CN105121659A - 单细胞中的靶蛋白和靶核酸的同时检测 - Google Patents

单细胞中的靶蛋白和靶核酸的同时检测 Download PDF

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Abstract

提供了用于检测和分析核酸的方法和试剂。该方法采用邻近延伸测定用来检测感兴趣的靶核酸，例如靶RNA。另外，该方法可与用于检测蛋白的蛋白邻近延伸测定一起用于多重测定。

Description

单细胞中的靶蛋白和靶核酸的同时检测
相关申请的交叉引用
本申请要求2013年3月15日提交的美国临时申请号61/799,559的权益，该临时申请为了所有目的通过引用并入本文。
发明领域
本发明涉及对于在单细胞中检测核酸，例如RNA是足够灵敏的基于扩增的检测系统。该方法可与用于蛋白检测的邻近延伸测定(proximityextensionassay)组合使用以提供检测核酸和蛋白两者的多重测定。
背景
由单独的细胞检测和定量蛋白和核酸是令人期望的，但因为单细胞中存在的材料微量而难以实现。此外，不像大块样品(bulksample)，单细胞不可划分为部分以分别分析蛋白和核酸水平。尽管单分子检测技术或质谱可提供用于实现单细胞分析的方法，这些方法是昂贵的。最近，已开发了一种测定，邻近延伸测定(PEA)，其足够灵敏以检测皮克量的蛋白(参见，例如，Lundberg等人，Nucl.AcidsRes.2011Aug；39(15):e102；epub2011Jun6,通过引用并入本文)。在一种方法中，PEA采用各具有附着至它的寡核苷酸的一对抗体。寡核苷酸包含彼此互补的区域。当抗体结合至靶蛋白时，寡核苷酸足够紧密邻近，使得来自各寡核苷酸的互补区域彼此杂交。DNA聚合酶的添加导致杂交的寡核苷酸的延伸。然后可检测或定量延伸产物。
发明简述
在各个方面，本发明包括，但不限于，以下的实施方案。
在一个方面，本发明提供了在样品中检测靶核酸，通常为RNA，的方法，该方法包括(a)在反应混合物中孵育：i)包含靶核酸的样品；和ii)包含第一和第二探针的一对邻近探针，其中：第一探针包含与靶核酸的第一靶(T)区段杂交的靶结合(TB)区段，和在该探针的3’末端处的相互作用(I)区段，其中I区段与在第二探针的3’末端处的I区段互补；且第二探针包含与紧密邻近(incloseproximity)该第一T区段的靶核酸的第二、非重叠T区段杂交的TB区段，和在3’末端处的I区段，其中该3’序列与该第一探针的I区段互补，其中
将反应混合物在其中第一探针的TB区段与靶核酸的第一T区段杂交且第二探针的TB区段与靶核酸的第二T区段杂交的条件下孵育，由此允许第一探针的I区段与第二探针的I区段杂交以形成包含第一和第二探针的I区段的双链体；
(b)添加DNA聚合酶并在其中延伸第一和/或第二探针的条件下保持反应混合物以获得第一延伸产物；
(c)在包含扩增第一延伸产物、或其亚区的一对扩增引物的扩增反应混合物中扩增延伸产物、或其亚区；
(d)检测(c)中获得的扩增子。
在一些实施方案中，检测扩增子的步骤包括使用例如qPCR反应定量扩增子。
在一些实施方案中，样品是单细胞。
在一些实施方案中，邻近对的成员中的一个在3’末端被封闭，以在步骤(b)中延伸仅一个探针。
在一些实施方案中，在延伸步骤中应用的DNA聚合酶具有3’核酸外切酶活性。在一些实施方案中，用于扩增步骤的聚合酶与用于延伸步骤的聚合酶不同。例如，用于扩增步骤的聚合酶可以是热稳定的，而用于延伸步骤聚的合酶可不是热稳定的。
在一些实施方案中，该方法还包括检测样品中的靶蛋白。在这样的实施方案中，该方法还包括：
将(a)的反应混合物中的样品与包含第一和第二蛋白检测邻近探针(protein-detectingproximityprobes)的一对蛋白检测邻近探针孵育，其中：
第一蛋白检测探针包含与靶蛋白结合的第一抗体，所述第一抗体与第一多核苷酸连接，所述第一多核苷酸包含与第二探针的3’末端上的I区段互补的3’末端上的I区段；且
第二蛋白检测探针包含与靶蛋白结合的第二抗体，所述第二抗体与第二多核苷酸连接，所述第二多核苷酸包含与第一多核苷酸的3’末端上的I区段互补的I区段；
其中第一抗体与靶蛋白的结合和第二抗体与靶蛋白的结合允许第一蛋白邻近探针的I区段与第二蛋白邻近探针的I区段杂交以形成步骤(b)中延伸的双链体，以提供第二延伸产物；
使用扩增第二延伸产物或其亚区的一组引物在(c)的扩增反应中扩增第二延伸产物、或其亚区；以及
检测来自第二延伸产物或其亚区的扩增的扩增子的量。
在一些实施方案中，检测该量的步骤包括使用例如qPCR反应定量扩增子的量。
在一些实施方案中，反应是在其中检测多种RNA的多重反应。
在另外的方面，本发明包括邻近探针对用于检测/定量样品中的靶核酸的用途；或邻近探针对用于检测/定量样品中的靶核酸和蛋白的用途。在一些实施方案中，本发明提供了邻近探针对用于检测/定量样品中的靶核酸的用途；或邻近探针对用于检测/定量样品中的靶核酸和蛋白的用途，其中邻近探针对的成员的一个被封闭。
附图简述
图1示出了检测靶RNA的核酸邻近延伸测定的一个实施方案。在该实施方案中，探针对的各成员的3’末端是可延伸的。
图2示出了检测靶RNA的核酸邻近延伸测定的另一个实施方案。在该实施方案中，探针中的一个的3’末端被封闭。
详细说明
1.定义和术语
如本文所用，“序列”意指多核苷酸的核酸碱基序列。除非另外指明或从上下文明显，当碱基或序列元件在多核苷酸中出现时，它们以顺序5’至3’呈现。
“多核苷酸”或“核酸”包括RNA或DNA的任何形式，包括例如，基因组DNA；互补DNA(cDNA)，其是信使RNA(mRNA)的DNA表示，通常通过mRNA的逆转录获得；以及合成或通过扩增产生的DNA分子。多核苷酸可包括包含非标准碱基(例如，肌苷)的嵌合分子和核酸。多核苷酸可以是单链或双链的。
术语“寡核苷酸”在本文中用于指是相对短的，通常短于200个核苷酸，更特别地，短于100个核苷酸或短于50个核苷酸的核酸。通常，寡核苷酸是单链DNA分子。
“靶多核苷酸”或“靶核酸”是包含靶序列的多核苷酸。在双链靶多核苷酸中，靶序列在一条链上且靶序列的互补序列(complement)在另一条链上。“靶RNA”是包含靶序列的RNA。
术语“区段”是指多核苷酸中的序列或亚序列，诸如具有特定功能的区段，例如，探针结合区段、引物结合区段、索引序列，本文还称为“标签序列”以及本文所列出的其他区段。单独的区段可具有与它们的预期功能一致的任何长度，诸如，但不限于，在10-100个核苷酸、10-70个核苷酸、14-50个核苷酸、14-35个核苷酸的范围内的长度。
“靶序列”是在测定中检测的核酸序列。在大多数情况下，感兴趣的靶序列是预定义的(即，分析之前序列已知)。在其他情况下，完整的靶序列是未知的，而是被定义为由已知序列的引物扩增的序列。靶序列可在DNA(包括基因组的、线粒体的、病毒的、合成的和cDNA)，在RNA、或其可扩增的合成类似物中发现。
如本文所用，术语“互补”是指两个核苷酸之间精确配对的能力。即，如果核酸的给定位置上的核苷酸能够与另一个核酸的核苷酸氢键键合，则这两个核酸被认为在该位置上彼此互补。“互补序列”可以是完全互补或部分互补的序列。两个单链核酸分子之间的互补性可以是“部分的”，其中仅一些核苷酸结合，或当在单链分子之间存在总互补性(totalcomplementarity)时，它可以是完整的。当存在足够互补性使得序列在测定条件下杂交(形成双链区域)时，认为两种寡核苷酸具有“互补”序列。核酸链之间的互补性程度对核酸链之间杂交的效力和强度具有显著效应。部分互补的两条序列可具有，例如，在至少7个核苷酸的序列上，更通常在10-30个核苷酸的序列上，通常在14-25个核苷酸的序列上，且有时在更长序列(例如，26-100个核苷酸长度)上的至少90％同一性、或至少95％、96％、97％、98％、或99％同一性序列。将理解，引物序列的3’碱基将可期望与靶核酸序列的相应碱基完全互补以允许引发发生。当由第一序列组成的多核苷酸与由第二序列组成的多核苷酸足够互补以特异性杂交时，第一序列或区段与第二序列或区段“基本上互补”。为了便于说明，杂交条件是小于约1.0M钠离子，通常约0.01M至1.0M钠离子的盐浓度，在pH7.0至8.3，和用于10个至50个核苷酸长度的多核苷酸的至少约30℃及用于更长探针(例如，大于50个核苷酸)的至少约60℃的温度。通常，当在至少14个-25个核苷酸的延伸(stretch)上存在至少约55％碱基互补、优选地至少65％、更优选地至少75％、更优选地至少85％、更优选地至少90％、和最优选地至少95％时，特异性杂交将发生。引号[’]用于指示完全或基本互补序列。
提及两条多核苷酸序列、区段或链的术语“退火”、“杂交”或“结合”，可互换使用，并具有本领域的通常含义。两条互补序列(例如，DNA和/或RNA)通过与互补碱基形成氢键来退火或杂交，以产生双链多核苷酸或多核苷酸的双链区域。
如果不存在隔开多核苷酸中的两个序列或区段的插入序列或非核苷酸连接体，则它们是“相邻的(adjacent)”或“邻近的(contiguous)”。在一些情况下，“不相邻”是指两条探针结合序列通过插入靶序列彼此分离。
“引物”是包含与靶序列、或其互补序列互补，并能够杂交的序列的寡核苷酸或多核苷酸。通常，“引物”意指可引发模板依赖性的DNA合成的“可延伸引物”。在一些情况下，引物通过DNA依赖性DNA聚合酶延伸。
邻近探针可包括“核苷酸标签”。术语“核苷酸标签”在本文中用于指并入进邻近探针，以方便确认多重作用中的靶分子的预定核苷酸序列。
邻近探针通常包括DNA，但可还包括多核糖核苷酸(含有D-核糖)，和是嘌呤或嘧啶碱基的N-或C-糖苷的任何其他类型核酸，以及包含非核苷酸骨架的聚合物，例如聚酰胺(例如，肽核酸(PNA))和聚吗啉(作为Neugene从Anti-ViralsInc，Corvallis,Oreg.商购可得)聚合物，以及其他合成的序列特异性核酸聚合物，只要聚合物包含允许诸如在DNA和RNA中发现的碱基配对和碱基堆积的构型中的核酸碱基。
术语“多重”和“复用”是指其中两个或更多个引物组用于扩增相同扩增反应混合物中的两个或更多个不同的靶序列的测定。
如本文所用，核酸序列的“扩增”具有其通常的含义，并且是指用于酶促增加靶序列的拷贝数的体外技术。扩增方法包括非对称方法(其中主要产物是单链的)和常规方法(其中主要产物是双链的)两者。
术语“扩增子”和“扩增产物”可互换使用，并具有本领域中它们的常规含义。语法单数术语“扩增子”，可指扩增产物的许多相同拷贝。此外，提及“扩增子”包括扩增步骤中产生的分子和随后扩增步骤中产生的相同分子(诸如，但不限于，在随后几轮PCR扩增所产生的扩增产物)两者。此外，术语“扩增”可指变性、退火和延伸的循环，而不需要序列的几何或指数增加。
“扩增反应混合物”是在其中发生扩增反应的溶液，并可包括以下中的一个或更多个：靶多核苷酸、引物、聚合酶、连接酶、扩增试剂、扩增子、缓冲剂、核酸酶抑制剂、二价阳离子、dNTP、和/或本领域已知用于扩增的其他组分。
术语“qPCR”在本文中用于指定量实时聚合酶链式反应(PCR)，其还称为“实时PCR”或“动力学聚合酶链式反应”。
如本文所用，“样品”是指包含靶多核苷酸的组合物。“样品”还可包含靶蛋白。示例性样品包括细胞和细胞溶解产物(例如，真核细胞、人细胞、动物细胞、植物细胞、干细胞、血细胞、淋巴细胞、细菌细胞、重组细胞和受病原体感染的细胞。组织样品)、病毒、环境样品(例如，水样品)、食物样品、法医样品、植物样品、血液样品等。“细胞溶解产物”包括部分纯化的细胞级分。
“试剂”广义上是指反应中使用的除分析物(例如，被分析的核酸)以外的任何试剂。用于核酸扩增反应的说明性试剂包括，但不限于，缓冲液、金属离子、聚合酶、逆转录酶、引物、模板核酸、核苷酸、标记物、染料、核酸酶等。用于酶促反应的试剂包括，例如，底物、辅因子、缓冲液、金属离子、抑制剂、和活化剂。
如本文所用的术语“标记物”，是指可用于提供可检测和/或可定量信号的任何原子或分子。特别是，标记物可直接或间接地附着至核酸或蛋白。可附着至探针的合适的标记物包括，但不限于，放射性同位素、荧光团、生色团、质量标记物、电子致密颗粒、磁性颗粒、自旋标记物、发射化学发光的分子、电化学活性分子、酶、辅因子、和酶分子底物。
2.概述
在一个方面，本发明提供了用于检测样品中的靶核酸的邻近延伸方法。该方法通常与用于检测相同样品中的蛋白水平的邻近延伸测定同时使用。通常，被检测的靶核酸是RNA。在一些实施方案中，靶可以是单链DNA，诸如单链DNA病毒。
在一些实施方案中，靶核酸(例如，RNA)在样品中通过其中邻近探针对与靶核酸(例如，RNA)杂交的过程来检测。邻近探针对(“PPP”)的各成员包括通常位于或接近探针的5’末端的靶结合区段(“TB”区段)，其与靶核酸的预定义区段(“T”区段)杂交。PPP的各成员包括通常处于或接近探针的3’末端的相互作用区段(“I区段”)，其中PPP的一个成员的相互作用区段与PPP的另一个成员中存在的相互作用区段互补。选择或设计邻近探针的序列使得邻近探针对的各成员中的TB区段与靶核酸的不同区域(即，不同的、非重叠的T区段)结合，其中T区段位于足够紧密邻近处，且PPP具有足够的长度，使得当邻近探针与靶RNA杂交时，I区段可相互作用。
探针与靶核酸的结合允许PPP的I区段杂交。然后添加DNA聚合酶，其使杂交的探针在它们的3'末端延伸，延伸是双链的PPP二聚体的部分。I区段的杂交和双链体的延伸导致然后可在扩增反应中检测到的延伸产物。通常，邻近探针对的各成员还包含扩增引物结合位点(APBS)区段。通常，PPP的两个探针的每个具有不同的APBS。因此，当邻近探针经由它们的I区段杂交并通过聚合酶延伸时，产生具有APBS对的双链(或部分双链)多核苷酸。将认识到，各邻近探针具有单一APBS，且延伸步骤导致具有两个APBS的多核苷酸。
本发明的方法可方便地用于多重测定形式。例如，如果将要检测两个或更多个靶分子，例如，两个或更多个靶核酸诸如两个不同的RNA靶，则可在单一反应中使用多对邻近探针来检测产物，每对邻近探针形成唯一的延伸产物。类似地，当将要在相同反应中检测核酸，例如RNA，和蛋白时，在单独的反应中同时使用用于核酸和蛋白的邻近探针对，每个邻近探针对形成唯一的延伸产物。因此本发明的测定可容易地复用以评估样品中多个靶分子的存在或量。
扩增引物用于扩增延伸产物。扩增产物的存在、不存在、量或相对量的确定指示靶序列在初始样品中的存在、不存在、量或相对量。
在一些实施方案中，延伸产物的量在qPCR反应中进行定量。可使用各种其他扩增系统，如以下所讨论。
用于检测靶核酸，例如RNA的方法可还与检测样品中存在的蛋白的邻近延伸测定组合使用，如以下进一步详述。
3.核酸邻近探针对
本发明应用邻近探针对以检测靶核酸，通常靶RNA，诸如mRNA。在其他实施方案中，邻近探针对可用于检测靶DNA，诸如可在样品中存在的病毒DNA。邻近探针对的各成员包括以下区域：TB区段、I区段、和APBS区段。TB区段与靶核酸序列的T区段互补并结合。邻近探针对的一个成员与靶核酸上的T区段结合，且另一个成员与靶核酸上的不同的非重叠的T区段结合。位点紧密邻近，即，使得TB区域与靶核酸的杂交允许互补I区域杂交。通常探针结合位点被少于100个碱基，通常少于50个碱基，例如，40个、30个、20个、或15个核苷酸或更少隔开。在一些实施方案中，当两条序列或区段被从10个至50个碱基隔开时，认为它们在多核苷酸中紧密邻近。
邻近探针的TB区段位于或接近探针的5’末端。例如，TB区段可定位于在邻近探针的5’末端处的核苷酸的2-10个核苷酸内。TB区段的大小通常范围从10个至100个核苷酸长度的任何长度。在一些实施方案中，TB区段是小于50个核苷酸长度，且可以是小于20个或10个核苷酸长度。例如，TB区段可以是从5个至20个或10个至40个核苷酸长度。这些范围是示例性指导，而不意在限制本发明。
邻近探针的I区域位于或接近探针的3’末端，使得当邻近探针对与靶核酸杂交时，I区域可用于与探针对的另一成员的互补I区域杂交。在通常的实施方案中，设计I区段使得在与邻近对的另一成员的I区段杂交后，不存在3’非碱基配对的核苷酸。然而，还可预期其他实施方案。例如，邻近探针中的一个探针的3’末端，即，具有游离3’羟基基团的末端，可不包括在与邻近探针对的另一成员的互补I区段结合的I区段中，因此保留3’末端处的非碱基配对的核苷酸。具有3’外切核酸酶活性的聚合酶的使用将允许具有3’非碱基配对的核苷酸的探针的延伸。在其他实施方案中，探针中仅有一个可延伸。因此，可设计探针以具有在3’末端处的非碱基配对的核苷酸。在一些实施方案中，探针中的一个可在3’末端处修饰以防止延伸。
通常，I区段是小于20个核苷酸的长度。例如，I区段可以是从6个至12个核苷酸长度，例如6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个核苷酸长度。
在通常的实施方案中，邻近探针对的各成员还包含扩增引物结合位点。在延伸邻近探针后，产生其中存在两个APBS序列的多核苷酸分子。具有两个扩增引物结合位点的延伸的多核苷酸允许使用与引物结合位点结合的扩增引物扩增延伸产物。另外，邻近探针对的一个成员可具有扩增引物结合位点。例如，可在邻近探针的I区域杂交后，创建第二扩增引物结合位点。在其他实施方案中，仅邻近探针对的一个成员可延伸。延伸探针可包括两个扩增引物结合位点，以允许扩增延伸产物。
探针通常设计为避免RNA中二级结构的区域。例如，技术人员可使用已知的计算机程序，以提供靶RNA的结构模型。然后探针的TB区域可设计成避免二级结构诸如发夹、茎等的区域。可使用本领域中容易可得的软件，例如Primer3(WhiteheadInstituteforBiomedicalResearch)设计与靶RNA区段互补的探针。
在一些实施方案中，探针对的成员之一可被封闭以防止延伸。例如，探针中的一个可具有防止探针延伸的在3’末端的修饰的碱基。在一些实施方案中，3’核苷酸可被磷酸化。在其他实施方案中，3’末端可具有修饰的核苷酸，诸如硫代磷酸酯修饰的核苷酸、2’-OMe-CE亚磷酰胺修饰的核苷酸，或本领域已知的另外的延伸封闭核苷酸。在一些实施方案中，防止探针延伸的一个或更多个核苷酸可位于3’末端的上游，使得延伸不越过该点发生。例如，连接物可用于封闭探针延伸。
添加至反应混合物与靶RNA杂交的探针的浓度通常在1nM至100nM的范围内。邻近探针与样品孵育的时间和温度可取决于所用的特定探针而不同。时间应足以使探针与靶核酸结合并使3’末端杂交。在说明性实施方案中，孵育时间可为从约10分钟至约1-2小时，或更长，例如，12至24小时的任何时间。进行反应的温度可，取决于应用的探针及取决于在多重测定中是否还检测其他分子，诸如蛋白，而变化。当仅检测RNA时，探针与靶的通常孵育温度范围可从约55℃至约70℃。通常，孵育温度是从约60℃至约70℃，例如，孵育温度是61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、或70℃。当测定是还检测蛋白的多重测定时，孵育温度通常较低，例如从约35℃至约45℃。在一些实施方案中，温度在从约37℃至约42℃的范围内。用于包括检测靶RNA和靶蛋白两者的多重反应的说明性反应条件，包括1nM的探针浓度和在37℃下孵育一小时。用于仅检测靶RNA的说明性反应条件包括1nM的探针浓度和在65℃下孵育18至24小时。
在一些实施方案中，反应另外包括可稳定探针：RNA杂交的组分。这样的组分的实例是RNA酶H，其中RNA酶活性已失活，或单链核酸结合蛋白诸如T4gp32。
4.延伸反应
通常在探针与靶分子杂交后进行延伸反应。试剂诸如核苷酸和DNA聚合酶包括在延伸反应中。可使用任何DNA聚合酶。在一些实施方案中，DNA聚合酶具有3’外切核酸酶活性。这样的聚合酶的实例包括T4DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、Phi29(Φ29)DNA聚合酶、DNA聚合酶I、DNA聚合酶I的Klenow片段、强烈火球菌(Pyrococcusfuriosus)(Pfu)DNA聚合酶、和伍斯氏火球菌(Pyrococcuswoesei)(Pwo)DNA聚合酶。
在其他实施方案中，可采用缺乏3’至5’外切核酸酶活性的DNA聚合酶。这样的聚合酶包括聚合酶诸如Taq或ΔTaq聚合酶。
进行延伸反应的温度取决于应用的聚合酶的性质。例如，采用热稳定聚合酶的反应可在高于40摄氏度的温度下进行。然而，采用允许杂交的邻近探针保持与靶核酸杂交，且用于在探针的3’末端稳定杂交的温度。
聚合酶可连同邻近探针添加至测定，或可在邻近探针添加后添加。在一些实施方案中，在邻近探针与靶多核苷酸孵育一段时间后添加聚合酶。
5.蛋白检测邻近探针对
在一些实施方案中，感兴趣的靶核酸，例如，感兴趣的RNA的检测与相同反应混合物中感兴趣的蛋白的检测同时进行。因此，在一些实施方案中，方法包括进行如本文所述的邻近延伸测定用于检测一个或更多个特定RNA以及进行邻近延伸测定以检测一个或更多个特定蛋白。用于检测蛋白的邻近延伸测定是本领域熟知的(参见，例如，Lundberg等人Nucl.AcidsRes.39:e102,2011；和WO2012/104261，其各自通过引用并入)，且可使用任何这样的测定。
在一个可用于具有核酸邻近延伸测定的多重测定的说明性测定中，蛋白邻近探针对，即，用于检测感兴趣的蛋白的邻近探针对，包括包含与结合至感兴趣的蛋白的抗体连接的核酸结合区段(即，I区段)的一种探针。该对中的第二探针包括与第一探针的I区段互补，且还与结合至感兴趣的靶蛋白的抗体连接的核酸结合区段(即，I区段)。抗体与靶蛋白结合后，I区段杂交。
用于蛋白邻近探针的抗体可以是多克隆或单克隆抗体、或抗体的片段。此外，与蛋白邻近探针对的各成员连接的抗体可具有相同结合特异性或不同的结合特异性。本发明还包括应用该测定的变化形式，例如，描述于WO2012/104261中的变化形式。例如，探针可各自在5’末端处与它们各自的抗体连接，或一个探针可在5’末端且另一个在3’末端连接。
如以上所述，蛋白邻近探针对的抗体与靶蛋白结合后，3’末端杂交以形成具有可通过聚合酶来延伸的至少一个3’OH的双链核酸，如以上所述。如在核酸邻近探针对(用于检测感兴趣的核酸，例如，感兴趣的RNA)的情况下，用于蛋白的邻近探针杂交使得创建单一序列以用作序列标签，其可用作标识符。
延伸反应在适合于选择的聚合酶的温度下及在抗体保持与靶蛋白结合使得探针对的3’互补末端可杂交的条件下进行。在核酸邻近探针对和蛋白邻近探针对两者用于在相同反应中检测靶核酸和靶蛋白的测定中，延伸反应在适合于选择的聚合酶的温度下和在核酸邻近探针的T区段保持与靶核酸结合及用于蛋白邻近探针的抗体保持与靶蛋白结合使得对于邻近探针对的每个，3’互补区段可杂交的条件下进行。
6.扩增和扩增产物的检测
从延伸反应获得的延伸产物经受扩增反应以获得可检测并定量的扩增产物，如期望的。各种扩增反应的设计参数是熟知的。以下提供了提供指导的参考实例。在一些实施方案中，扩增反应使用用于延伸测定的相同聚合酶，任选地不添加更多聚合酶。在一些实施方案中，扩增反应使用与用于延伸测定的聚合酶不同的聚合酶。例如，在一些实施方案中，具有3’外切核酸酶活性的聚合酶可用于延伸反应，且Taq聚合酶可用于扩增反应。
在一些实施方案中，扩增反应可采用热启动聚合酶。例如，可使用，与在环境温度下抑制聚合酶活性的抗体络合的重组TaqDNA聚合酶。在PCR变性步骤后聚合酶是活性的。
检测和/或定量核酸的任何方法可用于本发明以检测和/或定量扩增产物。在具体实施方案中，使用实时定量方法。例如，“定量实时PCR”方法可用于通过测量在扩增过程本身期间形成的扩增产物的量确定样品中存在的扩增产物的量。监测扩增产物的形成的该方法包括测量在多个时间点的PCR产物积累。扩增产物的量反映了样品中存在的靶核酸或靶蛋白的量。
荧光核酸酶测定是可成功用于本文描述的方法的实时定量方法的一个具体实例。监测扩增产物的形成的该方法包括使用双标记的荧光寡核苷酸探针连续测量PCR产物积累—一种文献中作为"方法"经常被提及的方法。参见美国专利号5,723,591；Heid等人，1996，Real-timequantitativePCRGenomeRes.6:986-94，各自通过引用以其整体为了它们的荧光核酸酶测定的描述并入本文。将理解，虽然“探针”最广泛地用于qPCR，本发明并不限于使用这些探针；可使用任何合适的探针。
可应用于本发明的其他检测/定量方法包括FRET和模板延伸反应、分子信标检测、Scorpion检测(Scorpiondetection)、和侵入物检测(Invaderdetection)。
FRET和模板延伸反应利用以供体/受体对的一个成员标记的引物，和以供体/受体对的另一成员标记的核苷酸。在模板依赖性延伸反应期间将标记的核苷酸掺入进引物之前，供体和受体隔开足够远使得不能发生能量转移。然而，如果标记的核苷酸掺入到引物且间隔充分接近，则发生能量转移，并可被检测到。这些方法描述在美国专利号5,945,283和PCT公布WO97/22719中。
有了分子信标，当探针与扩增产物的互补区域杂交时，探针的构象中的变化导致形成可检测的信号。探针本身包括两个部分：一个部分在5’末端和另一部分在3’末端。这些部分位于退火至探针结合位点的探针部分的侧翼，并且彼此互补。一个端部通常附着至报告物染料，且另一端部通常附着至猝灭剂染料。在溶液中，两个端部可彼此杂交以形成发夹环。在这种构象中，报告物和猝灭剂染料处于足够紧密邻近使得来自报告物染料的荧光被猝灭剂染料有效地猝灭。相比之下，杂交探针导致线性构象，其中猝灭的程度被降低。因此，通过监测两种染料的发射变化，间接地监测扩增产物的形成是可能的。这种类型的探针和它们的用途由例如以下进一步描述：Piatek等人，(1998)Nat.Biotechnol.16:359-363；Tyagi，和Kramer(1996)Nat.Biotechnol,14:303-308；以及Tyagi，等人(1998)Nat.Biotechnol.16:49-53。Scorpion检测方法由例如以下描述：Thelwell等人描述，(2000)NucleicAcidsRes.,28:3752-3761以及Solinas等人(2001)NucleicAcidsRes.,29(20):e96。Scorpion引物是具有经由PCR阻塞物附着在5'末端的探针元件的荧光PCR引物。它们用于实时扩增子特异性检测同质溶液中的PCR产物。两种不同的格式是可能的，“茎-环”格式和“双链体”格式。在两种情况下，探测机制是分子内的。Scorpion在所有格式中的基本元件是：(i)PCR引物；(ii)PCR阻塞物以防止PCR通读探针元件；(iii)特异性探针序列；和(iv)包含至少一个荧光团和猝灭剂的荧光检测系统。在Scorpion引物的PCR延伸后，所得的扩增子包含与探针互补的序列，其在各PCR循环的变性阶段呈单链。冷却后，由于猝灭剂不再在荧光团的附近，探针可与该互补序列自由地结合，产生增加的荧光。PCR阻塞物防止TaqDNA聚合酶对探针的不希望的通读。侵入物测定(ThirdWaveTechnologies,Madison,WI)特别地用于SNP基因型分型并利用称为信号探针的寡核苷酸，其与靶核酸(DNA或RNA)或多态性位点互补。称为侵入物寡核苷酸的第二寡核苷酸，包含相同的5’核苷酸序列，但3'核苷酸序列包含核苷酸多态性。侵入物寡核苷酸干扰信号探针与靶核酸的结合，使得信号探针的5’末端在包含多态性的核苷酸处形成"flap"。该复合物由称为切割酶的结构特异性内切核酸酶识别。切割酶切割核苷酸的5’flap。释放的flap与携带FRET标记物的第三探针结合，由此形成由切割酶识别的另一个双链体结构。此时，切割酶切割远离猝灭剂的荧光团，并产生荧光信号。
如以上所述，各种扩增和反应方法可用来检测延伸产物。因此，根据本发明的扩增包括延伸产物的至少一部分通常以模板依赖性方式借以被复制的任何方法，包括但不限于，用于线性或指数扩增核酸序列的宽范围的技术。用于进行扩增步骤的说明性方法包括连接酶链式反应(LCR)、连接酶检测反应(LDR)、连接随后是Q-复制酶扩增、PCR、引物延伸、链置换扩增(SDA)、超支化链置换扩增(hyperbranchedstranddisplacementamplification)、多重置换扩增(MDA)、基于核酸链的扩增(NASBA)、两步多重扩增、滚环扩增(RCA)等，包括其多重版本及组合。这样的技术的描述可参见以下以及其他来源：Ausbel等人；PCRPrimer:ALaboratoryManual,Diffenbach，编著，ColdSpringHarborPress(1995)；TheElectronicProtocolBook,ChangBioscience(2002)；Msuih等人，J.Clin.Micro.34:501-07(1996)；TheNucleicAcidProtocolsHandbook,R.Rapley,编著，HumanaPress,Totowa,NJ.(2002)；Abramson等人，CurrOpinBiotechnol.1993Feb.；4(l):41-7，美国专利号6,027,998；美国专利号6,605,451,Barany等人，PCT公布号WO97/31256；Wenz等人，PCT公布号WO01/92579；Day等人，Genomics,29(1):152-162(1995),Ehrlich等人，Science252:1643-50(1991)；Innis等人，PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications,AcademicPress(1990)；Favis等人，NatureBiotechnology18:561-64(2000)；以及Rabenau等人，Infection28:97-102(2000)；Belgrader、Barany、和Lubin,DevelopmentofaMultiplexLigationDetectionReactionDNATypingAssay,SixthInternationalSymposiumonHumanIdentification,1995(可见于以下万维网：promega.com/geneticidproc/ussymp6proc/blegrad.html-)；LCR试剂盒说明书，目录号200520、Rev.#050002,Stratagene,2002；Barany,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:188-93(1991)；Bi和Sambrook,Nucl.AcidsRes.25:2924-2951(1997)；Zirvi等人，Nucl.AcidRes.27:e40i-viii(1999)；Dean等人，ProcNatlAcadSciUSA99:5261-66(2002)；Barany和Gelfand,Gene109:1-11(1991)；Walker等人，Nucl.AcidRes.20:1691-96(1992)；Polstra等人，BMCInf.Dis.2:18-(2002)；Lage等人，GenomeRes.2003Feb.；13(2):294-307，和Landegren等人，Science241:1077-80(1988),Demidov,V.,ExpertRevMoIDiagn.2002Nov.；2(6):542-8.,Cook等人，JMicrobiolMethods.2003May；53(2):165-74,Schweitzer等人，CurrOpinBiotechnol.2001Feb.；12(l):21-7，美国专利号5,830,711，美国专利号6,027,889，美国专利号5,686,243，PCT公布号WO0056927A3，和PCT公布号WO9803673A1。
如本文所用，术语“扩增”包括等温扩增方法。等温扩增采用恒定温度，而不是通过变性和退火/延伸步骤的循环。链分离的一些方法，例如，酶，用于代替热变性。等温扩增的实例包括：超支化链置换扩增(Groathouse,N.，等人(2006)"IsothermalAmplificationandMolecularTypingoftheObligateIntracellularPathogenMycobacteriumlepraeIsolatedfromTissuesofUnknownOrigins"J.Clin.Micro.44(4):1502-1508)；解旋酶依赖性扩增(Vincent,M.，等人(2004)"Helicase-dependentisothermalDNAamplification"EMBORep.5(8):795-800)；多重置换扩增(MDA；Luthra,R.，和Medeiros,J.(2004)"IsothermalMultipleDisplacementAmplification"JMoIDiagn.6(3):236-242)；环介导的等温扩增(Notomi,T.，等人(2000)NucleicAcidsResearch28(1)；PAN-AC(David,F.和Turlotte,E.,(1998)"AnIsothermalAmplificationMethod"C.R.Acad.SciParis,LifeScience321(1):909-14)；链置换扩增(SDA；Nycz,C，等人(1998)AnalyticalBiochemistry259(2):226-234)；滚环扩增(RCA；Lizardi,P.，等人，(1998)"Mutationdetectionandsingle-moleculecountingusingisothermalrolling-circleamplification"NatureGenetics19:225-232)；基于核酸链的扩增(NASBA；VanDerVliet,G.，等人(1993)"Nucleicacidsequence-basedamplification(NASBA)fortheidentificationofmycobacteria"JournalofGeneralMicrobiology139(10):2423-2429；和重组酶聚合酶扩增(美国专利号7,485,428；7,399,590；7,270,981；和7,270,951，其各自通过引用以其整体且特别是为了其重组酶聚合酶扩增的描述并入)。
在其中荧光团用作标记物的实施方案中，许多合适的荧光团是已知的。可使用的荧光团的实例包括，但不限于罗丹明、花青3(Cy3)、花青5(Cy5)、荧光素、VicTM、LizTM、TamraTM、5-FamTM、6-FamTM、和得克萨斯红(MolecularProbes)。(VicTM、LizTM、TamraTM、5-FamTM、6-FamTM都从AppliedBiosystems,FosterCity,Calif可得)。
在还使用猝灭剂用于检测扩增产物的实施方案中，有用的猝灭剂包括，但不限于，四甲基罗丹明(TAMRA)、DABCYL(DABSYL、DABMI或甲基红)蒽酮(anthroquinone)、硝基噻唑、硝基咪唑、孔雀绿、BlackHole例如，BHQ1(BiosearchTechnologies)、Iowa或ZEN猝灭剂(来自IntegratedDNATechnologies,Inc)、TIDEQuencher2(TQ2)和TIDEQuencher3(TQ3)(来自AATBioquest)。
PCR和荧光检测可方便地使用系统诸如BioMarkTM系统(FluidigmCorporation,SouthSanFrancisco)来进行。
7.样品
可使用本发明的邻近延伸探针测定检测任何靶核酸。在通常的实施方案中，靶核酸是RNA分子。靶可包括，例如，与病原体，诸如病毒、细菌、原生动物、或真菌相关的核酸；RNA，例如，其过表达或低表达指示疾病的那些、以组织特异性或以发育特异性方式表达的那些；或由特定的刺激诱导的那些。在一些实施方案中，该方法包括使用如本文中描述的核酸邻近延伸测定和蛋白邻近延伸测定同时检测样品中的靶RNA和靶蛋白两者。
包含核酸，例如，RNA或感兴趣的核酸和蛋白的样品可从生物来源获得并使用本领域已知的常规方法制备。特别是，根据本文描述的方法的待分析的可样品从任何来源获得，包括细菌、原生动物、真菌、病毒、细胞器，以及高等生物体诸如植物或动物，特别是哺乳动物，并且更特别是人。其他样品可从环境来源(例如，池塘水、空气样品)，从人造制品(例如食品)，从法医样品等来获得。样品可通过各种标准技术中的任何技术从细胞、体液(例如，血液、血液级分、尿液等)，或组织样品中获得。说明性样品包括血浆、血清、脊髓液、淋巴液、腹膜液、胸膜液、口液、和皮肤的外部部分的样品；来自呼吸道、肠道、生殖道和尿道的样品；眼泪、唾液、血细胞、干细胞、或肿瘤样品。例如，样品可从胚胎或从母体血液中获得。样品还可从活的或死的生物体或从体外培养物中获得。说明性样品可包括单细胞、石蜡包埋的组织样品，和穿刺活检。
本发明的测定可对单细胞或细胞群(即两个或更多个细胞)进行。在一些实施方案中，使用从单细胞、或小数目(少于10个、或少于5个)的细胞获得的核酸和蛋白进行测定。在采用单细胞的一种方法中，分离并溶解细胞；且将试剂，例如，邻近延伸探针、延伸试剂、聚合酶、扩增试剂直接添加至溶解产物进行检测测定。在一些实施方案中，使用微流体装置进行测定、大分子从单细胞的分离，或两者。用于从单细胞分离和获得大分子和/或使用大分子进行测定的微流体系统是已知的。示例性设备是从FluidigmCorp.7000ShorelineCourt,Suite100,SouthSanFrancisco,CA)商购可得的C1TM单细胞自动制备系统(C1TMSingle-CellAutoPrepSystem)。C1TM单细胞自动制备系统分离单细胞，溶解它们，并由溶解产物进行一系列反应(例如，cDNA合成、核酸扩增等)。其他设备描述于2013年2月28日提交的，标题为“Methods,Systems,AndDevicesForMultipleSingle-CellCapturingAndProcessingUsingMicrofluidics”的美国专利申请号13/781,292；以及2013年3月15提交的，代理人案号85665-861169(021800US)，标题为“MethodsAndDevicesForAnalysisOfDefinedMulticellularCombinations,”的美国临时申请号61/852,135中，这两者通过引用以其整体为了所有目的并入本文。任选地C1TM单细胞自动制备系统可与Fluidigm的BioMarkTMHD系统(FluidigmCorp.7000ShorelineCourt,Suite100,SouthSanFrancisco,CA)组合使用。2013年2月28日提交的，美国专利申请号13/781,292以其整体为了所有目的并入本文。
用于操作单细胞的其他设备包括以下(其中没有一个被承认是现有技术)：Sims等人，2007,“Analysisofsinglemammaliancellson-chip”LabChip7:423–440；Wheeler等人，2003,“Microfluidicdeviceforsingle-cellanalysis”AnalChem75:3581–3586；Skelley等人，2009“Microfluidiccontrolofcellpairingandfusion”NatMethods6:147–152；Marcus等人，2006,“Microfluidicsingle-cellmRNAisolationandanalysis”AnalChem78:3084–3089；Bontoux等人，2008“Integratingwholetranscriptomeassaysonalab-on-a-chipforsinglecellgeneprofiling”LabChip8:443–450；Zhong等人，2008“Amicrofluidicprocessorforgeneexpressionprofilingofsinglehumanembryonicstemcells”LabChip8:68–74；Wheeler2003“MicrofluidicDeviceforSingle-CellAnalysisAnal.Chem.”75:3581-3586；和White等人，August23,2011“High-throughputmicrofluidicsingle-cellRT-qPCRPNAS”卷108,34:13999–14004；上述出版物的每个通过引用并入本文。
用于扩增和检测扩增产物的另外的方法描述于美国专利公布号2012-0115143(“UniversalProbeAssayMethods”)、US2012-0288857(“MultifunctionalProbe-Primers”)、US2013-0045881(“ProbeBasedNucleicAcidDetection”)；以及共同未决共同拥有的国际专利申请号PCT/US2012/065376(“NUCLEICACIDDETECTIONUSINGPROBES”)和国际PCT申请号PCT/US2007/063229(“COOPERATIVEPROBESANDMETHODSOFUSINGTHEM”)中，其各自通过引用为了所有目的清楚并入。
10.试剂盒
根据本发明的试剂盒包括对于实践本发明的一种或更多种测定法是有用的一种或更多种试剂。试剂盒通常包括具有容纳试剂(例如，核酸邻近延伸探针和任选地，蛋白邻近延伸探针)，作为一个或更多个单独的组合物的一个或更多个容器的包装。在一些实施方案中，当试剂的兼容性将允许时，探针可作为混合物提供。试剂盒还可包括从用户角度可期望的其他材料，诸如缓冲液、稀释剂、标准和/或在样品处理、洗涤、或进行测定的任何其他步骤中是有用的任何其他材料。
根据本发明的试剂盒通常包括用于进行本发明的一种或更多种方法的说明。包括在本发明的试剂盒中的说明，可贴到包装材料，或可被包括作为包装说明书。而说明通常是书面或印刷材料，但它们不限于此。本发明考虑能够储存这样的说明，并将它们传达给最终用户的任何介质。这样的介质包括，但不限于，电子储存介质(例如，磁盘、磁带、盒式贮存器、芯片)、光学介质(例如，CD-ROM)，RF标签等。如本文所用，术语“说明”可包括提供说明的互联网网站的地址。
将理解，本文所描述的实施例和实施方案仅用于说明性的目的，且根据其的各种修改或改变对本领域技术人员将是暗示的，并被包括在本申请的精神和范围及所附的权利要求的范围内。
此外，本文引用的所有其他出版物、专利和专利申请通过引用以其整体为了所有目的并入本文。

Claims (12)

1.一种检测样品中靶核酸的方法，所述方法包括：
(a)在反应混合物中孵育：
i)包含靶核酸的样品；和
ii)包含第一和第二探针的邻近探针对，其中：
第一探针包含与所述靶核酸的第一靶(T)区段杂交的靶结合(TB)区段，和在所述探针的3’末端上的相互作用(I)区段，其中所述I区段与所述第二探针的3’末端上的I区段互补；且
第二探针包含与紧密邻近所述第一T区段的所述靶核酸的第二、非重叠T区段杂交的TB区段，和在3’末端上的I区段，其中所述3’序列与所述第一探针的I区段互补，其中
将所述反应混合物在其中所述第一探针的TB区段与所述靶核酸的第一T区段杂交且所述第二探针的TB区段与所述靶核酸的第二T区段杂交的条件下孵育，由此允许所述第一探针的I区段与所述第二探针的I区段杂交以形成包含所述第一和第二探针的I区段的双链体；
(b)添加DNA聚合酶并在其中所述第一和/或第二探针被延伸的条件下保持所述反应混合物以获得第一延伸产物；
(c)在包含扩增所述第一延伸产物、或其亚区的一对扩增引物的扩增反应混合物中扩增所述延伸产物、或其亚区；
(d)检测(c)中获得的扩增子。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述样品是RNA。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述样品是单细胞。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述检测步骤包括定量扩增反应。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述定量扩增反应是qPCR。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述邻近对的成员中的一个在3’末端被封闭，使得在步骤(b)中延伸仅一个探针。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述DNA聚合酶具有3’外切核酸酶活性。
8.如权利要求1所述的方法，其中步骤(c)的扩增用与步骤(b)的延伸反应中采用的DNA聚合酶不同的DNA聚合酶来进行。
9.如权利要求8所述的方法，其中扩增反应中的DNA聚合酶是热稳定聚合酶。
10.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括检测所述样品中的靶蛋白，其中所述方法还包括：
将(a)的反应混合物中的样品与包含第一和第二蛋白检测邻近探针的一对蛋白检测邻近探针孵育，其中：
所述第一蛋白检测探针包含与所述靶蛋白结合的第一抗体，所述第一抗体与第一多核苷酸连接，所述第一多核苷酸包含与所述第二探针的3’末端上的I区段互补的3’末端上的I区段；且
所述第二蛋白检测探针包含与所述靶蛋白结合的第二抗体，所述第二抗体与第二多核苷酸连接，所述第二多核苷酸包含与所述第一多核苷酸的3’末端上的I区段互补的I区段；
其中所述第一抗体与所述靶蛋白的结合和所述第二抗体与所述靶蛋白的结合允许所述第一蛋白邻近探针的I区段与所述第二蛋白邻近探针的I区段杂交以形成步骤(b)中延伸的双链体，以提供第二延伸产物；
使用扩增所述第二延伸产物或其亚区的一组引物在(c)的扩增反应中扩增所述第二延伸产物、或其亚区；以及
检测来自所述第二延伸产物或其亚区的扩增的扩增子的量。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述检测步骤包括定量扩增反应。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述定量扩增反应是qPCR。
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