三次，变异系数C.V＝0％，说明三 批试剂盒三次检测数据的变异程度低。
使用20190307435、20190321435、20190403435三个批次试剂盒进行3次检测结果完全 一致的数量均为为40个，占100％。40份样本重复测定三次变异系数C.V＝0％，说明上述试剂 盒三次检测数据的变异程度低，且批次间变异水平低，重复性好。
d.符合率：
根据敏感性、特异性及重复性结果，本试剂盒与样品盘背景符合率见表7。
表7非洲猪瘟病毒可视化LAMP检测试剂盒与样品盘背景符合率结果
由上表所示的40个样品的检测结果表明，非洲猪瘟病毒可视化LAMP检测试剂盒与样品 盘原始背景符合率为100％。
e.结论：
通过对样品盘40份样品检测结果可知，非洲猪瘟病毒可视化LAMP检测试剂盒特异性、 敏感性及重复性均符合实验要求，质量稳定可靠。
Claims (5)
1.一种检测非洲猪瘟病毒的LAMP引物组，其特征在于：所述引物组为以下六条引物：
ASFV-LP-F3-3：5'-CTAAATACTATCAGCCCCCTCTTG-3'，
ASFV-LP-FIP-3：5'-ATTGCGTCTACTGGGGCGTCCAGTTTTGGCGAGCGCTTTATCACCATA-3'，
ASFV-LP-FLOOP-3：5'-CACCAAATCCTTTTGCGATGC-3'，
ASFV-LP-BIP-3：
5'-CGCTTTAAACCATGGTTTATCCCAGTTTTTCAGGGGTTACAAACAGGTTATTGA-3'，
ASFV-LP-BLOOP-3：5'-GAAATCTCGCTCACGAATAATG-3'，
ASFV-LP-B3-3：5'-GGGTCACCTGCGTTTTATGGA-3'。
2.一种检测非洲猪瘟病毒的LAMP试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒主要由非洲猪瘟病毒可视化LAMP检测试剂盒组成；
所述非洲猪瘟病毒可视化LAMP检测试剂盒其成分如下：1080μlASFV恒温扩增反应液、60μlBst DNA聚合酶、1ml矿物油、100μl LAMP ASFV阳性对照、100μlLAMP ASFV阴性对照；
所述恒温扩增反应液中主要包括扩增非洲猪瘟病毒p72基因的LAMP引物、扩增缓冲液和显色染料；其中扩增非洲猪瘟病毒p72基因的LAMP引物预混液的终浓度分别为：
0.08μM ASFV-LP-F3/ASFV-LP-B3、0.8μM ASFV-LP-FIP/ASFV-LP-BI、
0.8μM ASFV-LP-FLOOP/ASFV-LP-BLOOP。
4.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的检测反应条件为：64℃，45分钟；终止反应。
5.如权利要求2所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：所述试剂盒的使用方法为：
1)常规样品核酸提取：
a、常规样品核酸提取，制备得到非洲猪瘟病毒可视化LMAP检测的模板即样品DNA模板，待用；
2)非洲猪瘟病毒检测：
a.向对应的反应管中加入制备好的样品DNA模板1μl，然后向阴性对照管内加入1μlLAMP阴性对照，最后向阳性对照管内加入1μl LAMP阳性对照；
反应体系：
b.将分别加入待检核酸样品、LAMP阴性对照与LAMP阳性对照的反应管加热；
所述加热反应管采用水浴锅、金属浴或者常规PCR仪中的一种；
所述水浴锅或没有热盖的金属浴则需向每管表面加入20μl矿物油，采用带热盖的金属浴或者常规PCR仪则无需加入矿物油；
c.预热好相应的仪器，64℃反应45分钟，反应结束后及时取出反应管，或者保持在室温或者4℃，反应结束后即可直接肉眼观察判定结果；
d.结果判定：
1)阴性对照样品管反应结束后颜色为橘黄或者橘色，阳性对照样品管变为粉红色，若二者均成立才可判定试验成立，否则试验无效；
2)试验成立时，若待检样品管颜色变为和阳性对照样品管颜色一致或接近的粉红色则判为阳性。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| CN201910511586.0A CN110305984A (zh) | 2019-06-13 | 2019-06-13 | 一种非洲猪瘟病毒的可视化lamp检测试剂盒 |
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| CN201910511586.0A CN110305984A (zh) | 2019-06-13 | 2019-06-13 | 一种非洲猪瘟病毒的可视化lamp检测试剂盒 |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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