CN107208160B

CN107208160B - 无显微镜成像

Info

Publication number: CN107208160B
Application number: CN201680008079.XA
Authority: CN
Inventors: T·E·绍斯; 陈曦; 尹鹏
Original assignee: Harvard College
Current assignee: Harvard College
Priority date: 2015-01-30
Filing date: 2016-01-29
Publication date: 2023-02-17
Anticipated expiration: 2036-01-29
Also published as: US20180010174A1; US11639522B2; CN107208160A; EP3250716A1; EP3250716B1; EP3250716A4; US20230366011A1; ES2891085T3; WO2016123419A1; EP3974537A1

Abstract

在一些方面，在本文中提供了成像分子而不使用显微镜或其他专门设备的方法，其在本文称为“无显微镜成像(MFI)”。在本文中，以“自下而上”的方式使用“分子设备”(例如，基于DNA的和基于蛋白质的分子)而不是显微镜来检查分子靶。

Description

无显微镜成像

相关申请

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2015年1月30日提交的美国临时申请号62/110,050的权益，其全部内容通过引用并入本文。

联邦资助研究

本发明是在国家卫生研究院授予的基金号1DP2OD007292-01、1R21HD072481-01和1R01EB018659-01、国家科学基金会授予的基金号CCF 1162459、CCF 1054898和CCF-1317291、海军研究所授予的基金号N00014-13-1-0593/N00014-14-1-0610和N00014-11-1-0914由政府支持完成的。政府对发明有一定的权利。

背景技术

使用显微镜在单分子分辨率下对活体的复杂分子系统的相关分子进行同时成像是具有挑战性的，特别是在高通量和多重分析方面。此外，通常用于解析分子相互作用的其他技术，例如共同免疫沉淀和邻近连接，是固有的破坏性的，这阻止了阐明个体分子网络所需的重复取样。

发明内容

在一些方面，在本文中提供了成像分子而不使用显微镜或其他专门设备的方法。这样的方法在本文称为“无显微镜成像(MFI)”方法。目前的成像技术以“自上而下”的方式使用显微镜来探测分子靶。在本文中，以“自下而上”的方式使用“分子设备”(例如，基于DNA的和基于蛋白质的分子)而不是显微镜来检查分子靶。本公开内容的方法提供了相对于当前显微镜成像技术的更高的空间分辨率(例如，可视化生物结构以及各个网络内的真实连通性和动态数据)，更高的复用能力和更高的通量分析。此外，本公开内容的方法提供了分子靶在其天然状态下的的原位获取。

本公开内容的一些方面提供核酸条形码化探针，其包括布置成形成具有部分双链引物结合区、双链条形码区、双链回文区和含有靶结合部分的单链环区的发夹结构的核酸，其中终止聚合的合成的非DNA接头位于双链回文区和环区之间。

本公开内容的一些方面提供核酸条形码化探针，其包含一个或多个核酸链，所述一个或多个核酸链被布置成：(a)双链回文区；(b)双链条形码区；和(c)引物结合区。

在一些实施方案中，核酸条形码化探针包含第一核酸链，其包含第一回文序列，第一条形码序列和引物结合序列，以及第二核酸链，其包含与第一回文序列互补并结合的第二回文序列和与第一条形码序列互补并结合的第二条形码序列，其中第一核酸链和第二核酸链通过接头(例如，非核酸接头，或连续的核酸片段)彼此连接，并且布置成双链回文区，双链条形码区和部分双链(或单链)引物结合区(例如，形成发夹环结构，如图5A所示的结构)。

在一些实施方案中，引物结合区是单链的。在一些实施方案中，引物结合区是部分双链的。

在一些实施方案中，双链回文区具有4至10个核苷酸碱基对的长度。在一些实施方案中，双链条形码区具有2至100个核苷酸碱基对的长度。在一些实施方案中，引物结合区具有4至40个核苷酸的长度。

在一些实施方案中，条形码化探针进一步包括与双链回文区邻近的终止聚合的分子或修饰。如果两个核酸区在彼此的0至10个核苷酸之间，则认为彼此“邻近”或“邻近”。在一些实施方案中，如果两个区之间没有核苷酸，例如两个区彼此连续，则认为两个区彼此“紧邻”。

在一些实施方案中，条形码化探针进一步包括邻近双链回文区的终止聚合的合成非DNA接头。例如，条形码化探针还可以包含与双链回文区邻近的三乙二醇间隔子(spacer)，其终止聚合。

在一些实施方案中，条形码化探针包含与终止聚合的分子或修饰邻近的双链置换区。双链置换区可以具有例如2至10个核苷酸碱基对的长度。

在一些实施方案中，条形码化探针被布置成形成包含单链环区的发夹结构。单链环区可以具有例如3至50个核苷酸的长度。

在一些实施方案中，条形码化探针还包含靶结合部分。在一些实施方案中，靶结合部分附接到单链环区。

在一些实施方案中，靶结合部分选自：生物素(例如，作为抗生物素蛋白或链霉亲和素的结合配偶体)，抗体(或抗体片段，例如Fc片段)，适体，纳米体，核酸，药物和原子。“适体”是结合特定分子靶的寡核酸或肽分子。DNA，RNA或XNA适体通常包括短(例如5至30个核苷酸)的寡核苷酸链。肽适体通常包括两端附接于蛋白质支架的短可变肽结构域。“纳米体”是包含单个单体可变抗体结构域并且能够选择性结合分子靶的单结构域抗体(也称为抗体片段)。

在一些实施方案中，条形码化探针包含至少一个锁核酸(LNA)核苷酸。LNA可以位于例如双链条形码区中或邻近双链条形码区。

在一些实施方案中，条形码化探针还包含单链多聚T(或多聚A)末端序列(例如，在3'末端或5'末端)。

在一些实施方案中，条形码化探针通过靶结合部分与分子靶结合。

本公开内容的一些方面提供了多个如本文提供的核酸条形码化探针。

在一些实施方案中，双链回文区对于多个核酸条形码化探针的每个探针是相同的。

在一些实施方案中，双链条形码区对于多个核酸条形码化探针的每个探针是唯一的。

在一些实施方案中，多个核酸条形码化探针包括条形码化探针的子集，每个子集包括独特的条形码区。

在一些实施方案中，引物结合区对于多个核酸条形码化探针的每个探针是相同的。

在一些实施方案中，引物结合区对于多个核酸条形码化探针的条形码化探针的每个子集是独特的。

在一些实施方案中，多个核酸条形码化探针的每个探针通过靶结合部分与分子靶结合。

本公开内容的一些方面提供了包含本文提供的多个条形码化探针以及与多个核酸条形码化探针的探针的引物结合区至少部分互补的引物的组合物。

在一些实施方案中，引物包含相对于引物结合区的至少一个核苷酸错配。

在一些实施方案中，引物包含至少一个与引物结合区不互补和/或不结合引物结合区的人造接头。

在一些实施方案中，组合物还包含链置换聚合酶。例如，组合物可以包含选自以下的链置换聚合酶：Bsu DNA聚合酶，大片段；phi29聚合酶；Deep VentR聚合酶；Klenow片段聚合酶；和修饰的Taq聚合酶。

在一些实施方案中，组合物还包含辅助核酸链，所述辅助核酸链与所述单链引物结合区部分互补，与邻近所述引物结合区的单链区部分互补，并且与邻近所述引物结合区的所述单链区短暂地结合。在一些实施方案中，辅助链长度为3至20个核苷酸。

本公开内容的一些方面提供检测分子靶相互作用的方法。在一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：(a)在单个反应中将多个核酸条形码化探针与(i)与多个核酸条形码化探针的探针的引物结合区互补的引物和(ii)链置换聚合酶组合，和(b)在导致产生条形码化记录物的条件下孵育反应。

在一些实施方案中，条形码化记录物是双链的。

在一些实施方案中，(b)的步骤包括在生理条件下孵育样品。“生理条件”包括20-40摄氏度(℃)的温度范围(例如20-25℃，20-30℃，20-35℃，25-40℃，25-35℃，25-30℃，30-40℃，35-40℃或37℃)，pH为6-8(例如pH6，6.5，7，7.5或8)，钠浓度为0-1M(通常为145mM)，并且镁浓度为0-20mM(例如，1-2mM)。因此，在一些实施方案中，(b)的步骤包括在37℃的温度下将样品在含有2mM浓度的镁的缓冲液中孵育。在一些实施方案中，缓冲液可商购，例如“1x Thermo Pol Buffer”(New England Biolabs)或类似的。

在一些实施方案中，(b)的步骤包括在37℃的温度(例如，在含有2mM镁的缓冲液中)孵育样品0.5至3.0小时。

在一些实施方案中，在产生双链条形码化记录物之后再生多个核酸条形码化探针。

在一些实施方案中，方法还包括从样品收集条形码化记录物。

在一些实施方案中，所述方法还包括纯化从样品收集的条形码化记录物。

在一些实施方案中，所述方法还包括对从样品收集的条形码化记录物进行测序，从而产生测序数据。

在一些实施方案中，所述方法还包括从测序数据重建分子靶相互作用的图像。

在一些实施方案中，所述方法还包括将条形码化记录物附接到序列特异性衔接子。

在一些实施方案中，将条形码化记录物附接到序列特异性衔接子包括(i)将双链条形码化记录物解离为单链条形码化记录物；(ii)使每条单链条形码化记录物自退火以形成发夹结构；和(iii)将每个发夹结构连接到衔接子序列，从而形成衔接子-条形码化记录物。

在一些实施方案中，所述方法还包括通过聚合酶链反应(PCR)扩增衔接子-条形码化记录物，由此产生衔接子-条形码化记录物的拷贝。

在一些实施方案中，所述方法还包括纯化衔接子条形码化记录物的拷贝，从而产生衔接子条形码化记录物的纯化拷贝。

在一些实施方案中，所述方法还包括对衔接子条形码化记录物的纯化拷贝进行测序，从而确定条形码化记录物的序列。

在一些实施方案中，所述方法还包括计算处理条形码化记录物的序列以产生分子靶相互作用的代表性网络。在本公开内容的上下文中的“计算处理”是指使用计算机和模型来处理核酸序列(例如，条形码化记录物的序列)的过程，例如被理解并表示为算法或协议。

在一些实施方案中，引物包括第一核酸链，其包含与单链引物结合区互补的第一序列和第二序列；以及第二核酸链，其包含与单链引物结合区互补的第三序列和与第二序列互补并与其结合的第四序列，其中所述第一和第二核酸链被布置成由单链引物区侧接的双链区。

在一些实施方案中，双链区包含条形码序列。

在一些实施方案中，引物还包含至少一个测序位点或附接位点。

在一些实施方案中，样品是生物样品。例如，生物样品可以是细胞或细胞裂解物。

本公开内容的一些方面提供了核酸条形码化探针对，其包括：(a)被布置成(i)双链条形码区和(ii)单链引物结合区的第一核酸条形码化探针，和(b)第二单链条形码化探针，其包含条形码区和与单链引物结合区互补的引物区。

在一些实施方案中，第一核酸条形码化探针的双链条形码区具有5至50个核苷酸碱基对的长度。

在一些实施方案中，第一核酸条形码化探针的单链引物结合区具有4至50个核苷酸的长度。

在一些实施方案中，第二核酸条形码化探针的条形码区具有5至50个核苷酸的长度。

在一些实施方案中，第二核酸条形码化探针的引物区具有4至50个核苷酸的长度。

在一些实施方案中，第一核酸条形码化探针进一步包含与双链条形码区邻近的终止聚合的分子或修饰。例如，第一核酸条形码化探针还可以包含与双链条形码区邻近的终止聚合的合成非DNA连接子。

在一些实施方案中，第一核酸条形码化探针包含与终止聚合的分子或修饰邻近的双链置换区。

在一些实施方案中，双链置换区具有2至10个核苷酸碱基对的长度。

在一些实施方案中，第一核酸条形码化探针被布置成形成包含单链环区的发夹结构。在一些实施方案中，单链环区具有3至50个核苷酸的长度。在一些实施方案中，单链环区含有(ii)的单链引物结合区。

在一些实施方案中，第一核酸条形码化探针和/或第二核酸条形码化探针进一步包含靶结合部分。在一些实施方案中，靶结合部分位于远离第一核酸条形码化探针的单链引物结合区的末端和/或位于远离第二核酸条形码化探针的引物区的末端。在一些实施方案中，靶结合部分选自：生物素，抗体，适体，纳米体和核酸。

在一些实施方案中，第一核酸条形码化探针和第二核酸条形码化探针各自通过靶结合部分与分子靶结合。

本公开内容的一些方面提供了包括如本文提供的核酸条形码化探针对和布置成双链条形码区和单链引物结合区的第三核酸条形码化探针的组合物，其中单链引物结合区与第二核酸条形码化探针的引物区互补并结合。

在一些实施方案中，第三核酸条形码化探针还包含靶结合部分。在一些实施方案中，第三核酸条形码化探针通过与结合分子靶的靶结合部分结合到分子靶。

本公开内容的一些方面提供了包括如本文提供的核酸条形码化探针对和链置换聚合酶的组合物。

在一些实施方案中，链置换聚合酶选自：Bst大片段聚合酶，phi 29聚合酶，DeepVentR聚合酶，Klenow片段聚合酶和修饰的Taq聚合酶。。

本公开内容的一些方面提供检测分子靶相互作用的方法，其包括以下步骤：(a)在单一反应中组合本文提供的核酸条形码化探针对和链置换聚合酶，和(b)在导致生产单链条形码化记录物的条件下孵育反应。

本公开内容的一些方面提供了检测分子靶相互作用的方法，其包括以下步骤：(a)两个单链核酸条形码化探针，其各自包含回文序列、条形码序列和引物结合序列，其中条形码序列彼此不同，并且其中每个条形码化探针附接到分子靶，(b)部分双链引物，其被布置成由各自含有引物与引物结合序列互补的3'单链侧翼区侧接的双链区，其中双链区含有可逆共价结合位点；以及链置换聚合酶；在足以允许引物与引物结合位点结合和引物的每个3'侧翼区的延伸的条件下孵育(a)和(b)；和将反应加热到至少50℃的温度以允许引物从所述两个单链核酸条形码化探针解离，从而再生(a)和(b)。

附图说明

附图并不是按比例绘制的。为了清楚起见，并非每个图中的每个组件都可被标注。

图1显示了显微镜成像和本公开内容的无显微镜成像的实例的示意性比较。

图2A显示了分子靶的DNA条形码化和相对于彼此的靶邻近度的后续DNA记录的简化概述。图2B，图(1)-(7)显示了指示分子靶邻近度和几何形状的DNA记录的示意图。图2C显示了本公开内容的无显微镜成像方法的一个实例的简要概述。

图3A显示了将编码发夹的DNA模板结构域t的实例自动循环和释放到引物链a的多个拷贝上(产生序列a*-t*)的示意图。图3B显示了初始引物结合(i)、延伸(ii)和链置换分支的随机行走(iii)的示例机制，其中针对每个模板核苷酸显示以计算预测的相对缔合概率。结构域长度可以是例如6-20个核苷酸(a)，5个核苷酸(b)，0-30个核苷酸(t)和5个核苷酸(x)。互补结构域用虚线表示。图3C显示了本公开内容的“自动循环”无显微镜成像方法(也称为“自动循环邻近记录”或“APR”)的实例的示意图。在该实例中，APR拷贝应用引物交换发夹对作为探针，其中个体延伸以结合半记录物(i)，链置换和3'回文结构域杂交(ii)，以及半记录物延伸至完整记录物(iii)。图3D显示指示具有彼此不同长度和不同邻近度的条形码的DNA记录物。完整记录物的产生需要探针的共定位，例如通过与链霉亲和素结合的生物素化发夹环，而分离的探针产生半记录物。显示了截取的变性PAGE凝胶，其描绘了具有生物素-链霉亲和素缔合的10μl反应(37℃下40分钟)，4:1的总体探针:链霉亲和素化学计量(插图)，8和22nt的条形码(复制的19和33nt的茎长度)，10:1的引物:探针和40nM总探针浓度。使用单引物序列，不进行二次扩增。凝胶定量显示每个条形码约5倍至10倍的引物周转量。图3E显示了通过定量截取的变性PAGE凝胶上的Cy5标记的探针来证明自动循环的数据。反应和凝胶条件与图1相同，除了使用10个核苷酸的间隔子(复制21个核苷酸茎长)和5:1的引物：探针比以外，探针仍然总浓度为40nM。图3F显示了使用图3A的探针和方法产生的不同DNA记录物的测序数据。

图4A-4C显示了用于制造可以根据本公开内容使用的“对称”自动循环探针的方法的实例。图4A显示化学合成的探针前体的实例(A6＝AAAAAA；U＝脱氧尿苷；a16＝U/CAT/U/CCCAGC/U/TAC/U(SEQ ID NO：7)；ax5＝CTCAC；H22＝A、C和/或T的随机22-核苷酸组合；T＝胸苷；DS6＝CGCTGG；间隔子9＝(Integrated DNA Technologies)“iSp9”；p6＝ACCGGT；探针前体序列：AAAAAA/U/CAT/U/CCCAGC/U/TAC/U/CTCACHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHACCGGTTCGCTGGTT/iBiodT/TTCCAGCG/iSp9/ACCGGT(SEQ ID NO：6))。图4B显示了图4A的探针前体通过聚合酶(BCi20＝条形码序列)延伸。图4C显示了图4B的延伸的探针前体的5'末端被'USER'酶切割(New England Biolabs)。

图5A显示了图4C所示探针的附加细节。包括全探针前体序列(SEQ ID NO：6)。图5B显示了具有5'末端附接物(接头)的截头探针的示例，两个特征将邻近度的最大距离减小到6nm。

图6A-6D显示了本公开内容的DNA记录物的制备方法的实例。探针与靶结合，加入可溶性记录引物(图6A)。引物结合并通过置换聚合酶复制条形码(图6B)。两个延伸记录物自动从探针中移位，并在回文3'末端杂交(图6C)。相同的聚合酶通过第二条码延伸记录物，并从探针中移除记录物(图6D)。示例反应条件：缓冲液-水中的1x Bst缓冲液；聚合酶-Bst，具有替代phi29或其他置换聚合酶；温度-37℃；时间-0.5至3小时或更长时间。

图7A-7C显示了本公开内容的DNA记录物的处理方法的一个例子。将记录物收集在上清液中(图7A)并附接到测序特异性“衔接子”(图7B)。然后，完成几轮PCR(图7C)。或者，可以使用各种标准方法在衔接子添加之前复制记录物，最终导致每个原始记录物的多个拷贝，每个具有衔接子序列。

图8A-8B显示了读取DNA记录物和重建过程的方法的示例。记录物被凝胶或柱纯化和测序(例如，通过下一代测序)(图8A)。然后计算处理结果进行网络提取(图8B)。

图9A-9G显示本公开内容的对称自动循环探针的其它实例。图9A显示了具有简单的“远端环”区的自动循环探针的示例。图9B显示具有锁核酸(LNA)的自动循环探针的实例。图9C显示了具有共价键或其它接头而不是茎或环的自动循环探针的实例。图9D显示了具有由凸起、弱匹配或错配削弱的引物的自动循环探针的实例。图9E显示了具有更强的回文或其他“p”序列的自动循环探针的实例。图9F显示了具有包括探针的任一端、记录物本身或作为第三链(示出)的动态“辅助”解离链的自动循环探针的实例。图9G显示了具有两个竞争者的自动循环双端或环状探针的示例。

图10A显示了“非对称”自动循环探针的示例。两个探针相互作用，将条形码区从左侧的发夹状探针(BCj12)复制到右侧的线性探针上。本文提供了各种探针结构(图10B-10E)。该探针组也是自动循环的，反复连接条形码到右侧探针的3'端。

图11显示了本公开内容的温度依赖性循环机制的实例，其中记录物如前所述被复制，但是在温度暂时升高时从探针对释放而不是从互补探针序列置换。如在(非温度依赖性)自动循环系统中的，可以重复该循环以从相同的探针创建更多记录物。

图12显示了本公开内容的引物的另一个实例。

图13A和图13A显示本公开内容的连接和扩增方法的实例。记录物可以用限制性内切酶切割，然后通过“粘性”末端连接(图13A)。可以用一种或多种内切核酸酶切割过量未连接的记录物材料(图13B)

图14显示了本公开内容的记录物释放机制的示例。

图15显示本公开内容的无显微镜成像方法的实例应用于异质EGFR膜蛋白簇，其可以在用药物治疗时重新配置。每个个体蛋白质(而不是蛋白质种类)可以用独特的条形码标记。

图16A-16C显示本公开内容的无显微镜成像方法用于核体组织的示例应用。灰色笔画表示染色体相互作用(图16A)。图16B显示以低分辨率(点)取样的染色体拷贝没有区别，并且相互作用的重构很差。图16C显示，在高分辨率(点)处，临界相互作用和染色体复制使用无显微镜成像是显而易见的。DNA和RNA或蛋白质之间的相互作用也可通过此分辨率下的无显微镜成像进行(未显示)。

图17显示了本公开内容的更远程无显微镜成像的示例。

图18显示了用于基于测序的靶蛋白计数的无显微镜成像方法的示例。可以从阅读生成的DNA报告物链/记录物的序列来解码各种信息，包括例如蛋白质类型，数字计数和样品来源。当两个探针靶向相同蛋白质时创建的唯一记录物条形码的数量表示系统中的蛋白质数量。该方案还利用记录引物(record primer)本身上的随机“独特的分子标识符”条形码，使得探针之间的机会相互作用(不是由靶蛋白上的共定位引起)可以在后处理中由于在该配对中生成的低(例如，单个)记录物数而被忽略。

图19A-19C显示了探针距离和几何结构。为了精确控制相对探针定位，将探针附接到测量为70×100nm的2D、矩形、扭曲校正的DNA纳米结构(图19A)。在完全组装之后，在12.5mM Mg₂₊存在下将纳米结构随机沉积在云母表面上，用于牢固的粘附，这是保护纳米结构免受聚合酶降解的条件。每个探针通过直接延伸两个短核酸(显示在纳米结构的小截面上)或共价附接到中间寡核苷酸(插图；在通过基于DIBO的点击化学共价连接在TTT-L中间体上并凝胶纯化的探针环上的叠氮化物)。在纳米结构附接点测量探针的分离。所产生的记录物可用例如a1*和a2*引物进行PCR扩增。否则，将间隔子长度为0或12(通过缝钉延伸连接)或18nt(共价连接)的相同探针以6至48nm×6nm增量的间隔保持成对，记录(室温下1小时，每孔约50万个纳米结构，100nM引物)和对数期PCR扩增(20个循环，500nM引物)至凝胶可检测水平(图19B)。对每个孔将变性PAGE带定量标准化至恒定参考对。然后将给定探针对类型的整个系列通过最小二乘法递归拟合到S形曲线c1/(1+Exp[c2(dist-c3)])，其中dist表示间隔距离，并归一化至1的最大速率。采用相同的纳米结构基础矩形，以四个布置(简图)以30nm的间隔保持三个探针(18nt间隔子设计的P1，P2，P3，)(图19C)。当三角形布置时，所有三个探针对产生记录物，但在线性布置中，只有邻近的探针对产生记录物。类似于图19B，通过变性PAGE定量对数期PCR。

图20A-20B表示表征状态变化的数据。使用与图19C中图(i)相同的纳米结构探针三角形，除了探针P3可以被失活之外(图20A)。图20B显示了来自活性探针的记录物的PCR扩增和变性PAGE凝胶，中间洗涤后，并从无活性探针进行记录。中间洗涤结果确保没有剩余的记录物。所有步骤均采用单组纳米结构，并进行重新采样。

发明详述

生物体是复杂的分子系统。成像提供了一种自然而直接的方式来研究这种系统，并已成为生物学研究的核心方法。研究这种系统的理想方法是以单分子分辨率同时显现其天然状态下的所有相关分子。可视化生物系统的一种方法是通过显微镜，尽管使用显微镜来成像分子世界带来了几个挑战，包括“视力模糊”，部分“色盲”，有限的通量和限制的样品获取。在动态地重新配置的拥挤的分子群体中，难以清晰地看到单个分子，导致“视力模糊”。可以仅使用少量不同的颜色(例如3或4)来同时跟踪多个不同的分子，这导致部分“色盲”；显微镜具有有限的视野，允许在所选择的区仅观察到小群体的选定分子，从而限制通量；难以清楚地以其天然生存形态可视化分子，特别是因为分子(例如，作为生物样品的组分)经常被从其生物背景中取出并被加工以适合于显微镜的特定观察平台(例如，在薄的固定或冷冻样品片)。

因此，需要替代显微镜来对复杂生物系统的分子相互作用进行成像。在本文中，在一些方面，提供了无显微镜成像(MFI)方法和相关组合物，其涉及大量分子靶的“自下而上”分析，其分别与独特的核酸条形码化探针连接，本文称为“条形码化靶“(参见例如图1和图2A)。例如，当条形码化靶彼此接近时，条形码化靶的空间配置的核酸记录物(本文简称为“记录物”)(例如，条形码化靶相对于彼此的邻近度和/或布置)被反复创建，而不会破坏条形码化靶。因此，随着时间的推移，随着条形码化靶改变其空间配置(例如，与不同的条形码化靶相互作用)，生成这些改变的记录物。记录物稍后通过例如高通量核酸测序读取，并且基础分子靶的图像被计算地重建。如果例如两个分子靶保持物理或化学地相互作用或彼此相关联，则它们被认为是彼此“邻近”的。如果两个靶之间的距离为0纳米(nm)至100纳米(或0个核苷酸(nt)至100nt)，则两个分子靶也被认为彼此“邻近”。例如，两个彼此接近的靶之间的距离可以是0nm至5nm，0nm至10nm，0nm至20nm，0nm至30nm，0nm至40nm或0nm至50nm。

本发明的方法和组合物在一些实施方案中提供了以高空间分辨率以大规模平行方式原位成像单分子靶(或可选地，单个种类的分子靶)的动态过程的平台(其具有复用能力)，实现高通量分子成像。有利地，如本文所提供的无显微镜成像避免了苛刻和破坏性的样品处理，同时允许超高分辨率，分子结构的图像的精确的计算生成，数字分子计算，相互作用化学计量和状态分布的分析以及从个体分子网络获得的真实的连通性和动力学数据。

本文提供的方法使用核酸(例如DNA，例如随机DNA)“条形码”来独特地标记每个感兴趣的分子靶(图2A)。当两个条形码化靶彼此靠近时，自动生成编码两个条形码的标识的记录物。对于分离的条形码化靶(也就是说，不靠近另一个条形码化靶的条形码化靶)，不会产生任何记录物(图2B(1))。对于一对接近的条形码化靶对，生成一对独特的记录物(图2B(2))，而对于三个接近的条形码化靶，生成两个记录物，每个记录物独特于三个条形码化靶的一对(图2B(3))。同样，对于更复杂的空间配置，产生多个记录物，每个记录物独特于复杂配置的每一对(图2B(5)和2B(6))。以这种方式，可以记录精确的相互连通性和通过推理，整体几何结构。此外，对于动态配置，产生与关联时间成比例的记录物，并且在某些情况下可以被时间标记(图2B(7))。本文提供的无显微镜成像方法的示例的概述如图2C所示。样品中的每个分子靶用独特的条形码标记，重复和连续的分子重构(例如，缔合/相互作用)，自主产生记录物，并且使用高通量测序读取记录物，然后通过动态分子靶重构的计算重建进行图像生成，如本文所用的术语“重新配置”和“重构”是指分子靶位置的变化随着时间的推移相对于彼此的变化。例如，在时间1，三个分子靶可以布置成线性构型，并且在时间2，三个分子靶可以布置成三角形构型。因此，相对于时间1，三个分子因此在时间2“重新配置”。

本公开内容的无显微镜成像基于“自动循环”反应。这种重复的自动循环(例如，重复的探针和靶产生)将异常产生的记录物(例如，在溶液中形成的记录物)限制至一个拷贝，这可以容易地丢弃。通常但并非总是在37℃下在置换聚合酶存在下进行反应。用于鉴定单分子靶的条形码被掺入核酸探针(本文中称为“核酸条形码化探针”或简称“条形码化探针”)，其在一些实施方案中通过靶结合部分(例如生物素，抗体，适体，纳米体或核酸)连接至分子靶。条形码化探针被设计成使得在存在置换聚合酶和通用的可溶性引物的情况下，条形码化探针引导重复产生邻近条形码化记录物的自循环过程。图3A描绘了本公开内容的基础方法的分子机制的实例。在步骤(1)中，可溶性通用u*引物以常见的单链引物结合u区结合每个探针，置换聚合酶将引物延伸穿过条形码(i或j)区和回文p区到终止聚合的分子或修饰(例如，合成的非DNA接头)，从而产生“半记录物”，其是指包含通用u*引物，条形码(i或j)和条形码(i或j)的新产生的核酸链回文p*序列(例如，u*-i*-p*或u*-j*-p*)。请注意，带有上标“*”的字母表示与没有“*”的相应字母表示的序列互补的序列。在步骤(2)中，半记录物通过“链置换”机制部分地从条形码化探针置换(参见例如Yurke等人，Nature 406：605-608,2000；以及Zhang等人，Nature Chemistry 3：103-113,2011，每篇文献通过引用并入本文)和近半记录物通过3'回文区p*相互杂交。在步骤(3)中，半记录物通过条形码(i和j)区和引物结合u区延伸，释放编码条形码(i和j)探针的可溶性完整记录物。条形码化探针被“再生”并且能够在相同或其它分子靶配对中经历额外的循环。循环反应终止后，通过例如大规模并行的下一代测序技术收集、制备和测序记录物。序列数据表示空间配置，在某些情况下表示分子靶的连接/相互作用，准备用于统计分析和图像重建。

“链置换”是指当邻近单个互补核酸链(或链的片段)时具有相同序列的两个核酸链对于该互补链进行相对快速(例如，时间尺度<1s)竞争的机制，假定通过“随机行走”机制从互补体中相互置换。

条形码化探针

在一些实施方案中，本公开内容的核酸条形码化探针包含一个或多个布置成双链回文区、双链条形码区和引物结合区的核酸链。在一些实施方案中，条形码化探针被布置成形成发夹结构，其是折叠并形成称为“茎”的双链区和称为“环”的单链区的单链连续核苷酸。当相同核酸的两个区的核苷酸彼此碱基配对时(分子内碱基配对)，形成双链区。条形码化核酸发夹的一个实例如图5A所示。

在一些实施方案中，本公开内容的核酸条形码化探针包含两个平行的核酸链(例如，作为两个分开的核酸或作为连续的折叠的发夹)。其中一条链称为“互补链”，另一条链称为“置换链”。互补链通常含有引物结合区，或至少引物结合(例如，杂交)的引物结合区的单链区段。互补链和置换链至少通过双链条形码区并通过双链回文区彼此结合。“置换链”是最初由如本文所述的新生成的半记录物置换并且进而随着置换链“重新结合”到互补链，置换新产生的半记录物的链。

如果两个核酸或两个核酸区通过Watson-Crick相互作用彼此碱基对或彼此结合以形成双链核酸分子，则彼此“互补”(也称为杂交)。如本文所用，“结合”是指在生理条件下由于例如静电，疏水，离子和/或氢键相互作用而在至少两个分子之间的缔合。

核酸的“双链区”是指含有通过互补的嘌呤(例如腺嘌呤和鸟嘌呤)和嘧啶(例如胸腺嘧啶，胞嘧啶和尿嘧啶)之间的氢键彼此结合从而形成双螺旋的两条平行核酸链的核酸区(例如DNA或RNA)。在一些实施方案中，形成双链区的两条平行核酸链是连续核酸链的一部分。例如，如上所述，本公开内容提供了发夹结构形式的核酸条形码化探针(例如，图5A)。

核酸的“单链区”是指含有与第二核酸链未结合(未配对)的单个核酸链的核酸区。应当理解，发夹结构形式的条形码化探针包含被称为“茎”的双链区(配对区)和被称为作为“环”的单链区(未配对区)，如上所述。

“双链回文区”是指核酸(例如，DNA或RNA)条形码化探针的区，其无论是在一条链的5’(5撇)至3’(3撇)还是在其形成双螺旋的互补链上的5'至3'均是相同序列的核苷酸。例如，以下序列，如图5A所示，被认为是回文序列：ACCGGT。因此，包含上述序列的双链回文区如下：

5'-ACCGGT-3’

3'-TGGCCA-5’；

如图3A所示，回文(p*)序列允许连接彼此接近的条形码化探针(和间接地，条形码化靶)。与引物结合区结合的引物的聚合酶延伸产生“半记录物”，其是指新产生的核酸链。半记录物的产生将条形码化探针中的一条链置换，被称为“置换链”。该置换链进而置换半记录物的一部分(通过结合其“互补链”)，从3'末端起始，从而使包含回文序列的半记录物的3'末端能够结合到同样从邻近的条形码化核酸置换的另一个半记录物。

在一些实施方案中，双链回文区具有4至10个核苷酸碱基对的长度。也就是说，在一些实施方案中，双链回文区可以包含与4至10个互补核苷酸结合的4至10个连续核苷酸。例如，双链回文区可以具有4、5、6、7、8、9或10个核苷酸碱基对的长度。在一些实施方案中，双链回文区可以具有5至6个核苷酸碱基对的长度。在一些实施方案中，双链回文区长于10个核苷酸碱基对。例如，双链回文区可以具有4至50个核苷酸碱基对的长度。在一些实施方案中，双链回文区具有4至40、4至30或4至20个核苷酸碱基对的长度。在一些实施方案中，可以用与另一探针产生的任意序列互补的任意序列来替代回文区。在这样的实施方案中，探针能够仅与具有互补的3'末端序列的探针配对。

双链回文区可以包括鸟嘌呤(G)，胞嘧啶(C)，腺嘌呤(A)和/或胸腺嘧啶(T)。在一些实施方案中，G和C核苷酸碱基对(G/C)相对于A和T核苷酸碱基对(A/T)的百分比大于50％。例如，双链回文区的G/C相对于A/T的百分比可以为50至100％。在一些实施方案中，G/C相对于A/T的百分比大于60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％。

在一些实施方案中，双链回文区可以包括偶数个核苷酸碱基对，尽管本发明的双链回文区不受此限制。例如，双链回文区可以包括4、6、8或10个核苷酸碱基对。或者，双链回文区可以包括5、7或9个核苷酸碱基对。

在多个核酸条形码化探针中，典型地，双链回文区对于多个核酸条形码化探针的每个探针是相同的，使得彼此接近的任何两个探针能够通过生成的包含回文序列的半记录物彼此结合。然而，在一些实施方案中，双链回文区可以仅在多个核酸条形码化探针的条形码化探针的子集中相同，使得两个不同的子集包含两种不同的双链回文区。

“双链条形码区”是指将探针识别为属于特定分子靶或分子靶种类的核酸(例如DNA或RNA)条形码化探针的双链区。双链条形码区可以以随机或合理设计的顺序包含核苷酸的任何组合。在一些实施方案中，双链条形码区具有2至100个核苷酸碱基对的长度。也就是说，在一些实施方案中，双链条形码区可以包含与分别2至100个互补的核苷酸结合的2至100个连续核苷酸。例如，双链条形码区的长度可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸碱基对。在一些实施方案中，双链条形码区可以具有2至5、2至10、2至15、2至20、2至25、2至30、2至35、2至40、2至45，或2至50个核苷酸碱基对的长度。在一些实施方案中，双链条形码区可以具有35至50、35至60、35至70、35至80、35至90或35至100个核苷酸碱基对的长度。在一些实施方案中，双链条形码区长于100个核苷酸碱基对。例如，双链条形码区可以具有2至200个核苷酸碱基对的长度。在一些实施方案中，双链条形码区的长度为2至190、2至180、2至170、2至160、2至150、2至140、2至130、2至120或2至110核苷酸碱基对。

如果探针的条形码区仅与分子靶相关联并且可以用于仅识别分子群体(包含具有自己独特的条形码化探针的其他分子靶分子靶)中的该分子靶，则核酸条形码化探针被认为对于该分子靶是“独特”或“特异性”的。类似地，如果探针的条形码区仅与分子靶种类相关联并且可以仅用于鉴定分子群体中的该分子靶种类，则核酸条形码化探针被认为针对该分子靶种类是“独特”或“特异性”的。

“引物结合区”是指其中单链引物(例如DNA或RNA引物)结合以起始复制的核酸(例如DNA或RNA)条形码化探针的区。引物结合区可以是单链区或部分双链区，其是指包含单链区段和双链区段的区。部分双链引物结合区的实例如图5A所示，其中“a16”表示引物结合区的单链区，“ax5”表示引物结合区的双链区。引物结合区可以以随机或合理设计的顺序包含核苷酸的任何组合。在一些实施方案中，取决于引物结合区的单链和/或双链性质，引物结合区具有4至40个核苷酸的长度(或核苷酸碱基对，或核苷酸和核苷酸碱基对的组合))。例如，引物结合区可以具有4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸(和/或核苷酸碱基对)的长度。在一些实施方案中，引物结合区可以具有4至10、4至15、4至20、4至25、4至30、4至35或4至40个核苷酸(和/或核苷酸碱基对)的长度。在一些实施方案中，引物结合区长于40个核苷酸。例如，引物结合区可以具有4至100个核苷酸的长度。在一些实施方案中，引物结合区具有4至90、4至80、4至70、4至60或4至50个核苷酸的长度。

在一些实施方案中，引物结合区被设计为适应多于一种(例如2或3种不同的)引物的结合。

再次参照图3A和5，作为实例，通过置换聚合酶的引物(与引物结合位点结合)的延伸通常通过终止聚合的分子或修饰的存在来终止。因此，在一些实施方案中，本公开内容的核酸条形码化探针包含终止聚合的分子或修饰。终止聚合的分子或修饰(“终止物”或“阻断物”)通常位于与双链回文区邻近的条形码化探针的双链区，使得聚合终止引物通过双链回文区的延伸。对于以发夹形式布置的核酸条形码化探针，终止聚合的分子或修饰可以位于双链回文区和发夹环之间，如图5A所示(“间隔子9”)。在一些实施方案中，终止聚合的分子是合成的非DNA接头，例如三乙二醇间隔子，例如Int Spacer 9(iSp9)或Spacer 18(Integrated DNA Technologies(IDT))。应当理解，可以如本文提供的那样使用终止聚合酶聚合的任何非天然接头。这种分子和修饰的其它非限制性实例包括三碳键(/iSpC3/)(IDT)，ACRYDITE^TM(IDT)，腺苷酸化，叠氮化物，地高辛(NHS酯)，胆固醇-TEG(IDT)，I-LINKER^TM(IDT)和3-氰基乙烯基咔唑(CNVK)及其变型。通常，但不总是，短接头(例如，iSp9)导致更快的反应时间。

在一些实施方案中，终止聚合的分子是分别是胞嘧啶和鸟嘌呤的化学变体的单个或成对的非天然核苷酸序列，例如iso-dG和iso-dC(IDT)。Iso-dC将与Iso-dG碱基配对(氢键)，但不与dG结合。类似地，Iso-dG将与Iso-dC碱基配对但不与dC碱基配对。通过在发夹的相对侧上成对并入这些核苷酸，在终止位置，聚合酶将被停止，因为在溶液中没有互补核苷酸以在该位置添加。

在一些实施方案中，通过将反应中的dNTP浓度(例如，200μm)降低至100μm，10μm，1μm或更小来提高“终止”或“阻断”修饰的性能的效率。

包含终止聚合的分子或修饰通常在条形码化探针的双链区(例如，发夹结构的茎区)中产生“凸起”，因为分子或修饰物不配对(参见例如图5A)。因此，在一些实施方案中，与分子或修饰相对地，条形码化探针被设计为包括单个核苷酸(例如胸腺嘧啶)，至少两个相同核苷酸(例如，胸腺嘧啶二聚体(TT)或三聚体(TTT))，或非自然修饰。

因此，为了防止聚合酶延伸条形码化探针的末端(例如，5'或3'末端)，使用多聚T序列(例如，序列2、3、4、5、7、8、9或10个胸腺嘧啶核苷酸的序列)，如图5A所示。或者，可以将合成碱基(例如反向dT)或其它修饰物加入到条形码化探针的末端(例如5'或3'末端)，以防止探针的不期望的聚合。其他终止分子(阻止不期望延伸的3'末端的延伸的分子)包括但不限于iso-dG和iso-dC或其他非天然核苷酸或修饰。

如上所述，半记录物的产生(参见例如图3A)置换条形码化探针中的一条链。这个置换的链进而从3'端开始置换半记录物的一部分。在一些实施方案中，通过与终止聚合的分子或修饰邻近的“双链置换区”，半记录物的这种置换被促进(参见例如图5A，“DS6”)。在其中条形码化探针具有发夹结构的实施方案中，双链置换区可以位于终止聚合的分子或修饰和发夹环之间(参见例如图5A)。双链置换区可以以随机或合理设计的顺序包含核苷酸的任何组合。在一些实施方案中，双链置换区具有2至10个核苷酸碱基对的长度。例如，双链置换区可以具有2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸碱基对的长度。在一些实施方案中，双链回文区可以具有5至6个核苷酸碱基对的长度。在一些实施方案中，双链回文区可以仅含有C和G核苷酸的组合。

在一些实施方案中，也可以通过修改反应条件来促进半记录物的置换。例如，一些自循环反应可以包括用于新链产生的硫代磷酸酯核苷酸(2'-脱氧核苷α-硫醇2'-脱氧核苷α-硫醇三磷酸酯集，Trilink Biotechnologies)来替代天然的可溶性dNTP。这些在天然dNTP的杂交中不太稳定，并导致半记录物和茎之间的相互作用减弱。它们可以以任何组合使用(例如，硫代磷酸酯A与天然T，C和G碱基，或混合物的其它组合或比例)。可以进行其它这样的化学修饰以减弱半记录物配对并促进置换。

类似地，在一些实施方案中，探针本身可以被修饰，其中非天然核苷酸代替加强发夹茎。在这样的实施方案中，产生半记录物的置换聚合酶仍可以打开并复制茎，但是在链置换过程中，在与茎模板的半记录物杂交方面在能量上有利于茎序列的重新杂交。非天然核苷酸的非限制性实例包括5-甲基dC(5-甲基脱氧胞苷；当代替dC时，该分子将核酸的解链温度每个核苷酸插入增加多达5℃)，2,6-二氨基嘌呤(该分子可以使每个插入的解链温度提高多达1-2℃)，Super T(5-羟基丁炔-2'-脱氧尿苷也可以增加核酸的解链温度)和/或锁核酸(LNA)。它们可能发生在发夹茎的任一条或两条链中。

在一些实施方案中，可以使用非天然核苷酸引入新的半记录物序列和茎之间的错配。例如，如果isoG核苷酸存在于茎的模板链中，则聚合酶在某些情况下会错误地添加可用的可溶性核苷酸之一来延长半记录物，并且这样做会在新的半记录物和茎模板链之间产生“凸起”，非常类似于图5A的凸起(包括在引物中)。同样的目的是削弱半记录物-模板相互作用和鼓励置换。

在一些实施方案中，本公开内容的核酸条形码化探针被设置成形成发夹结构，其是折叠并形成双链区(称为“茎”)和单链区(被称为“环”)的单链连续核苷酸。在一些实施方案中，单链环区具有3至50个核苷酸的长度。例如，单链环区可以具有3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个核苷酸的长度。在一些实施方案中，单链环区具有3至10、3至15、3至20、3至25、3至30、3至35、3至40、3至45或3至50个核苷酸的长度。在一些实施方案中，单链环区长于50个核苷酸。例如，单链环区可以具有3至200个核苷酸的长度。在一些实施方案中，单链环区具有3至175、3至150、3至100或3至75个核苷酸的长度。在一些实施方案中，环区包括较小的分子内碱基配对区。发夹环在一些实施方案中允许条形码化探针相对于靶结合部分的取向具有柔性。也就是说，环通常允许条形码化探针相对于靶结合部分占据各种位置和角度，从而允许相继地与多个附近的探针(例如，附接到其它靶)相互作用。

本公开内容的核酸条形码化探针通常通过靶结合部分附接到分子靶。在一些实施方案中，靶结合部分附接到条形码化探针的末端(例如，远离引物结合区的末端)。在一些实施方案中，靶结合部分附接到以发夹形式布置的条形码化探针的单链环区(参见例如图5A)。

用于本文提供的靶结合部分的实例包括但不限于生物素，抗体，适体，纳米体，核酸，药物(例如小分子药物)和原子(例如Li)。考虑了其他靶向分子。在一些实施方案中，分子靶可以通过杂交或“点击化学”附接到条形码化探针。参见例如Kolb H.C.,等人.Angewandte Chemie International Edition 2001,40(11):2004–2021；and EvansR.A.Australian Journal of Chemistry,2007,60(6):384–395。

在一些实施方案中，本公开内容的核酸条形码化探针包含至少一个锁核酸(LNA)核苷酸或其他修饰的碱基。成对的LNA或其他修饰的碱基可以在条形码化探针的双链区中用作更强(或更弱)的碱基对，从而偏好链置换反应。在一些实施方案中，至少一个LNA分子位于条形码化探针的互补链上，位于双链条形码区和单链引物结合区之间。

在一些实施方案中，本公开内容的核酸条形码化探针与分子靶结合。“分子靶”是任何希望观察或定量的分子。分子靶的实例包括但不限于蛋白质，糖(例如多糖)，脂质，核酸(例如DNA，RNA，微RNA)和小分子。分子靶可以是DNA或RNA。在一些实施方案中，分子靶是RNA干扰分子，例如短干扰RNA(siRNA)或微RNA(microRNA)。在一些实施方案中，分子靶是反义分子，例如DNA反义合成寡核苷酸(ASO)。

在一些实施方案中，分子靶是生物分子。如本文所用，“生物分子”是由生物体产生的任何分子，包括大分子如蛋白质，多糖，脂质和核酸(例如，DNA和RNA如mRNA)，以及小分子如初级代谢产物，次生代谢产物和天然产物。分子靶，特别是生物分子的实例包括但不限于DNA，RNA，cDNA或经历反转录的RNA的DNA产物，A23187(卡西霉素，钙离子载体)，阿维菌素，松香酸，乙酸，乙酰胆碱，肌动蛋白，放线菌素D，腺苷，二磷酸腺苷(ADP)，单磷酸腺苷(AMP)，三磷酸腺苷(ATP)，腺苷酸环化酶，核糖醇，肾上腺素，肾上腺素，促肾上腺皮质激素(ACTH)，水母发光蛋白，黄曲霉毒素，琼脂，Alamethicin，醛固酮，阿仑膦酮，α-淀粉蛋白，尿囊素，烯丙菊酯，α-阿马丁，氨基酸，淀粉酶，合成代谢类固醇，茴香脑，血管紧张素原，异新霉素，抗利尿激素(ADH)，阿拉伯糖，精氨酸，子囊霉素，抗坏血酸(维生素C)，天冬氨酸，不对称二甲基精氨酸，心钠素(ANP)，生长素，抗生物素蛋白，印苦楝子素A-C35H44O16，细菌素，白藜芦醇，比丘核苷，胆红素，生物聚合物，生物素(维生素H)，布雷菲德菌素A，油菜素内酯，布鲁宁，尸胺，咖啡因，钙化醇(维生素D)，降钙素，钙调蛋白，钙调蛋白，钙网蛋白，樟脑-(C10H16O)，大麻酚，辣椒素，碳水化合物，碳水化合物，肉碱，卡拉胶，酪蛋白，胱天蛋白酶，纤维素酶，纤维素-(C6H10O5)，变蓝菌素，西曲溴铵(西三溴铵)-C19H42BrN，白屈菜赤碱，色霉素A3，Chaparonin，壳多糖，α-氯洛糖，叶绿素，缩胆囊素(CCK)，胆固醇，胆碱，硫酸软骨素，肉桂醛，柠檬醛，柠檬酸，香茅醇，瓜氨酸，钴胺素(维生素B12)，辅酶Q，秋水仙碱，胶原蛋白，Coniine，皮质类固醇，皮质酮，促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)，皮质醇，肌酸，肌酸激酶，结晶蛋白，α-环糊精，环糊精糖基转移酶，，环钛酸，半胱氨酸，胱氨酸，松胞菌素，松胞菌素E，细胞色素，细胞色素C，细胞色素C氧化酶，细胞色素C过氧化物酶，细胞因子，胞嘧啶-C4H5N3O，脱氧胆酸，DON(脱氧新戊酚)，脱氧呋喃核糖，脱氧核糖，脱氧核糖核酸(DNA)，葡聚糖，糊精，DNA，多巴胺，酶，麻黄素，肾上腺素-C9H13NO3，芥酸-CH3(CH2)7CH＝CH(CH2)11COOH，赤藓糖醇，促红细胞生成素(EPO)，雌二醇，丁子香酚，脂肪酸，纤维蛋白，纤连蛋白，叶酸(维生素M)，促卵泡激素(FSH)，甲醛，甲酸，Formnoci，果糖，Fumonisin B1，Gamma球蛋白，半乳糖，γ-球蛋白，γ-氨基丁酸，γ-丁内酯，γ-羟基丁酸(GHB)，胃泌素，明胶，球蛋白，胰高血糖素，葡萄糖胺，葡萄糖-C6H12O6，葡萄糖氧化酶，谷蛋白，谷氨酸，谷氨酰胺，谷胱甘肽，谷蛋白，甘油(甘油)，甘氨酸，糖原，乙醇酸，糖蛋白(例如糖蛋白酶如前列腺特异性抗原(PSA))，促性腺激素(GnRH)，粒酶，绿色荧光蛋白，生长激素，生长激素释放激素(GHRH)，GTP酶，鸟嘌呤，鸟苷，三磷酸鸟苷(+GTP)，海珠蛋白，苏木精，血红素，血红蛋白，血蓝蛋白，血红蛋白，血红蛋白，硫酸肝素，高密度脂蛋白，HDL，组胺，组氨酸，组蛋白，组蛋白甲基转移酶，HLA抗原，同型半胱氨酸，激素，人绒毛膜促性腺激素(hCG)，人生长激素，透明质酸盐，透明质酸酶，过氧化氢，5-羟甲基胞嘧啶，羟脯氨酸，5-羟基色胺，靛蓝染料，吲哚，肌苷，肌醇，胰岛素，胰岛素样生长因子，整合膜蛋白，整合酶，整合素，蛋白质，干扰素，菊糖，离子霉素，紫罗酮，异亮氨酸，铁硫簇，K252a，K252b，KT5720，KT5823，角蛋白，激酶，乳糖酶，乳酸，乳糖，羊毛脂，月桂酸，瘦素，轻肌蛋白B，亮氨酸，木质素，柠檬烯，芳樟醇，亚油酸，亚麻酸，脂肪酶，脂质，脂质锚定蛋白，脂酰胺，脂蛋白，低密度脂蛋白，LDL，促黄体激素(LH)，番茄红素，赖氨酸，溶菌酶，苹果酸，麦芽糖，褪黑素，膜蛋白，金属蛋白，金属硫蛋白，甲硫氨酸，含羞草素，光神霉素A，丝裂霉素C，单体，霉酚酸，肌红蛋白，肌球蛋白，天然酚，核酸，赭曲霉毒素A，雌激素，寡肽，寡核苷酸，地衣酚，阿立新，鸟氨酸，草酸，氧化酶，催产素，p53，PABA，紫杉醇，泛酸(维生素B5)，甲状旁腺激素(PTH)，副蛋白质，豹毒素，欧苷菊，棒曲霉素，蕈青霉素，青霉酸，青霉素，青霉素A，青霉震颤素A，肽酶，胃蛋白酶，肽，表霉素，外周膜蛋白，Perosamine，苯乙胺，苯丙氨酸，肌磷酸，磷酸酶，磷脂，苯丙氨酸，植酸，植物激素，多肽，多酚，多糖，卟啉，朊病毒，孕酮，催乳素(PRL)，脯氨酸，丙酸，鱼精蛋白，蛋白酶，蛋白质，类蛋白，腐胺，除虫菊酯，吡哆素或吡哆胺(维生素B6)，吡咯赖斯，丙酮酸，喹诺酮，萝沙星，棉子糖，肾素，视黄醇，视黄醇(维生素A)，视紫红质(视紫色)，核黄素(维生素B2)，呋喃核糖，核糖，核酶，蓖麻毒素，RNA-核糖核酸，RuBisCO，黄樟脑，水杨醛，水杨酸，Salvinorin-A-C23H28O8，皂苷，秘密蛋白，硒代半胱氨酸，硒代甲硫氨酸，硒蛋白，丝氨酸，丝氨酸激酶，血清素，生长抑素，山梨酸，角鲨烯，星形孢菌素，硬脂酸，白藜芦醇，甾醇，士的宁，蔗糖(糖)，糖(一般的)，超氧化物，T2毒素，丹宁酸，鞣酸，酒石酸，牛磺酸，河豚毒素，竹竿蛋白，拓扑异构酶，酪氨酸激酶，牛磺酸，睾酮，四氢大麻酚(THC)，河豚毒素，毒胡萝卜素，Thaumatin，硫胺素(维生素B1)-C12H17ClN4OS·HCl，苏氨酸，血小板生成素，胸腺嘧啶，胸腺嘧啶，Triacsin C，促甲状腺激素(TSH)，促甲状腺激素释放激素(TRH)，甲状腺素(T4)，生育酚(维生素E)三碘甲状腺原氨酸(T3)，跨膜受体，曲古抑菌素A，营养激素，胰蛋白酶，色氨酸，微管蛋白，突触蛋白，酪氨酸，泛素，尿嘧啶，尿素，尿素酶，尿酸-C5H4N4O3，尿苷，缬氨酸，瓦林霉素，Vanabin，加压素，疣孢菌素，维生素(一般的)，维生素A(视黄醇)，维生素B，维生素B1(硫胺素)，维生素B2(核黄素)，维生素B3(尼克酸或烟酸)，维生素B4(腺嘌呤)，维生素B5(泛酸)，维生素B6(吡哆醇或吡哆胺)，维生素B12(钴胺素)，维生素C(抗坏血酸)，维生素D(促钙醇)，维生素E(生育酚)，维生素F，维生素H(生物素)，维生素K(萘醌)，维生素M(叶酸)，渥曼青霉素和木糖。

在一些实施方案中，分子靶是蛋白质靶，例如细胞环境的蛋白质(例如细胞内或膜蛋白)。蛋白质的实例包括但不限于纤维蛋白如细胞骨架蛋白(例如肌动蛋白，arp2/3，冠状蛋白，肌营养不良蛋白，FtsZ，角蛋白，肌球蛋白，伴肌动蛋白，血影蛋白，tau，肌联蛋白，原肌球蛋白，微管蛋白和胶原)和细胞外基质蛋白质(例如，胶原蛋白，弹性蛋白，f-脊椎动物，皮卡丘林和纤连蛋白)；球蛋白如血浆蛋白(如血清淀粉样蛋白P成分和血清白蛋白)，凝血因子(如补体蛋白，C1抑制剂和C3转化酶，因子VIII，因子XIII，纤维蛋白，蛋白C，蛋白S，蛋白Z，蛋白Z相关蛋白酶抑制剂，凝血酶，血管性血友病因子)和急性期蛋白如C反应蛋白；血红素蛋白；细胞粘附蛋白(例如钙粘蛋白，室芬灵，整联蛋白，Ncam和选择蛋白)；跨膜转运蛋白(例如CFTR，血型糖蛋白D和爬行酶)例如离子通道(例如，配体门控离子通道，如烟碱乙酰胆碱受体和GABAa受体，以及电压门控离子通道如钾，钙和钠通道)，同向运输/反向运输蛋白(如葡萄糖转运蛋白)；激素和生长因子(例如表皮生长因子(EGF)，成纤维细胞生长因子(FGF)，血管内皮生长因子(VEGF)，肽激素如胰岛素，胰岛素样生长因子和催产素，和类固醇激素如雄激素，雌激素和孕激素)；受体如跨膜受体(例如G蛋白偶联受体，视紫红质)和细胞内受体(如雌激素受体)；DNA结合蛋白(例如组蛋白，原蛋白，CI蛋白)；转录调节物(例如，c-myc，FOXP2，FOXP3，MyoD和P53)；免疫系统蛋白(例如，免疫球蛋白，主要组织相容性抗原和T细胞受体)；营养储存/转运蛋白(例如铁蛋白)；伴侣蛋白；和酶。

在一些实施方案中，靶蛋白是前列腺特异性抗原(PSA)。PSA(也称为γ-半乳糖蛋白或激肽释放酶-3)是KLK3基因在人体中编码的糖蛋白。PSA是激肽释放酶相关肽酶家族的成员，并且由前列腺的上皮细胞分泌。

本公开内容的核酸条形码化探针可以是DNA，例如D型DNA和L型DNA和RNA，以及其各种修饰。核酸修饰包括碱基修饰，糖修饰和骨架修饰。以下提供这些修饰的非限制性实例。

可以根据本公开内容使用的修饰的核酸(例如，DNA变体)的实例包括但不限于L-DNA(文献中已知的DNA的骨架对映异构体)，肽核酸(PNA)bisPNA夹，假互补PNA，锁核酸(LNA)和上述的共核酸如DNA-LNA共核酸。因此，本公开内容涉及包含DNA，RNA，LNA，PNA或其组合的纳米结构。应当理解，在本公开内容的方法和组合物中使用的核酸本质上可以是均相或异质的。作为实例，核酸本质上可以是完全的DNA，或者它们可以由DNA和非DNA(例如，LNA)单体或序列组成。因此，可以使用核酸元件的任何组合。核酸修饰可使核酸在某些条件下更稳定和/或更不易于降解。例如，在一些实施方案中，核酸是耐核酸酶的。

本文还提供了多个核酸条形码化探针。“多个”包含至少两个核酸条形码化探针。在一些实施方案中，多个包含2至2百万个核酸条形码化探针(例如，独特的条形码化探针)。例如，多个可包含100、500、1000、5000、100、000、100、000、100、000或更多个核酸条形码化探针。本发明并不限定于此。

本文还提供了核酸条形码化探针对。这样的对旨在彼此组合使用以检测分子靶空间布置和关联。在一些实施方案中，核酸条形码化探针对包含(a)布置成(i)双链条形码区和(ii)引物结合区(例如，单链引物-结合区)的第一核酸条形码化探针，简单地称为“第一探针”，和(b)第二单链条形码化探针，其包含条形码区和与单链引物结合区互补的引物区，称为“第二探针”(参见例如图10A)。每个探针通过靶结合部分附接到分子靶。在含有上述一对条形码化探针的无显微镜成像反应中，回文区是不必要的，因为第二个探针(单链探针)包括直接与第一个探针的引物结合区结合的引物。如图10A所示的例子所示，第二条形码化探针在一端(例如，远离附接到分子靶的末端和/或3'端)含有引物，其与第一探针的引物结合区互补并结合。一旦结合到第一探针的引物结合区，第二探针的引物通过第一探针的条形码区聚合，从而产生其与第一探针缔合的记录物-第二探针现在包含两个不同的条形码。当第一探针(其在引物的聚合过程中被置换)的置换链在其“重新结合”到第一探针上的其互补链上时部分地置换第二探针。部分置换的第二探针然后自发地从第一探针解离。现在包含其与第一探针的关联的记录物的第二探针可以自由地结合到另一个探针并“记录”该第二关联(参见例如图10A)。

通常，任何两个条形码化探针可以分别附接到两个分子靶。然而，在一些实施方案中，两个条形码化探针可以附接到相同分子靶(例如，蛋白质如抗体)的不同表位，例如，以产生表示溶液中该分子靶存在的记录物，当两个这样的条形码探针彼此靠近时，创建相同记录物的许多拷贝(参见例如图18)。在一些实施方案中，这允许数字“计数”溶液中的靶分子数。

图18显示了自动循环产生的DNA序列在单分子水平上报告抗体共定位的实例。具体而言，将随机条形码序列(在该特定图中被称为单个抗体(Ab)分子的独特分子标识符(UMI)和不同Ab类型的条形码)被并入到连接在Ab上的DNA发夹探针中。在Ab对共定位在其靶上后，具有UMI和样品条形码的引物对分别在3'突出端结合每个发夹探针。聚合酶将引物延伸至合成的“终止子”部位，复制Ab UMI(1，2)和Ab条形码。然后将延伸的引物通过链置换从发夹部分释放，并将它们的3'Ab条形码片段(针对靶蛋白质是独特的)配对。这些序列再次延伸，释放携带Ab UMI(1和2)和引物UMI(1)的报告链。因此，发夹探针再生到其初始状态并经历另外的循环，在每个循环中产生携带相同Ab UMI对(1和2)但不同引物UMI(2至n)的报告链。相比之下，如果抗体对在本体溶液中随机相互遇到，而不是在靶上共定位，则它们将仅针对每个Ab UMI对与一个引物UMI产生报告链一次。因此，通过对报告链进行测序来单独读取真正共定位事件产生的信号，并且可以通过在每个Ab UMI对上读取引物UMI来容易地丢弃背景报告链。该特征使检测单一蛋白分子成为可能，并且可以使用例如下一代测序技术来扩大测定。

系统与方法

本文提供的无显微镜成像系统包含核酸条形码化探针，设计用于结合那些探针的引物和置换聚合酶。

“引物”是用作核酸合成起点的单链核酸。聚合酶将核苷酸加入引物以产生新的核酸链。本公开内容的引物被设计为与核酸条形码化探针的引物结合区互补并结合。因此，引物长度和组成(例如，核苷酸组成)至少部分取决于条形码化探针的引物结合区的长度和组成。在一些实施方案中，引物具有4至40个核苷酸的长度。例如，引物可以具有长度为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23，24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸。在一些实施方案中，引物可以具有4至10、4至15、4至20、4至25、4至30、4至35或4至40个核苷酸的长度。

引物可以以成对或其他的组合(例如，在任何几何形状中的三联体或更多种类)存在，用于例如限制探针结合符合其几何标准的那些引物(参见例如图12)。所示的刚性双链连接在条形码探针之间实现最小和最大距离。双链“尺”结构域可以是任何长度(例如，2至100个核苷酸或更多)，并且可以可选地包括条形码本身，其通过信息内容链接两个半部，如果它们在处理期间变得分离。在一些实施方案中，实施在其间可能产生记录物的探针之间的典型距离的双链尺结构域是复杂结构，例如2-，3-或4-DNA螺旋束，DNA纳米结构，例如DNA折纸结构，或增加或改变尺的刚度/硬度的其他结构。

“链置换聚合酶”是指能够置换在核酸合成期间遇到的下游核酸(例如DNA)的聚合酶。不同的聚合酶可以具有不同程度的置换活性。链置换聚合酶的实例包括但不限于Bst大片段聚合酶(例如，New England Biolabs(NEB)#M0275)，phi 29聚合酶(例如NEB#M0269)，Deep VentR聚合酶，Klenow片段聚合酶和修饰的Taq聚合酶。考虑了其它链置换聚合酶。

在一些实施方案中，引物包含相对于单链引物结合区的至少一个核苷酸错配。可以使用这种不匹配来促进半记录物从条形码化探针的互补链的置换(参见例如图9D)。在一些实施方案中，引物包含至少一个人造接头。

如本文所提供的无显微镜成像反应的“循环速率”是指由两个最近的条形码分子靶的循环相互作用而产生完整记录物(相对于半记录物)的速率。在一些实施方案中，包含错配或人造接头的引物将循环速率提高5倍至10倍或更多。

在一些实施方案中，本公开内容的无显微镜成像系统还包含与单链引物结合区部分互补的辅助核酸链，其与邻近引物结合区的单链区部分互补，以及与邻近引物结合区的单链区短暂结合(参见例如图9F)。“辅助链”允许聚合酶引发聚合反应，同时也允许存在失配，如上所述。在一些实施方案中，辅助链长度为3至20个核苷酸。例如，辅助链可以具有3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸的长度。

本文提供了检测分子靶相互作用(例如彼此)的方法。在一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：(a)将本文提供的至少一个(例如多个)核酸条形码化探针，含有至少一种分子靶的样品，与多个核酸条形码化探针的探针的单链引物结合区互补的引物和链置换聚合酶接触，和(b)在允许产生条形码化记录物的条件下孵育样品。

在一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：使本文提供的核酸条形码化探针对与包含至少两个分子靶的样品和链置换聚合酶接触，和(b)在允许生成条形码化记录物的条件下(例如，在允许核酸复制的条件下)孵育样品。

“样品”可以包含一个或多个细胞，组织或体液如血液(血清和/或血浆)，尿液，精液，淋巴液，脑脊液或羊水。样品可以获自(或衍生自)任何来源，包括但不限于人，动物，细菌，病毒，微生物和植物。在一些实施方案中，样品是细胞裂解物或组织裂解物。样品还可以包含来自一个来源或不同来源的材料的混合物。样品可以是空间区域或体积(例如，阵列上的网格，或板或盘中的孔)。

在一些实施方案中，样品是单细胞，例如稀有细胞。稀有细胞的实例包括但不限于循环肿瘤细胞，上皮祖细胞和干细胞，间充质细胞和胎儿细胞，例如在血流中循环的。

“允许产生条形码化记录物的条件”可以是生理条件(例如，温度为20-40摄氏度，大气压力为1，和/或pH值为6-8)。

在一些实施方案中，步骤(b)在20至40摄氏度(℃)的温度下进行。例如，步骤(b)可以在20℃，21℃，22℃，23℃，24℃，25℃，26℃，27℃，28℃，29℃，31℃，32℃，33℃，34℃，35℃，36℃，37℃，38℃，39℃或40℃的温度下进行。

在一些实施方案中，步骤(b)进行10分钟(分钟)至24小时或更长时间。例如，步骤(b)可以进行10分钟至3小时(小时)，10分钟至12小时，10分钟至18小时或10分钟至24小时的时间。在一些实施方案中，步骤(b)进行10分钟，15分钟，20分钟，25分钟，30分钟，35分钟，40分钟，45分钟，50分钟，55分钟，60分钟，65分钟，70分钟，75分钟，80分钟，85分钟，90分钟，95分钟，100分钟，105分钟，110分钟，115分钟，120分钟，125分钟，130分钟，135分钟，140分钟，145分钟，150分钟，155分钟，160分钟，165分钟，170分钟，175分钟或180分钟的时间。

在一些实施方案中，无显微镜成像反应可以具有0.25-15mM Mg和/或50-250mM Na的盐浓度。

在一些实施方案中，无显微镜成像反应可具有0.05-5mM的反应dNTP浓度(例如，0.05mM，0.10mM，0.15mM，0.20mM，0.25mM，0.30mM，0.35mM，0.40mM，0.45mM，0.50mM，1.0mM，1.5mM，2.0mM，2.5mM，3.0mM，3.5mM，4.0mM，4.5mM或5.0mM。

可用于无显微镜成像反应的缓冲液包括但不限于“Thermo-Pol Buffer”(NewEngland Biolabs)，磷酸盐缓冲盐水(含或不含Mg或Na补充)，任何商业或实验室制备的细胞培养基，补充有足以进行DNA杂交和聚合酶操作的阳离子盐的任何pH-缓冲溶液或水。

在一些实施方案中，本文提供的无显微镜成像反应的循环速率为每对探针每10分钟1次完整记录物，但可以与每秒1个完整记录物一样快，或者像在某些(例如，更严格的)条件下每10个小时1个完整记录物一样缓慢。

在无显微镜成像“循环”结束时，产生条形码化靶的空间配置的核酸记录物(简称为“记录物”)(参见例如图3A)。在一些实施方案中，记录物是双链的。在一些实施方案中，记录物是单链的。记录物的长度可能会有所不同。例如，条形码化记录物可以具有30至500个核苷酸(或核苷酸碱基对)的长度。在一些实施方案中，条形码化记录物的长度为30至100、30至200、30至300、30至400、50至100、50至200、50至300、50至400或50至500个核苷酸(或核苷酸碱基对)。在一些实施方案中，条形码化记录物的长度为80至100个核苷酸(或核苷酸碱基对)或90个核苷酸(或核苷酸碱基对)。

记录物可以通过聚合酶介导的机制从探针“释放”，或通过扩增的引物从探针上的引物结合区自发释放。在一些实施方案中，如图14所示，延伸引物的3'末端可以被设计成自身折回并延伸出探针。由于本公开内容的无显微镜成像系统通常不将成对的条形码复制到相同的记录物链上，所以可以将额外的条形码添加到在信息内容中连接记录物对的类似尺的引物。

在产生条形码化记录物之后，收集它们，并且在一些实施方案中被纯化。例如，可以将记录物收集在反应的上清液中或通过收集反应容器的全部内容物来收集。进一步制备记录物用于测序可能会进行平台特异性测序。一些平台可能不需要进一步的准备，但通常记录物必须具有以下的组合：(1)测序特异性“衔接子”或加入其末端的其他寡核苷酸，(2)进行“扩增”反应(例如聚合酶链反应PCR))，其中产生相同或几乎相同(例如99％，98％，95％，90％，80％相同)的记录物(具有或不具有“衔接子”序列)的拷贝，和(3)从可能干扰制备或测序的其他序列，蛋白质或反应组分的纯化。例如，衔接子序列可以使用常见的“A-加尾”技术附接到记录物，然后进行凝胶电泳纯化，最后进行PCR扩增。或者，一些实施方案可以直接进行记录物的PCR扩增，可能通过长DNA引物添加衔接子序列，或随后进行衔接子连接和凝胶纯化。

在一些实施方案中，可以使用两种或更多种类型的记录引物来例如促进随后的PCR扩增或用于测序的准备。每个引物可以具有相同的探针结合序列，但在不涉及记录物反应的另外的5'序列上不同。在两种引物类型的情况下，所有得到的记录物的平均一半将具有不同的非互补的5'和3'末端。这些可以用于进一步扩增(例如，通过使末端更容易与可溶性PCR引物杂交而不是形成发夹茎)，连接或其它加工。例如，如果使用10种类型的这种记录引物，则所有记录物的平均90％将具有不同的非互补的5'和3'末端，进一步有助于末端特异性扩增和加工。

在一些实施方案中，条形码化记录物通过凝胶电泳直接观察或通过PCR进行扩增和定量来“解码”(参见例如图19C)。该示例依赖于其记录引物或条形码中基于不同序列的特定记录物的特异性扩增。大量平行测序也包括在本公开内容中，并且可以用于解码大系统中精确的单个分子布置(参见例如图3F)。

然后对收集的条形码化记录物进行测序。在一些实施方案中，使用下一代测序技术对记录物进行测序。在一些实施方案中，使用Sanger测序以及正在开发的“下一代测序”技术，例如“基于纳米孔”的测序(例如，Oxford Nanopore Technologies，nanooretech.com)。在简化的系统中，例如，可以使用电泳凝胶来检测记录物中条形码的组合，通过区分产生的记录物的长度(参见例如图3D)，或者可以使用标准分辨率或超分辨率显微镜通过荧光原位杂交或类似方法目测检测探针序列。或者，核酸微阵列(例如，AgilentTechnologies)可以用于以序列特异性方式检测记录物。

图13A-13B显示了用于处理条形码化记录物的本公开内容的连接和扩增方法的实例。例如，可以用限制性内切核酸酶切割记录物，然后通过“粘性”末端连接(图13A)。可以用一种或多种内切核酸酶切割过多的未连接的记录物材料(图13B)。将测序衔接子附接到记录物的过程可以通过平末端“A-加尾”或限制性位点介导的连接进行。连接可以在原始的双链记录物上或在退火成发夹后进行。此外，引物可以不是作为单一种类加入，而是作为可以通过不主动参与记录物产生反应本身但允许大多数记录物的两端不同的5'延伸来区分的任何数量的种类(未示出)。这进而允许在每个末端使用不同引物进行PCR扩增，可能并入测序衔接子，并且该扩增可以在连接之前或之后进行。在一些实施方案中，外切核酸酶(作为单一酶或组合，例如T7外切核酸酶与外切核酸酶I，III或T组合)可以用于消化过量衔接子或其他序列，其中靶连接序列通过末端保护或环形成免于消化修改。

从获得的测序数据可以确定条形码分子靶相对于彼此的空间布置。例如，可以计算地处理测序数据以产生分子靶相互作用的代表性网络。这样的计算机代码可以读取测序数据文件，创建相关条形码的数字编码网络(例如，从读取记录物#1导出的“连接到B的条形码A”，来自记录物#2的“B-C”和来自记录物#3的“C-A”)。任何数量的市售(例如，Mathematica)或独立编写的代码然后可用于将该非几何数字表示变换成描述相对空间定位(在数学上被称为“图论”的方面)的描述。在这种情况下，记录物意味着与A，B和C相关联的靶的三角形定位。此外，这样的程序可以通过分析与蛋白质相关联的所有条形码的相互作用来计算例如与条形码A相关联的蛋白质的相互作用的统计学(先验已知，因为靶向部分可以在靶向和反应之前连接到特定的条形码集)。此外，可以通过分析在不同时间取得的不同记录物集或提供分子时间标记(例如，在反应的后半部分中加入轻微差异的引物)，可以从这些数据确定相互作用的时间依赖性。

本公开内容的一些方面提供了包括在单个反应将以下组合的方法:(a)两个单链核酸条形码化探针，每个包含回文序列，条形码序列和引物结合序列，其中条形码序列彼此不同并且其中每个条形码化探针附接到分子靶上，(b)部分双链引物，其布置成双链区，其侧翼为3'单链侧翼区，每个含有引物与引物结合序列互补的引物，其中所述双链区含有可逆共价结合位点(参见例如图11)和链置换聚合酶。

在一些实施方案中，可逆共价结合位点含有^CNVK修饰(参见例如美国专利号8,481,714)，使得两条链可以在存在紫外光的同时共价结合，并且随后在差异波长的光存在的情况下释放。可以使用其它温度稳定的可逆连接，如本文所提供的。

在一些实施方案中，所述方法包括在足以允许引物与引物结合位点的结合和并引物的每个3'侧翼区的延伸的条件下孵育(a)和(b)。

在一些实施方案中，所述方法包括将反应加热至至少50℃(例如50℃至100℃)的温度，以允许引物从两条单链核酸条形码化探针分离，由此再生(a)和(b)用于进一步的温度驱动循环。

图11显示了本公开内容的温度依赖性自动循环机制的示例。循环创建记录物，每个记录物来自两个独特的探针上的两个独特的引物。新生的“半记录物”不是从探针自发驱动的，而是在升高的温度下“熔化”。探针和引物如图11所示，引物为通过UV-可逆共价交联^CNVK部分连接在一起的双3'-头结构。引物结合任何一对探针，在低(例如25℃)温度下延伸以复制条形码，并且当温度升高到高于链的熔融温度(例如70℃)时释放。在再次降低温度时，溶液中的聚合酶可以完成通过结合回文序列连接的链的复制，在一些实施方案中，通过^CNVK连接的释放来辅助。因此，系统与温度循环同步驱动。

本发明通过以下实施例进一步说明，其实际上不应被解释为进一步的限制。在此整个申请中引用的所有参考文献(包括文献参考文献，已发明专利，公开专利申请和共同未决的专利申请)的全部内容特别地通过引用并入本文，特别是对于本文所引用的教导。

本公开内容的方面进一步由以下编号的段落定义：

1.一种核酸条形码化探针，包括：

被布置成形成具有部分双链的引物结合区、双链的条形码区、双链回文区和含有靶结合部分的单链环区的发夹结构的核酸，其中终止聚合的分子位于所述双链回文区和所述环区之间。

2.一种核酸条形码化探针，其包含一个或多个核酸链，所述一个或多个核酸链被布置成：

(a)双链回文区；

(b)双链条形码区；和

(c)引物结合区。

3.段落2的核酸条码探针，其中引物结合区是单链的。

4.段落2的核酸条码探针，其中引物结合区是部分双链的。

5.段落1-4中任一项的核酸条形码化探针，其中所述双链回文区具有4至10个核苷酸碱基对的长度。

6.段落1-5中任一项所述的核酸条形码化探针，其中所述双链条形码区具有2至100个核苷酸碱基对的长度。

7.段落1-6中任一项的核酸条形码化探针，其中引物结合区具有4至40个核苷酸的长度。

8.段落2-7中任一项的核酸条形码化探针，其中条形码化探针进一步包含与双链回文区邻近的终止聚合的分子或修饰。

9.段落2-7中任一项所述的核酸条形码化探针，其中所述条形码化探针进一步包含邻近所述双链回文区的终止聚合的合成非DNA接头。

10.段落2-7中任一项所述的核酸条形码化探针，其中所述条形码化探针进一步包含邻近所述双链回文区的三乙二醇间隔子，其终止聚合。

11.段落8-10中任一项所述的核酸条形码化探针，其中所述条形码化探针包含邻近终止聚合的分子或修饰的双链置换区。

12.段落11的核酸条码编码探针，其中所述双链置换区具有2至10个核苷酸碱基对的长度。

13.段落2-9中任一项所述的核酸条形码化探针，其中所述条形码化探针被布置成形成包含单链环区的发夹结构。

14.段落1或13的核酸条形码化探针，其中单链环区具有3至50个核苷酸的长度。

15.段落2-14中任一项的核酸条形码化探针，其进一步包含靶结合部分。

16.段落13或14的核酸条码编码的探针，其还包含附接到单链环区的靶结合部分。

17.根据段落1，15或16中任一项所述的核酸条形码化探针，其中所述靶结合部分选自：生物素，抗体，适体，纳米体，核酸，药物和一个原子

18.段落1-17中任一项的核酸条码编码探针，其中所述探针包含至少一个锁核酸(LNA)核苷酸。

19.段落18的核酸条码编码探针，其中至少一个LNA核苷酸位于双链条形码区中或邻近双链条形码区。

20.段落1-19中任一项所述的核酸条形码化探针，其中所述探针还包含单链多聚T末端序列。

21.段落1或15-20中任一项的核酸条形码化探针，其中所述探针通过靶结合部分与分子靶结合。

22.段落1-21中任一项的多个核酸条形码化探针。

23.段落22的多个核酸条形码化探针，其中所述双链回文区对于所述多个核酸条形码化探针的每个探针是相同的。

24.段落22或23的多个核酸条形码化探针，其中所述双链条形码区对于所述多个核酸条形码化探针的每个探针是独特的。

25.段落22或23的多个核酸条形码化探针，其中所述多个核酸条形码化探针包括条形码化探针的子集，每个子集包括独特的条形码区。

26.段落22-25中任一项中的多个核酸条形码化探针，其中所述单链引物结合区对于所述多个核酸条形码化探针的每个探针是相同的。

27.段落25的多个核酸条形码化探针，其中单链引物结合区对于所述多个核酸条形码化探针的条形码化探针的每个子集是独特的。

28.段落22-26中的任一项的多个核酸条形码化探针，其中所述多个核酸条形码化探针的每个探针通过靶结合部分与分子靶结合。

29.一种组合物，其包含段落22-26中的任一项的多个核酸条形码化探针和与所述多个核酸条形码化探针的探针的引物结合区至少部分互补的引物。

30.段落29的组合物，其中所述引物包含相对于引物结合区的至少一个核苷酸错配。

31.段落29的组合物，其中所述引物包含至少一个与引物结合区不互补和/或不结合引物结合区的人造接头。

32.段落29-31中任一项的组合物，还包含链-置换聚合酶。

33.段落32的组合物，其中链置换聚合酶选自：Bst大片段聚合酶，phi 29聚合酶，Deep VentR聚合酶，Klenow片段聚合酶和修饰的Taq聚合酶。

34.段落29-33中任一项所述的组合物，其还包含辅助核酸链，所述辅助核酸链与所述单链引物结合区部分互补，与邻近所述引物结合区的单链区部分互补，并且与邻近所述引物结合区的所述单链区短暂地结合。

35.段落34的组合物，其中所述辅助链长度为3至20个核苷酸。

36.一种检测分子靶相互作用的方法，包括以下步骤：

(a)将权利要求28的多个核酸条形码化探针与(i)与所述多个核酸条形码化探针的探针的引物结合区互补的引物和(ii)链置换聚合酶在单一反应中组合；和

(b)在导致产生条形码化记录物的条件下孵育所述反应。

37.段落36的方法，其中条形码化记录物是双链的。

38.段落36或37的方法，其中(b)的步骤包括在生理条件下孵育反应。

39.根据段落36或37所述的方法，其中步骤(b)包括在37℃的温度下孵育反应0.5至3.0小时。

40.如段落36-39中任一项所述的方法，其中所述多个核酸条形码化探针在生成所述双链条形码化记录物之后再生。

41.根据段落36-40中任一项所述的方法，还包括从所述反应中收集条形码化记录物。

42.段落41的方法，还包括纯化从反应中收集的条形码化记录物。

43.段落42的方法，还包括测序从反应收集的条形码化记录物，从而产生测序数据。

44.段落43的方法，还包括从测序数据重建分子靶相互作用的图像。

45.段落41的方法，还包括将条形码化记录物附加到序列特异性衔接子。

46.段落45的方法，其中将条形码化记录物附加到序列特异性衔接子包括：

(i)将双链条形码化记录物解离为单链条形码化记录物；

(ii)使每条单链条形码化记录物自退火以形成发夹结构；和

(iii)将每个发夹结构连接到衔接子序列，从而形成衔接子-条形码化记录物。

47.段落46的方法，还包括通过聚合酶链反应(PCR)扩增衔接子-条形码化记录物，从而产生衔接子-条形码化记录物的拷贝。

48.根据权利要求47所述的方法，还包括纯化衔接子-条形码化记录物的拷贝，由此产生衔接子条形码化记录物的纯化拷贝。

49.段落48的方法，还包括对衔接子条形码化记录物的纯化拷贝进行测序，从而确定条形码化记录物的顺序。

50.段落49的方法，还包括计算地处理条形码化记录物的序列以产生分子靶相互作用的代表性网络。

51.段36-50中任一项的方法，其中所述引物包含：

第一核酸链，其包含

与单链引物结合区互补的第一序列

和第二序列；和

第二核酸链，其包含

与单链引物结合区互补的第三序列

和与所述第二序列互补并与其结合的第四序列，

其中所述第一和第二核酸链被布置成由单链引物区侧接的双链区。

52.段落51的方法，其中双链区包含条形码序列。

53.段落51或52的方法，其中所述引物还包含至少一个测序位点或附接位点。

54.根据段落36-53中任一项所述的方法，其中所述分子靶是从生物样品获得的。

55.段落54的方法，其中所述生物样品是细胞或细胞裂解物。

核酸条形码化探针对，包括：

(a)第一核酸条形码化探针，其被布置成

(i)双链条形码区，和

(ii)单链引物结合区；

和

(b)包含条形码区和与单链引物结合区互补的引物区的第二单链条形码化探针。

57.段落56的核酸条形码化探针对，其中所述第一核酸条形码化探针的双链条形码区具有5至50个核苷酸碱基对的长度。

58.段落56的核酸条形码化探针对，其中所述第一核酸条形码化探针的单链引物结合区具有4至50个核苷酸的长度。

59.段落56的核酸条形码化探针对，其中所述第二核酸条形码化探针的条形码区具有5至50个核苷酸的长度。

60.段落56的核酸条形码化探针对，其中所述第二核酸条形码化探针的引物区具有4至50个核苷酸的长度。

61.段落56的核酸条形码化探针对，其中所述第一核酸条形码化探针进一步包含邻近所述双链条形码区的终止聚合的分子或修饰。

62.段落61的核酸条形码化探针对，其中所述第一核酸条形码化探针进一步包含邻近所述双链条形码区的终止聚合的合成的非DNA接头。

63.段落61的核酸条形码化探针对，其中所述第一核酸条形码化探针包含邻近所述终止聚合的分子或修饰的双链置换区。

64.段落63的核酸条形码化探针对，其中所述双链置换区具有2至10个核苷酸碱基对的长度。

65.段落56的核酸条形码化探针对，其中所述第一核酸条形码化探针被布置成形成包含单链环区的发夹结构。

66.段落65的核酸条形码化探针对，其中所述单链环区具有3至50个核苷酸的长度。

67.段落65的核酸条形码化探针对，其中所述单链环区含有(ii)的单链引物结合区。

68.段落56的核酸条形码化探针对，其中所述第一核酸条形码化探针和/或所述第二核酸条形码化探针进一步包含靶结合部分。

69.段落68的核酸条形码化探针对，其中靶结合部分位于远离第一核酸条形码化探针的单链引物结合区的末端和/或位于远离第二核酸条形码化探针的引物区的末端。

70.段落69的核酸条形码化探针对，其中所述靶结合部分选自：生物素，抗体，适体，纳米体和核酸。

71.段落68的核酸条形码化探针对，其中第一核酸条形码化探针和第二核酸条形码化探针中的每一个通过靶结合部分与分子靶结合。

72.一种组合物，其包含段落56的核酸条形码化探针对和布置成双链条码区和单链引物结合区的第三核酸条形码化探针，其中所述单链引物结合区与第二核酸条形码化探针的引物区互补并结合。

73.段落72的组合物，其中所述第三核酸条形码化探针还包含靶结合部分。

74.段落73的组合物，其中所述第三核酸条形码化探针通过与分子靶结合的靶结合部分结合到分子靶。

75.一种组合物，其包含段落56的核酸条形码化探针对和链置换聚合酶。

76.段落75的组合物，其中所述链置换聚合酶选自：Bst大片段聚合酶，phi 29聚合酶，Deep VentR聚合酶，Klenow片段聚合酶和修饰的Taq聚合酶。

77.检测分子靶相互作用的方法，包括以下步骤：

(a)将段落71的核酸条码探针对与链置换聚合酶在单一反应中组合；和

(b)在导致产生单链条形码化记录物的条件下孵育所述反应。

78.检测分子靶相互作用的方法，其包括以下步骤：

在单一反应中组合：(a)两个单链核酸条形码化探针，其各自包含回文序列、条形码序列和引物结合序列，其中条形码序列彼此不同，并且其中每个条形码化探针附接到分子靶，(b)部分双链引物，其被布置成由各自含有引物与引物结合序列互补的3'单链侧翼区侧接的双链区，其中双链区含有可逆共价结合位点；以及链置换聚合酶；

在足以允许引物与引物结合位点结合和引物的每个3'侧翼区的延伸的条件下孵育(a)和(b)；和

将反应加热到至少50℃的温度以允许引物从所述两个单链核酸条形码化探针解离，从而再生(a)和(b)。

实施例

实施例1。

图3示出来自实验的数据，其中显示了基于邻近的自动循环完整记录物生成方法的示例。电泳凝胶的泳道1-4各自含有不同长度和定位的条形码化探针(凝胶上方)的组合以及引物和聚合酶(未描绘)。在泳道1中，短和长条形码化探针在溶液中不连接。Cy5标记的引物(大量过量)转化为短或长半记录物，但由于探针彼此不邻近，因此没有产生完整记录物。在泳道2中，短条形码化探针共同定位在链霉亲和素分子上，产生短的半记录物，随后产生短的完整记录物。当使用短或长探针制备链霉亲和素时，然后混合在一起进行反应(泳道3)，产生短和长长度的半记录物和完整记录物，进一步表明条形码化探针彼此接近，或当完整记录物产生时，只在局部地进行相互作用。泳道4包含与泳道3加上共同定位的短和长探针相同的组分，这导致产生中长度完整记录物，结合短和长半记录物。不同长度的探针仅用于在本实验中将凝胶上的记录物长度(因此移动性)区分开来。

这种功能性自动循环反应允许在恒定的生理温度和条件下重复的条形码化探针读数。自动循环，结合允许单个分子的区分的独特的条形码标记，实现真正的网络解释和成像(图3)，精确度是显微镜和常见的成对邻近方法不能匹配的。使用常见的成对邻近技术(例如共免疫沉淀，邻近连接)的记录本质上是破坏性的，并且在不重复取样的情况下，个体网络(图2B)的解释是不可能的。

实施例2。

设计合成的DNA纳米结构，以纳米精度的任意用户指定位置显示DNA条形码，从而成为以严谨和精确的方式评估自动循环仪的性能和随后的图像重建方法的“工作台”。使用样品处理技术(例如，微流体装置)以及用于基于完整记录物序列的成像重建的计算算法和软件工具。然后将细胞表面上的蛋白质受体簇成像，首先在固定细胞中，然后在活细胞中成像。表面蛋白质簇的标记使用抗体和较小的粘合剂(例如纳米抗体或适体)来实现。将无显微镜成像(MFI)结果与使用超高分辨率显微镜的方法获得的数据进行比较。然后，MFI应用于另一个应用：高通量、高分辨率成像核体组织。最后，除了基于邻近的自动循环记录仪之外，还开发了一种基于扩散的分子记录仪，可以对远距离分离的靶重复产生分子记录物，进一步扩大MFI的容量。

实施例3。

在细胞膜上的蛋白质簇成像

可以使用本公开内容的方法和组合来成像和阐明细胞质膜中的蛋白质簇。例如，ErbB家族的四个类似的膜结合的EGF受体形成了在细胞表面上具有13个其他多肽配体的复杂的、模块化的异质网络的一部分。网络介导细胞增殖和存活以及迁移和粘附。它们以10种组合二聚化，并且似乎形成高达150nm的高级簇，意味着簇内数百个受体的共定位(Abulrob等，J Biol Chem 285(5)：3145-56，2010，通过引用并入本文)。他们识别和处理多种信号分子的能力，癌症过度表达和药物靶的上升使其成为无显微镜成像(MFI)的有趣和重要的靶(Citri和Yarden，Nat Rev Mol Cell Biol.7(7)：505 -16，2006，通过引用并入本文)。

如本文提供的本公开内容的无显微镜成像方法揭示了簇蛋白质含量和行为的许多方面(图15)。在静态(固定)细胞中，所有感兴趣的蛋白质的独特标记使整个网络内容和连接能够可视化，包括关联化学计量学和细胞内或细胞间蛋白质状态的分布。在活细胞中，MFI方法可以缓慢(例如，数十到数百秒)跟随簇的重新配置，并监视更快的过程。如本文提供的从MFI方法获得的数据提供分子尺度分辨率，真实复杂网络连接性以及跟踪动态分子相互作用的能力。

对于一些应用，创建了一种基于^CNVK的探针(Yoshimura等人，Org.Lett.10(15)：3227-3230，2008，引入参考)，其可以用312nm光的短脉冲解离。在具有适当激光的扫描共焦显微镜下识别感兴趣的区域可以禁用样品中的所有探针，除了感兴趣区域中的探针，从而允许从原位组织取样。

此外，对于某些应用，添加带有“时间标记”的条形码引物，例如条件A下的时间标记1，随后是在条件B下带有时间标记2的随后的条形码引物，允许例如药物递送后粗略的时间解析分辨状态改变用于药物筛选应用。

实施例4。

核体组织

在核中两米DNA、ncRNA和蛋白质的组织被严格控制并具有功能性后果。例如，转录调控涉及DNA结合蛋白和可能在相同或不同染色体上分开的lncRNA的结合。染色体构象捕获(3C)方法及其变体已经引起了细胞核中DNA的整体结构的兴趣，这些染色体构象捕获(3C)方法及其变体产生了从细胞群体甚至个体细胞的染色体间和染色体间相互作用的全基因组图谱。数据显示，大规模结构在细胞之间是可变的，但是小规模定位是可重复的，因此相对重要。目前的方法有几个限制：(1)4C方法产生的最高分辨率，在10-20kb，仍然长于伸直DNA中核的直径；(2)低分辨率成对数据不能区分同源染色体；和(3)它们不能同时检测多种蛋白质转录因子，调控RNA和DNA的相互作用。

本公开内容的无显微镜成像(MFI)方法用于阐明核体组织(图16)。应用MFI方法，应用OligoPaints方法(Beliveau等人，PNAS USA.109(52)：21301-21306，通过引用并入本文)，通过原位杂交在每个靶靶向成千上万个任意基因组片段，如本文提供的。由于靶区不受限制性内切酶序列的限制，记录物反应的循环性质允许探针参与许多记录物对，所以最终图谱的空间分辨率可以高于由4C提供的千碱基比例分辨率，且远远高于Hi-C。这种同源染色体对的高分辨率和独特标记允许在给定基因座处的染色体鉴定。针对lncRNA以及转录因子、辅因子和染色质调节因子(通过抗体)的类似探针允许更全面的调控。可以评估个体细胞差异和与表型的相关性。这些数据通过更高的空间分辨率、同源染色体鉴定和平行的高通量蛋白质DNA或RNA-DNA相互作用鉴定与3C或显微镜方法区分开。

在一些实施方案中，使用本公开内容的方法来实现胚胎干(ES)或诱导的多能干(iPS)细胞的多能性或分化因子结合和基因组组织的定位。了解多种转录因子与干细胞调节的联系和共同归属使得能够进一步去分化和更完整的靶分化。另外，本公开内容的MFI方法允许将未组装序列映射到基因组。重复序列或由重复序列围绕的那些可能难以定位，但是具有独特条形码的重复荧光原位杂交(FISH)探针，随后是基于邻近记录物的记录物生成，将在一个反应中难以阅读的序列连接在一起。

实施例5

较远的分子相互作用

除了近距离地分析分子靶之外，本公开内容的MFI可以适于映射由较长距离分离的靶。这种远距离数据对于更全面的分子解释是有用的。在蛋白质簇应用中，例如，细胞上的独立簇之间的相对定位可能是重要的，并且如果采用相同的机制，这些数据可以被注册到单个簇测量的相对定位。此外，染色体位置应用可能受益于跨越比直接接触的那些更远的序列的网络数据的附加网络数据。这种中间范围(5-25+nm)采集的机制依赖于释放半记录物的浓度梯度递减。将短长度引物短暂结合到现有探针上延伸到半记录物(图17)。链置换反应偶尔将半记录物解离为仅引物杂交的点，然后足够弱的引物杂交自发解离，并且半记录物扩散。由于距离很近，遇到结合的半记录物或另一个可溶性记录物，回文位点相互结合，并且聚合完整记录物。在7个核苷酸的引物长度上发现合理的引物结合和自发解离之间的优化平衡(数据未显示)。

实施例6。

为了表征作为探针间距离的函数的完整记录物产生率，将探针对固定在2D DNA纳米结构上的编程位置(图19A)。固定两种类型作为固有纳米结构核酸链的延伸，而第三种是通过与中间链(插图)的点击化学叠氮基-炔烃连接保持的，以证明探针如何附接到任意部分。两种方法都将单链DNA掺入作为柔性接头。给定纳米结构的许多拷贝在云母表面上保持平坦且不可移动(如用于DNA结构的原子力显微镜所做的那样)，并且分别进行每个探针分离距离的记录反应。然后通过PCR扩增记录物，并通过凝胶电泳定量产物。为了考虑实验条件的变化，特别是在纳米结构数量上，在每个纳米结构类型上存在具有正交PCR序列的第二探针对，但总是处于相同的固定分离距离。相对于该参考对计算生产率。

图19B表示三个探针设计的相对记录速率，包含0、12和18nt个间隔子结构域。对于6至48nm的间隔，每6nm测试一个探针对，记录物发生率数学拟合归一化至共同的最大值。零，12和18nt探针均以最接近最大速率生成记录物，表明局部浓度效应是速率的主要驱动力。速率分别在13、20和25nm处降低了一半，在18、42和48nm处具有最大距离(接近零速率)。绝对地说，12nt间隔探针以最快的速度产生记录物，大约是0和18nt探针的两倍(未显示)。当DNA探针和附加的半记录物如在直链中以最佳方式取向时，所有三个最大距离与预期值一致。对于0nt间隔探针，最大预期距离是探针长度(双链DNA的19nt，每碱基对0.34nm，13至6.5nm)和半记录物长度(单链DNA的11nt减去3nt回文重叠，每个碱基最大0.58nm，13至4.6nm)的总和的两倍，总共至22nm(如图2c中的几何结构，步骤ii之后)。类似地，12nt和18nt间隔探针分别具有约36和约43nm的最大预期距离。使用蠕虫状链模型的估计是相似的。

使用最长的探针(具有18nt的间隔子)来测试APR确定三个靶的相对位置的能力。三个这样的探针(其编程不同的引物序列，因此产生具有独特端的记录物)再次通过2D纳米结构在具有30nm探针分离的四种构型中的每一种中固定(图19C)。当放置在三角形配置(图19C，图(i))中，其中每个探针彼此等距时，在凝胶上产生并显著地看到所有三个记录物，指示每对的紧密接近和因此三角形布置。然而，当放置在邻近探针在距离范围内但远距离的探针不在距离范围内的线中时，只有邻近探针的产物是突出的。线性布置的三个可能的顺序各自产生适当的记录物(图19C，图(ii)-(iv))，证明了在任意配置中记录来自三个分子尺度靶的几何信息的能力。该方法可以简单地通过设计正交引物序列的其他探针来应用于三个以上的同时靶。

实施例7。

除了识别分子组织之外，还展示了改变系统的重新抽样。构建了图19C(i)的相同的基于纳米结构的三角形布置的再次采样，使用用于使探针P3失活的机制(图20A)。在每个采样点，上清液进行PCR扩增，并通过变性PAGE进行观察。首先，对三角形布置进行记录和采样，表明如预期的三个探针共定位(图20B，图(i))。用缓冲液洗涤后，对上清液进行取样，表示无残留记录物(图20B，图(ii))。然后，通过将不可延伸的P3封闭引物z*-u*(3'末端的反向dT)施加到系统，剩余P3引物u*和半记录物被置换，并且该探针不能进一步结合引物，使其失活。洗涤，记录和重新取样仅指示两个下部探针的共定位(图20B，图(iii))。

等同物

虽然本文已经描述和显示了几个发明实施例，但是本领域普通技术人员将容易地想出用于执行功能和/或获得结果的各种其他手段和/或结构和/或所描述的一个或多个优点并且这些变化和/或修改中的每一个被认为在本文所描述的发明实施例的范围内。更一般来说，本领域技术人员将容易地理解，本文所述的所有参数，尺寸，材料和构造意在是示例性的，并且实际参数，尺寸，材料和/或构造将取决于具体应用或应用使用本发明的教导。本领域技术人员将认识到或能够使用不超过常规实验来确定本文所述的具体创造性实施例的许多等同物。因此，应当理解，前述实施例仅以示例的方式呈现，并且在所附权利要求及其等同物的范围内，除了具体描述和要求保护之外，发明实施例可以被实施。本公开内容的发明实施例涉及本文所述的每个单独特征，系统，制品，材料，试剂盒和/或方法。此外，如果这些特征，系统，物品，材料，试剂盒和/或方法不相互矛盾，则两个或更多个这样的特征，系统，制品，材料，试剂盒和/或方法的任何组合都包括在本发明的发明范围。

应理解为在本文中定义和使用的所有定义，以控制字典定义，通过引用并入的文献中的定义和/或定义术语的普通含义。

本文中公开的所有参考文献，专利和专利申请均通过引用并入本文，涉及每个被引用的主题，在某些情况下可涵盖该文献的整体。

在本说明书和权利要求中使用的不定冠词“a”和“an”除非明确指出相反，应理解为“至少一个”。

在本说明书和权利要求书中使用的短语“和/或”应当理解为是指所结合的元件中的“一个或两个”，即在某些情况下结合存在的元件并且在另一个中分离存在的元件案例。以“和/或”列出的多个元素应以相同的方式来解释，即所谓的“一个或多个”元素的结合。可以可选地存在除“和/或”子句特别标识的元素之外的其它元素，无论是与特定识别的那些元素相关或不相关。

如本说明书和权利要求书中所使用的，短语“至少一个”对于一个或多个元素的列表应当被理解为是指从至少一个元素中选出的至少一个元素元素列表，但不一定包括元素列表中具体列出的每个元素中的至少一个元素，而不排除元素列表中元素的任何组合。该定义还允许除了在短语“至少一个”所指的元素列表中具体识别的元素之外，可以可选地存在这些元素，无论与特定识别的元素相关或不相关。

还应当理解，除非明确地指出相反，在本文要求保护的包括多于一个步骤或作用的任何方法中，方法的步骤或动作的顺序不一定限于步骤或步骤列举了该方法的作用。

在权利要求书中以及上述说明书中，所有过渡性短语如“包含”，“包括”，“携带”，“具有”，“包含”，“涉及”，“持有”将被理解为是开放式的，即意味着包括但不限于此。只有“由...组成”和“基本上由...组成”的过渡性短语分别是“美国专利局专利审查程序手册”第2111.03节中所规定的封闭或半封闭的过渡性短语。

序列表

<110> President and Fellows of Harvard College

<120> 无显微镜成像

<130> H0498.70529WO00

<140> NOT YET ASSIGNED

<141> 2016-01-29

<150> US 62/110,050

<151> 2015-01-30

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<400> 1

agtcagctcg agctaggtct agagctaggc tatcactagt gatagcctag ctctagacct 60

agctcgagct actt 74

<210> 2

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<400> 2

agtcagctcg agctaggtct tagcgtaggc tacaactagt gctagctagc gagcagacct 60

agctcgagct actt 74

<210> 3

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<400> 3

agtcagctcg agctaggtct agcgctatct agctactagt atcgtactgt gacgagacct 60

agctcgagct actt 74

<210> 4

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<400> 4

agtcagctcg agctaggtct gatctagcgt agccactagt aggctctagc gactagacct 60

agctcgagct actt 74

<210> 5

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<400> 5

agtcagctcg agctaggtct aggctctagc tagcactagt cgatagctag cgaaagacct 60

agctcgagct actt 74

<210> 6

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> n是脱氧尿苷

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(11)

<223> n是脱氧尿苷

<220>

<221> misc_feature

<222> (18)..(18)

<223> n是脱氧尿苷

<220>

<221> misc_feature

<222> (22)..(22)

<223> n是脱氧尿苷

<220>

<221> misc_feature

<222> (28)..(49)

<223> n is a, c, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (65)..(65)

<223> t用生物素修饰

<220>

<221> misc_feature

<222> (73)..(74)

<223> 用间隔子9修饰

<400> 6

aaaaaancat ncccagcnta cnctcacnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnna ccggttcgct 60

ggtttttcca gcgaccggt 79

<210> 7

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n是脱氧尿苷

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> n是脱氧尿苷

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> n是脱氧尿苷

<220>

<221> misc_feature

<222> (16)..(16)

<223> n是脱氧尿苷

<400> 7

ncatncccag cntacn 16

Claims

1.一种用于检测两个蛋白质靶之间的共定位的组合物，其包含：

两种蛋白质靶、链置换聚合酶、至少一种引物、第一核酸探针和第二核酸探针，其中

第一和第二核酸探针的每个包括部分双链的引物结合区、双链的条形码区、双链回文区、终止聚合的终止分子、茎区和单链环区，其中所述终止分子邻近所述双链回文区并且位于所述双链回文区和所述单链环区之间；

组合物的至少一种引物互补于第一核酸探针的部分双链引物结合区，并且组合物的至少一种引物互补于第二核酸探针的部分双链引物结合区，和

第一核酸探针与能够结合两个蛋白质靶之一的靶结合部分连接，并且第二核酸探针与能够结合两个蛋白质靶中的另一个的靶结合部分连接，并且其中所述靶结合部分是抗体或单结构域抗体。

2.权利要求1的组合物，其中所述靶结合部分是单个单体可变抗体结构域。

3.权利要求1的组合物，其中所述双链回文区具有4至10个核苷酸碱基对的长度。

4.权利要求1的组合物，其中所述双链条形码区具有5至50个核苷酸碱基对的长度。

5.权利要求1的组合物，其中所述部分双链的引物结合区具有4至40个核苷酸的长度。

6.权利要求1的组合物，其中所述单链环区具有5至50个核苷酸的长度。

7.权利要求1的组合物，其中所述第一核酸探针和/或所述第二核酸探针包含至少一个锁核酸(LNA)核苷酸。

8.权利要求7的组合物，其中所述至少一个LNA核苷酸位于所述双链条形码区中或邻近所述双链条形码区。

9.权利要求1的组合物，其中所述第一核酸探针和/或第二核酸探针进一步包含单链多聚T末端序列。

10.权利要求1的组合物，其中所述第一核酸探针的双链条形码区和所述第二核酸探针的双链条形码区是不同的。

11.权利要求10的组合物，其中所述第一核酸探针的双链回文区和所述第二核酸探针的双链回文区是相同的。

12.权利要求10的组合物，其中所述第一核酸探针的部分双链引物结合区和所述第二核酸探针的部分双链引物结合区是相同的。

13.权利要求10的组合物，其中所述第一核酸探针的部分双链引物结合区和所述第二核酸探针的部分双链引物结合区是不同的。

14.权利要求1的组合物，其中所述互补于第一核酸探针的部分双链引物结合区的至少一个引物包含相对于互补于第二核酸探针的部分双链引物结合区的至少一个引物的至少一个核苷酸错配。

15.权利要求1的组合物，其中所述互补于第一核酸探针的部分双链引物结合区的至少一个引物和/或互补于第二核酸探针的部分双链引物结合区的至少一个引物包含至少一个人造接头，其与部分双链引物结合区不互补。

16.权利要求1的组合物，其中所述链置换聚合酶选择自：Bst大片段聚合酶，phi 29聚合酶，Deep VentR聚合酶，Klenow片段聚合酶和修饰的Taq聚合酶。

17.权利要求1的组合物，其还包含第一辅助核酸链和/或第二辅助核酸链，其中

所述第一辅助核酸链与所述第一核酸探针的所述部分双链引物结合区部分互补，与邻近所述第一核酸探针的所述部分双链引物结合区的单链区部分互补，并且与邻近所述第一核酸探针的所述部分双链引物结合区的所述单链区短暂地结合，和/或

所述第二辅助核酸链与所述第二核酸探针的所述部分双链引物结合区部分互补，与邻近所述第二核酸探针的所述部分双链引物结合区的单链区部分互补，并且与邻近所述第二核酸探针的所述部分双链引物结合区的所述单链区短暂地结合。

18.权利要求17的组合物，其中所述第一辅助核酸链和/或第二辅助核酸链的长度为3至20个核苷酸。

19.一种检测两个蛋白质靶之间的共定位的方法，其包括在导致产生包含第一和第二核酸探针的双链条形码区的核酸的条件下孵育权利要求1的组合物，其中所述双链条形码区在核酸中的存在代表两个蛋白质靶之间的共定位。

20.权利要求19的方法，其中所述孵育包括在生理条件下孵育所述组合物。

21.权利要求19的方法，其中所述孵育包括在37℃的温度下孵育所述组合物0.5至3.0小时。

22.权利要求19的方法，其中第一和第二核酸探针在产生核酸之后再生。

23.权利要求19的方法，还包括收集所述核酸。

24.权利要求23的方法，还包括纯化所述收集的核酸。

25.权利要求24的方法，还包括对所述收集的核酸进行测序，从而产生测序数据。

26.权利要求25的方法，还包括从所述测序数据重建蛋白质靶之间共定位的图像。

27.权利要求23的方法，还包括将核酸附接到序列特异性衔接子。

28.权利要求27的方法，其中将核酸附接到序列特异性衔接子包括：

(i)将所述核酸解离为单链条形码化记录物；

(ii)使每条单链条形码化记录物自退火以形成发夹结构；和

(iii)将每个发夹结构连接到衔接子序列，从而形成衔接子-条形码记录物。

29.权利要求28的方法，还包括通过聚合酶链反应(PCR)扩增衔接子-条形码化记录物，由此产生衔接子-条形码化记录物的拷贝。

30.权利要求29的方法，还包括纯化所述衔接子条形码化记录物的拷贝，由此产生所述衔接子条形码化记录物的纯化拷贝。

31.权利要求30的方法，还包括对所述衔接子条形码化记录物的纯化拷贝进行测序，从而确定核酸的序列。

32.权利要求31的方法，还包括计算处理所述核酸的序列以产生分子靶共定位的代表性网络。

33.权利要求19的方法，其中所述至少一个引物的每个包含：

第一核酸链，其包含

与所述第一核酸探针或所述第二核酸探针的部分双链引物结合区互补的第一序列

和第二序列；和

第二核酸链，其包含

与所述第一核酸探针或所述第二核酸探针的部分双链引物结合区互补的第三序列

和与所述第二序列互补并与其结合的第四序列，

34.权利要求33的方法，其中所述双链区包含条形码序列。

35.权利要求34的方法，其中所述至少一个引物还包含至少一个测序位点或附接位点。

36.权利要求19的方法，其中所述蛋白质靶是从生物样品获得的。

37.权利要求36的方法，其中所述生物样品是细胞或细胞裂解物。