CN101787347A - 一种通过温度控制反应进程的反应管 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因工程领域，公开了一种通过温度控制反应进程的反应管。该反应管是在管内设计密封层，将需要控制的反应进程所需的反应试剂封于密封层中，通过控制温度的变化实现密封材料的熔化，释放被密封的反应试剂，从而实现反应进程的控制。这种反应管有效避免了反应过程中频繁打开反应管添加试剂造成的污染及反应结束后的滞后污染，减少反复添加试剂对反应过程的干扰，易于自动化控制，在一定程度上还可以控制各反应进程的起始时间，提高反应的特异性，也便于携带和运输，所需反应试剂无需要临时配制，节省操作时间。

Description

一种通过温度控制反应进程的反应管
技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及一种通过温度控制反应进程的反应管。
背景技术
聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。
滚环扩增技术(Rolling Circle Amplification，RCA)是一种等温信号扩增方法，DNA可在很短时间内实现指数扩增，因此，可用于痕量分子的检测。目前，该技术既可以扩增环状DNA、RNA，也可以扩增线性DNA，甚至全基因组DNA，主要用于全基因组扩增、核酸测序、单核苷酸多态性以及DNA芯片、蛋白质芯片分析等广泛领域。
环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal Amplification，LAMP)技术是近年来发展出的一种可替代PCR的敏感、特异、方便快捷的核酸扩增技术。其反应在不到1个小时的时间里进行核酸的扩增，其效率可达到109-1010个拷贝数量级。该方法具有简单、快速、准确、廉价、易检测等特点。
随着生物技术的发展，聚合酶链式反应(PCR)、滚环扩增反应(RCA)和环介导等温核酸扩增(LAMP)等核酸扩增技术在生物分析、病原微生物检测和疾病诊断等临床和基础研究中均有广泛应用，但作为核酸扩增技术，其最大的不足之处就是容易产生产物的滞后污染，尤其是在对扩展产物进行检测需要开管时，极易造成产物的污染。而这些核酸扩增技术的反应进程包括反应起始、终止和检测等均需要通过打开反应管加入或取出试剂才能进行，尤其是某些反应进程中若提前加入在后反应进程所需的试剂则会造成干扰甚至影响反应的继续进行，这些不足使得相应技术对操作人员和实验环境有很高的要求，限制了其应用范围，尤其是现场快速检测。
作为核酸扩增技术，由于聚合酶在低温仍有活性，引物错误退火可能导致非特异性的扩展。目前克服这种非特异扩增主要通过热启动聚合酶，其成本较普通聚合酶高很多，增加了实验成本，不利技术的推广。
目前没有一种无需在反应过程中添加反应试剂、减少操作污染、只需调节温度就能控制反应进程的温控反应管。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用温度控制反应进程的反应管。
本发明的目的是通过下列技术方案实现的：
一种通过温度控制反应进程的反应管，该反应管是在管内设计密封层，将需要控制的反应进程所需的反应试剂封于密封层中，通过控制温度的变化实现密封材料的熔化，释放被密封的反应试剂，从而实现反应进程的控制。
所述的反应管，当密封层为多层时，根据不同反应进程的先后顺序将密封层设置于该密封层熔化(实际上是构成该密封层的密封材料熔化，为表述方便而采用“密封层熔化”的描述，下同)后该密封层中的反应试剂能与前一反应进程反应体系(通常是反应液)相接触的位置，各密封层的熔化温度小于等于对应的反应进程的反应温度且高于在先反应进程的反应温度并低于与在后反应进程对应的密封层的熔化温度(最先的反应进程若采用密封层时因不存在在先反应进程而不考虑该密封层的熔化温度是否高于在先反应进程的反应温度，同理，最后熔化的密封层由于不存在在后反应进程对应的密封层而不考虑低于该密封层的熔化温度是否低于在后反应进程对应的密封层的熔化温度)。各密封层熔化顺序的设置按照反应温度从低至高的顺序。
所述的反应管，根据需要采用密封层控制的不同反应进程的先后顺序依次设置密封层，最外层的密封层(即最接近反应管管口的密封层)对应在先进行的反应进程。
所述的反应管，该反应管温度调节按照所需控制的反应进程分段调节，高于等于相应反应进程的反应温度且低于在后反应进程对应的密封层的熔化温度。优选将反应管温度调节至相应反应进程所需的反应温度，与相应反应进程对应的密封层因熔点小于等于该反应温度而熔化，将预先封于该密封层内的试剂释放，使相应的反应进程能够进行。
所述的反应管，其中反应管温度调节应按照反应进程的先后顺序从低温向高温调节。
所述的反应管，其中不同的密封层采用不同熔点的物质作为密封材料。
所述的反应管，其中不同熔点的物质为不同熔点的石蜡或不同熔点的的低熔点聚四氟乙烯。
所述的反应管，根据所需反应阶段的数目设计密封层的数量；不同温度的反应进程其相应密封层的熔点不同。
所述的反应管，其中密封层中的反应试剂混合在密封材料中或由密封材料隔开。
制备温控反应管时首先在管内加入相应反应阶段所需试剂，然后在所需试剂表面加入选择适当的石蜡(以石蜡为例，亦可采用其他密封层材料)，加热至石蜡融化，冷却至室温后实际即被石蜡密封。根据整个反应中需要采用密封层控制的不同进程的数量和反应温度设计反应管中密封层的数量和次序(或位置)，根据不同反应进程的温度选择熔点合适的石蜡作为密封层材料。
本发明所述温控反应管不限于应用于基因工程领域。
本发明的有益效果：
本发明提供的能够通过温度改变控制反应进程的反应管，通过改变温度，释放预先保存于反应管内的试剂，从而实现控制反应起始、终止和检测等进程。这种反应管有效避免了反应过程中频繁打开反应管添加试剂造成的污染及反应结束后的滞后污染，减少反复添加试剂对反应过程的干扰，易于自动化控制，在一定程度上还可以控制各反应进程的起始时间，提高反应的特异性。这种反应管可以广泛应用于生物医学领域的基础研究以及生物分析、病原微生物检测、疾病诊断的领域。另外，本发明温控反应管根据反应进程将所需反应试剂事先封好，便于携带和运输，无需要临时配制，节省操作时间。
附图说明
图1是本发明温控反应管示意图。其中：1、密封材料一；2、密封材料二；3、试剂一；4、试剂二；5、管身；6、管盖。密封材料一与试剂一构成密封层一，密封材料二与试剂二构成密封层二。
图2本发明温控反应管不同温度密封层示意图。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
石蜡供应厂商：南阳石蜡精细化工厂。
石蜡规格及特性
实施例1
结合图2，根据不同反应进程的先后顺序将密封层设置于该密封层熔化后该密封层中的反应试剂能与前一反应进程反应体系(通常为反应液，对于首次反应，由于不存在前一反应进程，故反应体系通常为待检物以及首次反应所需的不包含被密封的反应试剂的其他反应试剂)相接触的位置，各密封层的熔化温度小于等于对应的反应进程的反应温度且高于在先反应进程的反应温度(对应首次反应的密封层不考虑此条件，如本例中30℃密封层)并低于与在后反应进程对应的密封层的熔化温度(对应最后熔化的密封层不考虑此条件，如本例中80℃密封层)。各密封层中的反应试剂分别混合在构成各反应进程对应的密封层的密封材料中或由该密封材料隔开。进行反应时，反应管温度调节按照所需控制的反应进程分段调节，高于等于相应反应进程的反应温度且低于在后反应进程对应的密封层的熔化温度(为避免反应管温度高于相应反应进程的反应温度时会对某些反应进程造成不利影响，本例中各阶段反应管温度调节至相应反应进程所需的反应温度即可)。假设图2中各反应进程的反应温度依次为30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃，构成各反应进程对应的密封层的密封材料(如石蜡)的熔化温度分别为28～30℃、38～40℃、48～50℃、58～60℃、68～70℃、78～80℃，起始反应温度为30℃。加入待检物，反应管温度升至30℃时，30℃密封层熔化，释放第一阶段所需的反应试剂，第一阶段反应进行，熔化的石蜡浮于反应液上部；反应适当时间后，再将反应管温度升至40℃，40℃密封层熔化，释放第二阶段所需的反应试剂，第二阶段反应进行，熔化的石蜡浮于反应液上部；反应适当时间后，再将反应管温度升至50℃，50℃密封层熔化，释放第三段阶段所需的反应试剂，第三阶段反应进行，熔化的石蜡浮于反应液上部；以此类推，在60℃进行第四阶段反应，在80℃进行第五阶段反应。反应结束后，降低温度(或冷却)，浮于反应液上部的全部或部分石蜡凝固将反应液密封，避免滞后污染。
实施例2：温度控制实现反应终止
本方案通过温度控制密封层内反应终止剂的释放，实现温度控制反应终止，主要针对RCA以及LAMP等恒温反应的终止。本方案可以使用简单的恒温装置，实现对反应的控制，适合在病原微生物、疾病诊断等快速检验条件下使用。
在反应管底加入反应终止剂如乙二铵四乙酸钠(EDTA)溶液或其他金属络合剂以及蛋白变性剂。在其上表面加入10μl石蜡(80#)。将反应管加热到石蜡熔点使石蜡融化，将反应管取出冷却，使石蜡重新凝固形成密封层。
在进行RCA或LAMP反应时，在石蜡密封层上加入反应体系。恒温反应(60℃)结束后，将反应管加热至石蜡熔点，由于石蜡密度小于水，故石蜡融化后会漂浮于液体表面上层，反应体系则会与石蜡密封层下的反应终止剂混合，在反应终止剂所需要反应温度满足时，使RCA或LAMP反应终止。
将反应管取出冷却后，石蜡会再次凝固，使液体表面与空气隔绝，避免了反应产物可能造成的滞后污染。
实施例3：温度控制实现产物检测
本方案通过温度控制密封层内产物指示剂的释放，实现扩增反应和产物指示在同一管内进行。本方案主要针对RCA和LAMP等等温扩增反应，可以实现病原微生物现场快速、简便、可视化检测。
在反应管底部加入产物指示剂如SYB Green，Gold View等。在其上表面加入10μl石蜡(64#)。将反应管加热至石蜡熔点，使石蜡融化。取出反应管冷却至室温，使石蜡重新凝固形成密封层。
在进行RCA和LAMP等等温扩增反应时，在石蜡密封层上加入反应体系。恒温反应(60℃)结束后，将反应管加热至石蜡熔点，由于石蜡密度小于水，故石蜡融化后会漂浮于液体表面上层，反应体系则会与产物指示剂混合，在产物指示剂所需要反应温度满足时，产生肉眼可观测到的变化，实现对扩增产物的可视化检测。
本方案设计的检测方法一方面避免了在反应体系内加入产物指示剂造成的对扩增反应的抑制，另一方面实现了在同一反应管内实现反应和监测，不需要打开反应管，避免了产物的滞后污染。
实施例4：温度控制实现普通耐热聚合酶的热启动反应
本方案通过温度控制密封层内反应体系中关键成分的释放，实现在低温下非特异扩增反应被抑制，即实现普通耐热聚合酶的热启动反应。本方案主要针对PCR反应，可以实现使用价格低廉的普通耐热聚合酶进行热启动PCR。
在反应管底部加入PCR反应的关键成分，如耐热聚合酶、镁离子、dNTP等的一种或几种。在其上表面加入10μl石蜡(85#)。将反应管加热至石蜡熔点，使石蜡融化。取出反应管冷却至室温，使石蜡重新凝固形成密封层。
在进行PCR反应前，在石蜡密封层上加入除密封层内关键成分以外的反应体系。在进行反应时，首先加热到石蜡熔点之上并恒温5分钟，使石蜡充分融化。由于石蜡密度小于水，故石蜡融化后会漂浮于液体表面上层，反应体系将会与石蜡密封层之下的反应关键成分混合，扩增反应所需的反应温度亦满足，从而启动扩增反应。
本方案设计能够利用普通耐热聚合酶进行热启动反应，抑制了非特异扩增反应，提高了PCR反应的特异性，并且较热启动酶成本大大降低，有利于热启动技术的推广。
实施例5：温度控制实现普通耐热聚合酶热启动及显色反应
结合图1，本方案通过温度控制密封层二内反应体系中关键成分的释放，实现在低温下非特异扩增反应被抑制，同时通过更高的温度控制密封层一内的显色试剂释放，即在单管内实现普通耐热聚合酶的热启动及显色反应。本方案主要针对PCR反应，可以实现使用价格低廉的普通耐热聚合酶进行热启动PCR并且对PCR产物进行显色检测。
在反应管5的底部加入产物指示剂如SYB Green，Gold View等(即试剂一)。在其上表面加入10μl石蜡一(95#)(即密封材料一)。将反应管加热至石蜡一熔点，使石蜡一融化。取出反应管冷却至室温，使石蜡一重新凝固形成密封层一。
在密封层一表面加入PCR反应的关键成分，如耐热聚合酶、镁离子、dNTP等的一种或几种(即试剂二)。在其上表面加入10μl石蜡二(85#)(即密封材料二)，其温度低于PCR变性温度且低于密封层一的石蜡一的熔点。将反应管加热至石蜡二的熔点，使石蜡二融化。取出反应管冷却至室温，使石蜡二重新凝固形成密封层二。
在进行PCR反应前，在石蜡密封层二上加入除密封层内关键成分外反应体系，盖上管盖6。在进行反应时，首先加热到石蜡二的熔点之上并恒温5分钟，使石蜡二充分融化。由于石蜡密度小于水，故石蜡二融化后会漂浮于液体表面上层，反应体系将会与石蜡二之下的反应关键成分(即试剂二)混合，反应管温度符合扩增反应所需温度，从而启动扩增反应。
扩增反应结束后，将反应管加热至石蜡一的熔点，由于石蜡密度小于水，故石蜡一融化后会漂浮于液体表面上层，反应体系则会与产物指示剂(即试剂一)混合，反应管温度符合产物指示剂所需温度，产生肉眼可观测到的变化，实现对扩增产物的可视化检测。
本方案设计能够利用普通耐热聚合酶进行热启动反应，抑制了非特异扩增反应，提高了PCR反应的特异性的同时能够进行在同一管内对扩增产物进行显色反应。

Claims (10)

1.一种通过温度控制反应进程的反应管，其主要特征是在管内设计密封层，将需要控制的反应进程所需的反应试剂封于密封层中，通过控制温度的变化实现密封材料的熔化，释放被密封的反应试剂，从而实现反应进程的控制。
2.根据权利要求1所述的反应管，其特征在于密封层为多层时，根据不同反应进程的先后顺序将密封层设置于该密封层熔化后该密封层中的反应试剂能与前一反应进程反应体系相接触的位置，各密封层的熔化温度小于等于对应的反应进程的反应温度且高于在先反应进程的反应温度并低于与在后反应进程对应的密封层的熔化温度。
3.根据权利要求2所述的反应管，其特征在于根据需要采用密封层控制的不同反应进程的先后顺序依次设置密封层，最外层的密封层对应在先进行的反应进程。
4.根据权利要求2所述的反应管，其特征在于反应管温度调节按照所需控制的反应进程分段调节，高于等于相应反应进程的反应温度且低于在后反应进程对应的密封层的熔化温度。
5.根据权利要求4所述的反应管，其特征在于将反应管温度调节至相应反应进程所需的反应温度，与相应反应进程对应的密封层因熔点小于等于该反应温度而熔化，将预先封于该密封层内的试剂释放，使相应的反应进程能够进行。
6.根据权利要求4或5所述的反应管，其特征在于反应管温度调节应按照反应进程的先后顺序从低温向高温调节。
7.根据权利要求2所述的反应管，其特征在于不同的密封层采用不同熔点的物质作为密封材料。
8.根据权利要求2所述的反应管，其特征在于不同熔点的物质为不同熔点的石蜡或不同熔点的的低熔点聚四氟乙烯。
9.根据权利要求2所述的反应管，其特征在于根据所需反应阶段的数目设计密封层的数量；不同温度的反应进程其相应密封层的熔点不同。
10.根据权利要求1所述的反应管，其特征在于密封层中的反应试剂混合在密封材料中或由密封材料隔开。
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