CN113373202A - 防污染单管核酸恒温扩增检测系统 - Google Patents

防污染单管核酸恒温扩增检测系统 Download PDF

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CN113373202A CN202010160768.0A CN202010160768A CN113373202A CN 113373202 A CN113373202 A CN 113373202A CN 202010160768 A CN202010160768 A CN 202010160768A CN 113373202 A CN113373202 A CN 113373202A
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Abstract

本发明公开了一种可以简便快速检测核酸样本的恒温扩增检测系统，可以实现在同一反应管中进行核酸释放及恒温扩增和探针荧光信号检测，整个过程在5‑15min内即可完成。检测管内包含样本核酸裂解释放的缓冲体系、扩增所需要的酶及其所适应的缓冲体系和必需的盐离子，其中部分组分被常温下固体石蜡完全分隔开。在整个检测过程中，仅需加入待测样品而不需要反复开管加入其它反应试剂。相对于已有的恒温扩增检测技术，本发明的单管恒温扩增检测方法极大地降低了操作过程和复杂性，更加节省时间，还可有效避免气溶胶的产生，极大方便了实验人员操作。

Description

防污染单管核酸恒温扩增检测系统
技术领域
本发明涉及基因工程及分子生物学领域，更具体地说，涉及一种单管式自封避防污染的恒温扩增核酸检测方法。
背景技术
病原体检测方法有多种技术可以实现，其中最常见的方法包括两类，一类是采用免疫法直接检测抗原蛋白，或者检测由机体分泌产生针对侵入病原体特定抗原的抗体(IgG或IgM)；另一类则是通过检测病原体核酸来确定待检微生物存在与否。其中，核酸因为可以在体外通过多种扩增技术迅速得到数百万至上亿倍的特异性区段扩增产物，而且核酸作为生物体的遗传物质，是物种区分的主要依据。因此核酸扩增检验技术，即为通俗意义的分子诊断技术，在临床检验和生命科学领域获得越来越多的应用。核酸体外扩增技术主要有传统变温PCR(聚合酶链式反应)技术和等温扩增技术，如LAMP(环介导等温扩增技术)、TMA(转录介导的扩增技术)、RPA(重组酶聚合酶扩增技术)等技术。
传统PCR技术是指利用DNA聚合酶通过物理热变性与退火延伸循环的方式，实现DNA 模板数亿倍的扩增，再通过将PCR产物凝胶电泳分析获得结果；在此基础之上，发展出了基于荧光嵌合染料、荧光探针或者其它电化学方法，将DNA的扩增和检测同步整合实现了实时定量检测技术(Q-PCR)。Q-PCR方法更快、更灵敏，无需电泳即可提供实时数据。这类检测技术虽应用较为广泛，但依然存在一些限制实际应用的问题，包括所需检测仪器非常精密，价格较为昂贵，且体积偏大，不易移动；另外对待测样本的纯度和质量要求较高，核酸提取步骤较为复杂。随着芯片和精密仪器加工工艺技术的进步，核酸提取与PCR扩增一体化成为分子诊断发展的重要趋势之一。其中国际上重要代表产品包括罗氏诊断的
Figure BDA0002405705280000011
系统，赛沛诊断的
Figure BDA0002405705280000012
系统，生物梅里埃的
Figure BDA0002405705280000013
系统等。尽管通过这些系统操作非常简便，但因仪器和相应试剂耗材生产加工工艺复杂也必然导致较高检测成本和检测场景的局限。且基于物理方法实现的传统热变性扩增技术，且聚合酶无法实现连续不间断合成，因而时间上已经较难实现继续突破。
恒温扩增技术是通过链置换DNA聚合酶或者解旋酶等酶的作用下，对DNA双链进行解链并实现扩增，比较典型的代表如LAMP、TMA、RPA等技术，这类技术无需传统PCR的热循环条件。LAMP是利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNApolymerase)在等温条件下，扩增核酸的技术，具有效率高、特异性强、速度较快等特点。用4或6条引物，在63-65℃条件下反应60min，即可通过浊度或荧光值来检测产物。TMA是利用MMLV逆转录酶(Moloney MurineLeukemiaVirus Reverse Transcriptase)和T7 RNA聚合酶的共同作用，在等温条件下来扩增核酸的技术，最终产物是单链RNA分子，比DNA分子的后续处理简单。英国TwistDx 公司开发的RPA技术在反应的过程中主要利用三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。该反应体系一般需要ATP供能，所以还存在磷酸肌酶参与ATP的循环。该技术的反应温度在37-42℃，整个反应速度相当快速，20分钟即可完成扩增，且具有很高的灵敏度。另外，核酸等温扩增技术还包括NASBA (Nuclear acidsequence-based amplification，核酸依赖性扩增检测技术)，HDA (Helicase-dependentamplification.pdf解链酶扩增),SDA(strand displacement amplification，链置换扩增技术)等等。
在几乎所有的核酸扩增技术中，均具有多种必不可少的组份：具有DNA/RNA聚合酶(模板为RNA时需要反转录酶)，如Taq DNA聚合酶，其它辅助性功能酶或蛋白(如单链结合蛋白SSB，解旋酶，缺口酶，限制性内切酶)；提供能够提供聚合酶等较高活性的缓冲体系(buffer环境)；单条引物或上下游引物，或者多组引物组合，以及相应的探针(或嵌入性染料/电化学分子)等；核苷酸单体底物dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)等；提供酶促反应必需的激活阳离子(Mg2+或Mn2+等)；以及待检测的目标核酸(通常经过提纯或粗裂解的 DNA/RNA)。整个过程，所涉及到的缓冲液及成分较多且复杂，因此操作及其不便，尤其对于核酸的提纯过程，导致成为限制分子诊断发展的一个重要瓶颈问题。
因此科学家们也不断地探索将多种试剂通过一定方式实现合并，尽可能在同一管中实现反应与检测。同时，在扩增后防止气溶胶污染，保证结果的准确可靠性，也是分子诊断行业重要的考虑因素。
“单管法”的概念是指简化核酸提取与核酸扩增过程，并在在单管中完成，最大限度地减少操作步骤。最初的单管法核酸扩增技术只是侧重于扩增试剂的单管存储与反应液保存，P, Tilston在1993年使用蜡质界面分离逆转录与PCR试剂，将逆转录与PCR步骤结合在一个反应管中，简化了HCV RNA的检测。CN101302560A(2007)中先在PCR反应管中完成乙肝病毒的核酸提取，再将其他反应试剂加入到管中进行q-PCR。Meredith等(2012)通过显微解剖分离收集目标细胞，裂解细胞后直接在同一管进行核酸扩增。上述研究最大限度地减少了通过液体转移而丢失的核酸，也在一定程度上提高了灵敏度，降低了污染的可能性，但是均需要完成复杂的核酸提取过程，然后反复转移其他扩增试剂进入反应管，并非严格意义的“单管法”操作。
为了防止PCR反应试剂的蒸发和产物的污染，最初人们用矿物油作为覆盖物，但微量的矿物油在扩增悬浮液中已被证明会降低PCR后处理的效率，因此后来大部分都使用蜡或其他低粘附性的疏水性物质用于覆盖反应试剂。US005565339A(1994)中也提到使用脂或蜡替代矿物油，分隔PCR试剂的各个组分，防止蒸发，减少微生物对组分的消耗，防止反应Mix的活性降低，利于试剂的存储，另外，还可以防止气溶胶的产生。
目前，已有传统PCR、RT-PCR和q-PCR的部分核酸检测项目引入了利用石蜡实现“单管法”扩增技术的操作方式。CN1804035A(2005)公开了一种单管一步三引物RT-PCR方法，将PCR引物用熔点为65-85℃的石蜡包埋，与反转录引物分开，实现反转录与cDNA扩增在单管内闭盖完成，但该方法对引物的设计要求非常严格。CN101665816A(2009)中使用熔点在27-38℃的混合石蜡，隔离PCR反应液中酶与其他成分，制成一种易于保存的PCR扩增试剂盒。WO2011131192A1(2011)用石蜡将预扩增Mix与q-PCR Mix分隔开，将样本加入到位于上层的预扩增Mix先进行低温预扩增16h，再进行q-PCR，从而提高灵敏度，但整个过程耗时太长。上述发明都在一定程度上对核酸扩增的操作步骤进行了简化，但未涉及核酸提取，实际上只是转录扩增反应的“单管法”，而未能实现核酸提取和扩增反应两个步骤在一管中完成。CN105420416A(2009)利用不同熔点的石蜡油混合物对热启动DNA聚合酶、PCR扩增反应液和核酸裂解液分别进行包装，得到含有热启动DNA聚合酶、PCR扩增反应液和核酸裂解液的PCR扩增管，可立即使用也可封装后冷藏保存。该发明只需要将样本加入扩增管，后续无需再开盖，大大降低了实验操作的复杂程度，很有推广意义，但反应前需要两次加热，然后混匀，离心后才可以上机，而且较于等温扩增，q-PCR耗时长，仪器昂贵。
在恒温扩增实现单管扩增技术方面公布的文献或专利较少，CN 102703431 A专利公布了一种用石蜡保护酶成分的方法，并将引物、反应液等进行分离存储，以确保酶的稳定性； CN206970629U(2017)公开了一种石蜡分隔式环介导反应管装置，针对LAMP技术，在反应管管盖上设计了储存不耐高温冻干聚合酶的凹槽，用石蜡封存，避免对样本模板和引物高温处理时造成酶失活，在退火时，倒置反应液，融化石蜡，混匀，即可反应。该发明在不降低聚合酶活性的前提下，减少了开盖加酶的步骤，但样品处理及其他扩增组分的添加还需分步进行，该技术耗时仍然较长。而其他恒温扩增技术目前还是需要经历多管转移加样的过程，还未实现真正的“单管法”操作。而且，目前用于核酸扩增的仪器一般没有预混功能，所以还需要水浴锅、金属浴仪器、涡旋震荡仪等其他仪器配合使用，所以对实验室环境要求及检测人员的操作细节要求较高。
链置换扩增技术(strand displacement amplification,SDA)是基于限制性内切酶及DNA 聚合酶反应的体外扩增方法，通过将靶序列DNA两端引入限制性内切酶识别序列，并采用alpha-thio dATP替代dATP，在新合成的DNA链中含引入修饰的dATP[aS]无法被限制性内切酶切割，而只发生在双链中的无修饰的、原始DNA链或引物引导的合成链，因而形成DNA 单链缺口，在DNA聚合酶作用下，进行缺口延伸反应，扩增产物通过双向延伸实现指数级增长扩增。随着单链缺口限制性内切酶(又称切口酶)的发现，人们逐步用其替代双链限制性内切酶和修饰的单核苷酸方法。2000，New England Biolabs,Inc.科学团队建立了以Nt. BstNBI缺口酶和Bst DNApolymerase为基础的扩增反应，并分别证明了其它缺口酶如Nt.AlwI N.MlyI,BbvCI#2-12和#1-35同样可以应用于双链扩增(WO01/94544A2)。鉴于DNA聚合酶具有一定的Ab initio(起始)合成的能力，而限制性内切酶或缺口酶同时存在时极大促进这种非特异合成作用。而这种非特异的Ab initio扩增产物的合成，成为了限制利用这两类酶进行核酸扩增的重要因素。Van NessJ.等2003以DNA聚合酶和缺口酶为扩增体系的EXPAR (exponential amplification reaction)检测试验，但扩增中发现无法排除非特异扩增或假阳性现象。Traci Kiesling等2007利用Nt.Alw I和Nt.BstNBI与DNA聚合酶进行扩增检测反应，并将其命名为NESA扩增技术。Jianwei Jeffery Li等2008年也采用N.BbvcIA,N.Bbvc IB and N.BstNB I进行了类似扩增检测。Tan E.通过实验发现在DNA聚合酶和dNTPs及引物混合前预先55℃预热5分钟会有利于非特异性扩增产物减少。Brain K.Maples等利用Nt.BstNBI等与DNA聚合酶进行扩增检测反应，并通过质谱、凝胶电泳等方式验证扩增产物，(参考专利： US2009017453A1、US2014072978A1、US2018023130A1)。Simon R.G.,设计了一个简单的反应装置(patent：US9352312,US15141190,US20190039059A1)，尝试通过仪器实现预加热后试剂混合，但依然需要至少两个独立腔体分别存储不同的试剂。
发明内容
本发明提供了一种可利用普通的离心管或PCR管，或同类简单容器，不需要复杂的微流控装置或复杂的模块化设计，即可实现单管法基于缺口延伸的恒温扩增检验技术，可广泛适用于多种类型样本的核酸检测，包括口腔拭子/鼻咽拭子/生殖道拭子、培养细胞、培养菌体、血清、组织、病毒培养液等，整个检测耗时非常短，且操作极其简便。
本发明提供的技术方案，将切口酶聚合酶等扩增反应所必须的酶类、及酶的存储液、扩增所需要的引物探针、dNTPs、扩增反应液、二价阳离子(镁离子或锰离子)及核酸释放剂等所有试剂组分，预先放置于同一个管中，通过石蜡的分层密封设计为试剂的储存、运输及不同步骤的反应提供了便利，防止含酶反应液的挥发与氧化，也极大地降低了交叉污染风险；另外，将扩增所需要的酶类、引物探针及二价阳离子(Mg2+或Mn2+等)等组分适当分隔，也有利于降低非特异性扩增，降低检测反应的假阳性率。同时，扩增后石蜡层自动上浮于反应液上方，在温度下降凝固后，可自然将反应液封闭在试剂管底部，防止气溶胶产生，避免了后续可能造成的交叉污染。该技术不需要精密昂贵的仪器、复杂的样品核酸提取等处理步骤和多次开管多步加样操作步骤，只需要将适量生物样本加入到反应管中，处理1-3分钟左右，即可上机进行实时荧光检测(或通过水浴锅恒温反应，并通过荧光终点扫描)，整个过程约15分钟内即可得到检测结果。
为了便于描述，本发明单管恒温扩增检测体系中所使用的试剂分为以下四类。
A组分，在本发明中也称酶体系，包括反应所必须的酶以及能够保持酶活性的存储及反应缓冲液。适合于本发明的酶包括单链缺口酶和DNA聚合酶的混合物，如待检测核酸样本为RNA，还需包括RNA反转录酶。其中所述DNA聚合酶选自如Geobacillus bogazici DNA聚合酶,Bst(大片段)DNA聚合酶,Manta 1.0DNA聚合酶
Figure BDA0002405705280000051
等DNA聚合酶及其突变体中的一种或两种以上的混合物。所需单链缺口酶选自Nb.BtsI,Nt.AlwI,Nt.BspQI,Nb.BssBI,Nb.BbvCI,Nb.BsmI,Nb.BsrDI,Nb.BtsI,Nt.AlwI,Nt.BbvCI,Nt.BstNBI,Nt.CviPII,Nb.Bpu10I,Nt.Bpu10I and N.BspD61.中的一种或两种以上的混合物；RNA反转录酶选自如MMLV(Moloney Murine LeukemiaVirus Reverse Transcriptase)，AMV(AvianMyeloblastosis Virus Transcriptase)中的一种或两种以上的混合物。为进一步提高反应效率和检测的特异性，还可在上述酶体系中进一步添加防止污染的酶，如尿嘧啶糖苷酶UNG/UDG酶，或嗜冷尿嘧啶糖苷酶codUNG，双链特异性DNA酶HL-dsDNase(ArcticZymes)中的任意一种或两种以上的混合物。保持酶活性的存储及反应缓冲液包括Tris-Cl，Na+，K+或Cs+等单价阳离子， Tritonx-100，DTT，Tween-20等试剂，优选地，缓冲液PH范围为7.0-8.5。
B组分，在本发明中也称引物/探针体系，包括引物和荧光探针或引物和荧光嵌入染料。
C组分在本发明中也称dNTPs体系，包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP，如需要额外增加防止污染的试剂，则可进一步包含dUTP。
D组分在本发明中也称核酸释放体系，包括样本裂解或称核酸释放剂及二价阳离子 (Mg2+或Mn2+)，核酸释放体系优选PH范围为2.0-4.0或者8.0-11.0，以便于样本灭活和裂解释放。
本发明一种实施方案为：
(1)将A组分与D组分分别置于石蜡层的下部和上部；B组分和/或C组分的一种和/或几种和/或全部组分可以任意搭配，置于石蜡封装层的下部，即与A组分混合；或者置于固体石蜡封装层的上部，即与组分D混合；或者可以将组分B和/或组分C的一种和/或几种和/或全部组分与石蜡进行包埋，封装在石蜡层中间。
(2)步骤(1)采用的石蜡熔点为35～52℃，优选地，采用熔点为38～50℃的石蜡，再优选地，采用熔点为38～45℃的石蜡。
以上试剂便可作为单管扩增试剂成分，使用时，直接加入适量的待测样品，将试剂管放入45～58℃度恒温扩增仪或恒温水浴中内进行反应，反应结束后进行荧光检测。
例如，在一种实施方式下，
(1)将由A组分，B组分和C组分组成的反应体系加入试剂管管底；
(2)用熔点35～52℃的固态石蜡混合物覆盖，待石蜡冷凝；
(3)向凝固的石蜡封装层上部加入D组分；
在另外一种实施方式下，
(1)将A组分加入试剂管管底；
(2)用熔点35～52℃的固态石蜡混合物覆盖，待石蜡冷凝；
(3)向凝固的石蜡封装层上部加入B组分、C组分和D组分；
在第三种实施方式下，
(1)将A组分和B组分加入试剂管管底；
(2)用熔点35～52℃的固态石蜡混合物覆盖，待石蜡冷凝；
(3)向凝固的石蜡封装层上部加入C组分和D组分；
在第四种实施方式下，
(1)将A组分和C组分加入试剂管管底；
(2)用熔点35～52℃的固态石蜡混合物覆盖，待石蜡冷凝；
(3)向凝固的石蜡封装层上部加入B组分和D组分；
在第五种实施方式下，
(1)将A组分加入试剂管管底；
(2)用熔点35～52℃的固态石蜡混合物覆盖，同时向石蜡层中注射加入B组分和 C组分，待石蜡冷凝；
(3)向凝固的石蜡封装层上部加入D组分；
在第五种实施方式中，也可以将A组分与B或者C组分混合加入试剂管管底，在石蜡层中注射入C组分或B组分，最后将D组分加到凝固的石蜡封装层上部；还可以将A组分加入试剂管管底，在石蜡层中注射入B组分或C组分，最后将C组分或B组分与D组分混合加到凝固的石蜡封装层上部。
在本发明的另一种实施方案下，可以将B组分中的成分分别与A或D组分混合，C组分可以选择加入A组分，也可以选择加入D组分，然后通过石蜡封装层进行分隔；
例如在一种实施方式下，
(1)将A组分和B组分的中探针混合加入试剂管反应管管底；
(2)用熔点35～52℃的石蜡覆盖；待石蜡冷凝；优选地，采用熔点为38～50℃的石蜡，再优选地，采用熔点为38～45℃的石蜡；
(3)向凝固的石蜡封装层上部加入D组分、B组分中的上下游引物和C组分；
在第二种实施方式下，
(1)将A组分和B组分的中上下游引物混合加入试剂管反应管管底；
(2)用熔点为35～52℃的石蜡覆盖；
(3)向凝固的石蜡封装层上部加入D组分、B组分中的探针和C组分；
在第三种实施方式下，
(1)将A组分、C组分和B组分中的上下游引物混合加入试剂管反应管管底；
(2)用熔点为35～52℃的石蜡覆盖；
(3)向凝固的石蜡封装层上部加入D组分和B组分中的探针；
在第四种实施方式下，
(1)将A组分、C组分和B组分中的探针混合加入试剂管反应管管底；
(2)用熔点为35～52℃的石蜡覆盖；
(3)向凝固的石蜡封装层上部加入D组分和B组分中的上下游引物；
在第五种实施方式下，
(1)将A组分，B组分中的上游引物混合加入试剂管反应管管底；
(2)用熔点为35～52℃的石蜡覆盖；
(3)向凝固的石蜡封装层上部加入D组分、B组分的下游引物与嵌合荧光染料和C组分；
在第六种实施方式下，
(1)将A组分、C组分和B组分中的上游引物混合加入试剂管反应管管底；
(2)用熔点为35～52℃的石蜡覆盖；
(3)向凝固的石蜡封装层上部加入D组分和B组分的下游引物与嵌合荧光染料；
在第七种实施方式下，
(1)将A组分，B组分中的下游引物与嵌合荧光染料混合加入试剂管反应管管底；
(2)用熔点为35～52℃的石蜡覆盖；
(3)向凝固的石蜡封装层上部加入D组分、B组分中的上游引物和C组分；
在第八种实施方式下，
(1)将A组分、C组分和B组分中的下游引物与嵌合荧光染料混合加入试剂管反应管管底；
(2)用熔点为35～52℃的石蜡覆盖；
(3)向凝固的石蜡封装层上部加入D组分和B组分中的上游引物；
以上各实施方式反应管中的试剂便可作为单管扩增试剂成分，使用时，直接加入适量待测样品，将试剂反应管放入45～58℃恒温扩增仪或恒温水浴中内进行反应检测。
本发明使用的石蜡，又称晶形蜡，碳原子数约为18～30的烃类混合物，主要组分为直链烷烃(约为80％～95％)，还有少量带个别支链的烷烃和带长侧链的单环环烷烃(两者合计含量 20％以下)。石蜡是从原油蒸馏所得的润滑油馏分经溶剂精制、溶剂脱蜡或经蜡冷冻结晶、压榨脱蜡制得蜡膏，再经脱油，并补充精制制得的片状或针状结晶。根据加工精制程度不同，可分为全精炼石蜡、半精炼石蜡和粗石蜡3种。每类蜡又按熔点，一般每隔2℃，分成不同的品种，如52，54，56，58等牌号。石蜡的熔点是本发明的一个重要参数，本发明通常采用熔点为35～52℃的石蜡进行封装处理；优选地，采用熔点为38～50℃的石蜡，再优选地，采用熔点为38～45℃的石蜡。本发明提供了一种简单的调节不同熔点的石蜡的方法，可以将商品化购置的固体石蜡高温融解后与液体石蜡按一定体积混匀，即可调制出不同熔点的石蜡。
石蜡为惰性物质，不会影响PCR反应，其在高于熔点的温度下呈液态，且因密度低于水，会浮于扩增反应试剂上层。所有用于封装分层的石蜡的熔点要低于实际扩增反应的温度。扩增酶类也可以单独封在管底，扩增缓冲液分隔在中部，扩增缓冲液与核酸释放剂之间的封装石蜡熔点应较低，覆盖扩增酶类的封装石蜡熔点较高，其熔点温度可以较上述封装缓冲液的石蜡高1-10℃，优选地，高3-6℃，更优选地，高5℃；使酶在作用之前充分完成核酸释放剂与扩增缓冲液的混匀。每层加入的混合石蜡应保证完全覆盖住下层液体，无外溢。组分D中的阳离子盐成分(例如MgSO4，MnCl2等)，也可以用石蜡单独包装成小球。这些改变都不会影响反应时所产生的扩增效果。
本发明可采用普通的试剂管、反应管或者PCR管，优选地，采用0.1ml-15ml容积，进一步优选地，采用0.5ml-5ml容积，更优选地采用1.0-5.0ml容积。例如，本发明所述的试剂管，可以为常规的生物学实验室采用的0.1ml或0.2ml的PCR反应管，可以为0.5ml的离心管，也可以为1.5ml,2ml,4ml,5ml,10ml,15ml等离心管，或者任何可以密封使用的试剂容器。
常规的PCR扩增实验中，以采用20ul-50ul反应体系为主要形式，或者通过微流控芯片技术，使用更小体积的反应，其中一个考虑因素即为减少反应试剂，对于物理控制模块和试剂温度反应来说，可大大缩短试剂达到目标温度所需要的时间，同时还可以控制试剂成本。但本发明所基于的优先考虑，则是以试剂操作使用者，尤其本发明采用等温扩增技术，不需要频繁改变试剂温度。为获得更好操作体验和准确度，本发明优选地采用超大反应体系，如试剂反应体积为100ul-5000ul；更优选地，250ul-1000ul；综合经济实用性和操作便利性，更优选地，采用250-500ul反应体积。
本发明各种实施方式中步骤(1)至(2)需要将试剂反应管垂直放置，向管中加入液体时，可以通过离心或自然静置后通过重力得以实现分层。完成这2个步骤之后，可以封盖，制成恒温扩增单管试剂，可以在室温、4℃保存，或者-20℃长期保存一年以上，也可以直接加入待测样本进行检测。
步骤(3)中检测时所使用的恒温扩增仪的温度可根据实际扩增反应温度设定，加入样本的试剂管放入恒温扩增仪后，在反应温度下震荡3min左右，石蜡完全融化并上浮至表层。在一种实施案例中，反应温度采用52度，每30s采集一次信号值，大约需要10min即可完成反应。关于预震荡时间、信号采集时间间隔和读数过程中震荡频率的设定，可根据实际反应体积、封装石蜡体积、数据分析要求等按需要确定，反应体积大，混合石蜡多，应适当延长预震荡时间。若使用无震荡功能的扩增仪，可外部加热后震荡均匀再放回扩增仪进行反应。
在另外一种实施案例下，将所述试剂管底部混合物在加入石蜡封存前，进行冻干，以获得更为有利的试剂保存效果。例如：
(1)配制50μL预冻干扩增试剂，包括A组分、B组分、C组分试剂，于PCR反应管管底，放入冷冻干燥机中制成冻干粉；
(2)用熔点为35℃～52℃的石蜡封闭所述冻干扩增试剂于步骤(1)的PCR反应管内；
(3)待石蜡凝固后，将D组分置于PCR反应管中(D组分不冻干)；配制成冻干形式的单管检测试剂，用于接收样本并检测测试。
(4)使用时，加入待测样品，将PCR反应管放入恒温扩增仪内进行检测。
CN106457300A中提到冻干是可使生物试剂得以在室温下保持长时间稳定的一种方法，石蜡不会对冻干团块有不利影响，反而可以通过减少或防止冻干团块吸收湿气来保护冻干团块。所以为了更好地长期保存恒温扩增试剂，也可以制成单管恒温冻干扩增试剂。
步骤(1)中预冻干扩增试剂包含酶类、引物、探针、dNTPs等，将这些组分混合之后，分装，冻干，使这些组分可以在室温下保持长时间稳定。预冻干扩增试剂中最难以保存的主要是酶类，所以在有些实施例中为了降低非特异性扩增，可以只将酶冻干在管底，把引物、探针加到D组分中。
本发明还提供了使用上述试剂的单管恒温扩增检测方法，包括如下步骤：
(1)将核酸释放剂和扩增反应液各自分层包装在试剂管中，
(2)使用时加入待测样本，进行恒温扩增反应，
(3)检测荧光强度。
本发明的有益效果：
1.本发明提供了一种将核酸提取和检测在同一反应管中完成的技术方案，整个实验过程无需反复、多次开盖加样，操作简便；
2.扩增所需酶类通过石蜡等封闭，可防止氧化和失活，同时便于运输；
3.石蜡采用低温熔解温度，可作为运输与存储过程中的环境温度指示剂，在石蜡变形时，作为接触高于石蜡熔点温度和酶失活依据；
4.根据文献报道，通过将试剂隔离，在加热后再进行混合，可以有效降低Abinitio非特异起始合成扩增。
5.反应温度条件下，石蜡熔解后上浮于反应试剂上部。反应结束后，温度降低石蜡重新凝固，将反应扩增产物自然封闭，可有效防止气溶胶扩散，避免实验室被污染。
附图说明
图1为各组分在试剂管中封装分层示意图，通常A组分置于管底，通过石蜡封装层与D 组分分隔，B组分、C组分可以与A组分混合，也可以与D组分混合，也可以B组分和C组分混合被封装于石蜡层中。
图2为切口延伸反应作用原理图，在切口酶与DNA聚合酶的作用下，通过链置换反应和切口延伸反应对模板进行扩增。
图3为荧光定量PCR法对模板浓度进行测定的扩增曲线。
图4为针对梯度稀释的模板的灵敏度测试反应曲线图。
图5为终点扫描确定阴阳性扩增产物情况。
图6为实时荧光扫描检测沙眼衣原体样本的反应曲线图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更清晰，以下结合附图及具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。本发明以检测含有的样本为例，仅为具体实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
实施例1检测肺炎支原体(Mycoplasma Pneumonia)的单管式扩增试剂制备
A组分：缓冲液与酶成分，总体积47ul
成分 浓度/用量
pH8.0Tris-Cl 200mM
Tritonx-100 0.5％
DTT(二硫苏糖醇) 10mM
吐温20 0.25％
海藻糖 50mM
环糊精 0.5％
硫酸钠 100mM
CsCl 10mM
Nt.BstNBI 0.5ug
BstDNA聚合酶(外切活性) 25ug
将配制好的A组分试剂(总体积47ul)加入到0.5ml普通常用透明离心管底部。
B组分
通过NCBI搜索文献上肺炎支原体16s-23s rDNA基因，GenBank ID：CP014267.1，选取保守性和特异性区域作为目标扩增区段设计检测引物与探针。
上游引物序列MPF：5‘-TAATACTAATGAGTCGAGGACTTATTGGAAG-3’(SEQ ID No. 1)
下游引物序列MPR：5‘-CAGCGACAGAGTCACCAAACAAAAACGACA-3’(SEQ ID No.2)
探针序列MPBP：5'-Fam-CTGCGTATTTCCTACCAAAGGCTACGCAG-BHQ1-3'(SEQ IDNo.3)
将以上引物和探针用TE缓冲液稀释分别成100umol/L,将上游引物：下游引物：探针按照4:3:2的体积混合并混匀后，取1.5ul混合至管底的A组分中；
C组分，dNTPs，25mmol/L浓度，取1.5ul加至A组分中，并将ABC三组分充分混匀。
取熔点约为52℃的固体石蜡，加热至60℃熔解后，用移液器迅速取100ul加入至含混合好的A、B、C三组分水相试剂之上，并自然凝固，石蜡凝固后封闭了含A组分、B组分和C组分的下层水相试剂。
D组分
D组分总体积200ul，成分如下表所示：
Figure BDA0002405705280000111
Figure BDA0002405705280000121
将配制的试剂加入至石蜡封装层上层，盖好盖子，试剂作为单管检测核酸试剂，冷藏保存；或直接加入样本用于检测肺炎支原体病原。
实施例2采用上述单管检测试剂检测肺泡灌洗液中感染肺炎支原体样本
取20支相同的试剂管编号后用于肺炎支原体阴阳性的测试，试剂管中装有实施例1制备的检测试剂。
将10ul含有灭活的肺泡灌洗液的不同样本(n＝16)，另取4支用TE buffer替代样本分别加入到实施例1制备的试剂管中，与位于试剂管最上层的D组分震荡混匀后，将试剂管放置于有震荡功能的恒温金属浴上，恒温金属浴温度设置为55℃，震荡转速2000RPM/分钟。震荡并温度孵育5分钟后，停止震荡继续在55℃孵育10分钟反应结束。之后可通过FAM荧光读取装置(杭州奥盛仪器有限公司，型号：Fluo-100C，采用蓝光460nm波段动态扫描)，为了对比在荧光定量PCR仪器上的读值，同时将其中反应液50ul转移至200ul的PCR反应管中，通过荧光定量PCR仪器(苏州雅瑞科技有限公司，型号：MA-6000，温度设置37℃恒温,30 秒扫描一次，共5分钟)读取荧光；分析结果与阴性对照做对比，结果如下表所示：
Figure BDA0002405705280000122
实施例3
为使反应试剂更长期保存(可在冷冻条件下存放两年保持活性不受影响)，将组分A、组分B中的上下游引物进行冻干处理。试剂管采用常用0.2ml的96孔板或PCR 8联管。
配制预冻干扩增试剂，具体配方如下表(50μL反应体系)：
Figure BDA0002405705280000123
Figure BDA0002405705280000131
可配制大批量的预冻干扩增试剂，混匀后分装至PCR反应管管底，每管分装50μL，如有气泡，需要采用水平转子将离心管短暂离心后，静置。
将分装好的PCR反应管在开盖状态下放入冷冻干燥机中，冻干程序如下：
Figure BDA0002405705280000132
冻干结束后将试剂从冻干机中取出，并且快速将管盖盖紧，随后放入-20℃保存。
将探针与dNTP包埋至石蜡封装层中：
取熔点约为35℃的石蜡，加热至55℃熔解后，用移液器取约25ul(一滴)加入至含混合好的A组分、B组分中引物的试剂之上，并自然凝固。之后小心加入探针至冷却凝固的石蜡上面，再增加一滴55℃石蜡，自然降温并封闭。
组分B的探针部分 MPBP 0.15μM/50ul反应体系
配制D组分和C组分混合物，总体积50ul，成分如下表所示：
Figure BDA0002405705280000133
Figure BDA0002405705280000141
将配制的试剂加入至上述封闭后的1.5ml离心管中。盖好盖子，每管扩增试剂作为单管检测核酸试剂，-20℃冷冻可长期保存；使用时，取出放置室温平衡后，用于检测肺炎支原体病原。
实施例4反应体系灵敏度与特异性测试
取含高浓度的肺炎支原体的肺泡灌洗液经TE buffer稀释50、500、5000倍后，采用荧光定量技术进一步验证基因组拷贝数浓度，荧光定量采用双向引物为MPP-1QF:5'ACAAATAAGTGGAGGTAAAGC 3'(SEQ ID No.4)；MPP-1QR:5' TGTCTGACTGCGAGAATAA 3'(SEQID No.5)。采用南京诺唯赞生物科技有限公司AceQ qPCR SYBR Green Master Mix(LowROX Premixed)货号：Q131-02染料法荧光定量预混PCR 试剂进行扩增。仪器采用Bio-RadCFX MiniOpticon System，退火温度设置为54℃，并通过熔解曲线辅助判断特异性产物扩增情况，结果如图3所示。
将验证后模板进一步用TE Buffer倍比稀释至30cp/ul(拷贝/微升)，50cp/ul，300cp/ul， 3000cp/ul，30000cp/ul用于检测试剂的灵敏度试验。
单管检测试剂制备流程和试剂参照实施例3进行，除其中使用的引物探针替换为经过 2’-O-methyl-修饰，碱基序列完全一致。向制备好的反应管中分别加入不同拷贝数浓度的肺炎支原体，每个反应中添加1ul，并设置两个阴性对照(TE缓冲液)。所修饰碱基如下，碱基前加的m代表2’-O-methyl-修饰碱基。
上游引物序列mMPF：5‘-TAATACTAATGAGTCGAGGAmC mU mU mATT mG G mA mAmG-3’(SEQ ID No.15)
下游引物序列mMPR：5‘-CAGCGACAGAGTCACCAAACAAmA mAA mC mG A mC mA-3’(SEQID No.16)
探针序列mMPBP：5'-Fam-CTGCGTAT mU mU C mC TACCA mA mA mG mG mCTACGCAG-BHQ1-3'(SEQ ID No.17)
摇动混匀后放入恒温震荡仪，温度设置为55℃，2000RPM/分钟震荡30s；之后迅速转移至恒温荧光扩增仪上，在52℃条件下继续反应10min，每45s采集一次荧光信号值。检测结果见图4，本实施例中反应试剂可以检出低至30拷贝的模板。
取不同物种来源的基因组约1ng/ul浓度，进行上述试剂的非特异扩增试验。扩增条件与上述反应一致。所扩增的结果如下，说明上述试剂与下列基因不存在交叉反应。
Figure BDA0002405705280000151
实施例5检测呼吸道合胞病毒B亚型(Human respiratory syncytial virus,RSV,B)的单管式扩增试剂
A组分总体积360ul，所含组分及浓度如下表所示：
成分 浓度/用量
pH8.0Tris-Cl 200mM
Tritonx-100 0.5％
DTT(二硫苏糖醇) 10mM
吐温20 0.25％
海藻糖 150mM
环糊精 0.5％
硫酸钠 100mM
CsCl 10mM
Nt.BstNBI 10ug
BstDNA聚合酶(外切活性) 120ug
M-MLV反转录酶 40ug
HL-dsDNase 5U
将配制好的A组分(总体积360ul)加入到5ml普通透明离心管底部。
B组分
根据呼吸道合胞病毒B亚型序列GenBank:MK109789.1，选取特异性区域作为目标扩增区段设计筛选引物与探针。
上游引物序列RVF：5‘-TGACTCAATTGAGTCACGATCAACTCAAGAA-3’(SEQ ID No.6)
下游引物序列RVR：5'-GGACTCAGCTGAGTCCATTTGCACTTATGGT-3'(SEQ ID No.7)
探针序列RVBP：5'-Fam-AGTGCTGTGCATTTGAGCCAGCACAGCACT-BHQ2-3'(SEQ IDNo.8)
将以上引物和探针用TE缓冲液稀释分别成100umol/L,将上游引物：下游引物：探针按照4:3:1的体积混合并混匀后，取15ul混合至管底的A组分中；
C组分，dNTPs，25mmol/L浓度，取25ul加至A组分中，并将ABC三组分充分混匀。取熔点约为45℃的固体石蜡，加热至55℃熔解后，用移液器迅速取1000ul加入至含混合好的A、B、C三组分水相试剂之上，并自然凝固。凝固后封闭了含酶和引物探针的下层水相试剂。
D组分
D组分总体积1600ul，成分如下，
Figure BDA0002405705280000161
Figure BDA0002405705280000171
将配制的D组分加入至上述凝固后的石蜡上层。盖好盖子，试剂作为单管检测核酸试剂用于检测呼吸道合胞病毒B亚型病原。
样本测试：
将蘸有RSV B灭活病毒的基因采样拭子8支，并以未蘸有RSV B病毒的8支采样拭子作为阴性样本进行扩增，扩增结果作为平行对照试验。分别在上述封闭好得单管检测试剂的上层试剂中搅动10秒钟，之后将拭子取出。封闭管盖，置于56℃水浴锅中，一边加热一边手动轻轻震荡，待固体石蜡全部熔化后，迅速取出并充分混匀，放回水浴锅中，继续反应12分钟后80℃水浴终止反应。终止后小心吸取(防止扩增产物气溶胶污染实验室环境)管中下部液体50ul，转移至0.2ml离心管中进行荧光终点扫描。通过荧光定量PCR仪器(苏州雅瑞科技有限公司，型号：MA-6000，温度设置37℃恒温,30秒扫描一次，共5分钟)读取荧光。通过终点扫描法，阴性与阳性扩增产物明显区分，结果如图5所示。扩增产物进一步采用克隆后，挑取50个克隆后，测序验证，其结果均为目标产物。
实施例6检测沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis，CT)的单管式扩增试剂
A组分总体积8.5ul，具体组分如下表所示：
成分 浓度/用量
pH8.0Tris-Cl 200mM
Tritonx-100 0.5％
DTT(二硫苏糖醇) 10mM
吐温20 0.25％
海藻糖 200mM
环糊精 0.5％
硫酸钠 20mM
CsCl 10mM
Nt.AlwI 0.1ug
BstDNApolymerase(exo-) 5ug
将配制好的A组分(总体积8.5ul)加入到0.2ml普通常用透明PCR反应管底部。
B组分
通过NCBI搜索文献上沙眼衣原体基因genbank：CP016427，选取特异性区域作为目标扩增区段设计筛选引物与探针。引物探针为经过2’-O-methyl-修饰,所修饰碱基如下，碱基前加的m代表2’-O-methyl-修饰碱基。
上游引物序列CTF：5'-CGATCCAACCGGATCGGAGTCTGAG mC mA mC mC mC T-3' (SEQID No.9)
下游引物序列CTR：5'-TGATCCAACCGGATCAGATAACCCC mG mC mA mC mG T-3' (SEQID No.10)
探针序列CTBP：5'-Rox-AGGCGTTTGCTGTGACGGAGT mA mC mA mA mA mC mG mC CT-BHQ1-3'(SEQ ID No.11)
将以上引物和探针用TE缓冲液稀释分别成100umol/L,将上游引物：下游引物：探针按照8:5:3的体积混合并混匀后，取0.5ul混合至管底的A组分中；另外补加100X SybrGreen I 0.3ul
C组分，dNTPs，25mmol/L浓度，取0.7ul加至A组分中，并将ABC三组分充分混匀。
取熔点约为48℃的石蜡，加热至55℃熔解后，用移液器迅速取30ul加入至含混合好的 A、B、C三组分水相试剂之上，并自然凝固。凝固后封闭了含ABC组分的下层水相试剂。
D组分
D组分总体积40ul，成分如下表所示：
成分 浓度
Tris-ClpH8.2 18mM
DTT(二硫苏糖醇) 2mM
硫酸铵 23.75mM
MgSO4 15mM
双蒸水 补至40ul
将配制的试剂加入至上述凝固后的石蜡上层，盖好盖子，试剂作为单管检测核酸试剂，冷藏保存；或用于检测沙眼衣原体病原。
样本测试：
将冷冻存储于生理盐水中沙眼衣原体病原的溶液融化后，取5ul加入至上述封闭好的沙眼衣原体单管检测试剂上层溶液中。盖上管盖，将试剂管放置于有震荡功能的恒温金属浴上，恒温金属浴温度设置为58℃，震荡转速2000RPM/分钟。震荡3分钟后，将试剂转移至恒温扩增仪在50℃反应15分钟后结束，设置间隔30s扫描一次，荧光通道选取Fam和Rox双荧光扫描。
结果如图6所示，说明所配制试剂和方法均可检出阳性样本。
实施例7检测非洲猪瘟(African Swine fever virus，ASFV)的单管式扩增试剂
A组分总体积18ul，各组分如下表所示：
成分 浓度/用量
pH8.0Tris-Cl 200mM
Tritonx-100 0.5％
DTT(二硫苏糖醇) 10mM
吐温20 0.25％
海藻糖 160mM
环糊精 0.5％
硫酸钠 100mM
CsCl 10mM
Nt.AlwI 0.9ug
BstDNA聚合酶(外切酶活性) 10ug
codUNG 1U
将配制好的A组分试剂(总体积18ul)加入到0.2ml普通常用透明PCR反应管底部。
B组分
通过NCBI搜索文献上非洲猪瘟基因genbank：MK128995.1，选取特异性区域作为目标扩增区段设计筛选引物与探针。引物探针为经过2’-O-methyl-修饰,所修饰碱基如下，碱基前加的m代表2’-O-methyl-修饰碱基。
上游引物序列AVF：5'-CAGGAAATTGGATCACCAAAT mC mC mU mU mU mU mG mC GA-3'(SEQ ID No.12)
下游引物序列AVR：5'-TGATCCACTCGGATCAGTATCCAT mU mC mC mC mU mU C-3'(SEQ ID No.13)
探针序列AVBP：5'-Fam-ATGCAACTTTATCACCATA mA mA mG mC mU mU mG mC mAT-BHQ1-3'(SEQ ID No.14)
将以上引物和探针用TE缓冲液稀释分别成20umol/L。取0.8ul探针至管底的A组分中； C组分，dNTPs，25mmol/L浓度，取1.2ul加至A组分中，另补加dUTP 0.2ul，并将A组分、B组分中的探针和C组分三组分充分混匀。
取熔点约为48℃的石蜡，加热至55℃熔解后，用移液器迅速取40ul加入至含混合好的 A、B、C三组分水相试剂之上，并自然凝固。凝固后封闭了含A组分及B组分中探针和C组分的下层水相试剂。
D组分
D组分总体积77.5ul，包含如下表所示的组分：
成分 浓度
Tris-ClpH10.0 8mM
DTT(二硫苏糖醇) 2mM
硫酸铵 23.75mM
MgSO4 15mM
双蒸水 补至77.5ul
将上述上游引物：下游引物按照8:5的体积混合并混匀后，取2.5ul引物混合物加入至D 组分中。再将含上下游引物的组分D共计80ul加入至上述封闭后的0.2ml透明PCR反应管中。盖好盖子，试剂作为单管检测核酸试剂，冷藏保存；或用于检测非洲猪瘟病原。
样本测试：
将感染有非洲猪瘟病原的不同组织类型或血清，包括血清、口腔分泌物，或肝脏组织、脾脏组织研磨浆各约1ul后，加入至上述封闭好的非洲猪瘟病毒单管检测试剂上层溶液中。盖上管盖，将试剂管放置于恒温金属浴上，恒温金属浴温度设置为60℃，静置保温5分钟后，将试剂充分混匀转移至恒温扩增仪在56℃反应15分钟后结束。恒温扩增仪采用先达基因科技有限公司自有生产的GS8型号，Fam荧光通道，30s扫描一次，结果根据软件自动判读，检测后阴阳性结果与荧光定量PCR诊断结果进行对比。
Figure BDA0002405705280000201
Figure BDA0002405705280000211
结果说明本发明所使用的试剂和方法所得到的检测结果与传统荧光定量PCR结果完全一致。
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Claims (10)

1.一种单管核酸恒温扩增系统，其特征在于将恒温扩增反应酶体系、引物/探针体系、dNTPs体系和核酸释放体系各自分层包封在反应管内，其中核酸释放体系在最上层并与酶体系分隔，同时酶体系必须与二价阳离子分隔，使用时加入待测样品。
2.如权利要求1所述的扩增系统，其特征在于所述酶体系包括单链缺口酶和DNA聚合酶。
3.如权利要求2所述的扩增系统，其特征在于所述酶体系还可以包括防止污染的酶，选自尿嘧啶糖苷酶UNG/UDG酶、嗜冷尿嘧啶糖苷酶cod UNG、双链特异性DNA酶HL-dsDNase中的任意一种或两种以上的组合。
4.如权利要求2所述的扩增系统，其特征在于在待测样品为RNA的情况下还可以包括反转录酶。
5.如权利要求1所述的扩增系统，其特征在于二价阳离子选自Mg2+或者Mn2+。
6.如权利要求1所述的扩增系统，其特征在于体系反应温度为45～58℃范围内的恒定温度。
7.如权利要求2所述的扩增系统，其特征在于引物具有缺口酶识别序列。
8.如权利要求1所述的扩增系统，其特征在于分层包封采用的是熔点为35～52℃的石蜡，优选地，采用熔点为38～50℃的石蜡，再优选地，采用熔点为38～45℃的石蜡。
9.如权利要求1所述的扩增系统，其特征在于所述核酸释放体系pH范围为2.0-4.0或者8.0-11.0。
10.如权利要求1所述的扩增系统，其特征在于待测样品为细菌、细胞、病毒、衣原体、支原体、血清、血浆、组织或器官灌洗液、唾液、泪液、尿液、腹水、脑脊液。
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