CN116635536A

CN116635536A - 用于制作条形码化颗粒群的物理图谱的方法

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Publication number: CN116635536A
Application number: CN202180086609.3A
Authority: CN
Inventors: S·佛雷德里克森; F·卡尔松
Original assignee: Purcergen Technologies Ag
Current assignee: Purcergen Technologies Ag
Priority date: 2020-12-22
Filing date: 2021-12-17
Publication date: 2023-08-22

Abstract

本文提供了用于制作条形码化颗粒群的物理图谱的方法。在一些实施方案中，所述方法可包括：产生复合物，所述复合物包括：i.条形码化颗粒群，其中条形码化颗粒被具有独特颗粒标识符序列的表面系连的寡核苷酸独特地条形码化，和ii.包含寡核苷酸序列的桥接部分群，其中桥接部分直接或间接与表面系连的寡核苷酸中的互补位点杂交；在复合物上进行连接、聚合和/或缺口填充/连接反应，从而产生包含来自相邻条形码化颗粒的独特颗粒标识符序列或其互补序列对的反应产物；对反应产物进行测序，分析序列以制作条形码化颗粒的一个或多个物理图谱。还提供了用于实施该方法的系统。

Description

用于制作条形码化颗粒群的物理图谱的方法

交叉引用

本申请要求2020年12月22日提交的美国临时申请系列第63/129,248号和2021年3月30日提交的美国临时申请系列第63/168,119号的权益，所述申请通过引用并入本文。

技术背景

细胞极性，即标志物向细胞内或细胞表面上的一个或多个区域的偏移，是一种常见现象，但很难以高通量的方式进行研究。例如，虽然有几种用于分析单个细胞上细胞表面标志物的表达的方法(例如涉及流式细胞术或将个体细胞放入隔室中然后对个体细胞进行测定的方法)，但是这些方法不提供任何关于个体细胞上细胞表面标志物的空间关系的信息。用于分析细胞内或细胞上的生物分子之间的空间关系的较新方法，例如，靠近连接测定(proximity ligation assay)(参见例如等人Nature Methods.2006 3:995–1000)、Weinstein的基于扩散的方法(参见例如Cell 2019 178:229-241和US20160265046)以及基于阵列的方法(参见例如Vickovic等人，Nature Methods 2019 16:987-990)要么不容易适用于细胞表面标志物的分析，要么它们不提供任何关于细胞极性的信息。显微镜检查是分析单个细胞上标志物之间空间关系的金标准。然而，显微镜检查本身处理量非常低，自动化难度很大。

鉴于上述情况，仍然需要以高通量方式分析细胞极性的方法。

发明内容

本文提供了用于制作条形码化颗粒群的物理图谱的方法，在一些实施方案中，所述条形码化颗粒可以附着至表面，例如一个或多个细胞的表面。在一些实施方案中，该方法可包括：产生复合物，其包含：i.条形码化颗粒群，其中条形码化颗粒被具有独特颗粒标识符序列的表面系连的寡核苷酸独特地条形码化，和ii.包含寡核苷酸序列的桥接部分群，其中桥接部分直接或间接与表面系连的寡核苷酸中的互补位点杂交。

在该方法中，在复合物上进行连接、聚合和/或缺口填充/连接反应，从而产生反应产物，所述反应产物包含来自相邻条形码化颗粒的独特颗粒标识符序列对或其互补序列。对这些反应产物进行测序，并对序列进行分析，以鉴定哪对独特颗粒标识符序列或其互补序列的对已被复制和/或连接在一起。可使用所鉴定的序列对制作条形码化颗粒的一个或多个物理图谱。还提供了用于实施该方法的系统。

该方法可用于分析可存在于细胞中或细胞上的标志物的分布。一般而言，这些实施方案可包括将颗粒固定在靶标(例如细胞或基底)中或靶标上，将颗粒相对于彼此作图，然后通过靠近测定将标志物的位置和数量作图到颗粒上。

在图2、图3、图7和图8中概念性地示出了这种方法的某些方面，尽管几种变化是可能的。

附图说明

本领域技术人员将理解，下面描述的附图仅用于说明目的。附图无意以任何方式限制本教导的范围。

图1示意性地示出了覆盖有颗粒的细胞。

图2示意性地示出了探针系统，其包括：i.条形码化颗粒群，其中条形码化颗粒(顶部)被具有独特颗粒标识符序列(U1、U2、U3......等)的表面系连的寡核苷酸独特地条形码化，ii.包含寡核苷酸序列(底部)的桥接部分群，其中桥接部分直接地或通过夹板间接地与表面系连的寡核苷酸中的互补位点杂交。在该图中，颗粒的表面系连的寡核苷酸也包含B序列，其与桥接部分中的互补桥接部分结合序列(BMBS)杂交。因此，在该实例中，桥接部分直接与表面系连的寡核苷酸中的互补位点杂交。

图3示意性地示出了在彼此杂交后，图2所示的条形码化颗粒与桥接部分之间的复合物。复合物可包含至少1000个由桥接部分连接的条形码化颗粒。

图4示意性地示出了条形码化颗粒(在该图中称为UMI克隆珠)、抗体-寡核苷酸缀合物和哺乳动物细胞的相对尺寸。

图5示意性说明了如何可将来自相邻条形码化珠粒的独特分子标识符添加到桥接部分的实例。在该实例中：i.可通过使用表面系连的寡核苷酸作为模板延伸桥接部分的3’末端，将独特分子标识符之一(例如UID2)的互补序列添加到桥接部分的3’末端上，以及ii.另一种独特分子标识符(例如UID1)的互补序列可通过例如上游寡核苷酸的缺口填充/连接(如图6所示，并将在下面更详细地描述)或通过将桥接部分连接到与所述独特分子标识符互补并与表面系连的寡核苷酸杂交的寡核苷酸上而被添加到桥接部分的5’末端。在后一种实施方案中，表面系连的寡核苷酸充当夹板用于连接。在替代实施方案中，可以例如使用夹板将桥接部分连接到系连的寡核苷酸上。

图6示意性示出了一种方式，通过该方式，来自相邻颗粒的UMI可通过缺口填充/连接反应而被添加到桥接部分。在实践中，该方法的实施可包括产生如图3所示的大复合物，以及加入聚合酶、核苷酸和连接酶，从而延伸与相邻颗粒中的序列杂交的所有桥接部分的末端。或者，可通过连接添加UMI。

图7示出了如何以成对的方式比较延伸的桥接部分末端的序列以提供条形码化颗粒的关系图，所述延伸的桥接部分包含识别原始桥接部分所结合的条形码化颗粒的序列。

图8示意性地示出了本方法的第一实施方式。

图9示意性地示出了本方法的第二实施方式。

图10示意性地示出了使用图9所示的方法产生的PCR扩增子。

图11示意性地示出了本方法的第三实施方式。

图12示意性地示出了本方法的第四实施方式。

图13示意性地示出了本方法的第五实施方式。

图14示意性地示出了本方法的第六实施方式。

图15示意性地示出了本方法的第七实施方式。

图16示意性地示出了本方法的第八实施方式。

图17示意性地示出了本方法的第九实施方式的第一部分。

图18示意性地示出了本方法的第九实施方式的第二部分。

图19示意性地示出了本方法的第十实施方式。

图20示意性地示出了使用RCA产物制造条形码化颗粒的一种方式。

图21示意性地示出了使用RCA产物制造条形码化颗粒的一种相关方式。

图22示意性地示出了使用条形码化颗粒作为桥接部分的测定。

图23示意性地示出了使用RCA产物制造条形码化颗粒的另一种方式。

定义

在更详细地描述示例性实施方案之前，阐述了以下定义来说明和定义本说明书中使用的术语的含义和范围。

数值范围包括定义该范围的数值。除非另有说明，否则分别地，核酸以5’至3’方向从左至右书写；氨基酸序列以氨基至羧基的方向从左到右书写。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。Singleton等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY ANDMOLECULAR BIOLOGY，第2版，John Wiley和Sons,New York(1994)以及Hale&Markham,THEHARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY,Harper Perennial,N.Y.(1991)为技术人员提供了本文使用的许多术语的一般含义。然而，为了清楚和便于参考，下面定义了某些术语。

必须注意，如本文和所附权利要求中所使用的，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该(the)”包括复数指示物。例如，术语“一个(种)引物”是指一个(种)或多个(种)引物，即单个(种)引物和多个(种)引物。还应注意，权利要求可以撰写成排除任何可选要素的形式。因此，该陈述旨在用作使用与权利要求要素的叙述有关的诸如“单独地”、“仅”等此类排它性术语或使用“否”限制的先行基础。

术语“核苷酸”旨在包括那些不仅含有已知的嘌呤和嘧啶碱基，还含有其它已被修饰的杂环碱基的部分。此类修饰包括甲基化的嘌呤或嘧啶、酰化的嘌呤或嘧啶、烷基化的核糖或其它杂环。另外，术语“核苷酸”包括含有半抗原或荧光标记的那些部分，并且不仅可以含有常规的核糖和脱氧核糖，还可以含有其它糖。经修饰的核苷或核苷酸还包括糖部分上的修饰，例如，其中一个或多个羟基被卤素原子或脂肪族基团取代，被官能化为醚、胺等。

术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互换使用，用来描述由核苷酸例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸组成的具有任何长度(例如大于约2个碱基、大于约10个碱基、大于约100个碱基、大于约500个碱基、大于1000个碱基、高达约10,000个或更多个碱基)的聚合物，并且可通过酶促或合成(例如如美国专利第5,948,902号和其中引用的参考文献中描述的PNA)产生，其可以以类似于两种天然存在的核酸的序列特异性方式的序列特异性方式与天然存在的核酸杂交，例如，可以参与沃尔森-克里克碱基配对相互作用。天然存在的核苷酸包括鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶(分别为G、C、A、T和U)。DNA和RNA分别具有脱氧核糖和核糖糖主链，而PNA的主链由通过肽键连接的重复N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元组成。在PNA中，各种嘌呤和嘧啶碱基通过亚甲基羰基键连接到骨架上。锁核酸(LNA)，通常被称为不可及RNA，是经修饰的RNA核苷酸。LNA核苷酸的核糖部分被连接2’氧和4’碳的额外桥修饰。该桥将核糖“锁定”在3’-内(北)构象中，这通常存在于A-型双链体中。只要需要，就可将LNA核苷酸与寡核苷酸中的DNA或RNA残基混合。术语“非结构化核酸”或“UNA”是含有非天然核苷酸的核酸，所述核苷酸以降低的稳定性彼此结合。例如，非结构化核酸可以包含G’残基和C’残基，其中这些残基对应于G和C的非天然存在的形式，即类似物，它们以降低的稳定性彼此碱基配对，但保留分别与天然存在的C和G残基碱基配对的能力。非结构化核酸描述于US20050233340中，该文献出于UNA的公开通过引用并入本文。

本文所用的术语“寡核苷酸”表示长度为约2至200个核苷酸，最长达500个核苷酸的核苷酸单链多聚体。寡核苷酸可以是合成的或者可以是酶促制备的，并且在一些实施方案中，长度为30至150个核苷酸。寡核苷酸可包含核糖核苷酸单体(即，可以是寡核糖核苷酸)或脱氧核糖核苷酸单体。例如，寡核苷酸的长度可以是10至20个、21至30个、31至40个、41至50个、51至60个、61至70个、71至80个、80至100个、100至150个或150至200个核苷酸。

本文所用的术语“引物”是指当置于其中诱导与核酸链互补的引物延伸产物合成的条件下时，即在核苷酸和诸如DNA聚合酶等诱导剂存在的情况下以及在合适的温度和pH下，能够充当合成起始点的寡核苷酸。引物可以是单链的，并且必须足够长以在诱导剂存在的情况下引发所需延伸产物的合成。引物的确切长度取决于许多因素，包括温度、引物来源和方法的使用。例如，对于诊断应用，根据靶序列或片段的复杂性，寡核苷酸引物通常含有15-25个或更多个核苷酸，尽管其可包含更少的核苷酸。本文的引物被选择为基本上与特定靶DNA序列的不同链互补。这意味着引物必须充分互补才能与它们各自的链杂交。因此，引物序列不需要反映模板的精确序列。例如，非互补核苷酸片段可以连接到引物的5’末端，引物序列的剩余部分与该链互补。或者，非互补碱基或更长的序列可以散布在引物中，条件是引物序列与链的序列具有足够的互补性以与其杂交，从而形成用于延伸产物合成的模板。

术语“杂交(hybridization)”或“杂交(hybridizes)”是指这样的过程，其中在正常杂交条件下核酸链与第二互补核酸链退火并形成稳定的双链体(同源双链体或异源双链体)，而在相同的正常杂交条件下不与无关的核酸分子形成稳定的双链体。双链体的形成是通过在杂交反应中使两条互补的核酸链退火来完成的。可通过调节在其下发生杂交反应的杂交条件(通常称为杂交严格性)来使杂交反应高度特异，使得两条核酸链之间的杂交不会形成稳定的双链体，例如在正常严格条件下保留双链性区域的双链体，除非这两条核酸链含有一定数量的基本上或完全互补的特定序列的核苷酸。对于任何给定的杂交反应,“正常杂交或正常严格条件”很容易确定。参见例如Ausubel等人，Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,New York或Sambrook等人，MolecularCloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press。如本文中所用，术语“杂交(hybridizing)”或“杂交(hybridization)”是指核酸链籍以通过碱基配对与互补链结合的任何过程。

如果两个序列在中度至高度严格杂交和洗涤条件下彼此特异性杂交，则认为核酸能与参考核酸序列“选择性杂交”。中度和高度严格杂交条件是已知的(参见例如Ausubel等人，Short Protocols in Molecular Biology，第3版，Wiley&Sons 1995和Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第3版，2001Cold Spring Harbor,N.Y.)。高严格条件的一个实例包括在约42℃下在50％甲酰胺、5X SSC、5X Denhardt’s溶液、0.5％ SDS和100ug/ml变性载体DNA中杂交，随后在室温下于2X SSC和0.5％ SDS中洗涤两次，并在42℃下于0.1X SSC和0.5％ SDS中另外洗涤两次。

如本文中所用，术语“测序”是指籍以获得多核苷酸的至少10个连续核苷酸的身份(例如至少20个、至少50个、至少100个或至少200个或更多连续核苷酸的身份)的方法。

术语“下一代测序”是指目前由例如Illumina、Life Technologies、BGI Genomics(完全基因组学技术)和Roche等使用的所谓的并行合成测序(parallelized sequencing-by-synthesis)或连接测序平台。下一代测序方法还可包括纳米孔测序方法或基于电子检测的方法，例如由Life Technologies商业化的Ion Torrent技术。

如本文中所用，术语“双链体”或“双链体化的(duplexed)”描述了碱基配对(即杂交在一起)的两个互补多核苷酸。

术语“确定”、“测量”、“估量”、“评估”、“测定”和“分析”在本文中可互换使用，是指测量的形式，并且包括确定要素是否存在。这些术语包括定量和/或定性测定。评估可以是相对的，也可以是绝对的。

如本文中所用，术语“连接”是指第一DNA分子5’末端的末端核苷酸与第二DNA分子3’末端的末端核苷酸的酶促催化连接。

“缺口填充/连接”反应是这样一种反应，其中两个寡核苷酸与模板杂交，其间有缺口，其中一个寡核苷酸被聚合酶延伸以填充缺口，连接酶将延伸的寡核苷酸与另一个寡核苷酸密封。

“聚合”反应是其中寡核苷酸与模板杂交，并且寡核苷酸被聚合酶延伸的反应。在聚合反应中没有与另一个寡核苷酸的连接。

术语“多个”、“组”和“群”可互换使用，指包含至少两个成员的事物。在某些情况下，多个可以具有至少10个、至少100个、至少100个、至少10,000个或至少100，000个成员。

“引物结合位点”是指靶多核苷酸或片段杂交中与寡核苷酸的位点。如果寡核苷酸为引物“提供”结合位点，那么引物可以与该寡核苷酸或其互补序列杂交。

本文使用的术语“链”指由通过共价键如磷酸二酯键共价连接在一起的核苷酸组成的核酸。

如本文中所用，术语“延伸”是指通过使用聚合酶添加核苷酸来延伸引物。如果与核酸退火的引物被延伸，则核酸充当延伸反应的模板。延伸也可通过连接来完成。为了清楚起见：延伸可以通过如上定义的连接、缺口填充连接反应或聚合反应来完成。

如本文中所用，术语“表面”指任何固体材料(例如玻璃、金属、陶瓷、有机聚合物表面或凝胶)，其可包含细胞或源自细胞的生物分子(诸如蛋白质、核酸、脂质、寡糖/多糖)、生物分子复合物、细胞器、细胞碎片或排泄物(外来体、微泡)等的任意组合。组织印迹、蛋白质印迹和载玻片是具有表面的固体材料的实例。细胞，例如哺乳动物细胞的悬浮液，是表面的另一个实例。

如本文中所用，术语“夹板”(splint)是指与两个其它寡核苷酸的末端杂交并将那些末端带到一起以产生可连接的接合点(junction)的寡核苷酸。

如本文中所用，术语“条形码化颗粒群”是指被寡核苷酸包被的颗粒，例如小珠粒或金属颗粒等，其中每个颗粒上的表面系连的寡核苷酸具有独特的序列，所述序列不同于系连于群体中其它颗粒的寡核苷酸中的序列。换句话说，如果有1,000个条形码化颗粒，系连至每个颗粒上的寡核苷酸将具有独特的序列(在本文中称为独特的分子标识符“UMI”或独特的标识符“UID”)。一个颗粒的UID不同于其它颗粒的UID。

如本文中所用，术语“桥接部分”是指具有至少两个核酸末端的部分，所述末端可与其它序列杂交，并可被聚合酶延伸或被连接酶连接。常规寡核苷酸(其具有5’和3’末端，在本文中称为“桥接寡核苷酸”)是桥接部分的实例，尽管也可以使用其它部分，例如直接或间接彼此连接的寡核苷酸。在一些实施方案中，桥接部分可以是含有表面系连的寡核苷酸的颗粒，如图20至图22所示的。如所显示的，这些颗粒可具有条形码化表面系连的寡核苷酸，其中不同的颗粒具有不同的条形码。

如本文中所用，术语“杂交”是指其中两个序列彼此碱基配对的反应。杂交需要序列之间至少10个碱基对的互补性，尽管在许多情况下，如果有至少12个、至少15个碱基对的互补性，就可获得更高的特异性。

术语的其它定义可能出现在整个说明书中。

具体实施方式

在描述各种实施方案之前，应该理解的是，本公开的教导不限于所描述的特定实施方案，因此当然可以变化。还应该理解，本文使用的术语仅仅是为了描述特定的实施方案，而不旨在限制，因为本教导的范围将仅由所附权利要求来限定。

本文使用的章节标题仅用于组织目的，不应被解释为以任何方式限制所描述的主题。虽然结合各种实施方案描述了本教导，但是本教导无意局限于此类实施方案。相反，如本领域技术人员将理解的，本教导包含各种替代、修改和等同物。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管类似于或等同于本文所述的方法和材料的任何方法和材料也可用于本教导的实践或测试，但现在描述一些示例性的方法和材料。

任何出版物的引用都是为了其在申请日之前的公开，并且不应该被解释为承认本权利要求不会因在先发明而早于此类出版物。另外，所提供的出版日期可以与实际出版日期不同，这可能需要独立确认。

如本领域技术人员在阅读本公开后将会明白的，在不脱离本教导的范围或精神的情况下，本文描述和示出的每个单独的实施方案具有可容易地与另外几个实施方案的任一个的特征分开或组合的分立的组分和特征。任何引述的方法可以以引述的事件的顺序或逻辑上可能的任何其它顺序来执行。

本文提及的所有专利和出版物，包括这些专利和出版物中公开的所有序列，都明确地通过引用并入。

以下公开内容提供了制作相邻条形码化颗粒的图谱的方法。由该方法产生的图谱可以是三维图谱或二维图谱，这取决于该方法是如何实现的。例如，如果以三维方式固定条形码化颗粒，那么产生的图谱可以是三维的。在其它实施方案中，例如，如果条形码化颗粒被固定在一个或多个表面上(例如一个或多个细胞的表面，所述细胞可以是悬浮的或被固定在支持物上)，那么通过该方法产生的图谱可以是二维的或三维的。在一些实施方案中，该方法可以产生多个二维图谱，其中每个图谱对应于细胞的表面。虽然该方法可应用于细胞(如下所述),但该方法可适用于制作固定在任何表面(例如可具有组织印迹或蛋白质印迹等的载玻片)上的相邻条形码化颗粒的图谱。同样，尽管条形码化颗粒或可能与条形码化颗粒结合的桥接部分可以通过抗体(例如与寡核苷酸缀合的抗体，所述寡核苷酸具有与条形码化颗粒或桥接部分中的序列互补的序列)锚定到细胞中或表面上的位点，但可通过使用任何类型的相互作用(例如共价或非共价相互作用)直接或间接固定条形码化颗粒或桥接部分，其中在一些实施方案中，条形码化颗粒或桥接部分可以通过非抗体结合剂(例如适体或寡核苷酸等)与细胞结合，其中结合剂与条形码化颗粒或桥接部分中的序列以及存在于细胞中或一个或多个细胞表面上的位点结合。在一些实施方案中，条形码化颗粒或桥接部分可通过与寡核苷酸杂交而被固定，所述寡核苷酸也与核酸杂交(例如与细胞RNA杂交)。条形码化颗粒或桥接部分可通过静电相互作用、通过链霉抗生物素蛋白/生物素相互作用或通过共价键联(例如通过点击偶联)非共价地固定于位点。

为了清楚起见，短语“使桥接部分群和条形码化颗粒群杂交，其中桥接部分或条形码化颗粒被固定”旨在涵盖以下实施方式，其中：(a)桥接部分与固定的条形码化颗粒杂交(在这种情况下，首先固定条形码化颗粒，然后使桥接部分杂交)或(b)使条形码化颗粒与固定的桥接部分杂交(在这种情况下，首先固定桥接部分或原位产生桥接部分，然后使条形码化颗粒杂交)。

在任何实施方案中，可将桥接部分群或条形码化颗粒分子群固定在溶液中的细胞中或之上、支持物(例如载玻片)上的细胞中或之上、组织的三维样品中的细胞中或之上或者组织切片中的细胞中或之上。例如，包含溶液中的细胞的样品可以是作为细胞悬浮物生长的培养细胞的样品。在其它实施方案中，可使用离散的细胞(所述细胞可以是通过使用胰蛋白酶等分离培养的细胞或实体组织(例如软组织诸如肝或脾)中的细胞而产生的)。在特定实施方案中，可将桥接部分群或条形码化颗粒群固定在可存在于血液中的细胞(例如全血中的细胞或其细胞亚群)上。全血中的细胞亚群包括血小板、红细胞(红细胞(erythrocyte))、血小板和白细胞(即外周血白细胞，其由嗜中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和单核细胞组成)。这五种类型的白细胞可被进一步分为两组：粒细胞(其也被称为多形核白细胞，包括中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)和单核白细胞(包括单核细胞和淋巴细胞)。淋巴细胞可被进一步分为T细胞、B细胞和NK细胞。外周血细胞存在于血液循环库中，并且未被隔离在淋巴系统、脾脏、肝脏或骨髓中。如果使用固定在支持物上的细胞，那么可以通过例如在平面表面上生长细胞，例如通过离心将细胞沉积在平面表面上，通过将含有细胞的三维物体切割成切片并将切片安装在平面表面上(即产生组织切片)，来制备样品。在替代实施方案中，所述表面可通过将细胞组分吸附到表面上来制备。

在任何实施方案中，所述方法可以包括将数千、数万、数十万、至少100万、至少1000万、至少1亿或至少10亿个条形码化颗粒(每个都具有独特的标识符)固定到细胞群上(例如通过抗体)，使得条形码化颗粒包被细胞。每个细胞可被至少100个、至少1,000个或至少10,000个颗粒包被。图1示意性地示出了包被了颗粒的细胞。显而易见，该图是示意图：细胞不是完美的球形，并且条形码化颗粒可以不是完美的球形、同一尺寸或以规则的图案均匀分布，如所显示的。条形码化颗粒可通过抗体或核酸探针锚定到细胞上，尽管其它方法也是可能的。在某些情况下，条形码化颗粒可通过与桥接部分杂交而被固定至细胞。如下文将更详细描述的，每个条形码化颗粒具有独特的标识符序列以及桥接部分可与之杂交的序列。桥接部分和条形码化颗粒杂交以产生包含条形码化颗粒和桥接部分的基质，其中桥接部分直接或间接与相邻的条形码化颗粒杂交。杂交后，相邻条形码化颗粒的独特标识符序列从条形码化颗粒复制到或连接到桥接部分上。如下文将更详细描述的，可对延伸的桥接部分进行测序。可基于已经添加到桥接部分的序列构建条形码化颗粒的物理图谱。

图2显示了条形码化颗粒群和包含寡核苷酸序列的桥接部分群，其中所述条形码化颗粒被具有独特颗粒标识符序列的表面系连的寡核苷酸独特地条形码化，其中所述桥接部分直接或间接(例如通过夹板)与条形码化颗粒的表面系连的寡核苷酸中的互补位点杂交。图2所示的条形码化颗粒群由10个颗粒(BP1至BP10)组成。如上所述，在实践中，该方法中使用的条形码化颗粒的数量可能高得多(例如数百万个或甚至数十亿个)。在图2所示的实例中，条形码化颗粒被具有独特颗粒标识符序列(UID1至UID10)的表面系连的寡核苷酸独特地条形码化，其中UID在该图中被缩写为“U”。在该图所示的实施方式中，表面系连的寡核苷酸额外地含有与桥接部分互补的序列(桥接部分结合序列或BMBS，其在该图中缩写为“B”)。在该实例中，在条形码化颗粒中有两种类型的BBBS，一种类型具有BMBS1序列(在图中缩写为“B1”)，另一种类型具有另一种类型的BMBS2序列(在图中缩写为“B2”)。不同的BMBS序列允许桥接部分(在所示的实施方案中，其具有与BMBS1和BMBS2互补的序列)优先与相邻的颗粒杂交，而不是与同一颗粒杂交。条形码化颗粒群(示于图2的底部)与桥接部分的杂交产生了包含条形码化颗粒群和桥接部分群的复合物。该复合体示意性地示于图3中。如下面将更详细描述的，该方法也可以在不使用不同BBBS序列的情况下实现。

在图2、图3、图5和图6以及随后的一些附图中，桥接部分被示为与条形码化颗粒的表面系连的寡核苷酸中的序列杂交的寡核苷酸。因此，在一些实施方案中，桥接部分可以是具有与表面系连的寡核苷酸中的序列互补的末端的寡核苷酸。在这些实施方案中，表面系连的寡核苷酸包含桥接部分结合序列，桥接部分的末端与那些序列互补并能够与之杂交。在替代实施方案中，桥接部分可以例如通过夹板与表面系连的寡核苷酸中的互补位点间接杂交。在这些实施方案中，桥接部分可以连接到表面系连的寡核苷酸上。在某些情况下，桥接部分可以潜在地含有两个游离的3’末端，其中桥接部分的3’末端与处于表面系连的寡核苷酸的远端的序列互补并能与之杂交。在这些实施方案中，桥接部分的3’末端与相邻条形码化颗粒上的表面系连的寡核苷酸的远端杂交，并被延伸以将UID从那些表面系连的寡核苷酸复制到桥接部分上。因此，在一些实施方案中，桥接部分可以是夹板连接的或未被夹板连接的寡核苷酸，其具有在夹板连接反应中与表面系连的寡核苷酸杂交或能够与之连接的末端，或者桥接部分可包含寡核苷酸序列并具有可与系连的寡核苷酸杂交的游离末端。在一些实施方案中，以及如图19所示，桥接寡核苷酸可以充当夹板，所述夹板将系连的寡核苷酸从一个颗粒连接到另一个颗粒。在这些实施方案中，一种类型颗粒中的系连的寡核苷酸应该具有游离的5’末端，一种类型的颗粒中的系连的寡核苷酸应该具有游离的3’末端。

该方法可包括将桥接部分(例如网格寡核苷酸分子群或具有表面系连的寡核苷酸的颗粒群)与条形码化颗粒群杂交，其中桥接部分或条形码化颗粒可被固定在一个或多个细胞上。该步骤可使用单一类型的桥接部分(即，具有相同序列的相同分子群)来实施，所述桥接部分在分子中间具有可以潜在地用作分子标识符的任选的简并序列(例如随机序列)。该方法可使用除独特的标识符序列外其它方面都相同的条形码化颗粒群来实施。然而，在其它实施方案中，该方法可使用至少在独特颗粒标识符序列以及它们的桥接部分结合序列方面不同的两种或更多种类型的条形码化颗粒来实施。后一个实施方案在图2和图3中进行了说明。在所示实施方案中，条形码化颗粒群包含：i.第一组条形码化颗粒，每个颗粒包含独特颗粒标识符序列(UID或“U”，如所示出的)和第一桥接部分结合序列(BMBS1或“B1”，如所示出的)，和ii.第二组条形码化颗粒，每个颗粒包含独特颗粒标识符序列(UID或“U”，如所示出的)和第二桥接部分结合序列(BMBS2或“B2”，如所示出的)。在第一组中可以有至少1M、至少10M、至少100M或至少1B条形码化颗粒，在第二组中可以有类似数量的条形码化颗粒(即，至少1M、至少10M、至少100M或至少1B条形码化颗粒)，其中每个条形码化颗粒具有独特颗粒标识符序列。如所显示的，在使用中，第一组和第二组条形码化颗粒彼此散布，使得来自第一组的条形码化颗粒可能接近来自第二组的至少一个，但有时两个、三个或四个条形码化颗粒。

颗粒可具有任何合适的尺寸、材料和形状。图4显示了相对于哺乳动物细胞的颗粒。在许多实施方案中，颗粒具有10-200nm的尺寸。使用的颗粒越小，获得的图像分辨率越高。可使用金颗粒(其可被容易地制成在例如1.8nm至1500nm范围内的任何直径)，尽管颗粒也可由银、二氧化硅、二氧化钛、碳、聚合物(如聚苯乙烯、聚丙烯酸酯等)、琼脂糖等制成。也可以使用铁和各种合金的磁性颗粒(Creative Diagnostics,Shirley,NY,USA)。同样，颗粒可以具有任何合适的形状，诸如球形、棒状、纳米立方体、板状、纳米星形等。例如，可以使用球形颗粒(Creative Diagnostics,Shirley,NY,USA)。颗粒不必是磁性的，但是磁性纳米球可以在某些情况下使用(Creative Diagnostics,Shirley,NY,USA)。有几种可用于使金属表面官能化，使得使它们可被连接至核酸的表面化学方法。例如，可修饰颗粒以包含反应性基团，包括但不限于N-羟基琥珀酰亚胺酯、磺基-N-羟基琥珀酰亚胺酯、卤代苯酚酯、五氟苯酚酯、硝基取代的苯酚酯、酸酐、异氰酸酯、异硫氰酸酯、亚氨基酯、马来酰亚胺、碘乙酰基、酰肼、醛或环氧化物。其它合适的基团是本领域已知的，并且可以描述于例如Hermanson,“Bioconjugate Techniques”Academic Press，第2版，2008中。最常用的捕获剂反应性基团是NHS(其是与胺反应性的)和马来酰亚胺(其是与巯基反应性的)，尽管也可以使用许多其它基团。颗粒也可用链霉抗生物素蛋白包被，链霉抗生物素蛋白可与生物素化的核酸结合。本公开中描述的条形码化颗粒不是滚环扩增(RCA)产物。

在一些实施方案中，条形码化颗粒可以通过乳液PCR制成，该方法已成功用于其它应用，并且描述于例如Kanagal-Shamanna等人(Methods Mol Biol 2016 1392:33-42)和Shao等人(PlosOne 20110024910)中。在一些实施方案中，该方法可包括用正向引物(例如通过点击化学、链霉抗生物素蛋白或通过共价相互作用)包被颗粒群，将颗粒与反向引物、dNTP、聚合酶和寡核苷酸模板(其具有与正向引物杂交的5’序列、复制时产生UMI的可变序列(例如随机序列)和对应于反向引物的3’序列)混合，产生乳液，其中每个液滴平均含有单个颗粒、单个模板分子和多个反向引物分子，并将乳液进行热循环，从而将模板序列的拷贝移植到正向引物上。随后可通过变性去除不需要的链。Dressman等人(PNAS 2003 100:8817-8822)描述了乳液PCR的一些方面。在该实例中，链霉抗生物素蛋白包被的珠粒与生物素化的PCR引物结合，并与水和油乳液中的模板(加上非生物素化的第二引物)组合，以在统计上每个乳液仅获得1个序列拷贝，其被扩增到珠粒上，产生多个拷贝的附着序列。通过将珠粒浸入氢氧化钠中，然后洗涤，可以使这些珠粒结合的序列成为单链的(参见Siu等人Talanta 2021 221:121593)。如可理解的，模板分子可具有正向引物结合位点、6-10个核苷酸(或甚至更多随机核苷酸，这取决于所需的独特颗粒的数量)的简并(例如随机)序列和在被复制时为反向引物提供结合位点的序列。

图20和图21示出了可籍以制造条形码化颗粒的替代方法。如所显示的，条形码化颗粒可通过将RCA产物与含有表面系连的引物的颗粒组合来制备，其中RCA产物具有独特的RCA标识符序列，并且引物与RCA产物中位于RCA标识符序列上游的序列杂交。众所周知，“滚环扩增”或简称“RCA”是指使用链置换聚合酶产生环状核酸模板的线性串联拷贝的等温扩增。RCA在分子生物学领域是众所周知的，并且描述于各种出版物中，包括但不限于Lizardi等人(Nat.Genet.1998 19:225-232)、Schweitzer等人(Proc.Natl.Acad.Sci.2000 97:10113-10119)、Wiltshire等人(Clin.Chem.2000 46:1990-1993)和Schweitzer等人(Curr.Opin.Biotech 2001 12:21-27)，所述文献通过引用并入本文。如本文中所用，术语“滚环扩增产物”是指滚环扩增反应的串联产物。使用链置换DNA聚合酶以环状分子为模板的RCA产物由数百或数千个环状反向互补拷贝的多联体组成。如图20所示，在该实施方案中，RCA产物的重复序列可与颗粒上多个引物分子的末端杂交，与分子标识符上游的位点杂交。引物的延伸将来自RCA产物的RCA标识符的反向互补序列添加到颗粒上。因为RCA产物的每个重复包含相同的标识符序列，所以相同的序列将被添加到每个引物中。如所显示的，延伸产物现在是双链的，可被限制性酶切割以产生含有多个引物的颗粒，每个引物具有独特标识符的互补序列，如从相同的RCA产物复制的。图21示出了产生具有可用于本发明方法的表面系连的寡核苷酸的颗粒的替代方法。在该方法中，条形码化RCA产物与颗粒杂交，RCA产物被切割，从而产生一个或多个含有独特标识符序列的末端。

这些实施方案可通过将具有表面系连的引物的颗粒与预制的RCA产品混合来完成。或者，如图21所示，在一些实施方案中，RCA反应可以“原位”进行，即通过将单个环状模板与每个颗粒杂交，并延伸一个系连至颗粒表面的引物分子来进行。如所显示的，该反应应该产生与同一颗粒上的另外的引物杂交的串联产物。在一些实施方案中(以及如所示出的)，RCA可以“原位”进行，即使用系连至颗粒的引物进行。在任何实施方案中，杂交反应可在足够低的稀释度下进行，以避免两个环(或RCA产物)与一个颗粒杂交。或者，如上所述，RCA反应或杂交可以在隔室中，例如在乳液中进行。

例如，用于产生具有独特标识符的环状分子和RCA产物的方法描述于Wu等人(Nat.Comm.2019 10:3854)和US20160281134中，并且容易适用于本文中的用途。在这些实施方案中，环状分子可以通过例如合成具有简并序列的初始寡核苷酸，使用夹板环化初始寡核苷酸来制备。如果使用预制的RCA产物，可通过经由RCA扩增环化的寡核苷酸来产生RCA产物。在一些实施方案中，初始寡核苷酸可包含6-10个核苷酸的简并(例如随机)序列，或者甚至更多随机核苷酸，这取决于所需的独特RCA产物或环的数量。RCA产物或环中的标识符序列长度可以是6-20个核苷酸，但在某些情况下可使用长度超出该范围的标识符序列。在一些实施方案中，除独特的标识符序列外，不同RCA产物或环的序列是相同的。

该方法的该实施方案可通过将至少1,000个颗粒(例如至少10,000个、至少100,000个、至少100万个、至少1000万个、至少1亿个或至少10亿个颗粒)(全部具有相同的引物附着至它们的表面)与合适数量的各自具有独特标识符序列的环或RCA产物(例如至少1,000个、至少10,000个、至少100,00个、至少100万个、至少1000万个、至少1亿个或至少10亿个具有独特标识符序列的环或RCA产物)杂交来完成。在该方法中，独特的标识符序列从RCA产物转移到颗粒上，从而产生可用于本发明方法的条形码化颗粒群。

因此，提供了用于制造条形码化颗粒的方法。这些方法通常描述于图20和图21中，并且可包括：(a)将具有独特标识符序列的RCA产物群与具有表面系连的寡核苷酸的颗粒群杂交，其中多个颗粒与单一RCA产物杂交，并且多个颗粒中每一个的多个表面系连的寡核苷酸与RCA产物中位于标识符序列上游的位点杂交，以及(b)或者在RCA产物中位于标识符序列下游的位点切割RCA产物，或者使用杂交的RCA产物作为模板延伸表面系连的寡核苷酸，从而将来自RCA产物的标识符序列添加到颗粒中。如上所述，后一个实施方案可通过将预先制备的RCA产物与颗粒或原位(即在颗粒上)制备的RCA产物杂交来完成，如图21所示。

图22中显示了使用此类颗粒作为桥接部分的测定的一个实例。

如图5所示，在一些实施方案中，该方法中使用的桥接部分可以各自包含与第一桥接部分结合序列(BMBS1或B1)互补的第一末端序列和与第二桥接部分结合序列(BMBS2或B2)互补的第二末端序列。在该实例中，至少一些桥接部分通过那些序列与两个相邻的条形码化颗粒杂交。图5显示了与两个相邻的条形码化颗粒杂交的桥接部分。假设连续的碱基相距约0.3nm，那么100聚体寡核苷酸理论上应该能够延伸30nm，200聚体桥接部分(其为寡核苷酸)理论上应该能够延伸60nm，500聚体桥接部分理论上应该能够延伸150nm。这样，桥接部分与之杂交的条形码化颗粒可以相距小于100nm或小于50nm。显而易见，越靠近的颗粒提供越高的分辨率。在一些实施方案(例如其中桥接部分充当连接夹板以促进颗粒彼此连接的实施方案(参见例如图19))中，桥接部分可以是相对短的寡核苷酸(例如在12-30nt范围内的寡核苷酸)。

在该方法的下一步骤中，可以延伸与两个相邻颗粒杂交的桥接部分，以将来自两个相邻颗粒的独特颗粒标识符序列或其互补序列添加到桥接部分的末端，从而产生延伸的桥接部分。在图5所示的实例中，UID1’(即UID1的互补序列)被添加到桥接部分的一个末端，UID2’(UID2的互补序列)被添加到桥接部分的另一个末端。如图6所示，在一些实施方案中，可使用缺口填充/连接反应(参见例如Mignardi等人，NucleicAcidsRes.2015 43:e151)来延伸桥接部分，所述缺口填充/连接反应将来自两个相邻颗粒的独特颗粒标识符序列的互补序列添加到桥接部分。

这些组分杂交在一起可以产生复合物，其中第一和第二独特颗粒标识符序列可通过经由缺口填充/连接反应分别延伸桥接部分的3’和5’末端来复制。

如图5所示，在桥接部分已被延伸以将来自相邻条形码化颗粒的UID添加到它们的末端之后，对延伸的桥接部分进行测序，然后进行分析以鉴定哪些独特颗粒标识符序列的互补序列的对已被添加到桥接部分上。该方法如图7所示。如图7所示，每个延伸的桥接部分应该在一个末端具有第一独特颗粒标识符序列(例如UID1)的互补序列，在另一个末端具有第一独特颗粒标识符序列(例如UID3)的互补序列。可分析这些序列以编制成对颗粒标识符序列(例如UID1-UID3、UID1-UID13等)的列表，其可用于制作颗粒的二维或三维图谱。如图7所示，该方法可包括使用序列的成对颗粒标识符序列列表制作固定化颗粒的一个或多个物理图谱(关系图)。显然，该图谱可以是一个或多个细胞的表面的图谱。在一些情况下，物理图谱可包括重叠和/或非重叠的图谱。

图6显示了其中UMI可被添加到桥接部分的一种方式。在本实例中，反应包括：(a)产生如图2所示的桥接部分与条形码化颗粒的复合物，其中在该复合物中，桥接部分的末端序列(例如寡核苷酸的3’和5’末端序列)分别与第一和第二条形码化颗粒的第一和第二桥接部分结合序列(BMBS1和BMBS2)杂交；以及(b)用聚合酶和连接酶处理(a)的复合物，从而将第一和第二独特颗粒标识符序列的互补序列复制(通过缺口填充/连接反应)到桥接部分的3’末端，从而产生包含第一和第二独特颗粒标识符序列的互补序列的产物分子(延伸的桥接分子)。图6显示了如何使用上游和下游引物进行该反应，如下所述，所述引物可以非共价地系连至表面上的位点。显而易见的是，如果桥接部分具有两个3’末端，则所述末端可以与条形码化部分杂交，并且颗粒标识符序列可通过引物延伸反应复制到那些末端上。无论哪种方式，识别相邻颗粒的独特序列对的互补序列被复制到桥接部分中。

在其它实施方案中，添加可通过如上所述的连接来完成，并且在一些实施方案中，表面系连的寡核苷酸可以连接在一起。在这些实施方案中，桥接部分充当夹板(如图19所示)。同样，如图18所示，添加可以通过聚合来完成。

在任何实施方案中，在测序之前，可通过PCR扩增延伸的桥接部分和在测定中已经延伸的其它分子。根据所用的方法，这可使用一对、二对、三对或四对引物来完成(这可在多重反应中完成)。在这些实施方案的一些中，如图6所示，可将PCR引物的结合位点分别添加到上游和下游引物的3’和5’尾部，或者理论上，PCR引物的结合位点可被编码到寡核苷酸中，所述寡核苷酸被系连到颗粒上并在延伸反应期间复制到桥接部分的末端。

除了制作条形码化颗粒的图谱之外，该方法还可包括在结合到细胞中或细胞表面上的位点的一种或多种结合剂(例如结合到细胞上的细胞表面标志物的抗体)之间进行靠近测定。在这些实施方案中，独特颗粒标识符序列可被复制到与捕获剂连接的寡核苷酸中。在一些实施方案中，捕获剂是抗体-寡核苷酸缀合物，在其它实施方案中，捕获剂可以是寡核苷酸探针。在这些实施方案中，术语“抗体-寡核苷酸缀合物”和“与寡核苷酸连接的捕获剂”是指这样的捕获剂，例如抗体或适体，其以使得捕获剂仍能与其结合位点结合的方式与单链寡核苷酸非共价(例如通过链霉抗生物素蛋白/生物素相互作用)或共价(例如通过点击反应等)连接。寡核苷酸和捕获剂可通过许多不同的方法(包括使用具有半胱氨酸反应性的马来酰亚胺或含卤素基团的那些方法)连接。捕获剂和寡核苷酸可以连接到寡核苷酸的5’末端附近或5’末端、寡核苷酸的3’末端附近或3’末端，或其间的任何地方。在一些实施方案中，寡核苷酸可通过将寡核苷酸与捕获剂隔开的接头与捕获剂连接。寡核苷酸可使用任何方便的方法(参见例如Gong等人，Bioconjugate Chem.2016 27:217–225和Kazane等人Proc Natl Acad Sci 2012109:3731-3736)连接到捕获剂上。在许多实施方案中，与结合剂缀合的寡核苷酸的序列独特地识别结合剂所结合的表位或序列。例如，如果使用10种不同的抗体进行该方法，则每种抗体被系连至不同的序列，所述序列识别该抗体所结合的表位。该特征允许该方法被多路复用，并且在一些实施方案中，可以在该方法中使用至少5种、至少10种、至少20种或至少50种不同的抗体，所述抗体与细胞中或细胞表面上的不同标志物结合。每种抗体与不同的抗体标识符序列缀合，抗体标识符序列允许制作特定抗体的结合事件的图谱。此类标记的抗体描述于例如Wu等人(Nat.Comm.2019 10:3854)和US20160281134等中。

如图8-图18所示，可以以各种不同的方式实施靠近测定。在任何实施方案中，靠近测定可产生包含结合剂标识符序列或其互补序列和独特颗粒标识符序列或其互补序列的产物。在一些实施方案中，靠近测定的产物(延伸的靠近探针)可以是与延伸的桥接部分分开的分子。在其它实施方案中，靠近测定的产物(延伸的靠近探针)可以是延伸的桥接部分的一部分(参见例如图9)。在任何实施方案中，测定中使用的一部分捕获剂可以连接到寡核苷酸的5’末端，而剩余的捕获剂可以连接到寡核苷酸的3’末端。例如，在一些实施方案中，该方法可利用包含一种或多种抗体-寡核苷酸缀合物的混合物，其中在一些实施方案中，一些结合特定细胞表面标志物的抗体(例如30％-70％的抗体分子)与寡核苷酸的5’末端缀合，而剩余的结合该细胞表面标志物物的抗体与寡核苷酸的3’末端缀合。在这些实施方案中，寡核苷酸可以各自含有PCR引物结合位点(在与抗体连接的寡核苷酸的任何一端),并且通过该测定产生的产物可以通过PCR扩增。

如图12所示，在一些实施方案中，在加入条形码化颗粒之前，可将桥接部分固定在细胞表面。在这些实施方案中，该方法可包括(a)将条形码化颗粒群与固定在一个或多个表面上的桥接部分群杂交，其中：(i)条形码化颗粒群的条形码化颗粒各自具有独特颗粒标识符序列和桥接部分结合序列，ii)桥接部分各自包含与桥接部分结合序列互补的第一末端序列和与桥接部分结合序列互补的第二末端序列；以及(iii)至少一些桥接部分与两个相邻颗粒杂交；(b)延伸与两个相邻颗粒杂交的桥接部分，以将来自两个相邻颗粒的独特颗粒标识符序列或其互补序列添加到桥接部分，从而产生延伸的桥接部分；(c)对延伸的桥接部分进行测序；以及(d)分析所述序列以鉴定哪些独特颗粒标识符序列互补序列对已被添加到桥接部分上。在一些实施方案中，桥接部分本身可以是靠近连接测定法的产物。在这些实施方案中，桥接部分可是裂开的，使得每个部分与不同的探针杂交。在这些实施方案中，完整的桥接部分仅在桥接部分的两个部分彼此邻近并且能够在夹板连接反应中彼此连接的情况下产生。

该方法可包括使用通过分析序列读数鉴定的独特颗粒标识符序列对制作固定化颗粒的物理图谱，以及通过分析哪些独特颗粒标识符序列和哪些结合剂标识符序列存在于测定产物中，将结合剂作图到固定化颗粒的物理图谱中。在一些实施方案中，可将结合剂标识符序列的互补序列和独特颗粒标识符序列的互补序列掺入延伸的桥接部分。在其它实施方案中，将结合剂标识符序列的互补序列和颗粒产物标识符序列的互补序列掺入与延伸的桥接部分分开的测定产物中。在靠近测定中对复制到测定产物中的独特颗粒标识符序列的分析允许将与细胞结合的每种捕获剂的结合位点作图到特定颗粒上。具体地，每个结合事件可以被作图到颗粒上，因为该颗粒的独特颗粒标识符序列被添加到邻近该颗粒的结合剂系连的寡核苷酸上。然后可将结合剂放置在上述颗粒的图谱上，从而提供结合事件的二维或三维图谱，其中该图谱可以对应于一个或多个细胞的表面。

显而易见的是，每个条形码化颗粒包含多个拷贝的相同序列，因此，多个结合事件可被作图到条形码化颗粒上，从而提供了定量颗粒的一条途径。例如，如果100个抗体-寡核苷酸缀合物结合到均与特定颗粒邻近的位点，那么所有100个结合位点都有可能被作图到颗粒上。将结合位点作图到本身已经二维作图的颗粒上提供了检查结合位点在细胞中或细胞表面上的分布的一条途径。这反过来提供了不用显微镜术检查细胞极性的一条途径。

本文还提供了探针系统。如图2所示，在一些实施方案中，探针系统可包括：(a)条形码化颗粒群，其中所述条形码化颗粒被表面系连的寡核苷酸独特地条形码化，所述寡核苷酸具有独特颗粒标识符序列和桥接部分结合序列；和(b)包含寡核苷酸序列的桥接部分群，其中寡核苷酸序列与桥接部分序列互补。如上所述,(a)与(b)的杂交产生其中桥接部分与相邻颗粒杂交的复合物，如图3所示。条形码化颗粒群可包含至少10个成员(例如至少100个、至少1,000个、至少1,000个、至少10,000个、至少100,000个、至少1M个、至少10M个、至少100M个、至少1B个或至少10B个)成员。在一些实施方案中，颗粒中的桥接部分结合序列与系连至颗粒上的寡核苷酸中的独特颗粒标识符序列相邻，并且桥接部分的末端与桥接部分杂交，但不与独特颗粒标识符序列杂交。探针系统的更多细节可见于上面的方法部分。在一些实施方案中,(b)的桥接部分群是网格寡核苷酸(grid oligonucleotide molecule)分子群，其中网格寡核苷酸分子一端的末端处的序列与网格寡核苷酸结合序列互补，网格寡核苷酸分子另一端的末端处的序列与网格寡核苷酸结合序列互补。在这些实施方案中，网格寡核苷酸分子可以是单分子或裂开的，并且如果网格寡核苷酸分子裂开成一个或多个序列，那么该系统还包含一个或多个将序列保持在一起的夹板寡核苷酸。

在一些实施方案中，桥接部分可以是具有表面系连的寡核苷酸的颗粒，如图22所示。如所示出的，在任何实施方案中，桥接部分(例如颗粒)可包含添加到相邻颗粒上的UMI，这产生在一个分子中的UMI对。可对UMI对进行测序和解码，以鉴定哪些颗粒在附近。

在一些实施方案中，条形码化颗粒群可包含第一组条形码化颗粒和第二组条形码化颗粒：其中：i.第一组条形码化颗粒的表面系连的寡核苷酸包含第一桥接部分结合序列，以及ii.第二组条形码化颗粒的表面系连的寡核苷酸包含第二桥接部分结合序列；以及iii.在(b)的桥接部分群中，寡核苷酸序列包含与第一桥接部分结合序列互补的第一序列和与桥接部分结合序列互补的第二序列。这种实施方式如图3所示。在这些实施方案中，第一组和第二组颗粒可各自包含至少10个成员(例如至少100个、至少1,000个、至少1,000个、至少10,000个、至少100,000个、至少1M个、至少10M个、至少100M个、至少1B或至少10B个)成员。

在一些实施方案中,(b)的桥接部分群是网格寡核苷酸分子群，网格寡核苷酸分子一端的末端处的序列可与第一网格寡核苷酸结合序列互补，网格寡核苷酸分子另一端的末端处的序列可与第二网格寡核苷酸结合序列互补。在这些实施方案中，网格寡核苷酸分子是单分子或裂开的，并且如果网格寡核苷酸分子裂开成一个或多个序列，那么该系统还包含一个或多个将序列保持在一起的夹板寡核苷酸。在一些实施方案中，桥接部分结合序列与表面系连的寡核苷酸中的独特颗粒标识符序列相邻，并且桥接部分的寡核苷酸序列的末端与桥接部分结合序列杂交，但不与独特颗粒标识符序列杂交。

还提供了包含表面系连的寡核苷酸的条形码化颗粒群，其中所述表面系连的寡核苷酸具有独特颗粒标识符序列和桥接部分结合序列，其中所述群体包含第一组条形码化颗粒和第二组条形码化颗粒：其中：i.第一组条形码化颗粒的表面系连的寡核苷酸包含第一桥接部分结合序列，和ii.第二组条形码化颗粒的表面系连的寡核苷酸包含第二桥接部分结合序列。在这些实施方案中，表面系连的寡核苷酸中的桥接部分结合序列可以与独特颗粒标识符序列相邻。在任何实施方案中，第一组和第二组的颗粒群各自包含至少10个、至少100个、至少1,000个、至少1,000个、至少10,000个、至少100,000个、至少1M个、至少10M个、至少100M个、至少1B或至少10B个成员。

如上所述，本公开还提供了用于实施本方法的试剂盒。在某些实施方案中，试剂盒可包括探针系统的组分或用于制造这些组分的起始产品。试剂盒还可包括连接酶、核苷酸和/或聚合酶，用于缺口填充/连接、连接或聚合反应。该试剂盒的各种组分可以存在于单独的容器中，或者根据需要，可以将某些相容的组分预先组合到单个容器中。除了上述组分，本试剂盒还可包括使用试剂盒组分实施本方法的说明书。

实施例

提出以下实施例是为了向本领域普通技术人员提供如何制造和使用本发明的额外公开内容和描述，并不旨在限制本发明人认为是他们的发明的范围，也不旨在表示以下实验是所进行的全部或唯一实验。

实施例1

以下实施例提供了在单细胞中或单细胞上分析蛋白质和/或RNA而不需要分隔单细胞或显微镜检查的方法。该方法可用于分析悬浮液中的细胞(例如从体液、血液或组织中分离的免疫细胞)或已经固定在表面(例如载玻片)上的固定组织或组织切片。此类方法常规地使用显微镜检查来对细胞成像。此处取消了显微镜检查，取而代之的是，可通过DNA测序来分析结合模式。在该方法中，确定条形码化颗粒之间的空间关系以提供图谱(其中每个条形码化颗粒可被认为是一个“像素”)，并且捕获剂所结合的位点被作图到条形码化颗粒上。该方法利用随机条形码化(也称为“独特颗粒标识符序列”或独特的分子标识符或“UMI”)颗粒，其可具有数十纳米至100纳米的确定直径。本发明的方法不依赖于邻近扩散(proximal diffusion)；相反，本发明的方法依赖于与相邻颗粒杂交的桥接部分。在下面的实施例中，桥接部分是寡核苷酸，可被称为“网格”寡核苷酸，其中网格寡核苷酸具有3’和5’末端以及与颗粒杂交的序列。还可使用其它类型的桥接部分，例如，具有多个可以延伸的核酸末端的部分。

在下面所示的实施例中，靶分析物蛋白质和/或RNA可被连接到DNA标签的蛋白质特异性抗体和/或RNA结合核酸探针结合。每种分析物特异性探针类型都带有独特的固定的且已知(非随机)的条形码，用于靶标鉴定。

实施例2

以下描述提供了分析细胞(例如淋巴细胞)悬浮液的方法。

平均淋巴细胞体积为130um^3，表面积约为124um^2。在本实施例中，颗粒的平均直径约为50nm。假设在细胞表面有单层颗粒，则该示例性淋巴细胞可以有数千个颗粒覆盖其。

V＝4/3pi r^3

A＝pi^1/3x(6V)^2/3

因此，根据颗粒的尺寸，典型的细胞据估计可以结合几千个颗粒。

在该实施例中，悬浮的细胞也用每个单细胞表面上的靶蛋白质的空间分辨率进行分析，这可能提供有价值的诊断信息。这种信息通常被称为细胞极性，并调节许多免疫细胞功能(Russel等人Journal of Cell Science 2008 121:131-136和Oliaro J.等人PNASDecember 5,2006 103(49)18685-18690)。使用目前可用的方法，细胞极性的分析需要显微镜检查来分析免疫细胞，这将分析通量限制于仅仅几个样品中的几个细胞和几个靶标。本发明的方法能够定量数百万个免疫细胞上的数百至数千个细胞表面标志物的丰度和相对位置。细胞极性(即细胞表面蛋白质在细胞上的不均匀分布)调节许多重要功能，并且对于许多细胞上的许多蛋白质来说非常难以分析。极化不仅调节细胞迁移，还调节免疫细胞活性，例如抗原呈递和效应子功能。

实施例3

图8示出了该方法的第一实施方式。在该方法(和可能的其它方法)的实施方式中，为了使网格寡核苷酸(可使用的几种类型的桥接部分之一)结合到两个相邻的颗粒(在图中表示为“珠粒像素”)而不是同一个颗粒，将颗粒制造成至少两种不同的类型，显示为类型1和类型2，它们在网格寡核苷酸结合序列(GOBS)上不同。这些序列示为GOBS1和GOBS2。这种设计减轻了潜在的竞争性杂交反应，这些反应原本会降低检测效率。

在该方法中，可以预先对该方法中使用的所有颗粒进行测序，以鉴定每个颗粒中有哪些UMI的对。这可通过在通过乳液PCR制造颗粒的过程中对从颗粒中洗脱的链进行测序来完成。

在该方法的实施方式中，通过缺口填充/连接反应将来自相邻颗粒的UMI添加到网格寡核苷酸中，来产生末端具有正向和反向PCR引物位点的延伸的网格寡核苷酸。同样地，通过缺口填充/连接反应加入邻近与抗体缀合的表面系连的寡核苷酸的UMI，以产生延伸的抗体寡核苷酸，其末端也具有正向和反向PCR引物位点。然后可对延伸的网格寡核苷酸和抗体寡核苷酸进行扩增和测序。

对延伸的分子进行测序可鉴定出彼此邻近且已与同一网格寡核苷酸分子杂交的颗粒。该信息可用于构建颗粒的关系图谱。然后可将复制到抗体结合的寡核苷酸上的UMI作图到图谱上。

实施例4

图8示出了该方法的第二实施方式。在该方法的这个实施方式(以及可能的其它实施方式)中：1)靶细胞被靠近探针(偶联至针对靶蛋白身份条形码化的寡核苷酸的抗体，所述寡核苷酸含有游离3’末端或游离5’末端)或能够结合特定RNA序列的核酸探针结合；2)将至少两种类型的条形码化颗粒加入到样品中，并通过“靠近探针结合序列”(PPBS)与靠近探针的末端杂交；3)将桥接部分加入到样品中，并使其与任一颗粒类型的GOBS1和GOBS2杂交。可在步骤1、2、3之间进行任选的洗涤步骤，以除去未结合的试剂。5)接下来，该方法可包括使DNA聚合酶和dNTP延伸杂交的3′-末端以及使连接酶合并序列，从而用来自颗粒的UMI编码PCR扩增子，以产生通过两个颗粒从一个靠近探针跨越到另一个靠近探针的靶扩增子，所述UMI提供它们的相对位置。当产物跨越至少两个颗粒时，可以获得邻近RCP的网格。6)接下来，该方法包括用PCR扩增合并的扩增子，然后对其进行测序以解码哪些蛋白质存在于何处的图像。

与实施例3一样，为了使网格寡核苷酸结合两个颗粒，而不是结合同一个颗粒，制造了至少两种颗粒类型，所述颗粒类型相异在于它们的网格寡核苷酸结合序列(GOBS1和GOBS2)。将UMI从颗粒中编码到延伸的网格寡核苷酸中。

图10示意性说明了在该方法的该实施方式中延伸的网格寡核苷酸的结构。

实施例5

图11示出了该方法的第三实施方式。在该方法的该实施方式中：1)靶细胞被靠近探针(偶联至针对靶蛋白身份条形化的寡核苷酸的抗体，所述寡核苷酸含有游离3’末端或游离5’末端)或能够结合特定RNA序列的核酸探针结合。2)将一种类型的预制颗粒加入到样品中，并使其通过网格寡核苷酸和靠近探针结合序列(GO&PP BS)与靠近探针的末端杂交。由于颗粒中有过剩的GO&PP BS，所以将会有结合位点留给下一步中加入的寡核苷酸；3)将网格寡核苷酸加入到样品中，并使其与颗粒的GO&PP BS杂交。为了去除未结合的试剂，可在步骤1、2、3之间进行任选的洗涤步骤。下一步可包括5)使DNA聚合酶和dNTP延伸杂交的3′-末端，并使连接酶合并序列，从而用UMI编码PCR扩增子。这种连接产生通过两个颗粒从一个靠近探针跨越到另一个靠近探针的靶扩增子，这提供了它们的相对位置。因为产物跨越至少两个颗粒，所以可以获得邻近颗粒的网格。6)接下来，该方法包括通过PCR扩增合并的扩增子，然后对其测序以解码哪些蛋白质位于何处的图像。同样，将UMI从颗粒中编码到延伸的网格寡核苷酸中。

实施例6

图12示出了该方法的第四实施方式。在该方法的该实施方式中：1)靶细胞被靠近探针(偶联至针对靶蛋白身份条形码化的寡核苷酸的抗体，所述寡核苷酸含有游离3’末端或游离5’末端)或能够结合特定RNA序列的核酸探针结合；2)将至少两种类型的预制条形码化颗粒加入到样品中，并使其通过“靠近探针结合序列”(PPBS)与靠近探针的末端杂交；3)将网格寡核苷酸加入到样品中，并使其与任一条形码化颗粒类型的GOBS1和GOBS2杂交。为了除去未结合的试剂，可在步骤1、2、3之间进行任选的洗涤步骤；5)接下来，该方法包括使DNA聚合酶和dNTP延伸杂交的3′-末端，并使连接酶合并序列，从而用来自相邻条形码化颗粒的UMI编码PCR扩增子，从而形成通过两个条形码化颗粒从一个靠近探针跨越到另一个靠近探针的靶扩增子，以提供它们的相对位置。由于产物跨越至少两个颗粒，获得了邻近条形码化颗粒的网格。6)接下来，该方法包括用PCR扩增合并的扩增子，然后对其进行测序以解码哪些蛋白质存在于何处的图像。与上面的实施例一样，为了使网格寡核苷酸与两个邻近的条形码化颗粒结合，而不是与同一个条形码化颗粒结合，这些条形码化颗粒被制造成至少两个不同序列的区域。在所示的实施方案中，它们相异在于它们的GOBS序列。同样，将UMI从条形码化颗粒中编码到延伸的网格寡核苷酸中。

实施例7

图13示出了该方法的第五实施方式。在该方法的该实施方式中，检测RNA。如所显示的，网格寡核苷酸被设计成结合与细胞RNA杂交的探针中的位点。在这种实施方式中，测序结果应该表明细胞中mRNA 1接近mRNA 2(因为与那些mRNA结合(间接地，通过探针)的网格寡核苷酸在它们在缺口填充/连接反应中延伸时都增加了左手颗粒的UMI)。

实施例8

图14示出了该方法的第六实施方式。在该方法的该实施方式中，网格寡核苷酸被分成两部分，这两部分只有当在夹板存在的情况下彼此非常接近时才连接在一起。图14中所示的实施方式类似于上述实施例6中所述的(和图10所示的)植入，不同之处在于夹板介导的靠近连接测定(PLA)步骤确保了如果发生两个与同一靶分子的结合事件，则网格寡核苷酸将是单个分子。这增加了测定的特异性。在该实施例中，网格寡核苷酸被一分为二，并用PLA夹板固定在一起。PLA夹板可被设计成仅固定靶向相同蛋白质的靠近探针对，这进一步增加了特异性和多路复用能力。

实施例9

图15示出了该方法的第七实施方式。这种实施方式利用颗粒的游离3’末端来产生PCR扩增子。在该实施例中，靠近探针(即，与抗体连接的寡核苷酸)包括与网格寡核苷酸互补的序列。对于1型颗粒(左边)，夹板连接反应将P-UMI及F-PCR与网格寡核苷酸连接，而对于2型颗粒(右边)，聚合反应将P-UMI与R-PCR结合在一起。在该方法的实施方式中使用了至少两种不同的颗粒类型。

实施例10

图16示出了该方法的第八实施方式。该实施方式基本上与上面实施例9中描述的设计#7相同，但其包括PLA步骤来增加检测的蛋白质的特异性。

实施例11

图17和图18示出了该方法的第九实施方式。在图17中，将条形码化颗粒用在颗粒与样品混合之前延伸的引物预杂交。在该实施例中，预先制备颗粒，以实现仅需要DNA连接反应的样品反应，这简化了测定操作。在测定之前，在珠粒-像素的制造中，将系连于1型颗粒(左边)的寡核苷酸的3’末端与作为夹板的寡核苷酸杂交，所述夹板用于将网格寡核苷酸的5’末端连接至表面系连的寡核苷酸。此夹板的3'端可能被封闭，因此其无法延伸。将2型颗粒(右侧)用与表面系连的寡核苷酸的3’末端杂交的寡核苷酸(其通过聚合酶延伸以复制P-UMI和R-PCR序列)预杂交。如所显示的，这种延伸的寡核苷酸具有便于连接至网格寡核苷酸的夹板。

在该测定中(如图18所示)，样品首先被靶特异性探针结合，然后其次被图17所示的两种类型的颗粒结合。DNA连接反应通过与靶特异性探针杂交的网格寡核苷酸将相邻颗粒的序列连接起来。如上所述，然后可通过PCR扩增整个序列并对其进行测序，以产生邻近的像素和相同邻近的靶生物分子(蛋白质和/或RNA)的图谱。

实施例12

图19示出了该方法的第十实施方式。在该实施例中，使用桥接部分作为夹板，将来自相邻条形码化颗粒的表面系连的寡核苷酸连接在一起。在该实施例中，可使用连接在一起的寡核苷酸中的正向和反向引物容易地扩增所述连接产物并对其进行测序。该实施方式使用具有游离3’末端的颗粒和具有游离5’末端的颗粒。游离5’末端颗粒可通过将寡核苷酸与表面系连的寡核苷酸预杂交，并通过聚合产生UMI的互补序列来制备(图中未显示)。在靶特异性探针(即，抗体)与样品结合后，将条形码化颗粒加入到样品中，其中将一种类型的颗粒用桥接部分预杂交，所述桥接部分充当连接夹板，或者可以稍后加入夹板。然后，单次连接将颗粒连接在一起，并将每个靶特异性寡核苷酸连接到颗粒上。可对连接产物进行PCR扩增、测序和分析，以提供条形码化颗粒以及与这些颗粒结合的靶的图谱。

实施例13

图23示意性地示出了可籍以生产条形码化颗粒的另一种方式。在该实施例中，将条形码化RCA产物(其每一个都包含数百至数千个重复UMI)用作模板，以通过DNA聚合反应(例如缺口填充/连接或引物延伸反应)将UMI复制到生物素化的引物上。在不使来自RCA产物的引物延伸产物变性的情况下，然后使RCA产物(具有生物素化的延伸产物)与链霉抗生物素蛋白包被的珠粒结合。生物素与珠粒结合，并且因为近端UMI(来自相同的RCA产物)与链霉抗生物素蛋白包被的珠粒上的邻近位点结合，所以被一簇UMI条形码化。在引物延伸产物与珠粒结合后，RCA产物然后可通过去杂交(例如通过加热，或变性剂)或UNG降解去除，露出3’游离的带UMI条形码的珠粒。

Claims

1.一种用于制作条形码化颗粒群的物理图谱的方法，其包括：

(a)产生复合物，其包含：

i.条形码化颗粒群，其中所述条形码化颗粒被具有独特颗粒标识符序列的表面系连的寡核苷酸独特地条形码化；和

ii.包含寡核苷酸序列的桥接部分群；

其中所述桥接部分直接地或通过夹板间接地与所述表面系连的寡核苷酸中的互补位点杂交；

(b)在所述复合物上进行连接、聚合和/或缺口填充/连接反应，从而产生包含来自相邻条形码化颗粒的独特颗粒标识符序列或其互补序列的对的反应产物；

(c)对步骤(b)中产生的所述反应产物进行测序；

(d)分析所述序列以鉴定在步骤(b)中哪些独特颗粒标识符序列或其互补序列的对已被复制和/或连接在一起；以及

(e)使用(d)中鉴定的所述序列对制作所述条形码化颗粒的一个或多个物理图谱。

2.如权利要求1所述的方法，其中步骤(b)通过连接完成。

3.如权利要求1所述的方法，其中步骤(b)通过聚合或缺口填充/连接反应完成。

4.如权利要求1或2所述的方法，其中在步骤(a)中，所述桥接部分将来自两个相邻条形码化颗粒的表面系连的寡核苷酸夹在一起，并且其中：

步骤(b)包括在所述复合物上进行连接，从而产生反应产物，所述反应产物包含来自相邻条形码化颗粒的独特颗粒标识符序列的对；以及

步骤(c)包括对步骤(b)中产生的所述反应产物进行测序。

5.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述方法包括：(b)延伸与两个条形码化颗粒的表面系连的寡核苷酸杂交的桥接部分，以将来自所述两个条形码化颗粒的独特颗粒标识符序列或其互补序列添加到所述桥接部分；

(c)对所述延伸的桥接部分进行测序；

(d)分析所述序列以鉴定哪些独特颗粒标识符序列或其互补序列的对已被添加到所述桥接部分上；以及

6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(a)包括:

将所述桥接部分群与所述条形码化颗粒群杂交，其中将所述桥接部分或所述条形码化颗粒固定，并且其中：

(i)除了独特颗粒标识符序列之外，所述条形码化颗粒的表面系连的寡核苷酸各自还具有桥接部分结合序列，以及

(ii)所述桥接部分各自包含与桥接部分结合序列互补的第一末端序列和与桥接部分结合序列互补的第二末端序列；以及

(iii)至少一些所述桥接部分与两个相邻条形码化颗粒的表面系连的寡核苷酸杂交。

7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述延伸包括聚合和/或缺口填充和/或连接反应，所述聚合和/或缺口填充和/或连接反应将来自所述两个相邻条形码化颗粒的独特颗粒标识符序列或其互补序列添加到所述桥接部分上。

8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(a)中：

(i)条形码化颗粒群包含第一组条形码化颗粒和第二组条形码化颗粒，其中：

i.所述第一组条形码化颗粒的表面系连的寡核苷酸还包含第一桥接部分结合序列，以及

ii.所述第二组条形码化颗粒的表面系连的寡核苷酸还包含第二桥接部分结合序列；

(ii)所述桥接部分各自包含与所述第一桥接部分结合序列互补的第一末端序列和与所述第二桥接部分结合序列互补的第二末端序列；以及

9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在测序之前通过PCR扩增步骤(b)的所述产物。

10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中固定所述桥接部分，并将所述条形码化颗粒与所述固定的桥接部分分子杂交。

11.如权利要求10所述的方法，其中在与所述条形码化颗粒杂交之前，将所述桥接部分与存在于细胞中或细胞上的序列杂交。

12.如权利要求10所述的方法，其中在与所述条形码化颗粒杂交之前，在细胞中或细胞上原位产生所述桥接部分。

13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中固定所述条形码化颗粒，并将所述桥接部分与所述固定的条形码化颗粒杂交。

14.如权利要求13所述的方法，其中在与所述桥接部分杂交之前，将所述条形码化颗粒与存在于细胞中或细胞上的序列杂交。

15.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过抗体固定所述桥接部分或所述条形码化颗粒。

16.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过核酸探针固定所述桥接部分或所述条形码化颗粒。

17.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述桥接部分或条形码化颗粒固定在一个或多个表面上。

18.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述桥接部分或条形码化颗粒固定到存在于一个或多个细胞之中或之上的位点，其中所述细胞处于悬浮液中或附着于支持物。

19.如权利要求18所述的方法，其中将所述桥接部分或所述条形码化颗粒通过一种或多种结合剂固定到存在于一个或多个细胞之中或之上的位点，其中所述结合剂各自结合到桥接部分或条形码化颗粒中的序列和一个或多个细胞之中或之上的位点。

20.如权利要求19所述的方法，其还包括在一种或多种结合剂与它们所结合的条形码化颗粒之间进行靠近测定。

21.如权利要求20所述的方法，其中所述靠近测定产生包含结合剂标识符序列或其互补序列和独特颗粒标识符序列或其互补序列的测定产物。

22.如权利要求21所述的方法，其中所述方法包括：

通过分析哪些独特颗粒标识符序列和哪些结合剂标识符序列存在于所述测定产物中，将所述结合剂定位到所述固定化颗粒的物理图谱中。

23.如权利要求22所述的方法，其中将所述结合剂标识符序列或其互补序列以及所述独特颗粒标识符序列或其互补序列掺入步骤(b)的所述延伸的桥接部分中。

24.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述桥接部分独特地与结合剂标识符序列杂交。

25.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中桥接部分不是滚环扩增(RCA)产物。

26.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述桥接部分是网格寡核苷酸。

27.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述桥接部分是具有表面系连的寡核苷酸的颗粒。

28.一种探针系统，其包括：

(a)条形码化颗粒群，其中所述条形码化颗粒被表面系连的寡核苷酸独特地条形码化，所述寡核苷酸具有独特颗粒标识符序列和桥接部分结合序列；和

(b)包含寡核苷酸序列的桥接部分群，其中所述寡核苷酸序列与所述表面系连的寡核苷酸的所述桥接部分结合序列互补，

其中(a)与(b)的杂交产生其中所述桥接部分与相邻条形码化颗粒杂交的复合物。

29.如权利要求28所述的探针系统，其中(b)的所述桥接部分群是网格寡核苷酸分子群，其中所述网格寡核苷酸分子一端的末端处的序列与网格寡核苷酸结合序列互补，并且所述网格寡核苷酸分子另一端的末端处的序列与网格寡核苷酸结合序列互补，

30.如权利要求29所述的探针系统，其中所述网格寡核苷酸分子是单分子或分裂的，并且如果所述网格寡核苷酸分子分裂成一个或多个序列，则所述系统还包含将所述序列结合在一起的一个或多个夹板寡核苷酸；

31.如权利要求28-30中任一项所述的探针系统，其中所述桥接部分充当夹板，使得来自不同颗粒的表面系连的寡核苷酸可以连接在一起。

32.如权利要求27-31中任一项所述的探针系统，其中：

(a)的条形码化颗粒群包含第一组条形码化颗粒和第二组条形码化颗粒：其中：

i.所述第一组条形码化颗粒的表面系连的寡核苷酸包含第一桥接部分结合序列，以及

ii.所述第二组条形码化颗粒的表面系连的寡核苷酸包含第二桥接部分结合序列；以及

iii.在(b)的桥接部分群中，所述寡核苷酸序列包含与所述第一桥接部分结合序列互补的第一序列和与所述桥接部分结合序列互补的第二序列。

33.如权利要求32所述的探针系统，其中(b)的所述桥接部分群是网格寡核苷酸分子群，并且所述网格寡核苷酸分子一端的末端处的序列与所述第一网格寡核苷酸结合序列互补，并且所述网格寡核苷酸分子另一端的末端处的序列与所述第二网格寡核苷酸结合序列互补。

34.如权利要求33所述的探针系统，其中所述网格寡核苷酸分子是单分子或分裂的，并且如果所述网格寡核苷酸分子分裂成一个或多个序列，则所述系统还包含将所述序列结合在一起的一个或多个夹板寡核苷酸。

35.如权利要求28-34中任一项所述的探针系统，其中所述第一组和所述第二组条形码化颗粒各自包含至少10个成员。

36.如权利要求28-35中任一项所述的探针系统，其中所述桥接部分结合序列与所述表面系连的寡核苷酸中的独特颗粒标识符序列相邻，并且所述桥接部分的寡核苷酸序列的末端与所述桥接部分结合序列杂交，但不与所述独特颗粒标识符序列杂交。

37.如权利要求28、31、34、35或36中任一项所述的探针系统，其中所述桥接部分是具有表面系连的寡核苷酸的颗粒。

38.一种条形码化颗粒群，其被具有独特颗粒标识符序列和桥接部分结合序列的表面系连的寡核苷酸独特地条形码化，其中所述群体包含第一组条形码化颗粒和第二组条形码化颗粒：其中：

ii.所述第二组条形码化颗粒的表面系连的寡核苷酸包含第二桥接部分结合序列。

39.如权利要求38所述的条形码化颗粒群，其中所述表面系连的寡核苷酸中的桥接部分结合序列邻近所述独特颗粒标识符序列。

40.如权利要求38或39所述的条形码颗粒群，其中所述第一组和第二组条形码化颗粒各自包含至少10个成员。

41.一种用于制造条形码化颗粒的方法，其包括：

(a)将具有独特的标识符序列的RCA产物群与具有表面系连的寡核苷酸的颗粒群杂交，其中多个所述颗粒与单一RCA产物杂交，并且多个所述颗粒中的每一个的多个表面系连的寡核苷酸与所述RCA产物中位于所述标识符序列上游的位点杂交，以及

(b)(i)在位于所述RCA产物中的所述标识符序列的下游的位点处切割所述RCA产物，或(ii)使用所述杂交的RCA产物作为模板延伸所述表面系连的寡核苷酸，从而将来自所述RCA产物的标识符序列添加到所述颗粒上。

42.一种用于制造条形码化颗粒的方法，其包括：

(a)将具有独特的标识符序列的RCA产物群与生物素化引物杂交，所述引物与位于所述独特标识符序列上游的位点杂交；

(b)使用聚合(例如缺口填充/连接或引物延伸)反应，延伸所述引物以产生多个生物素化的引物延伸产物/RCA产物；

(c)在不使来自与其退火的所述RCA产物的所述生物素化引物延伸产物变性的情况下，将所述RCA产物与杂交的引物延伸产物混合到链霉抗生物素蛋白标记的颗粒上，使得至少几个RCA产物结合到单个颗粒上，从而将所述杂交的引物延伸产物结合到颗粒上，以及

(d)除去所述RCA产物，从而在所述颗粒上留下所述生物素化的引物延伸产物。