JP4571786B2 - 標的核酸の検出法 - Google Patents
標的核酸の検出法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4571786B2 JP4571786B2 JP2003164799A JP2003164799A JP4571786B2 JP 4571786 B2 JP4571786 B2 JP 4571786B2 JP 2003164799 A JP2003164799 A JP 2003164799A JP 2003164799 A JP2003164799 A JP 2003164799A JP 4571786 B2 JP4571786 B2 JP 4571786B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- target nucleic
- detecting
- probe
- labeled probe
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、傷病・病害の予防若しくは治療に際し、患者から採取した試料中に原因となる有害細菌やウイルスが存在するか否かを迅速に同定検出して対応するための標的核酸の検出方法に関し、より多くの標的核酸配列を高い効率で同時に増幅するとともに、その産物を定性的に高い感度で同時に検出する標的核酸検査方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
傷病・病害の予防、または治療において、原因となる有害な細菌やウィルスを迅速に同定し検出することが重要である。 細菌やウィルスの同定には、一般に病徴の観察による方法、電子顕微鏡などを使用した形態的特徴観察による方法、および抗体を用いる簡便な方法などが用いられているが、これらはいずれも厳密性（高い選択性）に欠けるという欠点があるため、最近では検定生物を用いる方法や遺伝子配列解析による方法、あるいはハイブリダイゼーションを利用する方法などが開発されるに至った。
【０００３】
具体的には、第１に、ヒト免疫不全ウイルス１型（HIV1）、２型（HIV2）およびヒト成人Ｔ細胞白血病ウイルス１型（HTLV１）、２型（HTLV２）を同時に定量と定性ができる方法、第２に、Ｂ型肝炎ウイルス（HBV）、Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）、 HIV1を同時に定性ができる方法、 第３に、HBV、HCVを同時に定量と定性ができる方法などが知られる。 上記した第１〜第３の方法は、何れもタックマンプローブ（Taqman probe）法を原理とした検出法（以下単に「タックマン法」と称する）である。
【０００４】
なおここで、タックマン法とは、まず FRET（fluorescence resonance energy transfer）の原理を利用したもので FRETとは接近して蛍光色素が存在するところに励起光を照射した場合、片方の蛍光色素（reporter;R）に吸収されたエネルギーがもう一方の蛍光色素（quencher;Q）に移る現象をいう。 この場合、reporter側の色素の蛍光は生じず、エネルギーの移動によりquencher側の色素の蛍光（波長が異なる）が生じる。5`端および3`端にreporter、quencher色素が付与したプローブがハイブリダイズし、TaqDNAポリメラーゼの5`→3`エキソヌクレアーゼ活性によりプローブが分解され、接近していた２種類の蛍光物質の距離が離れることにより、色素が蛍光を発するようになるのでこれを検出して測定をおこなうものである。
【０００５】
また第４に、BKウイルス（BKV）、JCウイルス（JCV）を同時に定量と定性ができる方法や、第５に、ハイブリプローブ（Hybri-probe）法を原理としたHCVの５種類の変異型が同定できる測定系の検出法も知られている。 さらに第６に、サイバーグリーン（Syber-GreenI）と融解曲線分析を原理とした検出法（以下単に「サイバーグリーン法」という）、すなわちSyber-GreenIとはインターカレート試薬とも呼ばれ、２本鎖遺伝子の中に入り込むことによって、その蛍光強度や蛍光波長が著しく変化するものがあり、その性質を利用して２本鎖遺伝子を検出する（１本鎖 DNAになると離れて再び変化する）ものであって、これによって単純ヘルペスウイルス（HSV）、水痘帯状庖疹（VZV）、エンテロウイルス（enterovirus）、ポリオウイルス（poliovirus）を同時に定性するものである。
【０００６】
また第７に、HSV,サイトメガロウイルス（CMV）、ＥＢウイルス（EBV）、ヒトヘルペスウイルス６型（HHV6）、VZVの５種類について同時に定性ができる方法や、第８に、HSV、VZV、EBV、CMVの４種類について同時に定性ができる方法、さらにはEBV、CMV、HHV6、HHV7、HHV8、pseudorabies herpesvirusの６種類について同時に定性できる方法も知られる。 さらに第９に、核酸の塩基配列決定または遺伝的置換の大量スクリーニング法も知られている（特許公表２０００−５１３２０２）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、タックマン法を原理とする前記第１〜第３の方法による場合には使用できる蛍光色素が４色に限られているため最大４種類が限界である。 またハイブリプローブ法は、使用されるBKV,JCVあるいはHCVは配列において殆ど同じ塩基配列を有する。 そのために同一あるいは、略同一のプライマーとプローブで判定できるが、通常は、各標的遺伝子ごとに異なる２つのプローブを必要とするので仮に多くの種類のプライマーとプローブを反応液に加えると PCR反応を阻害し、著しく検出感度が悪化する難点がある。
【０００８】
さらにサイバーグリーン法は、融解曲線分析を原理とした検出法であるが、融解曲線分析はその PCR産物の融解温度（Tm）値によりその目的産物であるか区別する方法である。 一般的には融解曲線分析により４種類の PCR産物を区別するが、PCR産物のような100bp-500bpの大きさではTm値が８０℃〜８５℃の範囲に集中し、多くをこの１０℃の範囲内で区別するのは難しく、また非特異的産物の検出（目的の核酸配列でない配列）を否定できない。
【０００９】
さらに既述した第７〜第８は、多いもので６種類の異なる標的核酸を増幅するがどの核酸が増幅されたか否かはアガロースゲル電気泳動法により PCR産物の長さで判定するため、 PCR後にさらに多くの操作と時間が必要となるのみならず、増幅産物が実験室内に拡散し、その後の検出において偽陽性の原因となる可能性が高い。 また第９は、PCR で１チューブに一度に増幅できる遺伝子数には限界があり、ハイブリダイゼーションと検出の処理には１日以上の操作時間を必要とする。
【００１０】
また近時においては移植医療、再生医療が盛んとなり、患者に移植や移入する際に、有害な細菌やウィルスの混入は人体に重大な危険を伴う。 また高品質を維持するためにも移植や移入の前に検査する必要がある。 しかし有害な細菌やウィルスには多くの種類が存在し、現在の技術では多量の検査と時間、人手、費用がかかる。 今後、移植医療、再生医療においてこれらの検査が必須になると予想され、高い検出感度の達成と時間、人手、費用の節約をするための効率化が求められる。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明は高い厳密性を有する PCRまたはRT-PCR法などの核酸配列の増幅を用いて１個のチューブ内あるいは１反応液内で同時に多数の種類を検査する方法について開発したものであって、上記で説明した分子生物学的手法の高い厳密性（細菌やウイルス間の高い選択性、検出性）を保持しつつ、かつ従来の技術の欠点を解決し、高感度でしかも高選択的、かつ迅速に細菌やウイルス、検出やSNPsなどの遺伝子解析をする方法を提供するものである。
【００１２】
すなわち、本発明は、ハイブリプローブ法を応用してプローブによる増幅核酸の同定をおこなう場合において、従来のように核酸増幅反応液にあらかじめプローブを加えて反応検出をおこなうのではなしに、増幅反応液にプローブを加えずに核酸増幅をおこない、反応終了後にプローブを加え、その後、融解曲線分析により各プローブのTm値の違いから目的とするウイルス等の標的核酸の有無を判定することを特徴とする。
【００１３】
具体的には、患者から抽出した試料中の核酸に対し、プローブを含まない添加剤を添加して核酸増幅した後、検出すべき標的核酸の配列に対して相補的塩基配列を有した複数の標識プローブを混入し、混入後のプローブに含まれる蛍光標識を融解曲線分析することにより複数の標的核酸を同時的に同定検出するようにした標的核酸の検出方法に関する。
【００１４】
上記により、増幅反応を行う際に反応液に混ざらない状態でキャピラリー中にプローブを加え、あるいは200μlマイクロチューブに反応液を加え、ついでミネラルオイルを加えた後オイルより上層にプローブ溶液を加える。 この状態では反応液とプローブ液がミネラルオイルを解して混ざらない状態になる。 増幅反応終了後に遠心操作によりプローブと反応液を混合し、融解曲線分析する。 この方法では増幅反応の際にプローブが反応を阻害しないためプライマーとプローブの複雑な産物を形成せず、これまでのハイブリプローブ法よりも検出感度が高い。
【００１５】
またプローブによる増幅産物の確認ができるため、特異的増幅産物のみを測定できる。 さらに、これまでのサイバーグリーン法よりも判定の際に使用するTm値の範囲が広いため、多くの種類の判定が容易となる。 電気泳動法のような増幅後の操作が不要で操作時間が節約できる。 増幅産物の拡散が無く、繰り返し測定を行っても偽陽性がでる可能性が極めて低い。 また目視でなく光学機器による計測のため微量でも検出、判定できる。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の具体的な内容について順次説明するとつぎの通りである。 まず検出したい遺伝子である標的核酸としては、癌関連遺伝子、遺伝病に関連する遺伝子、ウィルス遺伝子、細菌遺伝子及び病気のリスクファクターと呼ばれる多型性を示す遺伝子である塩基配列のものが含まれる。
【００１７】
ほかに、ヒト免疫不全ウイルス１型（HIV1）、２型(HIV2）およびヒト成人Ｔ細胞白血病ウイルス１型（HTLV1）、２型（HTLV２）、Ｃ型肝炎ウイルス（ HCV）、ピコルナウィルス（Picornaviruses）、カリシウィルス（Caliciviruses）、オルソミクソウィルス（Orthomyxoviruses）、トガウィルス（Togaviruses）などの RNAウィルス類、ＢＫウイルス（BKV）、ＪＣウイルス（JCV）、サイトメガロウイルス（CMV）、ＥＢウイルス（ EBV）、ヒトヘルペスウイルス６型（ HHV6）単純ヘルペスウイルス（HSV）、水痘帯状庖疹（VZV）、ポックスウイルス（Ppxviruses）、パルボウィルス（ Parvoviruses）、パポーバウイルス（Papovaviruses）、Ｂ型肝炎ウイルス（HBV）、Adenovirus、ヒト乳頭腫ウイルス（HPV）などのDNAウィルス類などがある。
【００１８】
また有害細菌としては、例えば、サルモネラ属（チフス菌、パラチフスＡ菌、パラチフスＢ菌、腸炎菌、ネズミチフス菌、アリゾナ菌等）、シゲラ属（赤痢菌等）、ビブリオ属（腸炎ビブリオ、コレラ菌、ＮＡＧビブリオ、ビブリオ・ミミカス、バルニフィカス、アルギノリチカス等）、エロモナス属（エロモナス・ヒドロフィア、ソブリアキャビエ、サルモニサイダ等）、プレジオモナス属（プレジオモナス・シゲロイデス等）、カンピロバクター属（カンピロバクター・ジェジュニー、カンピロバクター・コリ、カンピロバクター・フィタス等）、クロストリジウム属（ウエルシュ菌、ボツリヌス菌等）、スタフィロコッカス属（黄色ブドウ球菌、ＭＲＳＡ等）、エシェリキア属（大腸菌、腸管出血性大腸菌（Ｏ１５７等）、毒素原性大腸菌、組織侵入性大腸菌、病原血清型大腸菌、腸管付着性大腸菌属等）、エルシニア属（エルシニア・エンテロコリチカ、偽結核菌、ペスト菌等）、バシラス属（セレウス菌、炭疽菌、枯草菌、バシルス・ステアロサーモフィラス等）、リステリア属（リステリア・モノシトジェンズ等）、ミコバクテリア属（人型結核菌、牛型結核菌、鳥型結核菌等）、さらにCandida, Aspergillus, Mucor, Cryptococcus, Pneumicystis carinii, 梅毒菌、淋菌、および応用微生物学（昭和５０年発行、相田浩ら、株式会社朝倉書店 発行）の１３〜７６貢に記載の微生物などが挙げられる。
【００１９】
さらにビタミンＤ受容体遺伝子、アポリポタンパクＥ遺伝子およびエストロゲン受容体遺伝子などの遺伝子多型の SNPs（Single nucleotide polymorphismsの略）領域も含まれる。 SNPsとは、遺伝暗号である塩基配列は一人一人でかなり多くの部位で異なっている。この違いから同じ診断名や類似の症状の疾患であっても、その背景となる疾患を起こす仕組みが異なる。 SNPsの遺伝解析は、違いを考慮にいれた薬剤の使い分けなどの治療を可能にする所謂「オーダーメイド医療」を指す。 さらに疾患の予防、発症の遅延、早期発見、早期治療につながる。
【００２０】
また、病原菌等標的核酸を含む可能性のある試料（検体）としては、例えば、細菌、ウィルス等の病原体、生体から分離された血液、唾液、組織病片等、或いは糞尿等の排泄物が挙げられる。 これらのＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸を含有した試料は直接、又は必要に応じて遠心分離操作等により沈渣として濃縮した後、例えば、酵素処理、熱処理、界面活性剤処理、超音波処理、或いはこれらの組み合わせ等による細胞破壊処理を予め施したものを使用することができる。 この場合、上記細胞破壊処理は、目的とする組織由来のＤＮＡ又はＲＮＡを顕在化させる目的で行われるものである。
【００２１】
さらに試料中の核酸増幅は、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ法）やリガーゼ鎖反応（ＬＣＲ法あるいはｇａｐ−ＬＣＲ法）、もしくはライゲーション増幅反応（ＡＳＰＣＲ法）、あるいはＡＲＭＳ法、ＩＣＡＮ法、Ｌａｍｐ法、または特定の核酸配列を濃縮する他の方法の使用を示している。 なかでもＰＣＲ法は、一般にポリメラーゼ鎖反応法と呼ばれる方法であって、２本鎖の試料DNAを加熱して、１本鎖としてから、該１本鎖を鋳型として増幅プライマーをアニールさせ、次いで加温してDNAポリメラーゼにより該プライマーからdNTPsを合成し、伸張させる。
【００２２】
上記により得られた２本鎖を１本鎖に分離して、上記反応を繰り返すことにより、効率的に目標領域を有する DNAを増幅することができる。 一般に反応条件は９２〜９５℃で１秒間〜１分間、５０〜６５℃を５秒〜１分間、７０〜７５℃を５秒から５分間を、２０〜４０回繰り返す。 ５０〜６５℃の部分で上記アニールがおこり、反応を成功させるためのアニール温度は、主にプライマーの組成によって規定される。 ７０〜７５℃の部分で伸張がおこり、反応を成功させるための伸張時間は増幅する目標領域の長さによって規定される。 また標的核酸としてＲＮＡとＤＮＡとがあるがＲＮＡの場合、逆転写してｃＤＮＡに変換して増幅する場合とＲＮＡをそのまま増幅する場合がある。
【００２３】
本発明によるＤＮＡ又はＲＮＡの増幅は、上記したＰＣＲ法などによるほかに、ライトサイクラー又はABI PRISM 定量システムなどを用いておこなうこともできる。 また核酸増幅に際しては特異的プライマー、TaqDNApolymerase、ｐＨ調整剤、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩基、牛血清アルブミン、ゼラチンなどの添加剤が添加される。 さらに核酸増幅後に混入するプローブとは蛍光標識プローブなどであり、前記標的核酸と塩基配列が相補であるＲＮＡ又は１本鎖ＤＮＡをいう。 このようなプローブは、ＰＣＲ法、化学合成法などにより作製することができる。 プローブの長さは、通常のハイブリダイゼーション条件下で安定に標的分子とハイブリダイズできる限り、制限されないが、Tm値を設定から１５〜４０塩基が望ましい。
【００２４】
標的核酸の検出は、混入後のプローブに含まれる蛍光標識を融解曲線分析することにより複数の標的核酸を同時的に同定検出する。 標識物質の種類は限定されないが、例えば使用する標識物質が蛍光標識である場合、蛍光顕微鏡、蛍光強度測定装置およびレーザ・スキャニング・サイトメータ（以下、ＬＳＣと略す）等の使用が可能である。 しかし、検出機器は特に上記のものに限定されない。
【００２５】
使用する標識物質が蛍光標識である場合、検出方法の例を以下に示すとFRET（fluorescence resonance energy transfer）の原理を利用して検出する。 FRETとは、近接して蛍光色素が存在するところに励起光を照射した場合、片方の蛍光色素（reporter;R）に吸収されたエネルギーがもう一方の蛍光色素（quencher;Q）に移る現象を言う。
【００２６】
検出プローブの種類としては以下のものが例示される
Ａ．ハイブリプローブ（Roche Diagnostics社製）
これは２種類のプローブが増幅された核酸とハイブリダイズすることにより、２種類の蛍光色素が接近し、quencher側の色素が蛍光を発するようになるので、これを検出するものである
Ｂ．Moleculer Beacon（Stratagene社製）
これは、ハイブリダイゼーションプローブは遊離の状態ではヘアピン構造をとるため、２種類の蛍光色素（正確には、Moleculer Beaconの場合はquencherは蛍光物質でなく、quenching 作用のある物質）は近接している。 増幅された核酸とハイブリダイズすることにより、互いの距離が離れ、reporter側の色素が蛍光を発するようになるので、これを検出するものである。
【００２７】
上記いずれのものを使用する場合においても、それぞれの核酸配列固有のプローブの区別は融解曲線分析により判定される。 融解曲線分析は、増幅された核酸やプローブと増幅された核酸のハイブリッドを初めは低温（４０℃）から通常０．２℃/secの速度で７５℃まで温度を上げていくとそれぞれの増幅された核酸やプローブが持つ固有のTm値に従い核酸やプローブと増幅された核酸のハイブリッドが融解し、この場合、増幅された核酸はSyber-GreenIが、またプローブと増幅された核酸のハイブリッドはFRETの蛍光強度が急激に落ちる。 そしてその温度に対する急激に落ちた蛍光強度変化を微分してピーク化したものを分析する方法による。
【００２８】
なお、上記したSyber-GreenIとは、インターカレート試薬とも呼ばれ、２本鎖遺伝子の中に入り込むことによって、その蛍光強度や蛍光波長が著しく変化するものがあり、その性質を利用して２本鎖遺伝子を検出するものである。 １本鎖 DNAになると離れて再び変化する。
【００２９】
【実施例】
〔ＤＮＡの抽出〕
ウィルス性疾患の疑いのある患者から採血した血液から試料として Viral DNA抽出をした。 DNA の抽出は、QIAamp DNA Blood Mini kit を用い、以下の操作方法により抽出した。 すなわち 1.5μl tubeにProteinase K 20μlを入れ、そのTube内に血液または血清を200μl+Buffer AL200μl加え、これをVortex 15secした後、56C 10min incubation Tubeをスピンしてサンプルを集めた。
【００３０】
これに100% Ethanol 200μlを加え、Vortex 15sec し、さらにスピンした後に 2ml 遠心Tubeにセットしたスピンカラムにサンプルを移す。 8000rpm 1min 遠心後、2ml の遠心tube内の溶液を捨て、再びスピンカラムにセットする。 このスピンカラムにBuffer AW1 500μlを加えて再び8000rpm 1min 遠心する。
【００３１】
新しい 2ml 遠心tubeに交換してスピンカラム内にBuffer AW2 500μlを加え、これを再び 14000rpm 3min 遠心する。 2ml の遠心tube内の溶液を捨て、再びスピンカラムにセットし、14000rpm 1min 遠心する。 1.5ml 遠心tube内にスピンカラムを移し、Buffer AE 50μl を加え、室温で1min放置した後、8000rpm 1min 遠心してDNAを回収する。
【００３２】
〔核酸の増幅〕
DNA ウィルスについては、Herpes Simplex Virus1(HSV1)、 Herpes Simplex Virus2(HSV2)、 Varicella-Zoster Virus(VZV)、 Human Cytomegalovirus(HCMV)、 Human Herpes Virus 7(HHV7)、 Human Herpes Virus 8(HHV8)、 parvoB19、 BK Virus (BKV)、 JC Virus (JCV) などの各ウィルスを同時定性する。
【００３３】
これに添加するプライマーとしてウィルス特異的配列を有する核酸配列（例えば、
Journal of Medical Virology ,2002,68,p.399-403,
Journal of Clinical Microbiology Dec,2001,p.4357-4361.
Journal of Clinical Microbiology ,Dec,2001,p.4413-4419.
Journal of Clinical Microbiology ,Nov,2000,p.4006-4009.
Journal of Clinical Microbiology ,Sept,2000,p.3187-3189.
BMC Microbiology,2002, 2,p.12-22
に記載されている核酸配列のもの）、
またＨＨＶ７に特異的な増幅プライマー対：gaaaaatccg ccataatagc 配列番号１,atggaacacc tattaacgg c 配列番号2. 10μMを0.2μl ずつ合計2.8μl、 合成酵素として〔 Accuprime Taq DNA polymerase（Invitrogen社製）〕0.25μl、調整剤として 10＊Accuprime PCR buffer I 1μl、これに抽出した DNA 5μlと、Nucrease Free Water 1.95μlとを加えて合計 10μlとし、これを Mixし、図１に示したライトサイクラーキャピラリー１の透明ガラス製の細長い容器２内に注入（図１Ａのａ参照）する。 なお核酸の増幅手段としては、この場合ＰＣＲ法を用いた。
【００３４】
〔プローブの混入〕
ついでその上部に、蛍光色素（LCRed640,LCRed705,FITC）が付着したウィルス特異的ハイブリダイゼーションプローブミックス（例えば、
BMC Microbiology,2002, 2,p.12-22
Journal of Medical Virology ,2002,68,p.399-403,
Journal of Clinical Microbiology Dec,2001,p.4357-4361.
Journal of Clinical Microbiology ,Dec,2001,p.4413-4419.
Journal of Clinical Microbiology ,Nov,2000,p.4006-4009.
Journal of Clinical Microbiology ,Sept,2000,p.3187-3189.
に記載されている核酸配列のもの、ＨＨＶ７に特異的なプローブ： ttgtgaaatg tgttgcgata gggc 核酸配列３、gccataagaa acaggtacag acattgtca 核酸配列４、およびＨＣＭＶに特異的なプローブ：acaccactta tctg 核酸配列５、ＶＺＶに特異的なプローブ： aagttcgcgg tataattgt 核酸配列６を記載されているものの代わりに用いる。以上のプローブ混合液をつくり４μl 入れ（図１Ａのｂ参照）てプラスチック製の蓋３で栓をした。 この状態ではＰＣＲ溶液ａとハイブリイゼーションプローブミックスｂとは分離された状態にある。
【００３５】
キャピラリーを刺したカローセルをライトサイクラーにセットしてＰＣＲをおこなった。 ＰＣＲ条件は９５℃で２分、次に９５℃で１秒、５７℃で１５秒、７２℃で１５秒の温度サイクルを４０サイクルおこない、最後に４０℃で３０秒間の冷却をして終了した。
【００３６】
上記すべてのTemperature Transition Rateは20C/secでおこなった。 次にカローセルをカローセル遠心機にて遠心（3000rpm ３秒）し、ＰＣＲ反応液10μlとハイブリダイゼーションプローブミックス４μl を混合（図１Ｂのｃ参照）して１分間放置した後、再びライトサイクラーにカローセルをセットして、融解曲線分析をおこなった。 分析条件は、９５℃ １分、Temperature Transition Rate20C/sec、４０℃ １５秒 Temperature Transition Rate20℃/sec、７５℃０秒 Temperature Transition Rate0.6℃/sec Acquistion Mode CONT、４０℃ ３０秒である。
【００３７】
なおプローブの混合には上記した図１のライトサイクラーキャピラリー１に代えて図２にあらわしたマイクロチューブ（ＰＣＲチューブ）４を用いることもできる。 これはポリプロピレン等の透明な容器５と折り曲げ自在のヒンジを介して施蓋可能な蓋６とからなるもので、図２Ａはプローブを混合する前段階をあらわし、PCR 反応液ａ，プローブ溶液ｂ，ミネラルオイルｃが順次積層状に充填された状態をあらわしている。 また図２ＢはＰＣＲ後に3000rpm3秒間遠心してプローブ溶液を混合した状態をあらわしている。
【００３８】
〔融解曲線分析の解析〕
融解曲線分析結果を解析するための操作方法について説明すると、Select a Programにおいてプログラムをmelting curve programに選択し、またCalculation MethodをPolynominalに選択した。 Extra Manual Tm を選択して各サンプルのTm値を測定したところ、各ウィルスのハイブリダイゼーションプローブ融解ピーク（Tm値）は図３に示す通りであった。
【００３９】
融解Tm値が同じか、あるいは近いものは、蛍光色素「LCRed640(F2/F1), LCRed705(F3/F1)の２色」を換えて異なる波長で検出するようにした。 この操作によりウィルスが存在すれば、増幅されたＰＣＲ産物にウィルス種特異的プローブがハイブリダイゼーションする。 そして除々に温度を上げていくとそのハイブリダイゼーションプローブ固有のTm値のところでプローブが解離して蛍光強度が急激に落ちる。 縦軸を温度、横軸を温度にして急激に下がった温度変化を微分してピークとする。 その解離ピークのTm値よりウィルス種を判定する。
【００４０】
測定の結果、F2/F1チャンネルでTm値59℃にピークが現れ、HHV6において陽性となった。このサンプルをウィルス定量系にてウィルス定量したところHHV6においては２５コピー／μgDNA検出され、他のウィルスは検出されなかった。 このことから定性系と定量系との一致が見られた。 なおこの場合に予め反応液等を用意しておけば、血液から DNA,RNA抽出に３０分、核酸増幅に３０分、検出に１５分、数にもよるが操作の合計が３０分と、合計１時間４５分で検査作業が完了する。
【００４１】
なおＤＮＡ用ハイブリダイゼーションプローブミックスの組成・蛍光色素・添加量などの概要を図４に示す。
【００４２】
【発明の効果】
以上詳述した通り、本願の発明はPCR容器内に、検出すべき該標的核酸の配列に対して相補的塩基配列を有した標識プローブを含まない反応液を注入する工程と、該標的核酸反応液の上部に、検出すべき該標的核酸の配列に対して相補的塩基配列を有した標識プローブ混合液を注入する工程と、これに蓋をして核酸増幅させる工程と、核酸増幅後に遠心して反応液と標識プローブ混合液とを混合させる工程と、混合後に標識プローブの分析をする工程とからなる標的核酸の検出方法であるために、特殊技術を要することなく、従来技術より短時間で、しかも、少なくとも５種類以上の異なる核酸配列の増幅結果を、より高い検出感度で同時的に確認することができる。
【００４３】
その結果、傷病・病害の予防、または治療において、患者の体内に原因となる有害細菌やウイルスが存在するか否かを迅速に同定検出することができ、また近時盛んとなった移植医療、再生医療の分野において、患者に移植や移入する際の有害細菌・ウィルスの混入を事前に避けることができ、迅速かつ安全でしかも高品質の移植医療、再生医療の実現に寄与するところが大きい。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明において用いるプローブ混合手段の一例をあらわしたライトサイクラーキャピラリーの縦断面図。
【図２】本発明において用いるプローブ混合手段の別の例をあらわしたマイクロチューブ（ＰＣＲチューブ）の縦断面図。
【図３】本発明におけるＤＮＡウイルスハイブリダイゼーションプローブの融解ピークをあらわした実験結果表。
【図４】本発明において用いるＤＮＡウイルスハイブリダイゼーションプローブの内容をあらわした一覧表。
【符号の説明】
１ ライトサイクラーキャピラリー
２ 容器
３ 蓋
４ マイクロチューブ（ＰＣＲチューブ）
５ 容器
６ 蓋
【発明の属する技術分野】
本発明は、傷病・病害の予防若しくは治療に際し、患者から採取した試料中に原因となる有害細菌やウイルスが存在するか否かを迅速に同定検出して対応するための標的核酸の検出方法に関し、より多くの標的核酸配列を高い効率で同時に増幅するとともに、その産物を定性的に高い感度で同時に検出する標的核酸検査方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
傷病・病害の予防、または治療において、原因となる有害な細菌やウィルスを迅速に同定し検出することが重要である。 細菌やウィルスの同定には、一般に病徴の観察による方法、電子顕微鏡などを使用した形態的特徴観察による方法、および抗体を用いる簡便な方法などが用いられているが、これらはいずれも厳密性（高い選択性）に欠けるという欠点があるため、最近では検定生物を用いる方法や遺伝子配列解析による方法、あるいはハイブリダイゼーションを利用する方法などが開発されるに至った。
【０００３】
具体的には、第１に、ヒト免疫不全ウイルス１型（HIV1）、２型（HIV2）およびヒト成人Ｔ細胞白血病ウイルス１型（HTLV１）、２型（HTLV２）を同時に定量と定性ができる方法、第２に、Ｂ型肝炎ウイルス（HBV）、Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）、 HIV1を同時に定性ができる方法、 第３に、HBV、HCVを同時に定量と定性ができる方法などが知られる。 上記した第１〜第３の方法は、何れもタックマンプローブ（Taqman probe）法を原理とした検出法（以下単に「タックマン法」と称する）である。
【０００４】
なおここで、タックマン法とは、まず FRET（fluorescence resonance energy transfer）の原理を利用したもので FRETとは接近して蛍光色素が存在するところに励起光を照射した場合、片方の蛍光色素（reporter;R）に吸収されたエネルギーがもう一方の蛍光色素（quencher;Q）に移る現象をいう。 この場合、reporter側の色素の蛍光は生じず、エネルギーの移動によりquencher側の色素の蛍光（波長が異なる）が生じる。5`端および3`端にreporter、quencher色素が付与したプローブがハイブリダイズし、TaqDNAポリメラーゼの5`→3`エキソヌクレアーゼ活性によりプローブが分解され、接近していた２種類の蛍光物質の距離が離れることにより、色素が蛍光を発するようになるのでこれを検出して測定をおこなうものである。
【０００５】
また第４に、BKウイルス（BKV）、JCウイルス（JCV）を同時に定量と定性ができる方法や、第５に、ハイブリプローブ（Hybri-probe）法を原理としたHCVの５種類の変異型が同定できる測定系の検出法も知られている。 さらに第６に、サイバーグリーン（Syber-GreenI）と融解曲線分析を原理とした検出法（以下単に「サイバーグリーン法」という）、すなわちSyber-GreenIとはインターカレート試薬とも呼ばれ、２本鎖遺伝子の中に入り込むことによって、その蛍光強度や蛍光波長が著しく変化するものがあり、その性質を利用して２本鎖遺伝子を検出する（１本鎖 DNAになると離れて再び変化する）ものであって、これによって単純ヘルペスウイルス（HSV）、水痘帯状庖疹（VZV）、エンテロウイルス（enterovirus）、ポリオウイルス（poliovirus）を同時に定性するものである。
【０００６】
また第７に、HSV,サイトメガロウイルス（CMV）、ＥＢウイルス（EBV）、ヒトヘルペスウイルス６型（HHV6）、VZVの５種類について同時に定性ができる方法や、第８に、HSV、VZV、EBV、CMVの４種類について同時に定性ができる方法、さらにはEBV、CMV、HHV6、HHV7、HHV8、pseudorabies herpesvirusの６種類について同時に定性できる方法も知られる。 さらに第９に、核酸の塩基配列決定または遺伝的置換の大量スクリーニング法も知られている（特許公表２０００−５１３２０２）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、タックマン法を原理とする前記第１〜第３の方法による場合には使用できる蛍光色素が４色に限られているため最大４種類が限界である。 またハイブリプローブ法は、使用されるBKV,JCVあるいはHCVは配列において殆ど同じ塩基配列を有する。 そのために同一あるいは、略同一のプライマーとプローブで判定できるが、通常は、各標的遺伝子ごとに異なる２つのプローブを必要とするので仮に多くの種類のプライマーとプローブを反応液に加えると PCR反応を阻害し、著しく検出感度が悪化する難点がある。
【０００８】
さらにサイバーグリーン法は、融解曲線分析を原理とした検出法であるが、融解曲線分析はその PCR産物の融解温度（Tm）値によりその目的産物であるか区別する方法である。 一般的には融解曲線分析により４種類の PCR産物を区別するが、PCR産物のような100bp-500bpの大きさではTm値が８０℃〜８５℃の範囲に集中し、多くをこの１０℃の範囲内で区別するのは難しく、また非特異的産物の検出（目的の核酸配列でない配列）を否定できない。
【０００９】
さらに既述した第７〜第８は、多いもので６種類の異なる標的核酸を増幅するがどの核酸が増幅されたか否かはアガロースゲル電気泳動法により PCR産物の長さで判定するため、 PCR後にさらに多くの操作と時間が必要となるのみならず、増幅産物が実験室内に拡散し、その後の検出において偽陽性の原因となる可能性が高い。 また第９は、PCR で１チューブに一度に増幅できる遺伝子数には限界があり、ハイブリダイゼーションと検出の処理には１日以上の操作時間を必要とする。
【００１０】
また近時においては移植医療、再生医療が盛んとなり、患者に移植や移入する際に、有害な細菌やウィルスの混入は人体に重大な危険を伴う。 また高品質を維持するためにも移植や移入の前に検査する必要がある。 しかし有害な細菌やウィルスには多くの種類が存在し、現在の技術では多量の検査と時間、人手、費用がかかる。 今後、移植医療、再生医療においてこれらの検査が必須になると予想され、高い検出感度の達成と時間、人手、費用の節約をするための効率化が求められる。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明は高い厳密性を有する PCRまたはRT-PCR法などの核酸配列の増幅を用いて１個のチューブ内あるいは１反応液内で同時に多数の種類を検査する方法について開発したものであって、上記で説明した分子生物学的手法の高い厳密性（細菌やウイルス間の高い選択性、検出性）を保持しつつ、かつ従来の技術の欠点を解決し、高感度でしかも高選択的、かつ迅速に細菌やウイルス、検出やSNPsなどの遺伝子解析をする方法を提供するものである。
【００１２】
すなわち、本発明は、ハイブリプローブ法を応用してプローブによる増幅核酸の同定をおこなう場合において、従来のように核酸増幅反応液にあらかじめプローブを加えて反応検出をおこなうのではなしに、増幅反応液にプローブを加えずに核酸増幅をおこない、反応終了後にプローブを加え、その後、融解曲線分析により各プローブのTm値の違いから目的とするウイルス等の標的核酸の有無を判定することを特徴とする。
【００１３】
具体的には、患者から抽出した試料中の核酸に対し、プローブを含まない添加剤を添加して核酸増幅した後、検出すべき標的核酸の配列に対して相補的塩基配列を有した複数の標識プローブを混入し、混入後のプローブに含まれる蛍光標識を融解曲線分析することにより複数の標的核酸を同時的に同定検出するようにした標的核酸の検出方法に関する。
【００１４】
上記により、増幅反応を行う際に反応液に混ざらない状態でキャピラリー中にプローブを加え、あるいは200μlマイクロチューブに反応液を加え、ついでミネラルオイルを加えた後オイルより上層にプローブ溶液を加える。 この状態では反応液とプローブ液がミネラルオイルを解して混ざらない状態になる。 増幅反応終了後に遠心操作によりプローブと反応液を混合し、融解曲線分析する。 この方法では増幅反応の際にプローブが反応を阻害しないためプライマーとプローブの複雑な産物を形成せず、これまでのハイブリプローブ法よりも検出感度が高い。
【００１５】
またプローブによる増幅産物の確認ができるため、特異的増幅産物のみを測定できる。 さらに、これまでのサイバーグリーン法よりも判定の際に使用するTm値の範囲が広いため、多くの種類の判定が容易となる。 電気泳動法のような増幅後の操作が不要で操作時間が節約できる。 増幅産物の拡散が無く、繰り返し測定を行っても偽陽性がでる可能性が極めて低い。 また目視でなく光学機器による計測のため微量でも検出、判定できる。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の具体的な内容について順次説明するとつぎの通りである。 まず検出したい遺伝子である標的核酸としては、癌関連遺伝子、遺伝病に関連する遺伝子、ウィルス遺伝子、細菌遺伝子及び病気のリスクファクターと呼ばれる多型性を示す遺伝子である塩基配列のものが含まれる。
【００１７】
ほかに、ヒト免疫不全ウイルス１型（HIV1）、２型(HIV2）およびヒト成人Ｔ細胞白血病ウイルス１型（HTLV1）、２型（HTLV２）、Ｃ型肝炎ウイルス（ HCV）、ピコルナウィルス（Picornaviruses）、カリシウィルス（Caliciviruses）、オルソミクソウィルス（Orthomyxoviruses）、トガウィルス（Togaviruses）などの RNAウィルス類、ＢＫウイルス（BKV）、ＪＣウイルス（JCV）、サイトメガロウイルス（CMV）、ＥＢウイルス（ EBV）、ヒトヘルペスウイルス６型（ HHV6）単純ヘルペスウイルス（HSV）、水痘帯状庖疹（VZV）、ポックスウイルス（Ppxviruses）、パルボウィルス（ Parvoviruses）、パポーバウイルス（Papovaviruses）、Ｂ型肝炎ウイルス（HBV）、Adenovirus、ヒト乳頭腫ウイルス（HPV）などのDNAウィルス類などがある。
【００１８】
また有害細菌としては、例えば、サルモネラ属（チフス菌、パラチフスＡ菌、パラチフスＢ菌、腸炎菌、ネズミチフス菌、アリゾナ菌等）、シゲラ属（赤痢菌等）、ビブリオ属（腸炎ビブリオ、コレラ菌、ＮＡＧビブリオ、ビブリオ・ミミカス、バルニフィカス、アルギノリチカス等）、エロモナス属（エロモナス・ヒドロフィア、ソブリアキャビエ、サルモニサイダ等）、プレジオモナス属（プレジオモナス・シゲロイデス等）、カンピロバクター属（カンピロバクター・ジェジュニー、カンピロバクター・コリ、カンピロバクター・フィタス等）、クロストリジウム属（ウエルシュ菌、ボツリヌス菌等）、スタフィロコッカス属（黄色ブドウ球菌、ＭＲＳＡ等）、エシェリキア属（大腸菌、腸管出血性大腸菌（Ｏ１５７等）、毒素原性大腸菌、組織侵入性大腸菌、病原血清型大腸菌、腸管付着性大腸菌属等）、エルシニア属（エルシニア・エンテロコリチカ、偽結核菌、ペスト菌等）、バシラス属（セレウス菌、炭疽菌、枯草菌、バシルス・ステアロサーモフィラス等）、リステリア属（リステリア・モノシトジェンズ等）、ミコバクテリア属（人型結核菌、牛型結核菌、鳥型結核菌等）、さらにCandida, Aspergillus, Mucor, Cryptococcus, Pneumicystis carinii, 梅毒菌、淋菌、および応用微生物学（昭和５０年発行、相田浩ら、株式会社朝倉書店 発行）の１３〜７６貢に記載の微生物などが挙げられる。
【００１９】
さらにビタミンＤ受容体遺伝子、アポリポタンパクＥ遺伝子およびエストロゲン受容体遺伝子などの遺伝子多型の SNPs（Single nucleotide polymorphismsの略）領域も含まれる。 SNPsとは、遺伝暗号である塩基配列は一人一人でかなり多くの部位で異なっている。この違いから同じ診断名や類似の症状の疾患であっても、その背景となる疾患を起こす仕組みが異なる。 SNPsの遺伝解析は、違いを考慮にいれた薬剤の使い分けなどの治療を可能にする所謂「オーダーメイド医療」を指す。 さらに疾患の予防、発症の遅延、早期発見、早期治療につながる。
【００２０】
また、病原菌等標的核酸を含む可能性のある試料（検体）としては、例えば、細菌、ウィルス等の病原体、生体から分離された血液、唾液、組織病片等、或いは糞尿等の排泄物が挙げられる。 これらのＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸を含有した試料は直接、又は必要に応じて遠心分離操作等により沈渣として濃縮した後、例えば、酵素処理、熱処理、界面活性剤処理、超音波処理、或いはこれらの組み合わせ等による細胞破壊処理を予め施したものを使用することができる。 この場合、上記細胞破壊処理は、目的とする組織由来のＤＮＡ又はＲＮＡを顕在化させる目的で行われるものである。
【００２１】
さらに試料中の核酸増幅は、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ法）やリガーゼ鎖反応（ＬＣＲ法あるいはｇａｐ−ＬＣＲ法）、もしくはライゲーション増幅反応（ＡＳＰＣＲ法）、あるいはＡＲＭＳ法、ＩＣＡＮ法、Ｌａｍｐ法、または特定の核酸配列を濃縮する他の方法の使用を示している。 なかでもＰＣＲ法は、一般にポリメラーゼ鎖反応法と呼ばれる方法であって、２本鎖の試料DNAを加熱して、１本鎖としてから、該１本鎖を鋳型として増幅プライマーをアニールさせ、次いで加温してDNAポリメラーゼにより該プライマーからdNTPsを合成し、伸張させる。
【００２２】
上記により得られた２本鎖を１本鎖に分離して、上記反応を繰り返すことにより、効率的に目標領域を有する DNAを増幅することができる。 一般に反応条件は９２〜９５℃で１秒間〜１分間、５０〜６５℃を５秒〜１分間、７０〜７５℃を５秒から５分間を、２０〜４０回繰り返す。 ５０〜６５℃の部分で上記アニールがおこり、反応を成功させるためのアニール温度は、主にプライマーの組成によって規定される。 ７０〜７５℃の部分で伸張がおこり、反応を成功させるための伸張時間は増幅する目標領域の長さによって規定される。 また標的核酸としてＲＮＡとＤＮＡとがあるがＲＮＡの場合、逆転写してｃＤＮＡに変換して増幅する場合とＲＮＡをそのまま増幅する場合がある。
【００２３】
本発明によるＤＮＡ又はＲＮＡの増幅は、上記したＰＣＲ法などによるほかに、ライトサイクラー又はABI PRISM 定量システムなどを用いておこなうこともできる。 また核酸増幅に際しては特異的プライマー、TaqDNApolymerase、ｐＨ調整剤、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩基、牛血清アルブミン、ゼラチンなどの添加剤が添加される。 さらに核酸増幅後に混入するプローブとは蛍光標識プローブなどであり、前記標的核酸と塩基配列が相補であるＲＮＡ又は１本鎖ＤＮＡをいう。 このようなプローブは、ＰＣＲ法、化学合成法などにより作製することができる。 プローブの長さは、通常のハイブリダイゼーション条件下で安定に標的分子とハイブリダイズできる限り、制限されないが、Tm値を設定から１５〜４０塩基が望ましい。
【００２４】
標的核酸の検出は、混入後のプローブに含まれる蛍光標識を融解曲線分析することにより複数の標的核酸を同時的に同定検出する。 標識物質の種類は限定されないが、例えば使用する標識物質が蛍光標識である場合、蛍光顕微鏡、蛍光強度測定装置およびレーザ・スキャニング・サイトメータ（以下、ＬＳＣと略す）等の使用が可能である。 しかし、検出機器は特に上記のものに限定されない。
【００２５】
使用する標識物質が蛍光標識である場合、検出方法の例を以下に示すとFRET（fluorescence resonance energy transfer）の原理を利用して検出する。 FRETとは、近接して蛍光色素が存在するところに励起光を照射した場合、片方の蛍光色素（reporter;R）に吸収されたエネルギーがもう一方の蛍光色素（quencher;Q）に移る現象を言う。
【００２６】
検出プローブの種類としては以下のものが例示される
Ａ．ハイブリプローブ（Roche Diagnostics社製）
これは２種類のプローブが増幅された核酸とハイブリダイズすることにより、２種類の蛍光色素が接近し、quencher側の色素が蛍光を発するようになるので、これを検出するものである
Ｂ．Moleculer Beacon（Stratagene社製）
これは、ハイブリダイゼーションプローブは遊離の状態ではヘアピン構造をとるため、２種類の蛍光色素（正確には、Moleculer Beaconの場合はquencherは蛍光物質でなく、quenching 作用のある物質）は近接している。 増幅された核酸とハイブリダイズすることにより、互いの距離が離れ、reporter側の色素が蛍光を発するようになるので、これを検出するものである。
【００２７】
上記いずれのものを使用する場合においても、それぞれの核酸配列固有のプローブの区別は融解曲線分析により判定される。 融解曲線分析は、増幅された核酸やプローブと増幅された核酸のハイブリッドを初めは低温（４０℃）から通常０．２℃/secの速度で７５℃まで温度を上げていくとそれぞれの増幅された核酸やプローブが持つ固有のTm値に従い核酸やプローブと増幅された核酸のハイブリッドが融解し、この場合、増幅された核酸はSyber-GreenIが、またプローブと増幅された核酸のハイブリッドはFRETの蛍光強度が急激に落ちる。 そしてその温度に対する急激に落ちた蛍光強度変化を微分してピーク化したものを分析する方法による。
【００２８】
なお、上記したSyber-GreenIとは、インターカレート試薬とも呼ばれ、２本鎖遺伝子の中に入り込むことによって、その蛍光強度や蛍光波長が著しく変化するものがあり、その性質を利用して２本鎖遺伝子を検出するものである。 １本鎖 DNAになると離れて再び変化する。
【００２９】
【実施例】
〔ＤＮＡの抽出〕
ウィルス性疾患の疑いのある患者から採血した血液から試料として Viral DNA抽出をした。 DNA の抽出は、QIAamp DNA Blood Mini kit を用い、以下の操作方法により抽出した。 すなわち 1.5μl tubeにProteinase K 20μlを入れ、そのTube内に血液または血清を200μl+Buffer AL200μl加え、これをVortex 15secした後、56C 10min incubation Tubeをスピンしてサンプルを集めた。
【００３０】
これに100% Ethanol 200μlを加え、Vortex 15sec し、さらにスピンした後に 2ml 遠心Tubeにセットしたスピンカラムにサンプルを移す。 8000rpm 1min 遠心後、2ml の遠心tube内の溶液を捨て、再びスピンカラムにセットする。 このスピンカラムにBuffer AW1 500μlを加えて再び8000rpm 1min 遠心する。
【００３１】
新しい 2ml 遠心tubeに交換してスピンカラム内にBuffer AW2 500μlを加え、これを再び 14000rpm 3min 遠心する。 2ml の遠心tube内の溶液を捨て、再びスピンカラムにセットし、14000rpm 1min 遠心する。 1.5ml 遠心tube内にスピンカラムを移し、Buffer AE 50μl を加え、室温で1min放置した後、8000rpm 1min 遠心してDNAを回収する。
【００３２】
〔核酸の増幅〕
DNA ウィルスについては、Herpes Simplex Virus1(HSV1)、 Herpes Simplex Virus2(HSV2)、 Varicella-Zoster Virus(VZV)、 Human Cytomegalovirus(HCMV)、 Human Herpes Virus 7(HHV7)、 Human Herpes Virus 8(HHV8)、 parvoB19、 BK Virus (BKV)、 JC Virus (JCV) などの各ウィルスを同時定性する。
【００３３】
これに添加するプライマーとしてウィルス特異的配列を有する核酸配列（例えば、
Journal of Medical Virology ,2002,68,p.399-403,
Journal of Clinical Microbiology Dec,2001,p.4357-4361.
Journal of Clinical Microbiology ,Dec,2001,p.4413-4419.
Journal of Clinical Microbiology ,Nov,2000,p.4006-4009.
Journal of Clinical Microbiology ,Sept,2000,p.3187-3189.
BMC Microbiology,2002, 2,p.12-22
に記載されている核酸配列のもの）、
またＨＨＶ７に特異的な増幅プライマー対：gaaaaatccg ccataatagc 配列番号１,atggaacacc tattaacgg c 配列番号2. 10μMを0.2μl ずつ合計2.8μl、 合成酵素として〔 Accuprime Taq DNA polymerase（Invitrogen社製）〕0.25μl、調整剤として 10＊Accuprime PCR buffer I 1μl、これに抽出した DNA 5μlと、Nucrease Free Water 1.95μlとを加えて合計 10μlとし、これを Mixし、図１に示したライトサイクラーキャピラリー１の透明ガラス製の細長い容器２内に注入（図１Ａのａ参照）する。 なお核酸の増幅手段としては、この場合ＰＣＲ法を用いた。
【００３４】
〔プローブの混入〕
ついでその上部に、蛍光色素（LCRed640,LCRed705,FITC）が付着したウィルス特異的ハイブリダイゼーションプローブミックス（例えば、
BMC Microbiology,2002, 2,p.12-22
Journal of Medical Virology ,2002,68,p.399-403,
Journal of Clinical Microbiology Dec,2001,p.4357-4361.
Journal of Clinical Microbiology ,Dec,2001,p.4413-4419.
Journal of Clinical Microbiology ,Nov,2000,p.4006-4009.
Journal of Clinical Microbiology ,Sept,2000,p.3187-3189.
に記載されている核酸配列のもの、ＨＨＶ７に特異的なプローブ： ttgtgaaatg tgttgcgata gggc 核酸配列３、gccataagaa acaggtacag acattgtca 核酸配列４、およびＨＣＭＶに特異的なプローブ：acaccactta tctg 核酸配列５、ＶＺＶに特異的なプローブ： aagttcgcgg tataattgt 核酸配列６を記載されているものの代わりに用いる。以上のプローブ混合液をつくり４μl 入れ（図１Ａのｂ参照）てプラスチック製の蓋３で栓をした。 この状態ではＰＣＲ溶液ａとハイブリイゼーションプローブミックスｂとは分離された状態にある。
【００３５】
キャピラリーを刺したカローセルをライトサイクラーにセットしてＰＣＲをおこなった。 ＰＣＲ条件は９５℃で２分、次に９５℃で１秒、５７℃で１５秒、７２℃で１５秒の温度サイクルを４０サイクルおこない、最後に４０℃で３０秒間の冷却をして終了した。
【００３６】
上記すべてのTemperature Transition Rateは20C/secでおこなった。 次にカローセルをカローセル遠心機にて遠心（3000rpm ３秒）し、ＰＣＲ反応液10μlとハイブリダイゼーションプローブミックス４μl を混合（図１Ｂのｃ参照）して１分間放置した後、再びライトサイクラーにカローセルをセットして、融解曲線分析をおこなった。 分析条件は、９５℃ １分、Temperature Transition Rate20C/sec、４０℃ １５秒 Temperature Transition Rate20℃/sec、７５℃０秒 Temperature Transition Rate0.6℃/sec Acquistion Mode CONT、４０℃ ３０秒である。
【００３７】
なおプローブの混合には上記した図１のライトサイクラーキャピラリー１に代えて図２にあらわしたマイクロチューブ（ＰＣＲチューブ）４を用いることもできる。 これはポリプロピレン等の透明な容器５と折り曲げ自在のヒンジを介して施蓋可能な蓋６とからなるもので、図２Ａはプローブを混合する前段階をあらわし、PCR 反応液ａ，プローブ溶液ｂ，ミネラルオイルｃが順次積層状に充填された状態をあらわしている。 また図２ＢはＰＣＲ後に3000rpm3秒間遠心してプローブ溶液を混合した状態をあらわしている。
【００３８】
〔融解曲線分析の解析〕
融解曲線分析結果を解析するための操作方法について説明すると、Select a Programにおいてプログラムをmelting curve programに選択し、またCalculation MethodをPolynominalに選択した。 Extra Manual Tm を選択して各サンプルのTm値を測定したところ、各ウィルスのハイブリダイゼーションプローブ融解ピーク（Tm値）は図３に示す通りであった。
【００３９】
融解Tm値が同じか、あるいは近いものは、蛍光色素「LCRed640(F2/F1), LCRed705(F3/F1)の２色」を換えて異なる波長で検出するようにした。 この操作によりウィルスが存在すれば、増幅されたＰＣＲ産物にウィルス種特異的プローブがハイブリダイゼーションする。 そして除々に温度を上げていくとそのハイブリダイゼーションプローブ固有のTm値のところでプローブが解離して蛍光強度が急激に落ちる。 縦軸を温度、横軸を温度にして急激に下がった温度変化を微分してピークとする。 その解離ピークのTm値よりウィルス種を判定する。
【００４０】
測定の結果、F2/F1チャンネルでTm値59℃にピークが現れ、HHV6において陽性となった。このサンプルをウィルス定量系にてウィルス定量したところHHV6においては２５コピー／μgDNA検出され、他のウィルスは検出されなかった。 このことから定性系と定量系との一致が見られた。 なおこの場合に予め反応液等を用意しておけば、血液から DNA,RNA抽出に３０分、核酸増幅に３０分、検出に１５分、数にもよるが操作の合計が３０分と、合計１時間４５分で検査作業が完了する。
【００４１】
なおＤＮＡ用ハイブリダイゼーションプローブミックスの組成・蛍光色素・添加量などの概要を図４に示す。
【００４２】
【発明の効果】
以上詳述した通り、本願の発明はPCR容器内に、検出すべき該標的核酸の配列に対して相補的塩基配列を有した標識プローブを含まない反応液を注入する工程と、該標的核酸反応液の上部に、検出すべき該標的核酸の配列に対して相補的塩基配列を有した標識プローブ混合液を注入する工程と、これに蓋をして核酸増幅させる工程と、核酸増幅後に遠心して反応液と標識プローブ混合液とを混合させる工程と、混合後に標識プローブの分析をする工程とからなる標的核酸の検出方法であるために、特殊技術を要することなく、従来技術より短時間で、しかも、少なくとも５種類以上の異なる核酸配列の増幅結果を、より高い検出感度で同時的に確認することができる。
【００４３】
その結果、傷病・病害の予防、または治療において、患者の体内に原因となる有害細菌やウイルスが存在するか否かを迅速に同定検出することができ、また近時盛んとなった移植医療、再生医療の分野において、患者に移植や移入する際の有害細菌・ウィルスの混入を事前に避けることができ、迅速かつ安全でしかも高品質の移植医療、再生医療の実現に寄与するところが大きい。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明において用いるプローブ混合手段の一例をあらわしたライトサイクラーキャピラリーの縦断面図。
【図２】本発明において用いるプローブ混合手段の別の例をあらわしたマイクロチューブ（ＰＣＲチューブ）の縦断面図。
【図３】本発明におけるＤＮＡウイルスハイブリダイゼーションプローブの融解ピークをあらわした実験結果表。
【図４】本発明において用いるＤＮＡウイルスハイブリダイゼーションプローブの内容をあらわした一覧表。
【符号の説明】
１ ライトサイクラーキャピラリー
２ 容器
３ 蓋
４ マイクロチューブ（ＰＣＲチューブ）
５ 容器
６ 蓋
Claims (10)
- ＰＣＲ容器内に、検出すべき該標的核酸の配列に対して相補的塩基配列を有した標識プローブを含まない反応液とともにある標的核酸を注入する工程と、該標的核酸反応液の上部に、検出すべき該標的核酸の配列に対して相補的塩基配列を有した標識プローブ混合液を注入する工程と、これに蓋をして核酸増幅させる工程と、核酸増幅後に遠心して反応液と標識プローブ混合液とを混合させる工程と、混合後に標識プローブの分析をする工程とからなる標的核酸の検出方法。
- ＰＣＲ容器内に、検出すべき該標的核酸の配列に対して相補的塩基配列を有した標識プローブ混合液を注入する工程が、該標的核酸反応液の上部にミネラルオイルを加え、該ミネラルオイル層上に検出すべき該標的核酸の配列に対して相補的な塩基配列を有した標識プローブ混合液を注入するものである請求項１に記載の標的核酸の検出方法。
- ＰＣＲ容器が、マイクロチューブであるところの請求項１または請求項２に記載の標的核酸の検出方法。
- ＰＣＲ容器が、キャピラリーであるところの請求項１または請求項２に記載の標的核酸の検出方法。
- 反応液中の核酸がＤＮＡ又はＲＮＡであるところの請求項１又は請求項２に記載の標的核酸の検出方法。
- 標的核酸の増幅手段がＰＣＲ法によるものであるところの請求項１又は請求項２に記載の標的核酸の検出方法。
- 核酸増幅後に混合する標識プローブが、蛍光標識プローブであるところの請求項１又は請求項２に記載の標的核酸の検出方法。
- 標的プローブの分析が融解曲線分析であるところの請求項１又は請求項２に記載の標的核酸の検出方法。
- 標的核酸が、癌関連遺伝子、遺伝病に関連する遺伝子、ウィルス遺伝子、細菌遺伝子及び病気のリスクファクターと呼ばれる多型性を示す遺伝子である塩基配列のものであるところの請求項１又は請求項２に記載の標的核酸の検出方法。
- 標的核酸として少なくとも５種類以上の異なる核酸配列を同時的に確認することができるところの請求項１〜９のいずれか１に記載の標的核酸の検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003164799A JP4571786B2 (ja) | 2003-06-10 | 2003-06-10 | 標的核酸の検出法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003164799A JP4571786B2 (ja) | 2003-06-10 | 2003-06-10 | 標的核酸の検出法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2005000025A JP2005000025A (ja) | 2005-01-06 |
| JP4571786B2 true JP4571786B2 (ja) | 2010-10-27 |
Family
ID=34091470
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2003164799A Expired - Fee Related JP4571786B2 (ja) | 2003-06-10 | 2003-06-10 | 標的核酸の検出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4571786B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE102008035891A1 (de) | 2008-07-31 | 2010-02-04 | Oerlikon Leybold Vacuum Gmbh | Vakuumpumpe |
| TWI625395B (zh) * | 2016-09-10 | 2018-06-01 | 旭基科技股份有限公司 | 用於同時檢測及定量分析四種血源性病毒的多重Ｔａｑｍａｎ探針ｑＰＣＲ反應之套組 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002191384A (ja) * | 2000-11-15 | 2002-07-09 | F Hoffmann La Roche Ag | 反復性ｐｃｒ産物の融解曲線解析方法 |
| JP2002525128A (ja) * | 1998-09-30 | 2002-08-13 | ユニバーシティ オブ ユタ リサーチ ファウンデーション | 蛍光ハイブリダイゼーションプローブを用いる多重化遺伝子型判定 |
| JP2003510092A (ja) * | 1999-09-28 | 2003-03-18 | シトネット ゲーエムベーハー ウント ツェーオー．カーゲー | Ｅｈｅｃ感染を検出するための多重ｐｃｒ |
| JP2003511009A (ja) * | 1999-08-02 | 2003-03-25 | ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティー | デジタル増幅 |
-
2003
- 2003-06-10 JP JP2003164799A patent/JP4571786B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002525128A (ja) * | 1998-09-30 | 2002-08-13 | ユニバーシティ オブ ユタ リサーチ ファウンデーション | 蛍光ハイブリダイゼーションプローブを用いる多重化遺伝子型判定 |
| JP2003511009A (ja) * | 1999-08-02 | 2003-03-25 | ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティー | デジタル増幅 |
| JP2003510092A (ja) * | 1999-09-28 | 2003-03-18 | シトネット ゲーエムベーハー ウント ツェーオー．カーゲー | Ｅｈｅｃ感染を検出するための多重ｐｃｒ |
| JP2002191384A (ja) * | 2000-11-15 | 2002-07-09 | F Hoffmann La Roche Ag | 反復性ｐｃｒ産物の融解曲線解析方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2005000025A (ja) | 2005-01-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6784723B2 (ja) | マルチプル増幅サイクル検出 | |
| US11041191B2 (en) | Genetic markers for discrimination and detection of gray SPH region on Koi herprsvirus causing infectious aquatic organism diseases, and method of discriminating and detecting the virus using the same | |
| CN107385040B (zh) | 用于扩增多个靶标的扩增子拯救多重聚合酶链式反应 | |
| JP2007537746A (ja) | ２つの異なるアニーリング温度を示すｐｃｒ時におけるアンプリコン混入の検出方法 | |
| JP3426262B2 (ja) | 迅速なｐｃｒサイクルを用いる核酸の増幅方法及び検出方法 | |
| CN111270021A (zh) | 一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的引物对、探针、组合物、试剂盒及应用 | |
| JP2018528780A (ja) | 短いホモポリマー反復の改良された検出 | |
| KR102030244B1 (ko) | 뎅기 바이러스 검출용 올리고뉴클레오티드 세트 및 이의 용도 | |
| JP2024036617A (ja) | 病原体検出方法およびキット | |
| KR102061896B1 (ko) | 소 바이러스성 설사 바이러스 유전형 판별용 pna 프로브 및 이를 이용한 소 바이러스성 설사 바이러스 유전형 판별방법 | |
| JP7272202B2 (ja) | 標的核酸の検査方法および検査装置 | |
| JP4571786B2 (ja) | 標的核酸の検出法 | |
| KR102030245B1 (ko) | 치쿤군야 바이러스 검출용 올리고뉴클레오티드 세트 및 이의 용도 | |
| WO2016196827A1 (en) | Sample to sequence | |
| KR101655069B1 (ko) | 잉어 허피스 바이러스 그레이 에스피에이치 판별용 유전자 마커, 및 이를 이용한 원인바이러스의 판별 방법 | |
| KR101655071B1 (ko) | 참돔 이리도 바이러스 판별용 유전자 마커, 및 이를 이용한 원인바이러스의 판별 방법 | |
| JP2008306974A (ja) | Ｈｃｖ遺伝子型判定方法、並びに、これに用いるｌｎａプローブ及びキット | |
| JP5863162B2 (ja) | 標的核酸の検出方法 | |
| JPH10211000A (ja) | 細菌検出方法 | |
| KR20240038203A (ko) | 호흡기 바이러스 감염 진단을 위한 RT-qLAMP용 프라이머 세트 및 이를 포함하는 키트 | |
| JP2024095485A (ja) | 核酸検出用ｐｃｒ溶液 | |
| CN117467781A (zh) | 与布鲁氏菌复方新诺明耐药性相关的snp标记、pcr引物对和探针对、试剂盒及其应用 | |
| KR20240058022A (ko) | 대장균의 o105, o10, o119, o132, o150, o35, o25, o36, o177, o26 또는 o2 혈청형 신속 동정용 프라이머 세트 및 이를 이용한 대장균의 혈청형 동정 방법 | |
| KR20240058024A (ko) | 대장균의 o115 혈청형 신속 동정용 프라이머 세트 및 이를 이용한 대장균의 혈청형 동정 방법 | |
| KR20240058020A (ko) | 대장균의 o146 또는 o51 혈청형 신속 동정용 프라이머 세트 및 이를 이용한 대장균의 혈청형 동정 방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060511 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090616 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090813 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090826 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20091224 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20091224 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100216 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100415 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100603 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20100720 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20100813 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130820 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4571786 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130820 Year of fee payment: 3 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130820 Year of fee payment: 3 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20160820 Year of fee payment: 6 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |