RU2015123459A - Одновременная детекция белка-мишени и нуклеиновых кислот-мишеней в одной клетке - Google Patents

Claims (28)

1. Способ детекции нуклеиновой кислоты-мишени в образце, где способ включает:

(a) инкубацию в реакционной смеси:

i) образца, содержащего нуклеиновую кислоту-мишень, и

ii) пары проксимальных зондов, содержащей первый и второй зонд, где:

первый зонд содержит связывающийся с мишенью (TB) сегмент, который гибридизуется с первым (T) сегментом-мишенью нуклеиновой кислоты-мишени, и взаимодействующий (I) сегмент на 3'-конце зонда, где I-сегмент является комплементарным I-сегменту на 3'-конце второго зонда, и

второй зонд содержит TB-сегмент, который гибридизуется со вторым неперекрывающимся T-сегментом нуклеиновой кислоты-мишени, который находится в непосредственной близости с первым T-сегментом, и I-сегмент на 3'-конце, где 3'-последовательность является комплементарной I-сегменту первого зонда, где

реакционную смесь инкубируют в условиях, в которых TB-сегмент первого зонда гибридизуется с первым T-сегментом нуклеиновой кислоты-мишени, и TB-сегмент второго зонда гибридизуется со вторым T-сегментом нуклеиновой кислоты-мишени, таким образом, обеспечивая гибридизацию I-сегмента первого зонда с I-сегментом второго зонда с образованием дуплекса, содержащего I-сегменты первого и второго зонда;

(b) добавление ДНК-полимеразы и поддержание реакционной смеси в условиях, в которых первый и/или второй зонд достраиваются с получением первого достраиваемого продукта;

(c) амплификацию достраиваемого продукта или a его подобласти в реакционной смеси для амплификации, содержащей пару праймеров для амплификации, которые амплифицируют первый достраиваемый продукт или его подобласть;

(d) детекцию ампликона, получаемого на этапе (c).

2. Способ по п. 1, где образец представляет собой РНК.

3. Способ по п. 1 или 2, где образец представляет собой одну клетку.

4. Способ по п. 1, где этап детекции включает

количественную реакцию амплификации.

5. Способ по п. 4, где количественная реакция амплификации представляет собой количественную ПЦР.

6. Способ по п. 1, где один из представителей проксимальной пары является блокированным на 3'-конце, таким образом, что только один зонд достраивается на этапе (b).

7. Способ по п. 1., где ДНК-полимераза обладает 3'-экзонуклеазной активностью.

8. Способ по п. 1, где амплификацию на этапе (c) проводят с ДНК-полимеразой, отличной от ДНК-полимеразы, применяемой в реакции достройки на этапе (b).

9. Способ по п. 8, где ДНК-полимераза в реакции амплификации представляет собой термостабильную полимеразу.

10. Способ по п. 1, дополнительно включающий детекцию белка-мишени в образце, где способ дополнительно включает

инкубацию образца в реакционной смеси (a) с парой детектирующих белок проксимальных зондов, содержащих первый и второй детектирующий белок проксимальный зонд, где:

первый детектирующий белок зонд содержит первое антитело, которое связывается с белком-мишенью, присоединенным к первому полинуклеотиду, который содержит I-сегмент на 3'-конце, который является комплементарным I-сегменту на 3'-конце второго зонда, и

второй детектирующий белок зонд содержит второе антитело, которое связывается с белком-мишенью, присоединенным ко второму полинуклеотиду, который содержит I-сегмент, комплементарный I-сегменту на 3'-конце первого полинуклеотида;

где связывание первого антитела с белком-мишенью и связывание второго антитела с белком-мишенью обеспечивает возможность гибридизации I-сегмента первого проксимального зонда для белка с I-сегментом второго проксимального зонда для белка с образованием дуплекса, который достраивается на этапе (b) с получением второго достраиваемого продукта;

амплификацию второго достраиваемого продукта или его подобласти в реакции амплификации (c) с использованием набора праймеров, которые амплифицируют второй достраиваемый продукт или его подобласть, и

детекцию количества ампликона в результате амплификации второго достраиваемого продукта или его подобласти.

11. Способ по п. 10, где этап детекции включает реакцию количественной амплификации.

12. Способ по п. 11, где реакция количественной амплификации представляет собой количественную ПЦР.