CN111548918A - 一种能实现多体系兼容的全封闭一体式反应管 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种能实现多体系兼容的全封闭一体式反应管；包括管体和位于顶部可以开启的管盖，在管体中部设有温变相固体隔离层；所述管体被温变相固体隔离层分割形成第一腔室和第二腔室；所述温变相固体隔离层中间设有加样孔，所述加样孔为倒置的圆台体通道。温变相固体隔离层采用复合石蜡隔离层，随着温度的升高，温变相固体隔离层熔化，第一腔室和第二腔室的反应体系混合。本发明操作便捷，制作简单，隔离层性质稳定，兼容性强，适合于多体系的一管式反应。

Description

一种能实现多体系兼容的全封闭一体式反应管
技术领域
本发明属于生物实验仪器技术领域，涉及一种能实现多体系兼容的全封闭一体式反应管；尤其涉及一种可有效防止组分蒸发和核酸扩增产物外泄，避免气溶胶污染的能实现多体系兼容的全封闭一体式反应管。
背景技术
随着基因扩增技术的不断发展以及新型核酸酶的挖掘应用，多种反应体系的组合应用越来越广泛，例如RNA逆转录和PCR的联合反应、等温扩增技术和Argonaute蛋白的联合反应、RPA(重组酶聚合酶扩增技术)与CRISPR-Cas13蛋白的联合反应等。但是，大部分的体系之间由于反应条件不同、组分兼容性低，往往不能在同一个反应管中进行不开盖的全封闭反应，易造成核酸污染，且操作繁琐，时间较长。为此，国内外一些研究者也提出把基因芯片与微流体技术相结合，来实现所有操作过程的一体化，但由于这种芯片制备困难，并需要研制专门的反应器与之配套，故其成本很高，操作难度较大。
现有专利文献CN101787347公开了一种通过温度控制反应进程的反应管；该专利需要两步操作，也就是在第一步反应时间到了后立即倒转反应管并混匀。在实际应用中，通常第一步反应体系需要设置一个固定的反应时间(超过反应时间可能导致实验失败)，操作人员必须在固定的时间点按时进行反应管倒转混匀，这增大了人为因素的干扰，也增加了人为失误带来的风险。
因此，本领域仍然需要一种操作简便、快速、成本低廉并且能够有效避免核酸扩增过程中的污染的方法和装置。为此，本发明提供了一种能实现多体系兼容的全封闭一体式反应管。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能实现多体系兼容的全封闭一体式反应管。该全封闭一体式反应管使用方便，制作简单，隔离层性质稳定，兼容性强，适合于多体系的一管式反应。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明涉及一种反应管，包括管体6和位于顶部可以开启的管盖7，温变相固体隔离层3位于管体的中部，将管体分割为第一腔室1和第二腔室2，温变相固体隔离层3中间设有(用于加入反应液的)加样孔4，所述加样孔4为倒置的圆台体通道。当管盖7盖上后，形成相对封闭的上下两个腔体。
作为本发明的一个实施方案，所述加样孔4的上孔径范围为0.8～1.1mm，下孔径范围为0.6～0.8mm。
该反应管的简易制作方法为:将一个空的PCR管放置于95℃的金属浴中，在管体7中依次加入去核酸酶的超纯水、加热熔化的温变相固体(如液体复合石蜡)材料，取出PCR管，待凝固后形成温变相固体隔离层3，使用但不限于使用超细吸头刺穿温变相固体隔离层3吸出超纯水，将反应管放置于真空离心浓缩仪中蒸发残留的超纯水，即制作完成。作为优选，该反应管的制作需在净化的超净工作台中完成。
作为本发明的一个实施方案，所述加样孔4上设置可活动的球状封闭装置5。
作为本发明的一个实施方案，所述球状封闭装置5的直径与所述加样孔4的上孔径相适配。所述球状封闭装置5的直径为0.8～1.1mm。更优选，加样孔4的上孔径为1mm，下孔径为0.8mm；所述球状封闭装置5的直径为1mm。
作为本发明的一个实施方案，所述球状封闭装置5采用密度范围为1.2～6g/cm3，选用的材质包括但不限于类似理化性质的材料，例如硅酸锆、氧化锆、复合锆、氧化铝、氧化硅等。
作为优选，所述球状封闭装置5采用密度为3.5～4.5g/cm3的硅酸锆球状封闭装置。更优选，采用密度为4g/cm3的硅酸锆球状封闭装置。是一种化学稳定性较好的规则圆球体的高密度硅酸锆球状封闭装置，具有良好的耐磨性。
作为本发明的一个实施方案，所述温变相固体隔离层3的厚度为2～3mm；所述温变相固体的熔点为65～85℃，熔化后为透明液体。
作为本发明的一个实施方案，所述温变相固体隔离层3材料包括但不限于复合石蜡、松香、聚乙烯蜡、棕榈蜡、地蜡、热熔胶、聚氟乙烯。所述温变相固体隔离层3优选为复合石蜡隔离层。
作为本发明的一个实施方案，所述管体6的下端面为圆弧面。更优选，所述管体6包括管状的主体和与主体相连接的锥形底，锥形底的下端面为圆弧面。圆弧面的底部有利于球状封闭装置5的流动。
作为本发明的一个实施方案，所述管盖7与管体6为分体式结构。
作为本发明的一个实施方案，所述管体6采用聚丙烯管体；所述管盖7采用聚丙烯管盖。
作为本发明的一个实施方案，所述管盖7的下部设有朝外的环形凸起。环形凸起进入管体6内时，管壁对环形凸起起挤压作用，提高密封性。
作为本发明的一个实施方案，所述第二腔室2容量为20～50μl。更优选，所述第二腔室2容量为50μl。
作为本发明的一个实施方案，所述管体6容量为190～210μl。更优选，所述管体6容量为200μl。
作为本发明的一个实施方案，所述第二腔室2容量为20～30μl时，由于液面张力作用，可以选择不加入球状封闭装置5。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1)在同一管内进行两个体系的反应，整个过程是全封闭的，且在温变相固体隔离层覆盖下完成，无需加热盖，无需加额外加矿物油等封闭液，可有效防止组分蒸发和核酸扩增产物外泄，避免气溶胶污染，并且可有效避免核酸扩增与检测过程中的污染；
2)操作简便、快速：中途无需通过移液、离心、震动、倒转反应管或其他方式，使两种反应体系混合，大幅减少操作步骤和实验时间；
3)成本低廉，无需价格高昂的额外试剂和精密仪器；
4)可在普通实验室自行完成制作，且制作简单，成本极低，无需设计模具、委托生产；
5)本装置只需全程一步操作，无需反应中途通过移液、离心、震动、倒转反应管，也无需依靠其他仪器设备或外力实现不同大系的混匀，避免了人为因素的干扰。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为本发明一个实施例的三维结构示意图；
图2为本发明一个实施例的侧视结构示意图；
图3为图2所示管体部分的侧面剖视结构示意图；
图4依次为加入反应体系前、加入反应体系后、反应结束后的状态；
图5为本发明应用于在便携式恒温荧光检测仪的检测结果；
其中，1为第一腔室，2为第二腔室，3为温变相固体隔离层，4为加样孔，5为球状封闭装置，6为管体，7为管盖。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学术语及技术名词具有本领域科研技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的分子生物学、酶学、免疫学实验室操作均为相应领域内广泛使用的常规操作。同时，为了更好地理解本发明的内容，以下提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的，术语“PCR”应从广义上来理解，其包括从一切基于PCR(聚合酶链式反应)的基因扩增方法，包括且不限于反转录PCR、荧光定量PCR、不对称PCR、巢式PCR等。
如本文中所使用的，术语“等温扩增”是指在恒定不变的温度下对目标基因进行扩增。
如本文中所使用的，术语“全封闭一体式”是指，当第一腔室和第二腔室被固体隔离层分割后，并分别加入不同的反应体系，共同构成一个完整封闭的管体。
实施例1
如图1、图2和图3所示的一种反应管，包括管体5和管体相匹配的管盖7，管盖7与管体6为分体式结构，由聚丙烯材料制成，管体包括管状的主体和与主体相连接的锥形底，锥形底的下端面为圆弧面，管盖7的下部设有朝外的环形凸起，环形凸起进入管体6内时，管壁对环形凸起起挤压作用，提高密封性。管体6被温变相固体隔离层3分割为保存反应液的第一腔室1和完成反应的第二腔室2两个腔体，第二腔室2位于第一腔室1的下方，第二腔室的最大容量为50μl，能满足绝大部分反应体系容量。温变相固体隔离层3的材质为复合石蜡材料，厚度约为2mm，溶化后为透明液体，不影响反应过程中的荧光值读取，且可作为反应的密封层，避免交叉污染。温变相固体隔离层3正中间有用于加入反应液的加样孔4，加样孔4为倒置的圆台体，上孔径约为1mm，下孔径约为0.8mm，能够保证使用0.2-20μl吸头加样至第二腔室2。加样孔上方有可活动的球状封闭装置5，由于是球体，球状封闭装置5可被吸头挪动，以打开或关闭加样孔4，球状封闭装置5为直径1mm化学稳定性较好的硅酸锆珠，密度为4g/cm3，具有良好的耐磨性。在第二步反应中，当温变相固体隔离层3熔化后，球状封闭装置5掉入第二腔室2，同时上下反应体系混合，球状封闭装置5掉落过程中的滚动，也有利于反应体系的充分混匀。当管盖7盖上后，即形成相对封闭的上下两个腔体。
在实际应用中，发现如果在下面腔体容量很小的情况下，不加硅酸锆珠上面腔体的溶液由于张力也不会掉下来。如以下实施例2。
实施例2
一种反应管，包括管体和管体相匹配的管盖，管盖与管体为分体式结构，由聚丙烯材料制成，管体包括管状的主体和与主体相连接的锥形底，锥形底的下端面为圆弧面，管盖的下部设有朝外的环形凸起，环形凸起进入管体内时，管壁对环形凸起起挤压作用，提高密封性。管体被温变相固体隔离层分割为保存反应液的第一腔室和完成反应的第二腔室两个腔体，第二腔室位于第一腔室的下方，第二腔室的最大容量为50μl，能满足绝大部分反应体系容量。温变相固体隔离层的材质为复合石蜡材料，厚度约为2.5mm，溶化后为透明液体，不影响反应过程中的荧光值读取，且可作为反应的密封层，避免交叉污染。温变相固体隔离层正中间有用于加入反应液的加样孔，加样孔为倒置的圆台体，上孔径约为1mm，下孔径约为0.8mm，能够保证使用0.2-20μl吸头加样至第二腔室。在第二步反应中，当温变相固体隔离层熔化后，第一腔室反应体系掉入第二腔室，上下反应体系混合。当管盖盖上后，即形成相对封闭的上下两个腔体。
实施例3
一种能实现多体系兼容的全封闭一体式反应管，在SARS-CoV-2核酸等温扩增荧光检测中的实施方法：
步骤1.选取所述全封闭一体式反应管，配制LAMP等温扩增反应体系10μl，体系包括6条特异性引物、Bst酶、耐热逆转录酶、Bst Buffer、MgSO4、dNTP、ddH2O、SARS-CoV-2病毒RNA核酸模板或合成质粒模板，将混匀的等温扩增反应体系通过加样孔加入第二腔室，瞬时离心。
6条特异性引物序列为：
F3 TGTTCTTGCTCGCAAACA(SEQ ID NO.1)
B3 GTGTTGTAAATTGCGGACAT(SEQ ID NO.2)
FIP ACACATGACCATTTCACTCAATACT-AGCTTGTCACACCGTTTC(SEQ ID NO.3)
BIP CATTTGTCAAGCTGTCACGGC-GCAATTTTGTTACCATCAGTAG(SEQ ID NO.4)
LF CACTCATTAGCTAATCTATA(SEQ ID NO.5)
LB CAATGTTAATGCACTTTT(SEQ ID NO.6)
等温扩增体系为：
Figure BDA0002490911470000061
步骤2.配制基因编辑荧光检测体系40μl，体系包括基因编辑酶、Bst Buffer、guide DNA、荧光探针、MnCl2、ddH2O，将荧光检测体系沿管壁加入第一腔室，由于液面张力的作用，等温扩增反应体系不会掉入第二腔室，盖上管盖；
guide DNA、荧光探针序列为：
Figure BDA0002490911470000071
荧光检测体系为：
Figure BDA0002490911470000072
步骤3.在恒温荧光检测仪或荧光PCR仪中设置反应程序，第一步为等温扩增反应，62℃，30分钟，第二步为基因编辑荧光检测，95℃，30分钟。在第二步反应开始阶段温变相固体隔离层熔化，荧光检测体系掉落与第一反应的扩增产物混合。图4依次显示加入反应体系前、加入反应体系后、反应结束后的状态。
步骤4.在第二步反应期间实时读取荧光值，判定结果:如图5所示，1-6为已知的浓度递减的SARS-CoV-2核酸样本，7、8为阴性对照，1-5浓度梯度检测结果为阳性。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 能实现多体系兼容的全封闭一体式反应管
<130> DD08588
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgttcttgct cgcaaaca 18
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtgttgtaaa ttgcggacat 20
<210> 3
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acacatgacc atttcactca atactagctt gtcacaccgt ttc 43
<210> 4
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
catttgtcaa gctgtcacgg cgcaattttg ttaccatcag tag 43
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cactcattag ctaatctata 20
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caatgttaat gcactttt 18
<210> 7
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ttgatgaggt tccacc 16
<210> 8
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tcagttgtgg catctc 16
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cagttgtggc atctcctgat gaggttccac 30

Claims (10)

1.一种一体式反应管，包括管体(6)和位于顶部可以开启的管盖(7)，其特征在于，在管体(6)中部设有温变相固体隔离层(3)；所述管体(6)被温变相固体隔离层(3)分割形成第一腔室(1)和第二腔室(2)；所述温变相固体隔离层(3)中间设有加样孔(4)，所述加样孔(4)为倒置的圆台体通道。
2.根据权利要求1所述的一体式反应管，其特征在于，所述加样孔(4)的上孔径范围为0.8～1.1mm，下孔径范围为0.6～0.8mm。
3.根据权利要求1或2所述的一体式反应管，其特征在于，所述加样孔(4)上设置可活动的球状封闭装置(5)。
4.根据权利要求3所述的一体式反应管，其特征在于，所述球状封闭装置(5)的直径与所述加样孔(4)的上孔径相适配。
5.根据权利要求3所述的一体式反应管，其特征在于，所述球状封闭装置(5)采用的材质选自密度范围为1.2～6g/cm3的硅酸锆、氧化锆、复合锆、氧化铝、氧化硅。
6.根据权利要求1所述的一体式反应管，其特征在于，所述温变相固体隔离层(3)的厚度为2～3mm；温变相固体的熔点为65～85℃，熔化后为透明液体。
7.根据权利要求1所述的一体式反应管，其特征在于，所述温变相固体隔离层(3)材料包括复合石蜡、松香、聚乙烯蜡、棕榈蜡、地蜡、热熔胶、聚氟乙烯中的一种或几种。
8.根据权利要求1所述的一体式反应管，其特征在于，所述管体(6)的下端面为圆弧面。
9.根据权利要求1所述的一体式反应管，其特征在于，所述管盖(7)的下部设有朝外的环形凸起。
10.根据权利要求1所述的一体式反应管，其特征在于，所述第二腔室(2)容量范围为20～50μl；所述管体(6)总容量范围为190～210μl。
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