ES2891085T3

ES2891085T3 - Obtención de imágenes sin microscopio

Info

Publication number: ES2891085T3
Application number: ES16744150T
Authority: ES
Inventors: Thomas Schaus; Xi Chen; Peng Yin
Original assignee: Harvard University
Current assignee: Harvard University
Priority date: 2015-01-30
Filing date: 2016-01-29
Publication date: 2022-01-26
Anticipated expiration: 2036-01-29
Also published as: EP3250716A4; EP3974537A1; WO2016123419A1; US20180010174A1; US11639522B2; CN107208160B; EP3250716B1; CN107208160A; US20230366011A1; EP3250716A1

Abstract

Sonda con código de barras de ácido nucleico, que comprende: un ácido nucleico dispuesto para formar una estructura de horquilla que tiene una región de unión a cebador parcialmente bicatenaria, una región de código de barras bicatenaria, una región palindrómica bicatenaria y una región de bucle monocatenaria que contiene un resto de unión a diana, en la que una molécula que termina la polimerización se ubica adyacente a la región palindrómica bicatenaria y entre la región palindrómica bicatenaria y la región de bucle.

Description

DESCRIPCIÓN

Obtención de imágenes sin microscopio

Investigación patrocinada federalmente

Esta invención se realizó con apoyo gubernamental bajo las subvenciones n.os 1DP2OD007292-01, 1R21HD072481-01 y 1R01EB018659-01, concedidas por los Institutos Nacionales de Salud, las subvenciones n.os CCF-1162459, C^cF-1054898 y CCF-1317291, concedidas por la Fundación Nacional de Ciencias, y las subvenciones n.os N00014-13-1-0593, N00014-14-1-0610 y N00014-11-1-0914, concedidas por la Oficina de Investigación Naval. El gobierno tiene determinados derechos en la invención.

Antecedentes de la invención

El uso de un microscopio para obtener imágenes simultáneamente, con una resolución de molécula individual, de las moléculas relevantes de sistemas moleculares complejos de un organismo vivo supone un desafío, particularmente con respecto a los análisis de alto rendimiento y multiplexación. Además, otras técnicas, tales como coinmunoprecipitación y ligadura de proximidad, a menudo usadas para resolver interacciones moleculares, son inherentemente destructivas, lo que impide el muestreo repetido requerido para dilucidar las redes moleculares individuales.

El documento WO2014/130388 se refiere a métodos para secuenciar ácidos nucleicos en mezclas y composiciones relacionadas con los mismos y, en particular, se refiere a analizar la secuencia de un extremo a otro y las distribuciones relativas en mezclas heterogéneas de polinucleótidos y a métodos y a reactivos habilitantes relacionados con los mismos, incluyendo un método relacionado con la secuenciación de la longitud completa y el perfilado cuantitativo de los ARNm presentes en los transcriptomas de células o tejidos de, pero sin limitarse a, organismos multicelulares superiores que poseen genes interrumpidos sujetos a procesamiento de ARN postranscripcional complejo.

Sumario de la invención

La presente invención se define por las reivindicaciones. En algunos aspectos, en el presente documento se proporcionan métodos para obtener imágenes de moléculas sin un microscopio u otro equipo especializado. Tales métodos se denominan en el presente documento métodos de “obtención de imágenes sin microscopio (MFI)”. Las tecnologías actuales de obtención de imágenes usan microscopios en un enfoque “de arriba abajo” para sondear dianas moleculares. En el presente documento, se usan “instrumentos moleculares” (por ejemplo, moléculas basadas en ADN y basadas en proteínas), en lugar de microscopios, en un enfoque “de abajo arriba” para inspeccionar dianas moleculares. Los métodos de la presente divulgación proporcionan una mayor resolución espacial (por ejemplo, para visualizar estructuras biológicas así como datos dinámicos y de conectividad real dentro de las redes individuales), capacidades de multiplexación superiores y análisis de mayor rendimiento en relación con las técnicas actuales de obtención de imágenes por microscopía. Además, los métodos de la presente divulgación proporcionan acceso in situ a dianas moleculares en sus estados nativos.

Algunos aspectos de la presente divulgación proporcionan sondas con código de barras de ácido nucleico que incluyen un ácido nucleico dispuesto para formar una estructura de horquilla que tiene una región de unión a cebador parcialmente bicatenaria, una región de código de barras bicatenaria, una región palindrómica bicatenaria y una región de bucle monocatenaria que contiene un resto de unión a diana, en las que un ligador sintético distinto de ADN que termina la polimerización se ubica entre la región palindrómica bicatenaria y la región de bucle.

Algunos aspectos de la presente divulgación proporcionan sondas con código de barras de ácido nucleico que incluyen una o más hebras de ácido nucleico dispuestas en (a) una región palindrómica bicatenaria, (b) una región de código de barras bicatenaria y (c) una región de unión a cebador.

En algunas realizaciones, una sonda con código de barras de ácido nucleico comprende una primera hebra de ácido nucleico que comprende una primera secuencia palindrómica, una primera secuencia de código de barras y una secuencia de unión a cebador, y una segunda hebra de ácido nucleico que comprende una segunda secuencia palindrómica que es complementaria a y está unida a la primera secuencia palindrómica y una segunda secuencia de código de barras que es complementaria a y está unida a la primera secuencia de código de barras, en la que la primera hebra de ácido nucleico y la segunda hebra de ácido nucleico están unidas entre sí a través de un ligador (por ejemplo, un ligador sin ácido nucleico o un tramo contiguo de ácidos nucleicos) y están dispuestas en una región palindrómica bicatenaria, una región de código de barras bicatenaria y una región de unión a cebador parcialmente bicatenaria (o monocatenaria) (por ejemplo, forma una estructura de bucle de horquilla, tal como la estructura mostrada en la figura 5).

En algunas realizaciones, una región de unión a cebador es monocatenaria. En algunas realizaciones, una región de unión a cebador es parcialmente bicatenaria.

En algunas realizaciones, una región palindrómica bicatenaria tiene una longitud de 4 a 10 pares de bases de nucleótidos. En algunas realizaciones, una región de código de barras bicatenaria tiene una longitud de 2 a 100 pares de bases de nucleótidos. En algunas realizaciones, una región de unión a cebador tiene una longitud de 4 a 40 nucleótidos.

En algunas realizaciones, una sonda con código de barras comprende además, adyacente a la región palindrómica bicatenaria, una molécula o modificación que termina la polimerización. Dos regiones de ácido nucleico se consideran “adyacentes” una de otra si están dentro de 0 a 10 nucleótidos una de otra. En algunas realizaciones, dos regiones se consideran “inmediatamente adyacentes” una de otra si no hay nucleótidos entre las dos regiones, por ejemplo, las dos regiones son contiguas una de otra.

En algunas realizaciones, una sonda con código de barras comprende además, adyacente a la región palindrómica bicatenaria, un ligador sintético distinto de ADN que termina la polimerización. Por ejemplo, una sonda con código de barras puede comprender además, adyacente a la región palindrómica bicatenaria, un espaciador de trietilenglicol que termina la polimerización.

En algunas realizaciones, una sonda con código de barras comprende una región de desplazamiento bicatenaria adyacente a la molécula o modificación que termina la polimerización. Una región de desplazamiento bicatenaria puede tener, por ejemplo, una longitud de 2 a 10 pares de bases de nucleótidos.

En algunas realizaciones, una sonda con código de barras está dispuesta para formar una estructura de horquilla que comprende una región de bucle monocatenaria. Una región de bucle monocatenaria puede tener, por ejemplo, una longitud de 3 a 50 nucleótidos.

En algunas realizaciones, una sonda con código de barras comprende además un resto de unión a diana. En algunas realizaciones, un resto de unión a diana está unido a la región de bucle monocatenaria.

En algunas realizaciones, un resto de unión a diana se selecciona del grupo que consiste en: biotina (por ejemplo, como pareja de unión a avidina o estreptavidina), un anticuerpo (o un fragmento de anticuerpo, por ejemplo, fragmento Fc), un aptámero, un nanocuerpo, un ácido nucleico, un fármaco y un átomo. Un “aptámero” es una molécula de ácido oligonucleico o de péptido que se une a una diana molecular específica. Un aptámero de ADN, ARN o AXN incluye normalmente una hebra corta (por ejemplo, de 5 a 30 nucleótidos) de oligonucleótidos. Un aptámero peptídico incluye normalmente un dominio peptídico variable corto, unido en ambos extremos a un armazón de proteína. Un “nanocuerpo” es un anticuerpo de un único dominio (también denominado fragmento de anticuerpo) que incluye un único dominio de anticuerpo variable monomérico y puede unirse selectivamente a una diana molecular.

En algunas realizaciones, una sonda con código de barras comprende al menos un nucleótido de ácido nucleico bloqueado (LNA). Un LNA puede estar ubicado, por ejemplo, en o adyacente a la región de código de barras bicatenaria.

En algunas realizaciones, una sonda con código de barras comprende además una secuencia terminal de poli-T (o poli-A) monocatenaria (por ejemplo, en el extremo 3' o el extremo 5').

En algunas realizaciones, una sonda con código de barras se une a una diana molecular a través de un resto de unión a diana.

Algunos aspectos de la presente divulgación proporcionan pluralidades de sondas con código de barras de ácido nucleico, tal como se proporcionan en el presente documento.

En algunas realizaciones, la región palindrómica bicatenaria es la misma para cada sonda de la pluralidad.

En algunas realizaciones, la región de código de barras bicatenaria es única para cada sonda de la pluralidad.

En algunas realizaciones, una pluralidad comprende subconjuntos de sondas con código de barras, comprendiendo cada subconjunto una región con código de barras única.

En algunas realizaciones, la región de unión a cebador es la misma para cada sonda de una pluralidad.

En algunas realizaciones, la región de unión a cebador es única para cada subconjunto de sondas con código de barras de una pluralidad.

En algunas realizaciones, cada sonda de una pluralidad se une a una diana molecular a través de un resto de unión a diana.

Algunos aspectos de la presente divulgación proporcionan composiciones que incluyen una pluralidad de sondas con código de barras, tal como se proporcionan en el presente documento, y un cebador que es al menos parcialmente complementario a una región de unión a cebador de una sonda de la pluralidad.

En algunas realizaciones, un cebador comprende al menos un apareamiento erróneo de nucleótidos en relación con la región de unión a cebador.

En algunas realizaciones, un cebador comprende al menos un ligador artificial que no es complementario a y/o no está unido a la región de unión a cebador.

En algunas realizaciones, las composiciones comprenden además una polimerasa de desplazamiento de hebra. Por ejemplo, las composiciones pueden comprender una polimerasa de desplazamiento de hebra seleccionada del grupo que consiste en: ADN polimerasa de Bsu, fragmento grande; polimerasa phi29; polimerasa Deep VentR; polimerasa de fragmento de Klenow; y polimerasa Taq modificada.

En algunas realizaciones, las composiciones comprenden además una hebra de ácido nucleico auxiliar que es parcialmente complementaria a la región de unión a cebador monocatenaria, es parcialmente complementaria a una región monocatenaria adyacente a la región de unión a cebador y se une de manera transitoria a la región monocatenaria adyacente a la región de unión a cebador. En algunas realizaciones, una hebra auxiliar tiene una longitud de 3 a 20 nucleótidos.

Algunos aspectos de la presente divulgación proporcionan métodos para detectar interacciones de dianas moleculares. En algunas realizaciones, los métodos incluyen las etapas de (a) combinar en una única reacción la pluralidad de sondas con código de barras de ácido nucleico con (i) un cebador complementario a la región de unión a cebador de una sonda de la pluralidad y (ii) una polimerasa de desplazamiento de hebra, y (b) incubar la reacción en condiciones que dan como resultado la producción de registros con código de barras.

En algunas realizaciones, los registros con código de barras son bicatenarios.

En algunas realizaciones, la etapa de (b) comprende incubar la muestra en condiciones fisiológicas. “Condiciones fisiológicas” abarca un intervalo de temperatura de 20-40 grados centígrados (°C) (por ejemplo, 20-25°C, 20-30°C, 20-35°C, 25-40°C, 25-35°C, 25-30°C, 30-40°C, 35-40°C o 37°C), pH de 6-8 (por ejemplo, pH 6, 6,5, 7, 7,5 u 8), concentraciones de sodio de 0-1 M (normalmente 145 mM) y una concentración de magnesio de 0-20 mM (por ejemplo, 1-2 mM). Por tanto, en algunas realizaciones, la etapa de (b) comprende incubar la muestra a una temperatura de 37°C en un tampón que contiene magnesio a una concentración de 2 mM. En algunas realizaciones, el tampón está disponible comercialmente, por ejemplo, como “1x tampón ThermoPol” (New England Biolabs) o similar.

En algunas realizaciones, la etapa de (b) comprende incubar la muestra a una temperatura de 37°C (por ejemplo, en un tampón que contiene magnesio 2 mM) durante un tiempo de 0,5 a 3,0 horas.

En algunas realizaciones, las sondas con código de barras de ácido nucleico de la pluralidad se regeneran tras la producción de los registros con código de barras bicatenarios.

En algunas realizaciones, los métodos comprenden además recopilar registros con código de barras a partir de la muestra.

En algunas realizaciones, los métodos comprenden además purificar los registros con código de barras recopilados a partir de la muestra.

En algunas realizaciones, los métodos comprenden además secuenciar los registros con código de barras recopilados a partir de la muestra, produciendo de ese modo datos de secuenciación.

En algunas realizaciones, los métodos comprenden además reconstruir, a partir de los datos de secuenciación, una imagen de interacciones de dianas moleculares.

En algunas realizaciones, los métodos comprenden además unir los registros con código de barras a adaptadores específicos de secuencia.

En algunas realizaciones, unir los registros con código de barras a adaptadores específicos de secuencia comprende (i) disociar los registros con código de barras bicatenarios para dar registros con código de barras monocatenarios, (ii) autohibridar cada registro con código de barras monocatenario para formar una estructura de horquilla y (iii) ligar cada estructura de horquilla a una secuencia de adaptador, formando de ese modo registros con código de barras de adaptador.

En algunas realizaciones, los métodos comprenden además amplificar los registros con código de barras de adaptador mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR), produciendo de ese modo copias de los registros con código de barras de adaptador.

En algunas realizaciones, los métodos comprenden además purificar las copias de los registros con código de barras de adaptador, produciendo de ese modo copias purificadas de los registros con código de barras de adaptador.

En algunas realizaciones, los métodos comprenden además secuenciar las copias purificadas de los registros con código de barras de adaptador, determinando de ese modo la secuencia de los registros con código de barras. En algunas realizaciones, los métodos comprenden además procesar computacionalmente la secuencia de los registros con código de barras para producir una red representativa de interacciones de dianas moleculares. “Procesar computacionalmente”, en el contexto de la presente divulgación, se refiere al procedimiento mediante el cual se procesan las secuencias de ácido nucleico (por ejemplo, de registros con código de barras) usando un ordenador y un modelo, por ejemplo, entendido y expresado como un algoritmo o protocolo.

En algunas realizaciones, un cebador incluye una primera hebra de ácido nucleico que comprende una primera secuencia complementaria a la región de unión a cebador monocatenaria y una segunda secuencia; y una segunda hebra de ácido nucleico que comprende una tercera secuencia complementaria a la región de unión a cebador monocatenaria y una cuarta secuencia complementaria a y unida a la segunda secuencia, en el que las hebras de ácido nucleico primera y segunda están dispuestas en una región bicatenaria flanqueada por regiones de cebador monocatenarias.

En algunas realizaciones, la región bicatenaria contiene una secuencia de código de barras.

En algunas realizaciones, el cebador comprende además al menos un sitio de secuenciación o sitio de unión.

En algunas realizaciones, la muestra es una muestra biológica. Por ejemplo, la muestra biológica puede ser una célula o un lisado celular.

Algunos aspectos de la presente divulgación proporcionan pares de sondas con código de barras de ácido nucleico que incluyen: (a) una primera sonda con código de barras de ácido nucleico dispuesta en (i) una región de código de barras bicatenaria y (ii) una región de unión a cebador monocatenaria, y (b) una segunda sonda con código de barras monocatenaria que comprende una región de código de barras y una región de cebador complementaria a la región de unión a cebador monocatenaria.

En algunas realizaciones, la región de código de barras bicatenaria de la primera sonda con código de barras de ácido nucleico tiene una longitud de 5 a 50 pares de bases de nucleótidos.

En algunas realizaciones, la región de unión a cebador monocatenaria de la primera sonda con código de barras de ácido nucleico tiene una longitud de 4 a 50 nucleótidos.

En algunas realizaciones, la región de código de barras de la segunda sonda con código de barras de ácido nucleico tiene una longitud de 5 a 50 nucleótidos.

En algunas realizaciones, la región de cebador de la segunda sonda con código de barras de ácido nucleico tiene una longitud de 4 a 50 nucleótidos.

En algunas realizaciones, la primera sonda con código de barras de ácido nucleico comprende además, adyacente a la región de código de barras bicatenaria, una molécula o modificación que termina la polimerización. Por ejemplo, la primera sonda con código de barras de ácido nucleico puede comprender además, adyacente a la región de código de barras bicatenaria, un ligador sintético distinto de ADN que termina la polimerización.

En algunas realizaciones, la primera sonda con código de barras de ácido nucleico comprende una región de desplazamiento bicatenaria adyacente a la molécula o modificación que termina la polimerización.

En algunas realizaciones, la región de desplazamiento bicatenaria tiene una longitud de 2 a 10 pares de bases de nucleótidos.

En algunas realizaciones, la primera sonda con código de barras de ácido nucleico está dispuesta para formar una estructura de horquilla que comprende una región de bucle monocatenaria. En algunas realizaciones, la región de bucle monocatenaria tiene una longitud de 3 a 50 nucleótidos. En algunas realizaciones, la región de bucle monocatenaria contiene la región de unión a cebador monocatenaria de (ii).

En algunas realizaciones, la primera sonda con código de barras de ácido nucleico y/o la segunda sonda con código de barras de ácido nucleico comprende(n) además un resto de unión a diana. En algunas realizaciones, el resto de unión a diana se ubica en un extremo distal con respecto a la región de unión a cebador monocatenaria de la primera sonda con código de barras de ácido nucleico y/o en un extremo distal con respecto a la región de cebador de la segunda sonda con código de barras de ácido nucleico. En algunas realizaciones, el resto de unión a diana se selecciona del grupo que consiste en: biotina, un anticuerpo, un aptámero, un nanocuerpo y un ácido nucleico. En algunas realizaciones, la primera sonda con código de barras de ácido nucleico y la segunda sonda con código de barras de ácido nucleico se une, cada una, a una diana molecular a través de un resto de unión a diana.

Algunos aspectos de la presente divulgación proporcionan composiciones que incluyen un par de sondas con código de barras de ácido nucleico, tal como se proporcionan en el presente documento, y una tercera sonda con código de barras de ácido nucleico dispuesta en una región de código de barras bicatenaria, y una región de unión a cebador monocatenaria, en las que la región de unión a cebador monocatenaria es complementaria a y está unida a la región de cebador de la segunda sonda con código de barras de ácido nucleico.

En algunas realizaciones, la tercera sonda con código de barras de ácido nucleico comprende además un resto de unión a diana. En algunas realizaciones, la tercera sonda con código de barras de ácido nucleico se une a una diana molecular a través de un resto de unión a diana que se une a una diana molecular.

Algunos aspectos de la presente divulgación proporcionan composiciones que incluyen un par de sondas con código de barras de ácido nucleico, tal como se proporcionan en el presente documento, y una polimerasa de desplazamiento de hebra.

En algunas realizaciones, la polimerasa de desplazamiento de hebra se selecciona del grupo que consiste en: polimerasa de fragmento grande de Bst, polimerasa phi 29, polimerasa Deep VentR, polimerasa de fragmento de Klenow y polimerasa Taq modificada.

Algunos aspectos de la presente divulgación proporcionan métodos para detectar interacciones de dianas moleculares, que incluye las etapas de (a) combinar en una única reacción un par de sondas con código de barras de ácido nucleico, tal como se proporcionan en el presente documento, y una polimerasa de desplazamiento de hebra, y (b) incubar la reacción en condiciones que dan como resultado la producción de registros con código de barras monocatenarios.

Algunos aspectos de la presente divulgación proporcionan métodos para detectar interacciones de dianas moleculares, que incluyen las etapas de combinar en una única reacción (a) dos sondas con código de barras de ácido nucleico monocatenarias, comprendiendo, cada una, una secuencia palindrómica, una secuencia de código de barras y una secuencia de unión a cebador, en los que las secuencias de código de barras son diferentes una de otra y en los que cada sonda con código de barras se une a una diana molecular, (b) un cebador parcialmente bicatenario dispuesto en una región bicatenaria flanqueada por regiones flanqueantes monocatenarias 3' que contienen, cada una, un cebador complementario a la secuencia de unión a cebador, en los que la región bicatenaria contiene un sitio de unión covalente reversible; y una polimerasa de desplazamiento de hebra; incubar (a) y (b) en condiciones suficientes para permitir la unión de los cebadores a los sitios de unión a cebador y la extensión de cada región flanqueante 3' de los cebadores; y calentar la reacción hasta una temperatura de al menos 50°C para permitir la disociación de los cebadores a partir de las dos sondas con código de barras de ácido nucleico monocatenarias, regenerando de ese modo (a) y (b).

Breve descripción de los dibujos

No se pretende que los dibujos adjuntos estén dibujados a escala. Con fines de claridad, no todos los componentes pueden estar etiquetados en todos los dibujos.

La figura 1 muestra una comparación esquemática de obtención de imágenes con microscopio y un ejemplo de obtención de imágenes sin microscopio de la presente divulgación.

La figura 2A muestra una visión general simplificada de la identificación del código de barras de ADN de dianas moleculares y el posterior registro de ADN de la proximidad de una diana en relación con otra. La figura 2B, paneles (1)-(7), muestra un esquema de registros de ADN indicativos de proximidad y geometría de las dianas moleculares. La figura 2C muestra una visión general simplificada de un ejemplo de un método de obtención de imágenes sin microscopio de la presente divulgación.

La figura 3A muestra una visión general esquemática de la copia y liberación autocíclica de un ejemplo de un dominio t de molde de ADN codificado en horquilla en múltiples copias de hebra de cebador a, produciendo secuencias a* - 1*. La figura 3B muestra un mecanismo de ejemplo de la unión inicial de cebador (i), la extensión (ii) y el recorrido aleatorio de la rama de desplazamiento de hebra (iii), mostrándose las probabilidades de asociación relativas predichas computacionalmente para cada nucleótido de molde. Las longitudes de dominio pueden ser, por ejemplo, de 6-20 nucleótidos (a), 5 nucleótidos (b), 0-30 nucleótidos (t) y 5 nucleótidos (x). Los dominios complementarios se muestran en líneas discontinuas. La figura 3C muestra un esquema de un ejemplo de un método de obtención de imágenes sin microscopio “de ciclado automático” de la presente divulgación, también denominado “registro de proximidad de ciclado automático” o “APR”. Un ciclo de APR, en este ejemplo, aplica pares de horquillas de intercambio de cebador como sondas, con extensión individual a semirregistros unidos (i), desplazamiento de hebra e hibridación de dominio palindrómico 3' (ii), y extensión de semirregistros para dar registros completos (iii). La figura 3D muestra registros de ADN indicativos de códigos de barras que tienen diferentes longitudes y diferentes proximidades entre sí. La generación de registros completos requiere la localización conjunta de sondas, por ejemplo, mediante bucles de horquilla biotinilados unidos a estreptavidina, mientras que las sondas aisladas generan semirregistros. Se muestra un gel de PAGE desnaturalizante recortado, que representa reacciones de 10 |il (40 min a 37°C) con asociación de biotina-estreptavidina, una estequiometría global de sonda:estreptavidina 4:1 (recuadro), códigos de barras de 8 y 22 nt (longitudes de tallo de 19 y 33 nt copiadas), cebador:sonda 10:1 y una concentración total de sonda de 40 nM. Se usó una única secuencia de cebador y no se realizó amplificación secundaria. La cuantificación en gel mostró un recambio de cebadores de aproximadamente 5 veces a 10 veces por código de barras. La figura 3E muestra datos que demuestran el ciclado automático mediante cuantificación de sondas marcadas con Cy5 en geles de PAGE desnaturalizantes recortados. Las condiciones de reacción y de gel son idénticas a las de la figura 3B, excepto por el uso de un espaciador de 10 nucleótidos (longitud de tallo de 21 nucleótidos copiada) y un razón de cebador:sonda 5:1, con sondas todavía a una concentración total de 40 nM. La figura 3F muestra datos de secuenciación para diferentes registros de ADN generados usando las sondas y el método de la figura 3A.

Las figuras 4A-4C muestran un ejemplo de un método para fabricar sondas de ciclado automático “simétricas” que pueden usarse según la presente divulgación. La figura 4A muestra un ejemplo de un precursor de sonda químicamente sintetizado (A6=AAAAAA; U=desoxiuridina; a16=U/CAT/U/CCCAGC/U/TAC/U (SEQ ID NO: 7); ax5=CTCAC; H22=combinación de A, C y/o T de 22 nucleótidos aleatorios; T=timidina; DS6= CGCTGG; espaciador 9=(Integrated DNA Technologies) “iSp9”; p6=ACCGGT; secuencia de precursor de sonda: AAAAAA/U/CAT/U/CCCAGC/U/TAC/U/CTCACHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHACCGGTTCGCTGGTT/iBiodT/TT CCAGCG/iSp9/ACCGGT (SEQ ID NO:6)). La figura 4B muestra el precursor de sonda de la figura 4A extendido mediante polimerasa (BCi20=secuencia de código de barras). La figura 4C muestra el precursor de sonda extendido de la figura 4B con su extremo 5' escindido mediante enzimas 'USER' (New England Biolabs).

La figura 5A muestra detalles adicionales de la sonda representada en la figura 4C, que incluyen la secuencia de precursor de sonda completa (SEQ ID NO:6). La figura 5B muestra un ejemplo de una sonda truncada que tiene una unión en el extremo 5' (ligador), dos características que disminuyen la distancia máxima a la que se detecta la proximidad a tan solo 6 nm.

Las figuras 6A-6D muestran un ejemplo de un método para producir un registro de ADN de la presente divulgación. Las sondas se unen a las dianas y se añaden cebadores de registro solubles (figura 6A). Los cebadores se unen y se copian los códigos de barras mediante desplazamiento de la polimerasa (figura 6B). Se desplazan automáticamente dos registros extendidos a partir de la sonda y se hibridan en los extremos 3' palindrómicos (figura 6C). La misma polimerasa extiende los registros a través del segundo código de barras y desplaza los registros a partir de las sondas (figura 6D). Condiciones de reacción de ejemplo: tampón - 1x tampón Bst en agua; polimerasa -Bst, con phi29 u otra polimerasa de desplazamiento alternada; temperatura - 37°C; tiempo - de 0,5 a 3 horas, o más. Las figuras 7A-7C muestran un ejemplo de un método para procesar registros de ADN de la presente divulgación. Los registros se recopilan en el sobrenadante (figura 7A) y se ligan a “adaptadores” específicos de secuenciación (figura 7B). Entonces, se completan varias tandas de PCR (figura 7C). Alternativamente, los registros pueden copiarse antes de añadir los adaptadores, usando una variedad de métodos convencionales, lo que da como resultado en última instancia muchas copias de cada registro original, cada una con secuencias de adaptador.

Las figuras 8A-8B muestran un ejemplo de un método para leer registros de ADN y un procedimiento de reconstrucción. Los registros se purifican en gel o en columna y se someten a secuenciación (por ejemplo, mediante secuenciación de nueva generación) (figura 8A). Después se procesan los resultados computacionalmente para la extracción de redes (figura 8B).

Las figuras 9A-9G muestran otros ejemplos de sondas de ciclado automático simétricas de la presente divulgación. La figura 9A muestra un ejemplo de una sonda de ciclado automático que tiene una región de “bucle distal” sencilla. La figura 9B muestra un ejemplo de una sonda de ciclado automático que tiene un ácido nucleico bloqueado (LNA). La figura 9C muestra un ejemplo de una sonda de ciclado automático que tiene un enlace covalente u otro ligador en lugar de un tallo o bucle. La figura 9D muestra un ejemplo de una sonda de ciclado automático que tiene un cebador debilitado por una protuberancia, apareamiento débil o apareamiento erróneo. La figura 9E muestra un ejemplo de una sonda de ciclado automático que tiene una secuencia palindrómica u otra secuencia 'p' más fuerte. La figura 9F muestra un ejemplo de una sonda de ciclado automático que tiene una hebra de disociación “auxiliar” dinámica compuesta por cualquier extremo de la sonda, el propio registro o como una tercera hebra (mostrada). La figura 9G muestra un ejemplo de una sonda de ciclado automático de doble extremo o en bucle que tiene dos competidores. La figura 10A muestra un ejemplo de sondas de ciclado automático “asimétricas”. Dos sondas interaccionan para copiar la región de código de barras a partir de la sonda similar a horquilla de la izquierda (BC^j12) en la sonda lineal de la derecha. En el presente documento se proporcionan diversas configuraciones de sonda (figuras 10B-10E). Este conjunto de sondas también es autocíclico, concatenando repetidamente códigos de barras al extremo 3' de la sonda de la derecha.

La figura 11 muestra un ejemplo de un mecanismo de ciclación dependiente de la temperatura de la presente divulgación, en el que los registros se copian como antes pero se liberan a partir de los pares de sondas tras un aumento temporal de la temperatura en lugar de mediante desplazamiento a partir de una secuencia de sonda complementaria. Al igual que en el sistema de ciclado automático (no dependiente de la temperatura), el ciclo puede repetirse después para crear más registros a partir de las mismas sondas.

La figura 12 muestra otro ejemplo de un cebador de la presente divulgación.

Las figuras 13A y 13B muestran ejemplos de métodos de ligación y amplificación de la presente divulgación. Los registros pueden cortarse con endonucleasas de restricción, después ligarse mediante extremos “cohesivos” (figura 13A). El exceso de material de registro no ligado puede cortarse con una o más endonucleasas (figura 13B).

La figura 14 muestra ejemplos de mecanismos de liberación de registros de la presente divulgación.

La figura 15 muestra una aplicación de ejemplo de un método de obtención de imágenes sin microscopio de la presente divulgación para agrupaciones de proteínas de membrana EGFR heterogéneas, que pueden reconfigurarse cuando se tratan con fármacos. Cada proteína individual (en lugar de una especie de proteína) puede marcarse con un código de barras único.

Las figuras 16A-16C muestran una aplicación de ejemplo de un método de obtención de imágenes sin microscopio de la presente divulgación para la organización del nucleoma. Los trazos grises indican interacciones cromosómicas (figura 16A). La figura 16B muestra que las copias de cromosomas muestreadas a baja resolución (puntos) no se diferencian, y la reconstitución de las interacciones es escasa. La figura 16C muestra que, a alta resolución (puntos), las interacciones críticas y la copia de cromosomas son evidentes usando obtención de imágenes sin microscopio. Las interacciones entre ADN y ARN o proteína también son accesibles mediante obtención de imágenes sin microscopio a esta resolución (no representadas).

La figura 17 muestra un ejemplo de una obtención de imágenes sin microscopio de mayor alcance de la presente divulgación.

La figura 18 muestra un esquema de un ejemplo de un método de obtención de imágenes sin microscopio para el recuento de proteínas diana basado en secuenciación. Puede decodificarse una variedad de información, incluyendo, por ejemplo, tipo de proteína, recuento digital y origen de la muestra, a partir de la lectura de las secuencias de hebras/registros generados indicadores de ADN. El número de códigos de barras de registro únicos creado cuando dos sondas seleccionan como diana la misma proteína indica el número de proteínas en el sistema. Este esquema también utiliza un código de barras “de identificador molecular único” aleatorio en los propios cebadores de registro, de tal manera que pueden despreciarse las interacciones fortuitas (no provocadas por la localización conjunta en una proteína diana) entre sondas en el procesamiento posterior en virtud del bajo (por ejemplo, único) número de registros producidos en ese apareamiento.

Las figuras 19A-19C presentan datos que caracterizan el alcance y la geometría de la sonda. Para controlar el posicionamiento relativo de la sonda de manera precisa, se unieron las sondas a nanoestructuras de ADN bidimensionales, rectangulares, corregidas por torsión que medían 70 por 100 nm (figura 19A). Después del ensamblaje completo, se depositaron las nanoestructuras aleatoriamente sobre superficies de mica en presencia de Mg2+ 12,5 mM para una firme adhesión, una condición que protege a las nanoestructuras de la degradación por la polimerasa. Cada sonda se mantuvo por extensión directa de dos ácidos nucleicos cortos (mostrados, en una pequeña sección de nanoestructura) o unión covalente a un oligonucleótido intermediario (recuadro; azida en bucle de sonda unida covalentemente a alquino en intermediario TTT - L mediante química clic basada en DIBO y purificada en gel). Se midió la separación de sondas en el punto de unión de la nanoestructura. Los registros producidos pudieron amplificarse por PCR con, por ejemplo, los cebadores a1* y a2*. Se mantuvieron sondas por lo demás idénticas con longitudes de espaciador de 0 ó 12 (unidos mediante extensión de grapas) o 18 nt (unidos covalentemente) en pares separados desde 6 hasta 48 nm en incrementos de 6 nm, se registraron (1 hora a temperatura ambiente, aproximadamente 50 millones de nanoestructuras por pocillo, cebadores 100 nM) y amplificados por PCR en fase logarítmica (20 ciclos, cebadores 500 nM) hasta niveles detectables en gel (figura 19B). Se normalizó la cuantificación de bandas de PAGE desnaturalizante a un par de referencia constante para cada pocillo. A continuación, se ajustó la serie completa para un tipo de par de sondas dado mediante mínimos cuadrados recursivos a una curva sigmoidea c1/(1 Exp[c2(dist - c3)]), en la que dist representa la distancia de separación, y se normalizó a una tasa máxima de 1. Se adoptó el mismo rectángulo como base de nanoestructura para mantener las tres sondas (P1, P2, P3, de diseño de espaciador de 18 nt) a intervalos de 30 nm en cuatro disposiciones (diagrama simplificado) (figura 19C). Cuando estaban en una disposición triangular, los tres pares de sondas produjeron registros, sin embargo en disposiciones lineales únicamente produjeron registros los pares de sondas adyacentes. De manera similar a la figura 19B, la PCR en fase logarítmica se cuantificó mediante PAGE desnaturalizante.

Las figuras 20A-20B presentan datos que caracterizan cambios de estado. Se usó el mismo triángulo de sonda de nanoestructura que en la figura 19C, panel (i), excepto que la sonda P3 podía desactivarse (figura 20A). La figura 20B muestra una amplificación por ^pC^ry un gel de PAGE desnaturalizante de un registro a partir de una sonda activa, después de un lavado intermedio, y de un registro a partir de una sonda inactiva. El resultado del lavado intermedio garantiza que no hay registros sobrantes. Se usó un único conjunto de nanoestructuras para todas las etapas y volvió a muestrearse.

Descripción detallada de la invención

Los organismos vivos son sistemas moleculares complejos. La obtención de imágenes proporciona un modo natural y directo para investigar tales sistemas y se ha convertido en un método central para el estudio biológico. Un modo ideal para estudiar tales sistemas es visualizar simultáneamente todas las moléculas relevantes en su estado nativo con resolución de molécula individual. Un modo para visualizar sistemas biológicos es mediante microscopio, aunque el uso de microscopios para obtener imágenes del mundo molecular presenta varios desafíos, incluyendo “visión borrosa", “ceguera al color” parcial, rendimiento limitado y acceso restringido a las muestras. En una población abarrotada de moléculas que se reconfiguran dinámicamente, es difícil visualizar claramente moléculas individuales, lo que conduce a "visión borrosa”; sólo puede usarse un pequeño número de colores diferentes (por ejemplo, 3 ó 4) para rastrear simultáneamente múltiples moléculas distintas, lo que da como resultado "ceguera al color” parcial; los microscopios tienen un campo visual limitado, que permite la observación de apenas una pequeña población de moléculas seleccionadas en regiones seleccionadas, limitando de ese modo el rendimiento; y es difícil de visualizar claramente moléculas en su estado vivo nativo, particularmente porque las moléculas (por ejemplo, como componentes de una muestra biológica) a menudo se extraen de su contexto biológico y se procesan para ajustarse a la platina de observación particular del microscopio (por ejemplo, en un corte fino de muestra fija o congelada).

Por tanto, existe la necesidad de una alternativa a la microscopía para la obtención de imágenes de interacciones moleculares de sistemas biológicos complejos. En algunos aspectos, en el presente documento se proporcionan métodos de obtención de imágenes sin microscopio (MFI) y composiciones relacionadas dirigidas al análisis "de abajo arriba” de grandes poblaciones de dianas moleculares, cada una ligada a una sonda con código de barras de ácido nucleico única, denominadas en el presente documento "dianas con código de barras” (véanse, por ejemplo, las figuras 1 y 2A). Por ejemplo, cuando las dianas con código de barras están próximas entre sí, se crean repetidamente registros de ácido nucleico (denominados simplemente en el presente documento "registros”) de la configuración espacial de las dianas con código de barras (por ejemplo, la proximidad y/o disposición de dianas con código de barras en relación unas con otras), sin destruir las dianas con código de barras. Por tanto, a lo largo del tiempo, a medida que las dianas con código de barras cambian su configuración espacial (por ejemplo, interaccionan con diferentes dianas con código de barras), se generan registros de estos cambios. Después se leen los registros mediante, por ejemplo, secuenciación de ácidos nucleicos de alto rendimiento, y se reconstruyen computacionalmente imágenes de las dianas moleculares subyacentes. Se considera que dos dianas moleculares están "próximas” entre sí si, por ejemplo, interaccionan física o químicamente o se asocian de otro modo entre sí. También se considera que dos dianas moleculares están "próximas” entre sí si la distancia entre las dos dianas es de 0 nanómetros (nm) a 100 nm (o de 0 nucleótidos (nt) a 100 nt). Por ejemplo, la distancia entre dos dianas próximas entre sí puede ser de 0 nm a 5 nm, de 0 nm a 10 nm, de 0 nm a 20 nm, de 0 nm a 30 nm, de 0 nm a 40 nm o de 0 nm a 50 nm.

Los presentes métodos y composiciones proporcionan, en algunas realizaciones, una plataforma para obtener imágenes con alta resolución espacial, con capacidad de multiplexación, procesos dinámicos de dianas moleculares individuales (o, alternativamente, una única especie de dianas moleculares) in situ de manera masivamente paralela, lo que permite la obtención de imágenes moleculares de alto rendimiento. Ventajosamente, la obtención de imágenes sin microscopio, tal como se proporciona en el presente documento, evita el procesamiento riguroso y dañino de la muestra al tiempo que permite una resolución ultraalta, la producción computacional precisa de imágenes de estructuras moleculares, cálculos moleculares digitales, análisis de la estequiometría de interacción y distribución de estado, y datos de conectividad real y dinámicos obtenidos a partir de redes moleculares individuales. Los métodos proporcionados en el presente documento usan un "código de barras” de ácido nucleico (por ejemplo, un ADN, tal como un ADN aleatorio) para marcar de manera única cada diana molecular de interés (figura 2^a). Cuando dos dianas con código de barras están próximas entre sí, se genera de manera autónoma un registro que codifica para las identidades de ambos códigos de barras. Para una diana con código de barras aislada (es decir, una diana con código de barras que no está próxima a otra diana con código de barras), no se genera ningún registro (figura 2B(1)). Para un par de dianas con código de barras próximas, se genera un registro único para el par (figura 2B(2)), aunque para tres dianas con código de barras próximas, se generan dos registros, siendo cada registro único para un par individual de las tres dianas con código de barras (figura 2B(3)). Asimismo, para configuraciones espaciales más complejas, se generan múltiples registros, siendo cada registro único para cada par de la configuración compleja (figura 2B(5) y 2B(6). De esta manera, puede registrarse la interconectividad precisa y, por inferencia, la geometría global. Además, para configuraciones dinámicas, se generan registros en proporción a los tiempos de asociación y, en algunos casos, pueden tener un sello de tiempo (figura 2B(7)). En la figura 2C se esquematiza un resumen de un ejemplo de un método de obtención de imágenes sin microscopio, tal como se proporciona en el presente documento. Cada diana molecular en una muestra se marca con un código de barras único, las reconfiguraciones moleculares repetidas y continuas (por ejemplo, asociaciones/interacciones) producen registros de manera autónoma y los registros se leen usando secuenciación de alto rendimiento, seguido de producción de imágenes mediante reconstrucción computacional de las reconfiguraciones dinámicas de dianas moleculares. Los términos “reconfigurar” y “reconfiguración”, tal como se usan en el presente documento, se refieren a un cambio en las posiciones de dianas moleculares en relación unas con otras a lo largo del tiempo. Por ejemplo, en el tiempo 1, tres dianas moleculares pueden estar dispuestas en una configuración lineal y, en el tiempo 2, las tres dianas moleculares pueden estar dispuestas en una configuración triangular. Por tanto, las tres moléculas se han “reconfigurado” en el tiempo 2, en relación con el tiempo 1.

La obtención de imágenes sin microscopio de la presente divulgación se basa en una reacción “de ciclado automático”. Este ciclado automático repetitivo (por ejemplo, generación repetida de sondas y dianas) limita los registros producidos de manera aberrante (por ejemplo, aquellos formados en disolución) a una copia, que puede descartarse fácilmente. Normalmente, pero no siempre, la reacción tiene lugar a 37°C en presencia de una polimerasa de desplazamiento. Los códigos de barras usados para identificar dianas moleculares individuales se incorporan en sondas de ácido nucleico (denominadas en el presente documento “sondas con código de barras de ácido nucleico” o simplemente “sondas con código de barras”), que se unen a dianas moleculares, en algunas realizaciones, a través de un resto de unión a diana (por ejemplo, biotina, un anticuerpo, un aptámero, un nanocuerpo o un ácido nucleico). Las sondas con código de barras se diseñan de tal manera que, en presencia de una polimerasa de desplazamiento y un cebador soluble universal, las sondas con código de barras dirigen un proceso autocíclico que produce repetidamente registros de códigos de barras próximos. La figura 3A representa un ejemplo de un mecanismo molecular subyacente a los métodos de la presente divulgación. En la etapa (i), un cebador u* universal soluble une cada sonda a una región u de unión a cebador monocatenaria común, y una polimerasa de desplazamiento extiende el cebador a través de la región de código de barras (i o j) y una región p palindrómica hasta una molécula o modificación que termina la polimerización (por ejemplo, un ligador sintético distinto de ADN), generando de ese modo un “semirregistro”, que se refiere a una hebra de ácido nucleico recién generada que contiene un cebador u* universal, un código de barras (i o j) y una secuencia p* palindrómica (por ejemplo, u* - i* - p* o u* - j* - p*). Obsérvese que una letra con un superíndice “*” indica una secuencia complementaria a la secuencia representada por la letra correspondiente sin “*”. En la etapa (ii), los semirregistros se desplazan parcialmente a partir de la sonda con código de barras mediante un mecanismo de “desplazamiento de hebra” (véanse, por ejemplo, Yurke et al., Nature 406: 605-608, 2000; y Zhang et al. Nature Chemistry 3: 103-113, 2011), y los semirregistros próximos se hibridan entre sí a través de las regiones p* palindrómicas 3'. En la etapa (iii), los semirregistros se extienden a través de las regiones de código de barras (i y j) y las regiones u de unión a cebador, liberando registros completos solubles que codifican para ambas sondas con código de barras (i y j). Las sondas con código de barras se “regeneran” y pueden experimentar ciclos adicionales en el misma u otro par de dianas moleculares. Tras la terminación de la reacción cíclica, los registros se recopilan, preparan y someten a secuenciación mediante, por ejemplo, técnicas de secuenciación de nueva generación de manera masivamente paralela. Los datos de secuencia representan configuraciones espaciales y, en algunos casos, conectividades/interacciones de dianas moleculares, listos para el análisis estadístico y la reconstrucción de imágenes.

“Desplazamiento de hebra” se refiere al mecanismo por el cual dos hebras de ácido nucleico con secuencias idénticas, cuando están próximas a una hebra de ácido nucleico complementaria individual (o un segmento de una hebra), experimentan una competición relativamente rápida (por ejemplo, escala de tiempo < 1 s) por esa hebra de complemento, ‘"desplazándose” entre sí a partir del complemento supuestamente mediante un mecanismo de “recorrido aleatorio”.

Sondas con código de barras

Las sondas con código de barras de ácido nucleico de la presente divulgación, en algunas realizaciones, comprenden una o más hebras de ácido nucleico dispuestas en una región palindrómica bicatenaria, una región de código de barras bicatenaria y una región de unión a cebador. En algunas realizaciones, las sondas con código de barras están dispuestas para formar una estructura de horquilla, que es un tramo individual de nucleótidos contiguos que se pliega y forma una región bicatenaria, denominada “tallo”, y una región monocatenaria, denominada “bucle”. La región bicatenaria se forma cuando los nucleótidos de dos regiones de la misma base de ácido nucleico se aparean entre sí (apareamiento de bases intramolecular). En la figura 5A se representa un ejemplo de una horquilla de ácido nucleico con código de barras.

Las sondas con código de barras de ácido nucleico de la presente divulgación, en algunas realizaciones, comprenden dos hebras de ácido nucleico paralelas (por ejemplo, como dos ácidos nucleicos independientes o como una horquilla plegada contigua). Una de las hebras se denomina “hebra complementaria” y la otra hebra se denomina “hebra de desplazamiento”. La hebra complementaria contiene normalmente la región de unión a cebador, o al menos un segmento monocatenario de la región de unión a cebador, en la que se une (por ejemplo, se hibrida) el cebador. La hebra complementaria y la hebra de desplazamiento se unen entre sí al menos a través de una región de código de barras bicatenaria y a través de una región palindrómica bicatenaria. La “hebra de desplazamiento” es la hebra que se desplaza inicialmente por un semirregistro recién generado, tal como se describe en el presente documento, y, a su vez, desplaza el semirregistro recién generado a medida que la hebra de desplazamiento “vuelve a unirse” a la hebra complementaria.

Dos ácidos nucleicos o dos regiones de ácido nucleico son “complementarios” entre sí si aparean su bases, o se unen, entre sí para formar una molécula de ácido nucleico bicatenario mediante interacciones de Watson-Crick (también denominado hibridación). Tal como se usa en el presente documento, “unión” se refiere a una asociación entre al menos dos moléculas debido a, por ejemplo, interacciones electrostáticas, hidrófobas, iónicas y/o por enlaces de hidrógeno en condiciones fisiológicas.

Una “región bicatenaria” de un ácido nucleico se refiere a una región de un ácido nucleico (por ejemplo, ADN o ARN) que contiene dos hebras de ácido nucleico paralelas unidas entre sí mediante enlaces de hidrógeno entre purinas complementarias (por ejemplo, adenina y guanina) y pirimidinas (por ejemplo, timina, citosina y uracilo), formando de ese modo una hélice doble. En algunas realizaciones, las dos hebras de ácido nucleico paralelas que forman la región bicatenaria forman parte de una hebra de ácido nucleico contigua. Por ejemplo, tal como se comentó anteriormente, la presente divulgación proporciona sondas con código de barras de ácido nucleico en forma de estructuras de horquilla (por ejemplo, figura 5).

Una “región monocatenaria” de un ácido nucleico se refiere a una región de un ácido nucleico que contiene una única hebra de ácido nucleico, no unida (no apareada con) una segunda hebra de ácido nucleico. Debe entenderse que una sonda con código de barras en forma de una estructura de horquilla contiene tanto una región bicatenaria (una región apareada), denominada “tallo”, y una región monocatenaria (una región no apareada), denominada “bucle”, tal como se comentó anteriormente.

Una “región palindrómica bicatenaria” se refiere a una región de una sonda con código de barras de ácido nucleico (por ejemplo, ADN o ARN) que es la misma secuencia de nucleótidos ya se lea de 5' (cinco prima) a 3' (tres prima) en una hebra o de 5' a 3' en la hebra complementaria con la que forma una hélice doble. Por ejemplo, la siguiente secuencia, mostrada en la figura 5, se considera una secuencia palindrómica: ACCGGT. Por tanto, una región palindrómica bicatenaria que contiene la secuencia anterior se dispone de la siguiente manera:

5'-ACCGGT-3'

3'-TGGCCA-5';

Tal como se muestra en la figura 3A, las secuencias palindrómicas (p*) permiten la unión de sondas con código de barras (e, indirectamente, dianas con código de barras) que están próximas entre sí. La extensión con polimerasa de un cebador unido a la región de unión a cebador produce un “semirregistro”, que se refiere a la hebra de ácido nucleico recién preparada. La generación del semirregistro desplaza una de las hebras de la sonda con código de barras, denominada “hebra de desplazamiento”. Esta hebra de desplazamiento, a su vez, desplaza una porción del semirregistro (al unirse a su “hebra complementaria”), comenzando en el extremo 3', lo que permite que el extremo 3' del semirregistro, que contiene la secuencia palindrómica, se una a otro semirregistro desplazado de manera similar a partir de un ácido nucleico con código de barras próximo.

En algunas realizaciones, una región palindrómica bicatenaria tiene una longitud de 4 a 10 pares de bases de nucleótidos. Es decir, en algunas realizaciones, una región palindrómica bicatenaria puede comprender de 4 a 10 nucleótidos contiguos unidos a de 4 a 10 nucleótidos respectivamente complementarios. Por ejemplo, una región palindrómica bicatenaria puede tener una longitud de 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 pares de bases de nucleótidos. En algunas realizaciones, una región palindrómica bicatenaria puede tener una longitud de 5 a 6 pares de bases de nucleótidos. En algunas realizaciones, la región palindrómica bicatenaria es más larga de 10 pares de bases de nucleótidos. Por ejemplo, la región palindrómica bicatenaria puede tener una longitud de 4 a 50 pares de bases de nucleótidos. En algunas realizaciones, la región palindrómica bicatenaria tiene una longitud de 4 a 40, de 4 a 30 o de 4 a 20 pares de bases de nucleótidos. En algunas realizaciones, la región palindrómica puede reemplazarse por una secuencia arbitraria complementaria a la producida por otra sonda. En tales realizaciones, la sondas podrían aparearse únicamente con sondas que tienen secuencias de extremo 3' complementarias.

Una región palindrómica bicatenaria puede comprender guanina (G), citosina (C), adenina (A) y/o timina (T). En algunas realizaciones, el porcentaje de pares de bases de nucleótidos G y C (G/C) en relación con pares de bases de nucleótidos A y T (A/T) es mayor del 50%. Por ejemplo, el porcentaje de G/C en relación con A/T de una región palindrómica bicatenaria puede ser del 50% al 100%. En algunas realizaciones, el porcentaje de G/C en relación con A/T es mayor del 60%, del 65%, del 70%, del 75%, del 80%, del 85%, del 90%, del 95%.

En algunas realizaciones, una región palindrómica bicatenaria puede incluir un número par de pares de bases de nucleótidos, aunque la región palindrómica bicatenaria de la presente divulgación no está tan limitada. Por ejemplo, una región palindrómica bicatenaria puede incluir 4, 6, 8 ó 10 pares de bases de nucleótidos. Alternativamente, una región palindrómica bicatenaria puede incluir 5, 7 ó 9 pares de bases de nucleótidos.

Entre una pluralidad de sondas con código de barras de ácido nucleico, normalmente, las regiones palindrómicas bicatenarias son las mismas para cada sonda de la pluralidad, de tal manera que cualesquiera dos sondas próximas entre sí pueden unirse entre sí a través de semirregistros generados que contienen la secuencia palindrómica. Sin embargo, en algunas realizaciones, las regiones palindrómicas bicatenarias pueden ser las mismas únicamente entre un subconjunto de sondas con código de barras de la pluralidad, de tal manera que dos subconjuntos diferentes contienen dos regiones palindrómicas bicatenarias diferentes.

Una “región de código de barras bicatenaria” se refiere a una región bicatenaria de una sonda con código de barras de ácido nucleico (por ejemplo, ADN o ARN) que identifica la sonda como perteneciente a una diana molecular o especie de diana molecular particular. Una región de código de barras bicatenaria puede comprender cualquier combinación de nucleótidos en orden aleatorio o diseñado racionalmente. En algunas realizaciones, una región de código de barras bicatenaria tiene una longitud de 2 a 100 pares de bases de nucleótidos. Es decir, en algunas realizaciones, una región de código de barras bicatenaria puede comprender de 2 a 100 nucleótidos contiguos unidos a de 2 a 100 nucleótidos respectivamente complementarios. Por ejemplo, una región de código de barras bicatenaria puede tener una longitud de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 pares de bases de nucleótidos. En algunas realizaciones, una región de código de barras bicatenaria puede tener una longitud de 2 a 5, de 2 a 10, de 2 a 15, de 2 a 20, de 2 a 25, de 2 a 30, de 2 a 35, de 2 a 40, de 2 a 45 o de 2 a 50 pares de bases de nucleótidos. En algunas realizaciones, una región de código de barras bicatenaria puede tener una longitud de 35 a 50, de 35 a 60, de 35 a 70, de 35 a 80, de 35 a 90 o de 35 a 100 pares de bases de nucleótidos. En algunas realizaciones, una región de código de barras bicatenaria es más larga de 100 pares de bases de nucleótidos. Por ejemplo, una región de código de barras bicatenaria puede tener una longitud de 2 a 200 pares de bases de nucleótidos. En algunas realizaciones, una región de código de barras bicatenaria tiene una longitud de 2 a 190, de 2 a 180, de 2 a 170, de 2 a 160, de 2 a 150, de 2 a 140, de 2 a 130, de 2 a 120 o de 2 a 110 pares de bases de nucleótidos.

Una sonda con código de barras de ácido nucleico se considera “única” o “específica” para una diana molecular si la región de código de barras de la sonda está asociada únicamente con esa diana molecular y puede usarse para identificar únicamente esa diana molecular entre una población de moléculas, incluyendo otras dianas moleculares con sus propias sondas con código de barras únicas. De manera similar, una sonda con código de barras de ácido nucleico se considera “única” o “específica” para una especie de diana molecular si la región de código de barras de la sonda está asociada únicamente con la de la diana molecular y puede usarse para identificar únicamente esa especie de diana molecular entre una población de moléculas.

Una “región de unión a cebador” se refiere a una región de una sonda con código de barras de ácido nucleico (por ejemplo, ADN o ARN) en la que un cebador monocatenario (por ejemplo, cebador de ADN o ARN) se une para comenzar la replicación. Una región de unión a cebador puede ser una región monocatenaria o una región parcialmente bicatenaria, que se refiere a una región que contiene tanto un segmento monocatenario como un segmento bicatenario. En la figura 5 se muestra un ejemplo de una región de unión a cebador parcialmente bicatenaria, en la que “a16” indica un segmento monocatenario de la región de unión a cebador y “ax5” indica un segmento bicatenario de la región de unión a cebador. Una región de unión a cebador puede comprender cualquier combinación de nucleótidos en orden aleatorio o diseñado racionalmente. En algunas realizaciones, una región de unión a cebador tiene una longitud de 4 a 40 nucleótidos (o pares de bases de nucleótidos, o una combinación de nucleótidos y pares de bases de nucleótidos, dependiendo de la naturaleza monocatenaria y/o bicatenaria de la región de unión a cebador). Por ejemplo, una región de unión a cebador puede tener una longitud de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ó 40 nucleótidos (y/o pares de bases de nucleótidos). En algunas realizaciones, una región de unión a cebador puede tener una longitud de 4 a 10, de 4 a 15, de 4 a 20, de 4 a 25, de 4 a 30, de 4 a 35 o de 4 a 40 nucleótidos (y/o pares de bases de nucleótidos). En algunas realizaciones, una región de unión a cebador es más larga de 40 nucleótidos. Por ejemplo, una región de unión a cebador puede tener una longitud de 4 a 100 nucleótidos. En algunas realizaciones, una región de unión a cebador tiene una longitud de 4 a 90, de 4 a 80, de 4 a 70, de 4 a 60 o de 4 a 50 nucleótidos.

En algunas realizaciones, una región de unión a cebador se diseña para albergar la unión de más de un cebador (por ejemplo, 2 ó 3 diferentes).

Con referencia de nuevo a la figura 3A y la figura 5, como ejemplo, la extensión de un cebador (unido a un sitio de unión a cebador) mediante una polimerasa de desplazamiento se termina normalmente por la presencia de una molécula o modificación que termina la polimerización. Por tanto, en algunas realizaciones, las sondas con código de barras de ácido nucleico de la presente divulgación comprenden una molécula o modificación que termina la polimerización. Una molécula o modificación que termina la polimerización (“terminador” o “bloqueador”) se ubica normalmente en una región bicatenaria de una sonda con código de barras, adyacente a la región palindrómica bicatenaria, de tal manera que la polimerización termina la extensión del cebador a través de la región palindrómica bicatenaria. Para sondas con código de barras de ácido nucleico dispuestas en forma de una horquilla, una molécula o modificación que termina la polimerización puede estar ubicada entre la región palindrómica bicatenaria y el bucle de horquilla, tal como se muestra en la figura 5 (“espaciador 9”). En algunas realizaciones, la molécula que termina la polimerización es un ligador sintético distinto de ADN, por ejemplo, un espaciador de trietilenglicol, tal como el Int Spacer 9 (iSp9) o Spacer 18 (Integrated DNA Technologies (IDT)). Debe entenderse que puede usarse cualquier ligador no nativo que termine la polimerización mediante una polimerasa, tal como se proporciona en el presente documento. Otros ejemplos no limitativos de tales moléculas y modificaciones incluyen un enlace de tres carbonos (/iSpC3/) (IDT), ACRYDITE™ (IDT), adenilación, azida, digoxigenina (éster de NHS), colesteril-TEG (IDT), I-LINKER™ (IDT) y 3-cianovinilcarbazol (CNVK), y variantes de los mismos. Normalmente, pero no siempre, los ligadores cortos (por ejemplo, iSp9) conducen a tiempo de reacción más rápidos.

En algunas realizaciones, la molécula que termina la polimerización es una secuencia de nucleótidos no natural individual o apareada, tal como iso-dG e iso-dC (IDT), que son variantes químicas de citosina y guanina, respectivamente. Iso-dC apareará sus bases (enlace de hidrógeno) con Iso-dG pero no con dG. De manera similar, Iso-dG apareará sus bases con Iso-dC pero no con dC. Al incorporar estos nucleótidos en un par en lados opuestos de la horquilla, en la posición del terminador, la polimerasa se detendrá, ya que no tiene un nucleótido complementario en disolución para su adición en esa posición.

En algunas realizaciones, la eficiencia de rendimiento de una modificación “terminadora” o “bloqueadora” puede mejorarse reduciendo las concentraciones de dNTP (por ejemplo, desde 200 |im) en una reacción hasta 100 |im, 10 |im, 1 |im o menos.

La inclusión de una molécula o modificación que termina la polimerización a menudo crea una “protuberancia” en una región bicatenaria de una sonda con código de barras (por ejemplo, una región de tallo para estructuras de horquilla) porque la molécula o modificación no está apareada (véase, por ejemplo, la figura 5). Por tanto, en algunas realizaciones, las sondas con código de barras se diseñan para incluir, enfrente de la molécula o modificación, un nucleótido individual (por ejemplo, timina), al menos dos del mismo nucleótido (por ejemplo, un dímero (TT) o trímero (TTT) de timina) o una modificación no natural.

Por tanto, para evitar que la polimerasa extienda un extremo (por ejemplo, un extremo 5' ó 3') de una sonda con código de barras, puede usarse una secuencia de poli-T (por ejemplo, una secuencia de 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9 ó 10 nucleótidos de timina), tal como se muestra, por ejemplo, en la figura 5. Alternativamente, puede añadirse una base sintética (por ejemplo, una dT invertida) u otra modificación a un extremo (por ejemplo, un extremo 5' ó 3') de una sonda con código de barras para evitar la polimerización no deseada de la sonda. Otras moléculas de terminación (moléculas que evitan la extensión de un extremo 3' que no pretende extenderse) incluyen, sin limitación, iso-dG e iso-dC u otros nucleótidos o modificaciones no naturales.

Tal como se comentó anteriormente, la generación de un semirregistro (véase, por ejemplo, la figura 3A) desplaza una de las hebras de la sonda con código de barras. Esta hebra desplazada, a su vez, desplaza una porción del semirregistro, comenzando en el extremo 3'. Este desplazamiento del semirregistro se ve facilitado, en algunas realizaciones, por una “región de desplazamiento bicatenaria” adyacente a la molécula o modificación que termina la polimerización (véase, por ejemplo, la figura 5, “DS6”). En realizaciones en las que la sonda con código de barras tiene una estructura de horquilla, la región de desplazamiento bicatenaria puede estar ubicada entre la molécula o modificación que termina la polimerización y el bucle de horquilla (véase, por ejemplo, la figura 5). Una región de desplazamiento bicatenaria puede comprender cualquier combinación de nucleótidos en orden aleatorio o diseñado racionalmente. En algunas realizaciones, una región de desplazamiento bicatenaria tiene una longitud de 2 a 10 pares de bases de nucleótidos. Por ejemplo, una región de desplazamiento bicatenaria puede tener una longitud de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 pares de bases de nucleótidos. En algunas realizaciones, una región palindrómica bicatenaria puede tener una longitud de 5 a 6 pares de bases de nucleótidos. En algunas realizaciones, una región palindrómica bicatenaria puede contener únicamente una combinación de nucleótidos C y G.

El desplazamiento del semirregistro también puede verse facilitado, en algunas realizaciones, por la modificación de las condiciones de reacción. Por ejemplo, algunas reacciones autocíclicas pueden incluir, en lugar de dNTP naturales solubles para la generación de nuevas hebras, nucleótidos de fosforotioato (2'-desoxinucleósido alfa-tiol, conjunto de trifosfato de 2'-desoxinucleósido alfa-tiol, Trilink Biotechnologies). Estos son menos estables en hibridación que los dNTP naturales y dan como resultado una interacción debilitada entre el semirregistro y el tallo. Pueden usarse en cualquier combinación (por ejemplo, fosforotioato A con bases T, C y G naturales, u otras combinaciones o razones de mezclas). Pueden realizarse otras de tales modificaciones químicas para debilitar el apareamiento del semirregistro y facilitar el desplazamiento.

De manera similar, la propia sonda puede modificarse, en algunas realizaciones, con nucleótidos no naturales que sirven, en su lugar, para fortalecer el tallo de horquilla. En tales realizaciones, la polimerasa de desplazamiento que genera el semirregistro todavía puede abrir y copiar el tallo pero, durante el desplazamiento de hebra, la rehibridación de la secuencia del tallo es energéticamente favorable con respecto a la hibridación del semirregistro con molde de tallo. Los ejemplos no limitativos de nucleótidos no naturales incluyen 5-metil-dC (5-metildesoxicitidina; cuando se sustituye por dC, esta molécula aumenta la temperatura de fusión del ácido nucleico hasta en 5°C por inserción de nucleótido), 2,6-diaminopurina (esta molécula puede aumentar la temperatura de fusión hasta en 1-2°C por inserción), Super T (5-hidroxibutinl-2'-desoxiuridina también aumenta la temperatura de fusión del ácido nucleico) y/o ácidos nucleicos bloqueados (LNA). Pueden producirse en cualquiera o en ambas hebras del tallo de horquilla.

En algunas realizaciones, pueden usarse nucleótidos no naturales para introducir apareamientos erróneos entre la nueva secuencia de semirregistro y el tallo. Por ejemplo, si existía un nucleótido iso-G en la hebra de molde del tallo, una polimerasa, en algunos casos, añadirá por error uno de los nucleótidos solubles disponibles para extender el semirregistro y, al hacerlo, creará una “protuberancia” entre el nuevo semirregistro y la hebra de molde del tallo, muy similar a la protuberancia (incluida en el cebador) de la figura 5A. Tendrá el mismo propósito de debilitar la interacción semirregistro-molde y de fomentar el desplazamiento.

En algunas realizaciones, las sondas con código de barras de ácido nucleico de la presente divulgación están dispuestas para formar una estructura de horquilla, que es un tramo individual de nucleótidos contiguos que se pliega y forma una región bicatenaria, denominada “tallo”, y una región monocatenaria, denominada “bucle”. En algunas realizaciones, la región de bucle monocatenaria tiene una longitud de 3 a 50 nucleótidos. Por ejemplo, la región de bucle monocatenaria puede tener una longitud de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 nucleótidos. En algunas realizaciones, la región de bucle monocatenaria tiene una longitud de 3 a 10, de 3 a 15, de 3 a 20, de 3 a 25, de 3 a 30, de 3 a 35, de 3 a 40, de 3 a 45 o de 3 a 50 nucleótidos. En algunas realizaciones, la región de bucle monocatenaria es más larga de 50 nucleótidos. Por ejemplo, la región de bucle monocatenaria puede tener una longitud de 3 a 200 nucleótidos. En algunas realizaciones, la región de bucle monocatenaria tiene una longitud de 3 a 175, de 3 a 150, de 3 a 100 o de 3 a 75 nucleótidos. En algunas realizaciones, una región de bucle incluye regiones más pequeñas de apareamiento de bases intramolecular. Un bucle de horquilla, en algunas realizaciones, permite flexibilidad en la orientación de la sonda con código de barras en relación con un resto de unión a diana. Es decir, el bucle permite normalmente que la sonda con código de barras ocupe una variedad de posiciones y ángulos con respecto al resto de unión a diana, permitiendo de ese modo interacciones con una multitud de sondas cercanas (por ejemplo, unidas a otras dianas) en sucesión.

Las sondas con código de barras de ácido nucleico de la presente divulgación se unen normalmente a una diana molecular a través de un resto de unión a diana. En algunas realizaciones, el resto de unión a diana se une a un extremo de la sonda con código de barras (por ejemplo, el extremo distal a la región de unión a cebador). En algunas realizaciones, el resto de unión a diana se une a la región de bucle monocatenaria de una sonda con código de barras dispuesta en forma de una horquilla (véase, por ejemplo, la figura 5).

Los ejemplos de restos de unión a diana para su uso tal como se proporcionan en el presente documento incluyen, sin limitación, biotina, anticuerpos, aptámeros, nanocuerpos, ácidos nucleicos, fármacos (por ejemplo, fármacos de molécula pequeña) y átomos (por ejemplo, Li). Se contemplan otras moléculas de direccionamiento. En algunas realizaciones, una diana molecular puede unirse a una sonda con código de barras a través de hibridación o “química clic”. Véanse, por ejemplo, Kolb H.C., et al. Angewandte Chemie International Edition 2001, 40 (11): 2004 2021; y Evans R.A. Australian Journal of Chemistry, 2007, 60 (6): 384-395.

Las sondas con código de barras de ácido nucleico de la presente divulgación, en algunas realizaciones, comprenden al menos un nucleótido de ácido nucleico bloqueado (LNA) u otra base modificada. Los pares de LNA, u otras bases modificadas, pueden servir como pares de bases más fuertes (o más débiles) en regiones bicatenarias de sondas con código de barras, sesgando de ese modo la reacción de desplazamiento de hebra. En algunas realizaciones, al menos una molécula de LNA se ubica en una hebra complementaria de una sonda con código de barras, entre una región de código de barras bicatenaria y una región de unión a cebador monocatenaria.

Las sondas con código de barras de ácido nucleico de la presente divulgación, en algunas realizaciones, se unen a una diana molecular. Una “diana molecular” es cualquier molécula que sea desea observar o cuantificar. Los ejemplos de dianas moleculares incluyen, sin limitación, proteínas, sacáridos (por ejemplo, polisacáridos), lípidos, ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN, ARN, microARN) y moléculas pequeñas. La diana molecular puede ser ADN o ARN. En algunas realizaciones, la diana molecular son moléculas de interferencia por ARN, tales como ARN de interferencia pequeños (ARNip) o micro ARN (microARN). En algunas realizaciones, la diana molecular son moléculas antisentido, tales como oligonucleótidos antisentido (ASO) sintéticos de ADN.

En algunas realizaciones, una diana molecular es una biomolécula. Tal como se usa en el presente documento, una “biomolécula” es cualquier molécula que se produce por un organismo vivo, incluyendo macromoléculas grandes tales como proteínas, polisacáridos, lípidos y ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN y ARN tal como ARNm), así como moléculas pequeñas tales como metabolitos primarios, metabolitos secundarios y productos naturales. Los ejemplos de dianas moleculares, específicamente biomoléculas, incluyen, sin limitación, ADN, ARN, ADNc o el producto de ADN del ARN sometido a transcripción inversa, A23187 (calcimicina, ionóforo de calcio), abamectina, ácido abiético, ácido acético, acetilcolina, actina, actinomicina D, adenosina, difosfato de adenosina (ADP), monofosfato de adenosina (AMP), trifosfato de adenosina (ATP), adenilato ciclasa, adonitol, adrenalina, epinefrina, hormona adrenocorticotrópica (ACTH), aequorina, aflatoxina, agar, alameticina, alanina, albúminas, aldosterona, aleurona, alfa-amanitina, alantoína, aletrina, a-amanatina, aminoácido, amilasa, esteroide anabólico, anetol, angiotensinógeno, anisomicina, hormona antidiurética (ADH), arabinosa, arginina, ascomicina, ácido ascórbico (vitamina C), asparagina, ácido aspártico, dimetilarginina asimétrica, péptido natriurético atrial (ANP), auxina, avidina, azadiractina A - C³⁵H⁴⁴O¹⁶, bacteriocina, beauvericina, bicuculina, bilirrubina, biopolímero, biotina (vitamina H), brefeldina A, brassinolida, brucina, cadaverina, cafeína, calciferol (vitamina D), calcitonina, calmodulina, calmodulina, calreticulina, alcanfor -(C¹⁰H¹⁶O), cannabinol, capsaicina, carbohidrasa, hidrato de carbono, carnitina, carragenano, caseína, caspasa, celulasa, celulosa -(C⁶H¹⁰O⁵), cerulenina, bromuro de cetrimonio (cetrimida) - C^1gH⁴²BrN, queleritrina, cromomicina A3, chaperonina, quitina, a-cloralosa, clorofila, colecistoquinina (CCK), colesterol, colina, sulfato de condroitina, cinamaldehído, citral, ácido cítrico, citrinina, citronelal, citronelol, citrulina, cobalamina (vitamina B12), coenzima, coenzima Q, colquicina, colágeno, coniína, corticosteroide, corticosterona, hormona de liberación de corticotropina (CRH), cortisol, creatina, creatina cinasa, cristalina, a-ciclodextrina, ciclodextrina glicosiltransferasa, ciclopamina, ácido ciclopiazónico, cisteína, cistina, citidina, citocalasina, citocalasina E, citocromo, citocromo c, citocromo c oxidasa, citocromo c peroxidasa, citocina, citosina - C⁴H⁵N³O, ácido desoxicólico, DON (desoxinivalenol), desoxirribofuranosa, desoxirribosa, ácido desoxirribonucleico (ADN), dextrano, dextrina, ADN, dopamina, enzima, efedrina, epinefrina - C⁹H¹³NO³, ácido erúcico - CH³(CH²)⁷CH=CH(CH²)ⁿCOOH, eritritol, eritropoyetina (EPO), estradiol, eugenol, ácido graso, fibrina, fibronectina, ácido fólico (vitamina M), hormona estimulante de folículos (FSH), formaldehído, ácido fórmico, formnoci, fructosa, fumonisina B1, gamma-globulina, galactosa, gamma-globulina, ácido gamma-aminobutírico, gamma-butirolactona, gamma-hidroxibutirato (GHB), gastrina, gelatina, geraniol, globulina, glucagón, glucosamina, glucosa - C⁶H¹²O⁶, glucosa oxidasa, gluten, ácido glutámico, glutamina, glutatión, gluten, glicerina (glicerol), glicina, glicógeno, ácido glicólico, glicoproteína (por ejemplo, enzimas de glicoproteínas tales como antígeno prostático específico (PSA)), hormona de liberación de gonadotropina (GnRH), granzima, proteína fluorescente verde, hormona del crecimiento, hormona de liberación de la hormona del crecimiento (GHRH), GTPasa, guanina, guanosina, trifosfato de guanosina (+GTP), haptoglobina, hematoxilina, hemo, hemeritrina, hemocianina, hemoglobina, hemoproteína, sulfato de heparano, lipoproteína de alta densidad, HDL, histamina, histidina, histona, histona metiltransferasa, antígeno HLA, homocisteína, hormona, gonadotropina coriónica humana (hCG), hormona del crecimiento humana, hialuronato, hialuronidasa, peróxido de hidrógeno, 5-hidroximetilcitosina, hidroxiprolina, 5-hidroxitriptamina, colorante índigo, indol, inosina, inositol, insulina, factor de crecimiento similar a la insulina, proteína integral de membrana, integrasa, integrina, inteína, interferón, inulina, ionomicina, ionona, isoleucina, agrupación de hierro-azufre, K252a, K252b, KT5720, KT5823, queratina, cinasa, lactasa, ácido láctico, lactosa, lanolina, ácido láurico, leptina, leptomicina B, leucina, lignina, limoneno, linalol, ácido linoleico, ácido linolénico, lipasa, lípido, proteína anclada a lípidos, lipoamida, lipoproteína, lipoproteína de baja densidad, LDL, hormona luteinizante (LH), licopeno, lisina, lisozima, ácido málico, maltosa, melatonina, proteína de membrana, metaloproteína, metalotioneína, metionina, mimosina, mitramicina A, mitomicina C, monómero, ácido micofenólico, mioglobina, miosina, fenoles naturales, ácido nucleico, ocratoxina A, estrógenos, oligopéptido, oligomicina, orcina, orexina, ornitina, ácido oxálico, oxidasa, oxitocina, p53, PABA, paclitaxel, ácido palmítico, ácido pantoténico (vitamina B5), hormona paratiroidea (PTH), paraproteína, pardaxina, partenolida, patulina, paxilina, ácido penicílico, penicilina, penitrem A, peptidasa, pepsina, péptido, perimicina, proteína periférica de membrana, perosamina, fenetilamina, fenilalanina, fosfágeno, fosfatasa, fosfolípido, fenilalanina, ácido fítico, hormonas vegetales, polipéptido, polifenoles, polisacáridos, porfirina, prion, progesterona, prolactina (PRL), prolina, ácido propiónico, protamina, proteasa, proteína, proteinoide, putrescina, piretrina, piridoxina o piridoxamina (vitamina B6), pirrolisina, ácido pirúvico, quinona, radicicol, rafinosa, renina, retineno, retinol (vitamina A), rodopsina (púrpura visual), riboflavina (vitamina B2), ribofuranosa, ribosa, ribozima, ricina, ARN - ácido ribonucleico, RuBisCO, safrol, salicilaldehído, ácido salicílico, salvinorina A - C²³H²⁸O⁸, saponina, secretina, selenocisteína, selenometionina, selenoproteína, serina, serina cinasa, serotonina, escatol, partícula de reconocimiento de señal, somatostatian, ácido sórbico, escualeno, estaurosporina, ácido esteárico, esterigmatocistina, esterol, estricnina, sacarosa (azúcar), azúcares (en general), superóxido, toxina T2, ácido tánico, tanino, ácido tartárico, taurina, tetrodotoxina, taumatina, topoisomerasa, tirosina cinasa, taurina, testosterona, tetrahidrocannabinol (THC), tetrodotoxina, tapsigargina, taumatina, tiamina (vitamina B1) - C^H^Cl^OS^HCl, treonina, trombopoyetina, timidina, timina, triacsina C, hormona estimulante de la tiroides (TSH), hormona de liberación de tirotropina (TRH), tiroxina (T4), tocoferol (vitamina E), topoisomerasa, triyodotironina (T3), receptor transmembrana, tricostatina A, hormona trófica, tripsina, triptófano, tubulina, tunicamicina, tirosina, ubiquitina, uracilo, urea, ureasa, ácido úrico - C⁵H⁴N⁴O³, uridina, valina, valinomicina, vanabina, vasopresina, verruculógeno, vitaminas (en general), vitamina A (retinol), vitamina B, vitamina B1 (tiamina), vitamina B2 (riboflavina), vitamina B3 (niacina o ácido nicotínico), vitamina B4 (adenina), vitamina B5 (ácido pantoténico), vitamina B6 (piridoxina o piridoxamina), vitamina B12 (cobalamina), vitamina C (ácido ascorbico), vitamina D (calciferol), vitamina E (tocoferol), vitamina F, vitamina H (biotina), vitamina K (naftoquinona), vitamina M (ácido fólico), wortmanina y xilosa.

En algunas realizaciones, una diana molecular es una diana proteica tal como, por ejemplo, proteínas de un entorno celular (por ejemplo, proteínas intracelulares o de membrana). Los ejemplos de proteínas incluyen, sin limitación, proteínas fibrosas tales como proteínas citoesqueléticas (por ejemplo, actina, arp2/3, coronina, distrofina, FtsZ, queratina, miosina, nebulina, espectrina, tau, titina, tropomiosina, tubulina y colágeno) y proteínas de la matriz extracelular (por ejemplo, colágeno, elastina, F-espondina, pikachurina y fibronectina); proteínas globulares tales como proteínas plasmáticas (por ejemplo, componente amiloide P sérico y albúmina sérica), factores de coagulación (por ejemplo, proteínas del complemento, inhibidor C1 y convertasa C3, factor VIII, factor XIII, fibrina, proteína C, proteína S, proteína Z, inhibidor de proteasa relacionado con la proteína Z, trombina, factor de von Willebrand) y proteínas de fase aguda tales como proteína C reactiva; hemoproteínas; proteínas de adhesión celular (por ejemplo, cadherina, ependimina, integrina, Ncam y selectian); proteínas de transporte transmembrana (por ejemplo, CFTR, glicoforina D y escramblasa) tales como los canales iónicos (por ejemplo, canales iónicos dependientes del ligando tales como receptores nicotínicos de acetilcolina y receptores GABAa, y canales iónicos dependientes del voltaje tales como los canales de potasio, calcio y sodio), proteínas de simporte/antiporte (por ejemplo, transportador de glucosa); hormonas y factores de crecimiento (por ejemplo, factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), hormonas peptídicas tales como insulina, factor de crecimiento similar a la insulina y oxitocina, y hormonas esteroideas tales como andrógenos, estrógenos y progesteronas); receptores tales como receptores transmembrana (por ejemplo, receptor acoplado a proteína G, rodopsina) y receptores intracelulares (por ejemplo, receptor de estrógenos); proteínas de unión a ADN (por ejemplo, histonas, protaminas, proteína CI); reguladores de la transcripción (por ejemplo, c-myc, FOXP2, FOXP3, MyoD y P53); proteínas del sistema inmunitario (por ejemplo, inmunoglobulinas, antígenos principales de histocompatibilidad y receptores de células T); proteínas de almacenamiento/transporte de nutrientes (por ejemplo, ferritina); proteínas chaperonas; y enzimas.

En algunas realizaciones, la proteína diana es el antígeno prostético específico (PSA). El PSA (también denominado gamma-seminoproteína o calicreína-3) es un glicoproteína codificada en humanos por el gen KLK3. El PSA es un miembro de la familia de peptidasas relacionadas con calicreína y se secreta por las células epiteliales de la próstata.

Las sondas con código de barras de ácido nucleico de la presente divulgación pueden ser ADN, tal como ADN en forma D y ADN en forma L, y ARN, así como diversas modificaciones de los mismos. Las modificaciones de ácido nucleico incluyen modificaciones de bases, modificaciones de azúcares y modificaciones de la estructura principal. A continuación se proporcionan ejemplos no limitativos de tales modificaciones.

Los ejemplos de ácidos nucleicos modificados (por ejemplo, variantes de ADN) que pueden usarse según la presente divulgación incluyen, sin limitación, L-ADN (el enantiómero de la estructura principal del ADN, conocido en la bibliografía), ácidos nucleicos peptídicos (PNA), pinza de bisPNA, un PNA pseudocomplementario, ácido nucleico bloqueado (LNA) y co-écidos nucleicos de los anteriores, tales como co-écidos nucleicos de ADN-LNA. Por tanto, la presente divulgación contempla nanoestructuras que comprenden ADN, ARN, LNA, PNA o combinaciones de los mismos. Debe entenderse que los ácidos nucleicos usados en los métodos y las composiciones de la presente divulgación pueden ser de naturaleza homogénea o heterogénea. Como ejemplo, los ácidos nucleicos pueden ser completamente de naturaleza ADN o pueden estar compuestos por monómeros o secuencias de ADN y distintas de ADN (por ejemplo, LNA). Por tanto, puede usarse cualquier combinación de elementos de ácido nucleico. La modificación de ácido nucleico puede hacer que el ácido nucleico sea más estable y/o menos susceptible a la degradación en determinadas condiciones. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los ácidos nucleicos son resistentes a nucleasas.

En el presente documento también se proporcionan pluralidades de sondas con código de barras de ácido nucleico. Una “pluralidad” comprende al menos dos sondas con código de barras de ácido nucleico. En algunas realizaciones, una pluralidad comprende de 2 a 2 millones de sondas con código de barras de ácido nucleico (por ejemplo, sondas con código de barras únicas). Por ejemplo, una pluralidad puede comprender 100, 500, 1000, 5000, I ⁰⁰O⁰, 100000, 1000000 o más sondas con código de barras de ácido nucleico. La presente divulgación no está limitada en este aspecto.

En el presente documento también se proporcionan pares de sondas con código de barras de ácido nucleico. Se pretende que tales pares se usen en combinación entre sí para detectar asociaciones y disposiciones espaciales de dianas moleculares. En algunas realizaciones, un par de sondas con código de barras de ácido nucleico comprende (a) una primera sonda con código de barras de ácido nucleico dispuesta en (i) una región de código de barras bicatenaria y (ii) una región de unión a cebador (por ejemplo, una región de unión a cebador monocatenaria), denominada por simplicidad “la primera sonda”, y (b) una segunda sonda con código de barras monocatenaria que comprende una región de código de barras y una región de cebador complementaria a la región de unión a cebador monocatenaria, denominada “la segunda sonda” (véase, por ejemplo, la figura 10A). Cada sonda se une a una diana molecular a través de un resto de unión a diana. En una reacción de obtención de imágenes sin microscopio que contiene el par de sondas con código de barras anterior, las regiones palindrómicas son innecesarias porque la segunda sonda (la sonda monocatenaria) incluye un cebador que se une directamente a la región de unión a cebador de la primera sonda. Tal como se muestra en el ejemplo representado en la figura 10A, la segunda sonda con código de barras contiene un cebador en un extremo (por ejemplo, extremo 3' y/o distal al extremo que se une a una diana molecular) que es complementario a y se une a la región de unión a cebador de la primera sonda. Una vez unido a la región de unión a cebador de la primera sonda, el cebador de la segunda sonda se polimeriza a través de la región de código de barras de la primera sonda, generando de ese modo un registro de su asociación con la primera sonda (la segunda sonda ahora contiene dos códigos de barras diferentes). La hebra de desplazamiento de la primera sonda (que se desplazó durante la polimerización del cebador) desplaza parcialmente la segunda sonda cuando “vuelve a unirse” a su hebra complementaria en la primera sonda. Entonces se disocia espontáneamente la segunda sonda parcialmente desplazada a partir de la primera sonda. La segundo sonda, que ahora contiene un registro de su asociación con la primera sonda, es libre de unirse a otra sonda y “registrar” esa segunda asociación (véase, por ejemplo, la figura 10A).

En general, cualesquiera dos sondas con código de barras pueden unirse respectivamente a dos dianas moleculares. En algunas realizaciones, sin embargo, dos sondas con código de barras pueden unirse a diferentes epítopos de la misma diana molecular (por ejemplo, una proteína tal como un anticuerpo), por ejemplo, para generar registros que representan la presencia de esa diana molecular en disolución (se crean muchas copias del mismo registro cuando dos de tales sondas con código de barras están próximas entre sí) (véase, por ejemplo, la figura 18). En algunas realizaciones, esto permite el “recuento” digital del número de moléculas diana en disolución.

La figura 18 muestra un ejemplo en el que se incorporan secuencias de ADN generadas de manera autocíclica notifican la localización conjunta de anticuerpos a nivel de molécula individual. Específicamente, secuencias de código de barras aleatorias (en esta figura particular denominadas identificadores moleculares únicos (UMI) para la molécula de anticuerpo (Ac) individual y códigos de barras para los diferentes tipos de Ac) en sondas de horquilla de ADN unidas a Ab. Después de que los pares de Ac se localizan conjuntamente en su diana, los pares de cebadores con UMI y códigos de barras de muestra unen cada sonda de horquilla en la proyección 3' respectivamente. La polimerasa extiende los cebadores hasta un sitio “terminador” sintético, copiando el UMI del Ac (1, 2) y el código de barras del Ac. Después se liberan parcialmente los cebadores extendidos a partir de las horquillas mediante desplazamiento de hebra y aparean sus segmentos 3' de código de barras de Ac (únicos para la proteína diana). Estas secuencias se extienden de nuevo, liberando hebras indicadoras que portan ambos UMI del Ac (1 y 2) y un UMI del cebador (1). Por tanto, las sondas de horquilla se regeneran a su estado inicial y experimentan ciclos adicionales, generando hebras indicadoras que portan el mimo par de UMI del Ac (1 y 2) pero un UMI del cebador diferente (de 2 a n) en cada ciclo. En cambio, si el par de anticuerpos se encuentra aleatoriamente en la disolución a granel, en lugar de localizarse conjuntamente en una diana, sólo generarían hebras indicadoras una vez con un UMI del cebador para cada par de UMI del Ac. Por tanto, la señal generada por el acontecimiento real de localización conjunta se lee individualmente sometiendo a secuenciación las hebras indicadoras, y las hebras indicadoras de fondo pueden descartarse fácilmente leyendo el UMI del cebador en cada par de UMI del Ac. Esta característica posibilita la detección de una molécula de proteína individual, y el ensayo puede aumentarse de escala usando, por ejemplo, tecnologías de secuenciación de nueva generación.

Sistemas y métodos

Los sistemas de obtención de imágenes sin microscopio, tal como se proporcionan en el presente documento, comprenden sondas con código de barras de ácido nucleico, cebadores diseñados para unirse a esas sondas y polimerasa de desplazamiento.

Un “cebador” es un ácido nucleico monocatenario que sirve como punto de inicio para la síntesis de ácidos nucleicos. Una polimerasa añade nucleótidos a un cebador para generar una nueva hebra de ácido nucleico. Los cebadores de la presente divulgación se diseñan para ser complementarios a y unirse a la región de unión a cebador de una sonda con código de barras de ácido nucleico. Por tanto, la longitud y composición del cebador (por ejemplo, composición de nucleótidos) depende, al menos en parte, de la longitud y composición de una región de unión a cebador de una sonda con código de barras. En algunas realizaciones, un cebador tiene una longitud de 4 a 40 nucleótidos. Por ejemplo, un cebador puede tener una longitud de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ó 40 nucleótidos. En algunas realizaciones, un cebador puede tener una longitud de 4 a 10, de 4 a 15, de 4 a 20, de 4 a 25, de 4 a 30, de 4 a 35 o de 4 a 40 nucleótidos.

Los cebadores pueden existir unidos en pares u otras combinaciones (por ejemplo, tripletes o más, en cualquier geometría) con el fin de, por ejemplo, restringir la unión de la sonda con respecto a aquellos que cumplen con sus criterios geométricos (véase, por ejemplo, la figura 12). El enlace bicatenario rígido mostrado cumple tanto con una distancia mínima como con una máxima entre sondas con código de barras. El dominio “líder” bicatenario puede tener cualquier longitud (por ejemplo, de 2 a 100 nucleótidos, o más) y puede incluir opcionalmente un propio código de barras que une las dos mitades por contenido de información, en caso de que se separen durante el procesamiento. En algunas realizaciones, un dominio líder bicatenario, que cumple con una distancia típica entre sondas a la que pueden generarse los registros, es una estructura compleja, tal como un haz de hélices de 2, 3 ó 4 ADN, una nanoestructura de ADN, tal como una estructura de origami de ADN, u otra estructura que añade o modifica la tiesura/rigidez del líder.

Una “polimerasa de desplazamiento de hebra” se refiere a una polimerasa que es capaz de desplazar aguas abajo un ácido nucleico (por ejemplo, ADN) encontrado durante la síntesis de ácidos nucleicos. Polimerasas diferentes pueden tener grados variables de actividad de desplazamiento. Los ejemplos de polimerasas de desplazamiento de hebra incluyen, sin limitación, polimerasa de fragmento grande de Bst (por ejemplo, New England Biolabs (NEB) #M0275), polimerasa phi 29 (por ejemplo, NEB #M0269), polimerasa Deep VentR, polimerasa de fragmento de Klenow y polimerasa Taq modificada. Se contemplan otras polimerasas de desplazamiento de hebra.

En algunas realizaciones, un cebador comprende al menos un apareamiento erróneo de nucleótidos en relación con la región de unión a cebador monocatenaria. Un apareamiento erróneo de este tipo puede usarse para facilitar el desplazamiento de un semirregistro a partir de la hebra complementaria de una sonda con código de barras (véase, por ejemplo, la figura 9D). En algunas realizaciones, un cebador comprende al menos un ligador artificial.

La “tasa de ciclado” de una reacción de obtención de imágenes sin microscopio, tal como se proporciona en el presente documento, se refiere a la tasa a la que se produce un registro completo (en oposición a un semirregistro), que resulta de la interacción cíclica de dos dianas moleculares con código de barras próximas. En algunas realizaciones, un cebador que comprende un apareamiento erróneo o un ligador artificial aumenta la tasa de ciclado en de 5 veces a 10 veces, o más.

En algunas realizaciones, los sistemas de obtención de imágenes sin microscopio de la presente divulgación comprenden además una hebra de ácido nucleico auxiliar que es parcialmente complementaria a la región de unión a cebador monocatenaria, es parcialmente complementaria a una región monocatenaria adyacente a la región de unión a cebador y se une de manera transitoria a la región monocatenaria adyacente a la región de unión a cebador (véase, por ejemplo, la figura 9F). Una “hebra auxiliar” permite el inicio de la polimerización mediante la polimerasa al tiempo que también permite la presencia de un apareamiento erróneo, tal como se describió anteriormente. En algunas realizaciones, una hebra auxiliar tiene una longitud de 3 a 20 nucleótidos. Por ejemplo, una hebra auxiliar puede tener una longitud de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 nucleótidos.

En el presente documento se proporcionan métodos para detectar interacciones de dianas moleculares (por ejemplo, unas con otras). En algunas realizaciones, los métodos comprenden las etapas de (a) poner en contacto, con al menos una (por ejemplo, una pluralidad) de las sondas con código de barras de ácido nucleico tal como se proporcionan en el presente documento, una muestra que contiene al menos una diana molecular, un cebador complementario a una región de unión a cebador monocatenaria de una sonda de la pluralidad y una polimerasa de desplazamiento de hebra, y (b) incubar la muestra en condiciones que permitan la producción de registros con código de barras.

En algunas realizaciones, los métodos comprenden las etapas de poner en contacto, con un par de sondas con código de barras de ácido nucleico tal como se proporcionan en el presente documento, una muestra que contiene al menos dos dianas moleculares y una polimerasa de desplazamiento de hebra, y (b) incubar la muestra en condiciones que permitan la producción de registros con código de barras (por ejemplo, en condiciones que permitan la replicación de ácidos nucleicos).

Una “muestra” puede comprender células (o una célula), tejido o líquido corporal tal como sangre (suero y/o plasma), orina, semen, líquido linfático, líquido cefalorraquídeo o líquido amniótico. Una muestra puede obtenerse a partir de (o derivarse de) cualquier fuente, incluyendo, sin limitación, humanos, animales, bacterias, virus, microbios y plantas. En algunas realizaciones, una muestra es un lisado celular o un lisado tisular. Una muestra también puede contener mezclas de material a partir de una fuente o fuentes diferentes. Una muestra puede ser un área o volumen espacial (por ejemplo, una rejilla en una matriz o un pocillo en una placa).

En algunas realizaciones, una muestra es una célula individual, tal como una célula rara. Los ejemplos de una células rara incluyen, sin limitación, células tumorales circulantes, células madre y progenitoras epiteliales, células mesenquimatosas y células fetales, por ejemplo, que circulan en el torrente sanguíneo.

“Condiciones que permiten la producción de registros con código de barras” pueden ser condiciones fisiológicas (por ejemplo, una temperatura de 20-40 grados centígrados, presión atmosférica de 1 y/o un valor de pH de 6-8).

En algunas realizaciones, la etapa (b) se realiza a una temperatura de 20 a 40 grados centígrados (°C). Por ejemplo, la etapa (b) puede realizarse a una temperatura de 20°C, 21°C, 22°C, 23°C, 24°C, 25°C, 26°C, 27°C, 28°C, 29°C, 31°C, 32°C, 33°C, 34°C, 35°C, 36°C, 37°C, 38°C, 39°C o 40°C.

En algunas realizaciones, la etapa (b) se realiza durante un tiempo de 10 minutos (min) a 24 horas, o más. Por ejemplo, la etapa (b) puede realizarse durante un tiempo de 10 min a 3 horas (h), de 10 min a 12 h, de 10 min a 18 h o de 10 min a 24 h. En algunas realizaciones, la etapa (b) se realiza durante un tiempo de 10 min, 15 min, 20 min, 25 min, 30 min, 35 min, 40 min, 45 min, 50 min, 55 min, 60 min, 65 min, 70 min, 75 min, 80 min, 85 min, 90 min, 95 min, 100 min, 105 min, 110 min, 115 min, 120 min, 125 min, 130 min, 135 min, 140 min, 145 min, 150 min, 155 min, 160 min, 165 min, 170 min, 175 min o 180 min.

La reacción de obtención de imágenes sin microscopio puede tener, en algunas realizaciones, una concentración de sales de Mg 0,25-15 mM y/o Na 50-250 mM.

La reacción de obtención de imágenes sin microscopio puede tener, en algunas realizaciones, concentraciones de dNTP de 0,05-5 mM (por ejemplo, 0,05 mM, 0,10 mM, 0,15 mM, 0,20 mM, 0,25 mM, 0,30 mM, 0,35 mM, 0,40 mM, 0,45 mM, 0,50 mM, 1,0 mM, 1,5 mM, 2,0 mM, 2,5 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM o 5,0 mM).

Los tampones que pueden usarse en la reacción de obtención de imágenes sin microscopio incluyen, sin limitación, tampón “Thermo-Pol” (New England Biolabs), solución salina tamponada con fosfato (con o sin complementación de Mg o Na), cualquier medio celular preparado en el laboratorio o comercial, agua o cualquier disolución con pH tamponado complementada con sales catiónicas suficientes para la hibridación del ADN y la actividad de la polimerasa.

En algunas realizaciones, la tasa de ciclado de una reacción de obtención de imágenes sin microscopio, tal como se proporciona en el presente documento, es de 1 registro completo por 10 minutos por par de sondas, pero puede ser tan rápida como de 1 registro completo por segundo o tan lenta como de 1 registro completo por 10 horas en determinadas condiciones (por ejemplo, más restrictivas).

Al final del “ciclo” de obtención de imágenes sin microscopio, se producen registros de ácido nucleico (denominados simplemente en el presente documento “registros”) de la configuración espacial de dianas con código de barras (véase, por ejemplo, la figura 3A). En algunas realizaciones, los registros son bicatenario. En algunas realizaciones, los registros son monocatenario. La longitud de los registros puede variar. Por ejemplo, un registro con código de barras puede tener una longitud de 30 a 500 nucleótidos (o pares de bases de nucleótidos). En algunas realizaciones, un registro con código de barras tiene una longitud de 30 a 100, de 30 a 200, de 30 a 300, de 30 a 400, de 50 a 100, de 50 a 200, de 50 a 300, de 50 a 400 o de 50 a 500 nucleótidos (o pares de bases de nucleótidos). En algunas realizaciones, un registro con código de barras tiene una longitud de 80 a 100 nucleótidos (o pares de bases de nucleótidos), o 90 nucleótidos (o pares de bases de nucleótidos).

Los registros pueden “liberarse” a partir de las sondas mediante mecanismos mediados por polimerasa o mediante liberación espontánea de un cebador extendido a partir de la región de unión a cebador en una sonda. En algunas realizaciones, tal como se muestra en la figura 14, el extremo 3' de un cebador extendido puede modificarse por ingeniería para plegarse sobre sí mismo y extenderse fuera de la sonda. Dado que los sistemas de obtención de imágenes sin microscopio de la presente divulgación normalmente no copian el código de barras apareado en la misma hebra de registro, puede añadirse un código de barras adicional a un cebador similar al líder que une pares de registros juntos en contenido de información.

Una vez generados los registros con código de barras, se recopilan y, en algunas realizaciones, se purifican. Por ejemplo, los registros pueden recopilarse en el sobrenadante de la reacción o recopilando todo el contenido del recipiente de reacción. La preparación adicional de los registros para la secuenciación puede ser específica de la plataforma de secuenciación. Es posible que algunas plataformas no requieran una preparación adicional pero, a menudo, los registros deben tener una combinación de (1) un “adaptador” específico de secuenciación u otros oligonucleótidos añadidos a sus extremos, (2) experimentar reacciones de “amplificación” (por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa (PCR)) en la que se producen copias idénticas o prácticamente idénticas (por ejemplo, el 99%, el 98%, el 95%, el 90%, el 80% idénticas) de los registros (con o sin secuencias de “adaptador”) y (3) purificación a partir de otras secuencias, proteínas o componentes de reacción que pueden interferir con la preparación o secuenciación. Por ejemplo, las secuencias de adaptador pueden ligarse a los registros usando una técnica de “adición de cola de nucleótidos A” habitual, seguido de purificación mediante electroforesis en gel y finalmente amplificación por PCR. Alternativamente, algunas realizaciones pueden permitir directamente la amplificación por PCR de los registros, posiblemente añadiendo secuencias de adaptador a través de cebadores de ADN largos, o seguido de ligación de adaptadores y purificación en gel.

En algunas realizaciones, pueden usarse dos o más tipos de cebadores de registro para facilitar, por ejemplo, la posterior amplificación por PCR o preparación para la secuenciación. Cada cebador puede tener la misma secuencia de unión a sonda, pero variar en una secuencia 5' adicional no implicada en la reacción de registro. En el caso de dos tipos de cebadores, un promedio de la mitad de todos los registros resultantes tendrá diferentes extremos 5' y 3' no complementarios. Estos pueden usarse para la amplificación adicional (por ejemplo, permitiendo que los extremos se hibriden más fácilmente con cebadores de PCR solubles en lugar de formar un tallo de horquilla), la ligación u otro procesamiento. Si se usan diez tipos de tales cebadores de registro, por ejemplo, entonces un promedio del 90% de todos los registros tendrán diferentes extremos 5' y 3' no complementarios, facilitando de ese modo la amplificación y el procesamiento específicos de extremo.

En algunas realizaciones, los registros con código de barras se “decodifican” por observación directa mediante electroforesis en gel o amplificación y cuantificación por PCR (véase, por ejemplo, la figura 19C). Este ejemplo se basa en la amplificación específica de registros particulares basándose en diferentes secuencias en sus códigos de barras o cebadores de registro. La presente divulgación también abarca la secuenciación de manera masivamente paralela, y puede usarse para decodificar disposiciones moleculares individuales precisas en sistemas grandes (véase, por ejemplo, la figura 3F).

Después se someten a secuenciación los registros con código de barras recopilados. En algunas realizaciones, los registros se someten a secuenciación usando tecnologías de secuenciación de nueva generación. En algunas realizaciones, se usa secuenciación de Sanger así como tecnologías de “secuenciación posteriores a la nueva generación” en desarrollo, tales como secuenciación basada en “nanoporos” (por ejemplo, Oxford Nanopore Technologies, nanoporetech.com). En un sistema simplificado, por ejemplo, pueden usarse geles electroforéticos para detectar combinaciones de códigos de barras dentro de un registro mediante diferenciación por la longitud del registro producido (véase, por ejemplo, la figura 3b), o puede usarse microscopía de resolución convencional o de superresolución para detectar visualmente secuencias de sondas mediante hibridación de fluorescencia in situ o enfoques similares. Alternativamente, pueden usarse micromatrices de ácido nucleico (por ejemplo, Agilent Technologies) para detectar registros de manera específica de secuencia.

Las figuras 13A-13B muestran ejemplos de métodos de ligación y amplificación de la presente divulgación, usados para procesar registros con código de barras. Por ejemplo, los registros pueden cortarse con endonucleasas de restricción, después ligarse mediante extremos “cohesivos” (figura 13A). El material de registro no ligado en exceso puede cortarse con una o más endonucleasas (figura 13B) El procedimiento de ligación de adaptadores de secuenciación a los registros puede realizarse mediante ligación de extremos romos, “adición de cola de nucleótidos A” o ligación mediada por sitios de restricción. La ligación puede realizarse sobre registros bicatenarios sin procesar o después de la hibridación para dar horquillas. Además, pueden añadirse cebadores, no como especies individuales sino como cualquier número de especies diferenciadas por una extensión 5' que no participa activamente en la reacción de generación de registros en sí misma, pero permite que los dos extremos de la mayoría de los registros sean diferentes (no mostrado). Esto permite, a su vez, la amplificación por PCR con diferentes cebadores en cada extremo, quizás incorporando los adaptadores de secuenciar, y esta amplificación puede realizarse antes o después de la ligación. En algunas realizaciones, pueden usarse exonucleasas (como enzimas individuales o en combinación, por ejemplo, exonucleasa T7 en combinación con exonucleasa I, III o T) para digerir secuencias de adaptador u otras secuencias en exceso con la secuencia ligada diana protegida de la digestión mediante modificaciones terminales o la formación de bucles.

A partir de los datos de secuenciación obtenidos, puede determinarse la disposición espacial de dianas moleculares con código de barras, en relación unas con otras. Por ejemplo, los datos de secuenciación pueden procesarse computacionalmente para producir una red representativa de interacciones de dianas moleculares. Tal código informático puede leer archivos de datos de secuenciación, crear un red codificada digitalmente de códigos de barras asociados (por ejemplo, “código de barras A conectado a B” derivado del registro de lectura #1, “B-C” del registro #2 y “C-A” del registro #3). Hay disponibles cualquier número de códigos comercialmente disponibles (por ejemplo, Mathematica) o independientemente escritos para transformar esta representación digital no geométrica en una que describe el posicionamiento espacial relativo (conocido matemáticamente como aspectos de “teoría de grafos”). En este caso, los registros implican un posicionamiento similar a un triángulo de las dianas asociadas con A, B y C. Además, tales programas podrían calcular los parámetros estadísticos de las interacciones de proteínas, como la asociada con el código de barras A, analizando las interacciones de todos los códigos de barras asociados con esa proteína (conocida a priori porque los restos de direccionamiento pueden estar vinculados a conjuntos de códigos de barras específicos antes de que se lleven a cabo el direccionamiento y la reacción). Además, la dependencia temporal de las interacciones puede determinarse a partir de estos datos analizando los diferentes conjuntos de registros tomados a diferentes tiempos o proporcionados con sellos de tiempo moleculares (por ejemplo, cebadores con ligeras diferencias añadidas en la segunda mitad de una reacción).

Algunos aspectos de la presente divulgación proporcionan métodos que comprenden combinar en una única reacción (a) dos sondas con código de barras de ácido nucleico monocatenarias, comprendiendo, cada una, una secuencia palindrómica, una secuencia de código de barras y una secuencia de unión a cebador, en los que las secuencias de código de barras son diferentes unas de otras y en los que cada sonda con código de barras se une a una diana molecular, (b) un cebador parcialmente bicatenario dispuesto en una región bicatenaria flanqueada por regiones flanqueantes monocatenarias 3' que contienen, cada una, un cebador complementario a la secuencia de unión a cebador, en los que la región bicatenaria contiene un sitio de unión covalente reversible (véase, por ejemplo, la figura 11) y una polimerasa de desplazamiento de hebra.

En algunas realizaciones, el sitio de unión covalente reversible contiene una modificación CNVK (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 8.481.714), de tal manera que dos hebras pueden unirse covalentemente en presencia de luz ultravioleta y después liberarse en presencia de una longitud de onda de luz diferente. Pueden usarse otros enlaces reversibles termoestables, tal como se proporciona en el presente documento.

En algunas realizaciones, los métodos comprender incubar (a) y (b) en condiciones suficientes para permitir la unión de los cebadores a los sitios de unión a cebador y la extensión de cada región flanqueante 3' de los cebadores.

En algunas realizaciones, los métodos comprender calentar la reacción hasta una temperatura de al menos 50°C (por ejemplo, de 50°C a 100°C) para permitir la disociación de los cebadores a partir de las dos sondas con código de barras de ácido nucleico monocatenarias, regenerando de ese modo (a) y (b) para los ciclos impulsados por temperatura adicionales.

La figura 11 muestra un ejemplo de un mecanismo de ciclado automático dependiente de la temperatura de la presente divulgación. Los registros se crean cíclicamente, cada registro a partir de dos cebadores independientes en dos sondas únicas. Los “semirregistros” incipientes no se activan espontáneamente a partir de las sondas, sino que, en su lugar, “se eliminan por fusión” mediante una temperatura elevada. Las sondas y los cebadores se muestran en la figura 11, con los cebadores como estructuras de doble cabeza 3' mantenidas juntas mediante reticulación covalente reversible por UV de restos de CNVK. Los cebadores unen cualquier par de sondas, se extienden a baja temperatura (por ejemplo, 25°C) para copiar los códigos de barras y se liberan cuando la temperatura aumenta por encima de la temperatura de fusión de las hebras (por ejemplo, 70°C). Tras reducir la temperatura de nuevo, la polimerasa en disolución puede completar el copiado de las hebras unidas a través de la unión de secuencias palindrómicas, en algunas realizaciones, con la ayuda de la liberación del enlace de CNVK. Por tanto, el sistema se activa de manera síncrona con los ciclos de temperatura.

La presente invención se ilustra además mediante los siguientes ejemplos, que no deben interpretarse en modo alguno como limitación adicional.

Ejemplos

Ejemplo 1.

La figura 3 muestra datos a partir de un experimento que demuestra un ejemplo de un método de generación de registros completos autocíclico basado en proximidad. Los carriles 1-4 del gel electroforético contienen, cada uno, combinaciones de sondas con código de barras de diferentes longitudes y localización (representadas por encima del gel), junto con el cebador y la polimerasa (no representados). En el carril 1, existen sondas con código de barras cortas y largas no conectadas en disolución. Los cebadores marcados con Cy5 (en gran exceso) se convirtieron en semirregistros cortos o largos, pero no se generaron registros completos porque las sondas no estaban próximas unas de otras. En el carril 2, se localizaron conjuntamente sondas con código de barras cortas en moléculas de estreptavidina y se produjeron semirregistros cortos, y posteriormente registros completos cortos. Cuando se preparó estreptavidina usando o bien sondas cortas o bien largas, después se mezclaron juntas para la reacción (carril 3), se generaron tanto semirregistros como registros completos de longitudes cortas y largas, lo que indica además que las sondas con código de barras estaban próximas unas de otras, o que interaccionaban únicamente de manera local, cuando se produjeron registros completos. El carril 4 contiene los mismos componentes que el carril 3 más sondas cortas y largas localizadas conjuntamente, lo que dio como resultado la generación de registros completos de longitud intermedia, combinando semirregistros cortos y largos. Las sondas de diferentes longitudes se usan únicamente para diferenciar los registros por longitud (y, por tanto, movilidad) en el gel en este experimento. Esta reacción de ciclado automático funcional permite una lectura de sonda con código de barras repetida en condiciones y a temperaturas fisiológicas constantes. El ciclado automático, en combinación con marcaje de códigos de barras único que permite la diferenciación de moléculas individuales, permite una dilucidación de redes real y la obtención de imágenes (figura 3) con una precisión que no pueden conseguir la microscopía ni métodos habituales de proximidad por pares. El registro usando técnicas habituales de proximidad por pares (por ejemplo, coinmunoprecipitación, ligadura de proximidad) es inherentemente destructivo y, aun así, la dilucidación de redes individuales (figura 2B) no es posible sin muestreo repetido.

Ejemplo 2.

Se diseñaron por ingeniería nanoestructuras de ADN sintéticas para presentar códigos de barras de ADN en posiciones arbitrarias especificadas por el usuario con precisión nanométrica, sirviendo de ese modo como “banco de trabajo” para evaluar el rendimiento del ciclador automático y el posterior método de reconstrucción de imágenes de manera rigorosa y precisa. Se usan técnicas de manipulación de muestras (por ejemplo, dispositivos microfluídicos) así como algoritmos computacionales y herramientas de software para la reconstrucción de la obtención de imágenes basadas en secuencias de registro completo. Después se obtienen imágenes de agrupaciones de receptores de proteínas en las superficies celulares, en primer lugar en células fijas y después en células vivas. El marcaje de las agrupaciones de proteínas de superficie se consigue usando anticuerpos y proteínas de unión más pequeñas, tales como nanocuerpos o aptámeros. Los resultados de la obtención de imágenes sin microscopio (MFI) se comparan con los datos obtenidos usando métodos basados en microscopio de ultraalta resolución. Después se aplica MFI a otro aplicación: obtención de imágenes de alto rendimiento y alta resolución de organización del nucleoma. Finalmente, además del registrador de ciclado automático basado en proximidad, se desarrolla un registrador molecular basado en difusión, que puede generar repetidamente registros moleculares para dianas separadas en un amplio intervalo, expandiendo aún más la capacidad de MFI.

Ejemplo 3.

Obtención de imágenes de agrupaciones de proteínas en membranas de células

Pueden usarse los métodos y la composición de la presente divulgación para obtener imágenes y dilucidar agrupaciones de proteínas en membranas plasmáticas de células. Los cuatro receptores de EGF unidos a la membrana similares de la familia de ErbB, por ejemplo, forman una parte de una red compleja, modular, heterogénea con otros 13 ligandos polipeptídicos en la superficie de células. La red media la proliferación y la supervivencia, así como la migración y la adhesión, de las células. Dimerizan en 10 combinaciones y parecen formar agrupaciones de mayor orden de hasta 150 nm de ancho, lo que implica la localización conjunta de cientos de receptores dentro de las agrupaciones (Abulrob et al., J Biol Chem 285(5): 3145-56, 2010). Su capacidad para reconocer y procesar múltiples moléculas de señalización, la sobreexpresión en el cáncer y el aumento como dianas farmacológicas los convierte en dianas interesantes e importantes para la obtención de imágenes sin microscopio (MFI) (Citri y Yarden, Nat Rev Mol Cell Biol. 7(7):505-16, 2006).

Los métodos de obtención de imágenes sin microscopio de la presente divulgación, tal como se proporcionan en el presente documento, revelan muchos aspectos del contenido y comportamiento de las proteínas de la agrupación (figura 15). En una célula estática (fija), el marcaje único de todas las proteínas de interés permite la visualización del contenido y la conectividad de la red completa, incluyendo la estequiometría de asociación y la distribución de estados de proteína dentro de o entre las células. En células vivas, los métodos de MFI pueden seguir una reconfiguración de la agrupación lenta (por ejemplo, a lo largo de decenas a cientos de segundos) y monitorizar procesos más rápidos. Los datos obtenidos a partir de los métodos de MFI, tal como se proporcionan en el presente documento, ofrecen una resolución a escala molecular, una conectividad de red compleja real y la capacidad de rastrear interacciones moleculares dinámicas.

Para algunas aplicaciones, se creó una sonda basada en CNVK (Yoshimura et al. Org. Lett. 10(15): 3227-3230, 2008), que puede disociarse con pulsos cortos de luz a 312 nm. La identificación de regiones de interés bajo un microscopio confocal de exploración con un láser apropiado puede deshabilitar todas las sondas en una muestra, excepto aquellas en las regiones de interés, lo que permite el muestreo a partir de tejidos in situ.

Además, para algunas aplicaciones, la adición de cebadores con código de barras con “sellos de tiempo”, por ejemplo, sello de tiempo 1 en la condición A, seguido de un cebador con código de barras más tardío con sello de tiempo 2 en la condición B, permite cambios de estado bruscos resueltos en el tiempo tras, por ejemplo, la administración de fármacos para aplicaciones de detección de fármacos.

Ejemplo 4.

Organización del nucleoma

La organización de dos medidores de ADN, ARNnc y proteínas en el núcleo se controla estrechamente y tiene consecuencias funcionales. La regulación transcripcional, por ejemplo, implica la asociación de proteínas unidas a ADN y ARNncl que pueden estar muy alejados en el mismo cromosoma o en uno diferente. La estructura global de ADN en el núcleo ha recibido mucha atención recientemente puesto que el método de captura de la conformación de los cromosomas (3C) y sus variantes, que han generado mapas de todo el genoma de interacciones intracromosómicas e intercromosómicas a partir de poblaciones de células o incluso de células individuales. Los datos muestran que la estructura a gran escala es variable entre células, pero que el posicionamiento a pequeña escala es repetitivo y, por tanto, relativamente importante. Los métodos actuales tienen varias limitaciones: (1) el método de 4C genera la resolución más alta que, a 10-20 kb, es todavía más larga que el diámetro del núcleo en ADN enderezado; (2) los datos por pares de baja resolución no pueden diferenciar cromosomas homólogos; y (3) no pueden detectar simultáneamente la interacción de múltiples factores de transcripción de proteínas, ARN regulador y ADN.

Los métodos de obtención de imágenes sin microscopio (MFI) de la presente divulgación se usan para dilucidar la organización del nucleoma (figura 16). Se aplica un método OligoPaints (Beliveau et al., PNAS USA. 109(52): 21301-21306, 2012) para seleccionar como diana cientos de miles de segmentos de genoma arbitrarios mediante hibridación in situ, empleando los métodos de MFI, tal como se proporcionan en el presente documento, en cada diana. Dado que las regiones diana no están limitadas por las secuencias de enzimas de restricción y la naturaleza del ciclado de la reacción de registro permite que una sonda participe en muchos pares de registro, la resolución espacial del mapa final puede ser mayor que la resolución a escala de kilobases proporcionada por 4C y mucho mayor que la de Hi-C. Este marcaje de alta resolución y único de pares de cromosomas homólogos permite la identificación de cromosomas en un locus dado. Sondas similares dirigidas a ARNncl, así como a factores de transcripción, cofactores y reguladores de cromatina (mediante anticuerpos), permiten una representación más completa de la regulación. Pueden evaluarse las diferencias entre células individuales y la correlación con el fenotipo. Estos datos se diferencian de los métodos de 3C o microscopía en la mayor resolución espacial, la identificación de cromosomas homólogos y la identificación de interacciones proteína-ADN o ARN-ADN de alto rendimiento en paralelo.

En algunas realizaciones, el mapeo de la pluripotencia o la unión al factor de diferenciación y la organización del genoma de células madre embrionarias (ES) o células madre pluripotentes inducidas (iPS) se consigue usando los métodos de la presente divulgación. El conocimiento de la afiliación y afiliación conjunta de múltiples factores de transcripción a la regulación de células madre permite la desdiferenciación adicional y una diferenciación de la diana más completa. Además, los métodos de MFI de la presente divulgación permiten el mapeo de secuencias no ensambladas en el genoma. Las secuencias repetitivas, o aquellas rodeadas por repeticiones, pueden ser difíciles de localizar, pero las sondas de hibridación de fluorescencia in situ (FISH) repetitiva, cada una con códigos de barras únicos, seguido de la generación de registros basada en proximidad, vinculan secuencias que son difíciles de leer en una reacción.

Ejemplo 5

Interacciones moleculares de mayor alcance

Además de analizar dianas moleculares en estrecha proximidad, la MFI de la presente divulgación puede adaptarse para mapear dianas separadas mediante distancias más largas. Tales datos de mayor alcance son útiles para una dilucidación moleculares más completa. En la aplicación a agrupaciones de proteínas, por ejemplo, el posicionamiento relativo entre agrupaciones independientes en una célula puede ser importante, y estos datos pueden registrarse con los de mediciones de agrupaciones individuales si se toman mediante el mismo mecanismo. Además, la aplicación a posiciones de cromosomas puede beneficiarse de los datos de red adicionales que abarcan secuencias más lejanas que las que están en contacto directo. El mecanismo para esta adquisición de intervalo intermedio (5-25+ nm) se basa en disminuir los gradientes de concentración de los semirregistros liberados. Los cebadores de longitud corta que se unen de manera transitoria a sondas existentes se extienden en semirregistros (figura 17). La reacción de desplazamiento de hebra disocia ocasionalmente los semirregistro hasta el punto de únicamente la hibridación del cebador, y después la hibridación del cebador suficientemente débil se disocia espontáneamente y el semirregistro difunde. A una distancia corta, se encuentra o bien con un semirregistro unido o bien con otro soluble, los sitios palindrómicos se unen entre sí y se polimeriza el registro completo. Se halló un equilibrio optimizado entre unión a cebador razonable y disociación espontánea en una longitud de cebador de 7 nucleótidos (datos no mostrados).

Ejemplo 6.

Para caracterizar la tasa de producción de registros completos en función de la distancia entre sondas, se fijaron pares de sondas a posiciones programadas en nanoestructuras de ADN bidimensionales (figura 19A). Se fijaron dos tipos como extensiones de hebras de ácido nucleico de nanoestructura intrínseca, mientras que se mantuvo una tercera mediante un enlace azida-alquino de química clic a una hebra intermedia (recuadro) como una manera de demostrar cómo pueden unirse las sondas a restos arbitrarios. Ambos métodos incorporaron ADN monocatenario como ligadores flexibles. Se mantuvieron planas e inmóviles muchas copias de una nanoestructura dada sobre una superficie de mica (tal como se realiza para microscopía de fuerza atómica de estructuras de ADN) y se llevaron a cabo por separado las reacciones de registro para cada distancia de separación entre sondas. Después se amplificaron los registros por PCR y los productos se cuantificaron mediante electroforesis en gel. Para tener en cuenta la variación en las condiciones experimentales, especialmente en el número de nanoestructuras, se presentó un segundo par de sondas con secuencias de PCR ortogonales en cada tipo de nanoestructura, pero siempre a la misma distancia de separación fija. La tasa de producción se calculó con respecto a este par de referencia.

La figura 19B indica la tasa de registro relativa para tres diseños de sonda, que contienen dominios de espaciador de 0, 12 y 18 nt. Cada par de sondas se sometió a prueba cada 6 nm para las separaciones de 6 a 48 nm, y los ajustes matemáticos de la tasa de generación de registros se normalizaron a un máximo común. Las sondas de 0, 12 y 18 nt produjeron todas ellas registros cercanos a las tasas máximas cuando se aproximaban unas a otras, lo que sugiere que el efecto de concentración local era un impulsor dominante de la tasa. Las tasas se redujeron hasta la mitad a 13, 20 y 25 nm, respectivamente, y tuvieron un alcance máximo (tasa cercana a cero) a 18, 42 y 48 nm. En términos absolutos, la sonda con espaciador de 12 nt produjo registros a la tasa más rápida, aproximadamente dos veces más rápido que las sondas de 0 y 18 nt (no mostrado). Las tres distancias de alcance máximo corresponden bien a los valores esperados cuando las sondas de ADN y los semirregistros unidos se orientan de manera óptima, tal como en una cadena lineal. Para la sonda con espaciador de 0 nt, la distancia máxima esperada es el doble de la suma de la longitud de la sonda (19 nt de a Dn bicatenario, a 0,34 nm por par de bases, 13 ~6,5 nm) y la longitud de semirregistro (11 nt de ADN monocatenario menos solapamiento de palíndromo de 3 nt, a un máximo de 0,58 nm por base, 13 ~4,6 nm), representando una total de ~22 nm (geometría igual que en la figura 2c, después de la etapa ii). De manera similar, las sondas con espaciador de 12 nt y 18 nt tienen un alcance máximo esperado de ~36 y ~43 nm, respectivamente. Las estimaciones usando modelos de cadena similar a gusano son similares.

La sonda más larga, con un espaciador de 18 nt, se usó para someter a prueba la capacidad de APR para determinar las posiciones relativas de tres dianas. Tres de tales sondas, programadas con diferentes secuencias de cebador y, por tanto, que generan registros con extremos únicos, se fijaron de nuevo mediante una nanoestructura bidimensional en cada una de las cuatro configuraciones con separación entre sondas de 30 nm (figura 19C). Cuando se colocaron en una configuración triangular (figura 19C, panel (i)), en la que cada sonda es equidistante una de otra, se producen los tres registros y son notablemente visibles en el gel, lo que indica la estrecha proximidad de cada par y, por tanto, una disposición triangular. Sin embargo, cuando se colocaron en una línea en la que las sondas adyacentes están al alcance pero las sondas distantes no, sólo son notables los productos de sondas adyacentes. Los tres posibles órdenes de la disposición lineal producen, cada uno, los registros apropiados (figura 19C, paneles (ii)-(iv)), lo que demuestra una capacidad para registrar información geométrica a partir de tres dianas a escala molecular en una configuración arbitraria. Este método puede aplicarse a más de tres dianas simultáneas de manera sencilla diseñando sondas adicionales de secuencia de cebador ortogonal.

Ejemplo 7.

Además de identificar la organización molecular subyacente, se demostró el nuevo muestreo de un sistema cambiante. Se construyó la misma disposición de sondas triangular basada en nanoestructura de la figura 19C, panel (i), con un mecanismo para inactivar la sonda P3 (figura 20A). En cada punto de muestreo, el sobrenadante se amplificó por PCR y se observó mediante PAGE desnaturalizante. En primer lugar, se registró y muestreó la disposición triangular, indicando la localización conjunta de tres sondas tal como se esperaba (figura 20B, panel (i)). Después de un lavado con tampón, el sobrenadante se muestreó e indicó que no había registros residuales (figura

Claims

REIVINDICACIONES

i. Sonda con código de barras de ácido nucleico, que comprende:

un ácido nucleico dispuesto para formar una estructura de horquilla que tiene una región de unión a cebador parcialmente bicatenaria, una región de código de barras bicatenaria, una región palindrómica bicatenaria y una región de bucle monocatenaria que contiene un resto de unión a diana, en la que una molécula que termina la polimerización se ubica adyacente a la región palindrómica bicatenaria y entre la región palindrómica bicatenaria y la región de bucle.
2. Sonda con código de barras de ácido nucleico según la reivindicación 1, en la que la región palindrómica bicatenaria tiene una longitud de 4 a 10 pares de bases de nucleótidos, y/o la región de código de barras bicatenaria tiene una longitud de 2 a 100 pares de bases de nucleótidos, y/o la región de unión a cebador tiene una longitud de 4 a 40 nucleótidos, y/o la región de bucle monocatenaria tiene una longitud de 3 a 50 nucleótidos.
3. Sonda con código de barras de ácido nucleico según la reivindicación 1 ó 2, en la que el resto de unión a diana se selecciona del grupo que consiste en: biotina, un anticuerpo, un aptámero, un nanocuerpo, un ácido nucleico, un fármaco y un átomo.
4. Sonda con código de barras de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que la sonda comprende al menos un nucleótido de ácido nucleico bloqueado (LNA), opcionalmente en la que al menos un nucleótido de LNA se ubica en o adyacente a la región de código de barras bicatenaria.
5. Sonda con código de barras de ácido nucleico según la reivindicación 1, en la que la sonda comprende además una secuencia terminal de poli-T monocatenaria.
6. Pluralidad de sondas con código de barras de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, opcionalmente en la que la región palindrómica bicatenaria y/o la región de unión a cebador monocatenaria es la misma para cada sonda de la pluralidad.
7. Pluralidad según la reivindicación 6, en la que la pluralidad comprende subconjuntos de sondas con código de barras, comprendiendo cada subconjunto una región con código de barras única.
8. Composición que comprende la pluralidad según la reivindicación 6 y un cebador que es al menos parcialmente complementario a una región de unión a cebador de una sonda de la pluralidad, opcionalmente en la que el cebador comprende al menos un apareamiento erróneo de nucleótidos en relación con la región de unión a cebador y/o el cebador comprende al menos un ligador artificial que no es complementario a la región de unión a cebador, y opcionalmente en la que la composición comprende además una hebra de ácido nucleico auxiliar que es parcialmente complementaria a la región de unión a cebador monocatenaria, es parcialmente complementaria a una región monocatenaria adyacente a la región de unión a cebador y se une de manera transitoria a la región monocatenaria adyacente a la región de unión a cebador, opcionalmente en la que la hebra auxiliar tiene una longitud de 3 a 20 nucleótidos.
9. Composición según la reivindicación 8, que comprende además una polimerasa de desplazamiento de hebra, opcionalmente en la que la polimerasa de desplazamiento de hebra se selecciona de los grupos que consisten en: polimerasa de fragmento grande de Bst, polimerasa phi 29, polimerasa Deep VentR, polimerasa de fragmento de Klenow y polimerasa Taq modificada.
10. Método para producir registros con código de barras de interacciones de dianas moleculares, que comprende las etapas de:

(a) combinar en una única reacción la pluralidad de sondas con código de barras de ácido nucleico según la reivindicación 6 ó 7 con (i) un cebador complementario a la región de unión a cebador de una sonda de la pluralidad y (ii) una polimerasa de desplazamiento de hebra; y

(b) incubar la reacción en condiciones que dan como resultado la producción de registros con código de barras de las interacciones de dianas moleculares.
11. Método según la reivindicación 10, en el que los registros con código de barras son bicatenarios y/o en el que las sondas con código de barras de ácido nucleico de la pluralidad se regeneran tras la producción de los registros con código de barras bicatenarios.
12. Método según la reivindicación 10 u 11, en el que la etapa de (b) comprende incubar la reacción en condiciones fisiológicas, opcionalmente en el que la etapa de (b) comprende incubar la reacción a una temperatura de 37°C durante un tiempo de 0,5 a 3,0 horas.

Método según una cualquiera de las reivindicaciones 10-12, que comprende además recopilar registros con código de barras a partir de la reacción, purificar los registros con código de barras recopilados a partir de la reacción y secuenciar los registros con código de barras recopilados a partir de la reacción.

Método según una cualquiera de las reivindicaciones 10-13, en el que el cebador comprende:

una primera hebra de ácido nucleico que comprende

una primera secuencia complementaria a la región de unión a cebador monocatenaria y una segunda secuencia; y

una segunda hebra de ácido nucleico que comprende

una tercera secuencia complementaria a la región de unión a cebador monocatenaria y una cuarta secuencia complementaria a y unida a la segunda secuencia,

en el que las hebras de ácido nucleico primera y segunda están dispuestas en una región bicatenaria flanqueada por regiones de cebador monocatenarias, opcionalmente en el que la región bicatenaria contiene una secuencia de código de barras y/o el cebador comprende además al menos un sitio de secuenciación o sitio de unión.

Método según una cualquiera de las reivindicaciones 10-14, en el que las dianas moleculares se obtienen a partir de una muestra biológica, opcionalmente en el que la muestra biológica es una célula o un lisado celular.