JP5960709B2 - トーホールドプライマーデュプレックスの組成物およびその使用方法 - Google Patents

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関連出願
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づき、その全内容を本明細書に援用する２０１０年１０月２７日に出願された米国仮特許出願第６１／４０７，２９１号明細書の優先権を主張する。

本明細書に記載の実施形態は、部分二本鎖核酸プライマーと、たとえば核酸合成法におけるその使用とに関する。

核酸は生物学の重要情報の担い手であり、核酸の検出、増幅および同定は、バイオテクノロジーの幅広い部門の基礎となっている。特に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９，４８７−４９１（１９８８））などの方法は、ＤＮＡを増幅する信頼性の高い手段として世界中で使用されており、さらに逆転写酵素法は、トランスクリプトームを探索するのに使用されてきた。ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素の操作には、典型的にはプライマーと呼ばれる短いオリゴヌクレオチドフラグメントを使用して長い標的部分が複製または転写されるように誘導する。

核酸ハイブリダイゼーションの特異性は、多くの場合、大部分の標的配列に対して酵素活性を誘導するには十分であるものの、反復配列、二次構造および高Ｇ／Ｃ含量の標的を高収率で増幅するのは難しい。さらに、単一コピーヒトゲノムの増幅の場合など、バックグラウンドが高い他の核酸も頻繁に不正確な増幅が起こることがある。最後に、ＤＮＡチッププールなどからのマルチプレックス増幅も、多くのオルソゴナルな増幅反応が同時に起こらざるを得ないため、実現するのが難しい場合がある。同様の問題は、転写および逆転写の場合にも存在する。

核酸のハイブリダイゼーションは、単一のヌクレオチドレベルでは特異的である。たとえば、シトシンはグアニンに優先的に結合し、アデニンはチミンまたはウラシルに優先的に結合する。しかしながら、多くのヌクレオチドからなる核酸分子の場合、ハイブリダイゼーションの特異性が低下し、ほぼ相補的な配列の核酸は、完全な相補配列とほとんど同程度に強く結合する。目的の標的核酸（「標的」）と、たとえば、標的と１ヌクレオチド異なる配列の核酸（「擬似標的」）との不均一な混合物を仮定すると、標的と相補的であるプライマーの大部分は、むしろ擬似標的とハイブリダイズする。

正しい標的は相補配列を持つプライマーに、よりやや高い親和性で結合するため、十分な時間を与えれば、相補的プライマーへの結合において正しい標的が最終的には擬似標的に置き換わる。しかしながら、このプロセスは非常に速度が遅く、多くの実験系に典型的なナノモル濃度で数ヶ月を要すると考えられる。

相補的プライマーが擬似標的に結合する性質を緩和するため、多くの場合、核酸プライマーを用いた実験系をプライマー／標的複合体の融解温度付近で行うことが必要である。この融解温度は一般に、大部分の生体システムが自然に働く温度よりはるかに高いため、この高温要件は、通常の生体条件下で実験系を行うことを妨げる。加えて、この融解温度は標的によって異なっており、こうした実験系に必要温度範囲が狭いため、複数の標的を検出するために複数のプライマーを同時に使用することが制限される。

複数の実施形態において、本明細書で提供されるのは、広範囲の温度で核酸標的に高い特異性で速やかに結合することができるプライマー（たとえば、プライマーデュプレックスおよびヘアピンプライマーデュプレックス）である。こうしたプライマーは、たとえば、核酸合成反応（たとえば、ＰＣＲ）、マイクロアレイ解析、イメージング法および一塩基多型（ＳＮＰ）解析に使用してもよい。プライマーはまた、プライマーが主に「プローブ」として機能する核酸検出アッセイに使用してもよい。したがって、本発明のプライマーは、用途に関係なく、「プローブ」と同義で用いられることがある。本発明のプライマーは、用途（または使用方法）に関係なく、特定のハイブリダイゼーションが擬似標的の存在下で必要とされる場合に、より詳細にはそうした擬似標的が過度に存在する場合によく見られる問題を解決する。

本明細書で提供されるプライマーは、核酸に作用する酵素とプライマーを併用しやすくするいくつかの独特の特性を有する。第１に本プライマーは、その目的の標的にのみ高い特異性で結合するように熱力学的に設計されており、単１ヌクレオチド変化にも高い識別を示す。第２に本プライマーの特異性は、かなりの配列の反復、二次構造および／または高Ｇ／Ｃ含量を有するものなど従来困難であった標的のＰＣＲ、転写および逆転写を可能にする。こうしたプライマーで達成され得る高度の特異性はさらに、単一コピーヒトゲノムの増幅など核酸のバックグラウンドが高くても正確な処理を可能にする。第３に本プライマーが部分二本鎖性であることは、本プライマーが互いに相互作用するとは考えにくいことを意味し、その結果高度なマルチプレックスによる複製反応、転写反応および／または逆転写反応を行いやすくする。最後に、こうしたプライマーの標的とのハイブリダイゼーションは、比較的温度および塩分の影響を受けにくく、したがって本プライマーは標準的なプライマーより著しく長くてもよく、結果として特異性およびプライマー設計の柔軟性がさらに高まる。

いくつかの実施形態では、本明細書で考察される核酸プライマーは、特異的な標的核酸分子とプライマーとの間のハイブリダイゼーションの標準自由エネルギー（たとえば、理論上の標準自由エネルギー）がゼロに近くなる一方、それと比較して擬似標的（特異的な（実際の）標的と１ヌクレオチドとわずかに異なる擬似標的でも）とプライマーとの間のハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーは、それらの結合を起こりにくくするのに十分高くなるように合理的に設計される。本発明者らは、（ａ）「トーホールド」一本鎖標的特異的領域、（ｂ）「分岐点移動」二本鎖標的特異的領域、および（ｃ）「バランス」二本鎖標的非特異的領域を有するプライマーを設計することによりこれを達成した。

いくつかの実施形態では、プライマーは、自己ハイブリダイズして二本鎖領域を形成する一本鎖からなっていてもよい。いくつかの実施形態では、プライマーは、二本鎖からなっていてもよい。後者の実施形態の例として、プライマーは、第１の鎖または相補体鎖および第２の鎖または保護体鎖からなる。相補体鎖は、その名称が示唆する通り、目的の標的と部分的に相補的であり、標的にハイブリダイズする。一方、保護体鎖は標的にハイブリダイズせずに、むしろ相補体の結合において標的（または擬似標的）と競合するように設計される。

「トーホールド」領域は相補体鎖中に存在し、標的配列と相補的であるが、保護体領域とは相補的でない。相補体鎖中の「バランス」領域（すなわち、相補体バランス領域）は、保護体の一部（すなわち、保護体バランス領域）と相補的であるが、標的配列とは相補的でない。トーホールドと標的とのハイブリダイゼーションエネルギーは、相補体バランス領域と保護体バランス領域とのハイブリダイゼーションエネルギーに一致またはほぼ一致する（様々な他の熱力学的事項に応じて調整する）。バランス領域の配列は、温度およびプライマー濃度の所望の条件下でこの一致を達成するように合理的に設計される。その結果、実際の標的とプライマーとの平衡状態は、５０％標的：プライマー：：保護体：プライマー（またはその他の所望の比率）に速やかに近付く一方、擬似標的とプライマーとの平衡状態は保護体：プライマーに大きく有利である。特異的標的の存在下で大量の遊離のプライマーがあると、その高感度で特異的な検出が容易になる。

いくつかの実施形態では、本明細書で考察される核酸プライマーは、特異的な標的核酸分子とプライマーとの間のハイブリダイゼーションの濃度調整自由エネルギーがゼロに近くなる一方、それと比較して擬似標的とプライマーとの間のハイブリダイゼーションの濃度調整標準自由エネルギーはそれらの結合を起こりにくくするのに十分高くなるように設計される。本明細書で使用する場合、「濃度調整自由エネルギー」とは、ΔＧ°＋（Δｎ）ＲＴｌｎ（ｃ）をいい、式中、Ｒは一般気体定数、Ｔはケルビン温度、ｃはプライマー濃度、Δｎは反応の過程における分子数の変化である（標準的なハイブリダイゼーションでは、Δｎ＝−１、二本鎖プライマーのハイブリダイゼーションでは、Δｎ＝０である。

したがって本発明の態様は、プライマー、相補体鎖および保護体鎖を含む組成物を含むプライマー組成物（たとえばキット中）と、プライマーを作製する方法と、以下に限定されるものではないが、核酸合成および／または検出アッセイもしくは反応などアッセイまたは反応にプライマーを使用する方法とを提供する。

よって、一態様では、本発明は、（ａ）第１の核酸鎖（本明細書では相補体鎖ともいう）および第２の核酸鎖（本明細書では保護体鎖ともいう）からなり、第１および第２の鎖は、相互にハイブリダイズすると、第１の核酸鎖による寄与により（１）二本鎖標的非特異的（バランス）領域、（２）二本鎖標的特異的（分岐点移動）領域、および（３）一本鎖標的特異的（トーホールド）領域に配置され、二本鎖標的非特異的領域は、標的核酸に結合する一本鎖標的特異的領域の標準自由エネルギーとほぼ等しい標準自由エネルギーを有する部分二本鎖プライマーを提供する。部分二本鎖プライマーは、１つ以上の二本鎖標的非特異的領域、１つ以上の二本鎖標的特異的領域、および／または１つ以上の一本鎖標的特異的領域を含んでもよい。いくつかの実施形態では、部分二本鎖プライマーは、１つまたは２つの二本鎖標的非特異的（バランス）領域、１つ以上の二本鎖標的特異的（分岐点移動）領域、および／または１つ以上の一本鎖標的特異的（トーホールド）領域を含んでもよい。

いくつかの実施形態では、第２の核酸鎖はその３’末端に非伸長性ヌクレオチドを含み、および／または第１の核酸鎖は、その標的非特異的領域の３’末端または３’末端付近に非天然ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、非伸長性ヌクレオチドは非天然ヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、非天然ヌクレオチドはイソ−Ｃ、イソ−Ｇまたはデオキシウリジンである。これらの例は、非限定的な例として意図している。

いくつかの実施形態では、二本鎖標的非特異的領域は約４〜２０ヌクレオチド長である。二本鎖標的非特異的領域は、たとえば４〜２１ヌクレオチド長など２０ヌクレオチドより長くてもよい。いくつかの実施形態では、二本鎖標的非特異的領域は、約１２〜１９２ヌクレオチド長であってもよい。

いくつかの実施形態では、一本鎖標的特異的領域は約４〜２０ヌクレオチド長である。一本鎖標的特異的領域は、たとえば４〜２１ヌクレオチド長など２０ヌクレオチドより長くてもよい。いくつかの実施形態では、一本鎖標的特異的領域は、約１２〜１９２ヌクレオチド長であってもよい。

いくつかの実施形態では、二本鎖標的非特異的領域および一本鎖標的特異的領域は、Ａ／Ｔヌクレオチドの比率がほぼ同一または同一（さらに典型的にはＧ／Ｃヌクレオチドの比率もほぼ同一または同一）である。いくつかの実施形態では、第１および第２の核酸鎖は、ＤＮＡまたはＲＮＡまたはそれらの組み合わせからなる。

別の態様では、本発明は、部分的に自己ハイブリダイズして（１）二本鎖標的非特異的領域、（２）二本鎖標的特異的領域、（３）一本鎖標的特異的領域、および（４）ヘアピンループ領域を形成し、１つ以上の二本鎖標的非特異的領域が、標的核酸に結合する１つ以上の一本鎖標的特異的領域の濃度調整標準自由エネルギーとほぼ等しい濃度調整標準自由エネルギーを有する、一本鎖プライマーを提供する。

別の態様では、本発明は、上述のプライマーのいずれかを含む組成物を提供する。本組成物は、任意選択的に防腐剤、１つ以上の塩等を含む緩衝液などの担体をさらに含んでもよい。組成物はまた、各保護体鎖が保護体バランス領域および保護体分岐点移動領域を含む過剰の一本鎖保護体鎖を含む。一本鎖保護体鎖は各々、好ましくはその３’末端に非伸長性および／または非天然のヌクレオチドを含んでもよい。

別の態様では、本発明は、核酸標的、ポリメラーゼ、および前述のプライマーのいずれかを含むシステムを提供する。いくつかの実施形態では、プライマーは、第１の核酸鎖による寄与により（１）二本鎖標的非特異的領域、（２）二本鎖標的特異的領域、および（３）一本鎖標的特異的領域に配置された第１および第２の核酸鎖を含む部分二本鎖プライマーである。

いくつかの実施形態では、核酸標的は一本鎖である。いくつかの実施形態では、核酸標的はＤＮＡまたはＲＮＡである。いくつかの実施形態では、核酸標的は、反復配列、二次構造および／または高ＧＣ含量を含む。いくつかの実施形態では、核酸標的は複数の異なる核酸に存在する。いくつかの実施形態では、核酸標的は複数の異なる核酸中に単一コピーとしてまたは低コピー（たとえば、０．００１％未満、０．０１％未満、０．１％未満または１％未満）で存在する。

いくつかの実施形態では、システムは、複数の異なる部分二本鎖プライマーなど前述のプライマーのいずれかの複数を含む。いくつかの実施形態では、システムは、核酸標的の領域を増幅するために一緒に使用することができる、少なくとも２つの部分二本鎖プライマーなど前述のプライマーの少なくとも２つを含む。

別の態様では、本発明は、上述のシステムのいずれかを含む組成物を提供する。組成物は、防腐剤、１つ以上の塩、ポリメラーゼなどの１種または複数種の酵素、核酸合成に好適なヌクレオチド等を任意選択的に含む緩衝液などの担体をさらに含んでもよい。組成物はまた、各保護体鎖が保護体バランス領域および保護体分岐点移動領域を含む過剰の一本鎖保護体鎖も含む。一本鎖保護体鎖は各々、好ましくはその３’末端に非伸長性および／または非天然のヌクレオチドを含んでもよい。

別の態様では、本発明は、前述の部分二本鎖プライマーのいずれかなど前述のプライマーのいずれかをサンプルと接触させること、およびプライマーとサンプル中の標的とのハイブリダイゼーションを検出することを含む方法を提供する。

いくつかの実施形態では、部分二本鎖プライマーなどのプライマーを検出可能な部分で標識する。いくつかの実施形態では、検出可能な部分は、フルオロフォアまたは放射性同位元素を含む。

標的は典型的には核酸である。いくつかの実施形態では、標的は一本鎖核酸である。いくつかの実施形態では、標的はＤＮＡまたはＲＮＡである。いくつかの実施形態では、標的は、反復配列、二次構造および／または高ＧＣ含量を含む核酸である。いくつかの実施形態では、標的は複数の異なる核酸に存在する。いくつかの実施形態では、標的は複数の異なる核酸中に単一コピーとしてまたは低コピー（たとえば、０．００１％未満、０．０１％未満、０．１％未満または１％未満）で存在する。

いくつかの実施形態では、本方法および本明細書に記載の他の方法を相補体鎖−標的複合体の融解温度未満の温度で行う。いくつかの実施形態では、５０℃以下、または４０℃以下、または３０℃以下の室温の間の温度で本方法および本明細書に記載の他の方法を行う。いくつかの実施形態では、本方法および本明細書に記載の他の方法を約３７℃にて行う。いくつかの実施形態では、本方法および本明細書に記載の他の方法は、保護体バランス領域および保護体分岐点移動領域を含み、かつ部分二本鎖プライマーの保護体鎖と同一である過剰の保護体鎖を用いて行う。本方法および本明細書に記載の他の方法では、プライマーは、部分二本鎖プライマーを含む前述のプライマーのいずれであってもよい。

別の態様では、本発明は、前述の部分二本鎖プライマーのいずれかの第１の（相補体）鎖の一本鎖標的特異的（トーホールド）領域を核酸標的とハイブリダイズし、それによりプライマーの第１の鎖をプライマーの第２の（保護体）鎖から解離させること、および第１の鎖をポリメラーゼの存在下で標的と相補的にその３’末端から伸長させることを含む方法を提供する。

別の態様では、本発明は、核酸標的、ポリメラーゼおよび前述の部分二本鎖プライマーの１つ以上の存在下で核酸合成反応を行うことを含む方法を提供する。

いくつかの実施形態では、核酸合成反応は核酸増幅反応である。いくつかの実施形態では、核酸増幅反応はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。いくつかの実施形態では、核酸合成反応は転写反応である。いくつかの実施形態では、転写反応は逆転写反応である。

いくつかの実施形態では、２つの部分二本鎖プライマーを使用する。

別の態様では、本発明は、部分二本鎖プライマーを含む前述のプライマーのいずれかを使用して複数の特有の核酸分子を増幅させることを含む、マルチプレックスによる核酸増幅反応を行う方法を提供する。

別の態様では、本発明は、前述の部分二本鎖プライマーのいずれかの１つ以上（複数を含む）と、酵素、ヌクレオチド、塩、ＥＤＴＡ、緩衝液等の１種以上の核酸合成試薬とを含むキットを提供する。

いくつかの実施形態では、１種以上の核酸合成試薬は、緩衝液、ヌクレオチドおよびポリメラーゼからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、キットは、プライマーに含まれる保護体鎖と同一である過剰の保護体鎖をさらに含む。

いくつかの実施形態では、キットは使用説明書をさらに含む。

別の態様では、本発明は、第１の容器に第１の一本鎖（相補体）核酸、および第２の容器に、第１の一本鎖核酸の領域と相補的である第２の一本鎖（保護体）核酸を含み、第１および第２の一本鎖核酸が相互にハイブリダイズすると、第１の核酸による寄与により（１）二本鎖標的非特異的領域、（２）二本鎖標的特異的領域および（３）一本鎖標的特異的領域を含む部分二本鎖核酸が形成され、第１の一本鎖核酸は、非天然ヌクレオチドを含み、および／または第２の一本鎖核酸はその３’末端に非伸長性ヌクレオチドを含むキットを提供する。

いくつかの実施形態では、キットは使用説明書をさらに含む。いくつかの実施形態では、キットは、上述したものなど１種以上の核酸合成試薬をさらに含む。いくつかの実施形態では、１種以上の核酸合成試薬は、緩衝液、ヌクレオチドおよびポリメラーゼからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、保護体鎖は、キット中の相補体鎖の量（たとえば、モル量）より多い量（たとえば、モル量）でキットに含まれる。

前述の態様および発明のいくつかの実施形態、特に二本鎖のプライマーに関連するものでは、プライマーのヌクレオチド配列は、

のように選択され、式中、ΔＧ°_１は、保護体バランス領域と相補体バランス領域とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり；ΔＧ°_２は、保護体バランス領域と標的核酸配列（存在する場合）に第１の方向で直接隣接する配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり；ΔＧ°_３は、トーホールド領域と第２の標的核酸配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり；ΔＧ°_Ｒは３．５ｋｃａｌ／ｍｏｌである。

一態様では、本明細書で提供されるのは、相補体鎖および保護体鎖を含むプライマーデュプレックスシステムであって、保護体鎖は、第１の末端と、第２の末端と、第１の末端および第２の末端を有する第１の標的核酸配列と一致する配列とを有する保護体分岐点移動領域であり、保護体分岐点移動領域の第１の末端および第１の標的核酸配列の第１の末端はどちらも５’であるかまたはどちらも３’である保護体分岐点移動領域と；第１の標的核酸配列（存在する場合）の第１の末端に直接隣接する配列と一致しない配列を有する、保護体分岐点移動領域の第１の末端に直接隣接する保護体バランス領域とを有する核酸を含み；相補体プライマーは、第１の末端と、第２の末端と、保護体分岐点移動領域と相補的である配列とを有する相補体分岐点移動領域であり、相補体分岐点移動領域の第１の末端および第１の標的核酸配列の第１の末端は、どちらも５’であるかまたはどちらも３’である相補体分岐点移動領域と；相補体分岐点移動領域の第１の末端に直接隣接し；かつ第１の標的核酸配列の第２の末端に直接隣接する第２の標的核酸配列と相補的であるトーホールド領域と；相補体分岐点移動領域の第２の末端に直接隣接し；保護体バランス領域と相補的であり；かつ下記式のような配列を有する相補体バランス領域であって、

式中、ΔＧ°_１は、保護体バランス領域と相補体バランス領域とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり；ΔＧ°_２は、保護体バランス領域と標的核酸配列（存在する場合）に第１の方向で直接隣接する配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり；ΔＧ°_３は、トーホールド領域と第２の標的核酸配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり；ΔＧ°_Ｒは３．５ｋｃａｌ／ｍｏｌである、相補体バランス領域とを有する核酸を含む、プライマーデュプレックスシステムである。

別の態様では、本明細書で提供されるのは、保護体鎖、ヘアピン領域および相補体鎖を有する核酸を含むプライマーデュプレックスシステムであって、保護体鎖は保護体分岐点移動領域および保護体バランス領域を含み、保護体分岐点移動領域は第１の末端；第２の末端；ならびに第１の末端および第２の末端を有する第１の標的核酸配列と一致する配列を有し、保護体分岐点移動領域の第１の末端および第１の標的核酸配列の第１の末端は、どちらも５’であるかまたはどちらも３’であり；保護体バランス領域は、第１の末端；保護体分岐点移動領域の第１の末端に直接隣接する第２の末端；および第１の標的核酸配列（存在する場合）の第１の末端に直接隣接する配列と一致しない配列を有し；ヘアピン領域は、第１の末端；および保護体バランス領域の第１の末端に直接隣接する第２の末端を含み；相補体鎖は、相補体バランス領域、相補体分岐点移動領域、およびトーホールド領域を含み、相補体バランス領域は、第１の末端；ヘアピン領域の第１の末端に直接隣接する第２の末端；および保護体バランス領域と相補的である配列を有し；相補体分岐点移動領域は、第１の末端；相補体バランス領域の第１の末端に直接隣接する第２の末端；および保護体分岐点移動領域と相補的である配列を有し、相補体分岐点移動領域の第１の末端および第１の標的核酸配列の第１の末端は、どちらも５’であるかまたはどちらも３’であり；トーホールド領域は、相補体分岐点移動領域の第１の末端に直接隣接し；かつ第１の標的核酸配列の第２の末端に直接隣接する第２の標的核酸配列と相補的であり；相補体バランス領域は、下記式のような配列を有し、

式中、ΔＧ°_１は、保護体バランス領域と相補体バランス領域とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり；ΔＧ°_２は、保護体バランス領域と標的核酸配列（存在する場合）に第１の方向で直接隣接する配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり；ΔＧ°_３は、トーホールド領域と第２の標的核酸配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり；ΔＧ°_４は、ヘアピン領域の保持の標準自由エネルギーであり；Ｒは理想気体定数であり；Ｔは、プライマーデュプレックスシステムを使用する温度であり；ｃは、プライマーデュプレックスシステムを使用する濃度であり；ΔＧ°_Ｒは３．５ｋｃａｌ／ｍｏｌである、プライマーデュプレックスシステムである。

なお別の態様では、本明細書で提供されるのは、３’から５’方向に第１の保護体鎖、第１のヘアピン領域、相補体鎖、第２のヘアピン領域および第２の保護体鎖を有するシステムであって、第１の保護体鎖は、第１の標的核酸配列と一致する配列を有する第１の保護体分岐点移動領域；および第１の保護体分岐点移動領域の５’に隣接し；かつ第１の標的核酸配列（存在する場合）の５’に隣接した配列と一致しない配列を有する第１の保護体バランス領域を含み；第１のヘアピン領域は、第１の保護体バランス領域の５’に隣接し；相補体鎖は、第１のヘアピン領域の５’に隣接し；かつ第１の保護体バランス領域の配列と相補的である配列を有する第１の相補体バランス領域；第１の相補体バランス領域の５’に隣接し；かつ第１の保護体分岐点移動領域と相補的である配列を有する第１の相補体分岐点移動領域；第１の相補体分岐点移動領域の５’に隣接し；かつ第１の標的核酸配列の３’に隣接した第２の標的核酸配列と相補的である配列を有するトーホールド領域；トーホールド領域の５’に隣接し；かつ第２の標的核酸配列の３’に隣接した第３の標的核酸配列と相補的である配列を有する第２の相補体分岐点移動領域；第２の相補体分岐点移動領域の５’に隣接し；かつ第３の標的核酸配列（存在する場合）の３’に隣接した配列と相補的でない配列を有する第２の相補体バランス領域を含み；第２のヘアピン領域は、第２の相補体バランス領域の５’に隣接し；第２の保護体鎖は、第２のヘアピン領域の５’に隣接し；かつ第２の相補体バランス領域と相補的である配列を有する第２の保護体バランス領域；および第２の保護体バランス領域の５’に隣接し；かつ第２の相補体分岐点移動領域と相補的である配列を有する第２の保護体分岐点移動領域を含み；第１の相補体バランス領域および第２の相補体バランス領域は、下記式のような配列を有し：

式中、ΔＧ°_１は、第１の保護体バランス領域と第１の相補体バランス領域とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり；ΔＧ°_２は、第１の相補体バランス領域と第１の標的核酸配列（存在する場合）の５’に隣接した配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり；ΔＧ°_３は、第２の保護体バランス領域と第２の相補体バランス領域とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり；ΔＧ°_４は、第２の相補体バランス領域と第３の標的核酸配列（存在する場合）の３’に隣接した配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり；ΔＧ°_５は、トーホールド領域と第２の標的核酸配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり；ΔＧ°_６は第１のヘアピン領域の保持の標準自由エネルギーであり；ΔＧ°_７は第２のヘアピン領域の保持の標準自由エネルギーであり；Ｒは理想気体定数であり；Ｔは、プライマーデュプレックスシステムを使用する温度であり；ｃは、プライマーデュプレックスシステムを使用する濃度であり；ΔＧ°_Ｒは３．５ｋｃａｌ／ｍｏｌである、システムである。

さらに別の態様では、本明細書で提供されるのは、ヘアピンプライマーおよび保護体鎖を含むプライマーデュプレックスシステムであって、ヘアピンプライマーは、第１の標的核酸配列と一致する配列を有する第１の保護体分岐点移動領域；および第１の保護体分岐点移動領域の５’に隣接し；かつ第１の標的核酸配列（存在する場合）の５’に隣接した配列と一致しない配列を有する第１の保護体バランス領域を有する第１の保護体鎖と；第１の保護体バランス領域の５’に隣接したヘアピン領域と；第１のヘアピン領域の５’に隣接し；かつ第１の保護体バランス領域の配列と相補的である配列を有する第１の相補体バランス領域；第１の相補体バランス領域の５’に隣接し；かつ第１の保護体分岐点移動領域と相補的である配列を有する第１の相補体分岐点移動領域；第１の相補体分岐点移動領域の５’に隣接し；かつ第１の標的核酸配列の３’に隣接した第２の標的核酸配列と相補的である配列を有するトーホールド領域；トーホールド領域の５’に隣接し；かつ第２の標的核酸配列の３’に隣接した第３の標的核酸配列と相補的である配列を有する第２の相補体分岐点移動領域；第２の相補体分岐点移動領域の５’に隣接し；第３の標的核酸配列（存在する場合）の３’に隣接した配列と相補的でない配列を有する第２の相補体バランス領域を有する相補体鎖とを有する核酸を含み；保護体は、第２の相補体バランス領域と相補的である配列を有する第２の保護体バランス領域；および第２の保護体バランス領域の５’に隣接し；かつ第２の相補体分岐点移動領域と相補的である配列を有する第２の保護体分岐点移動領域を有する第２の保護体鎖を有する核酸を含み；第１の相補体バランス領域および第２の相補体バランス領域は、下記式のような配列を有し：

式中、ΔＧ°_１は、第１の保護体バランス領域と第１の相補体バランス領域とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり；ΔＧ°_２は、第１の相補体バランス領域と第１の標的核酸配列（存在する場合）の５’に隣接した配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり；ΔＧ°_３は、第２の保護体バランス領域と第２の相補体バランス領域とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり；ΔＧ°_４は、第２の相補体バランス領域と第３の標的核酸配列（存在する場合）の３’に隣接した配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり；ΔＧ°_５は、トーホールド領域と第２の標的核酸配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり；ΔＧ°_６は、ヘアピン領域の保持の標準自由エネルギーであり；ΔＧ°_Ｒは３．５ｋｃａｌ／ｍｏｌである、プライマーデュプレックスシステムである。

さらなる態様では、本明細書で提供されるのは、保護体鎖およびヘアピンプライマーを含むプライマーデュプレックスシステムであって、保護体鎖は、第１の標的核酸配列と一致する配列を有する第１の保護体分岐点移動領域；および第１の保護体分岐点移動領域の５’に隣接し；かつ第１の標的核酸配列（存在する場合）の５’に隣接した配列と一致しない配列を有する第１の保護体バランス領域を有する第１の保護体鎖を有する核酸を含み；ヘアピンプライマーは、第１の保護体バランス領域の配列と相補的である配列を有する第１の相補体バランス領域；第１の相補体バランス領域の５’に隣接し；かつ第１の保護体分岐点移動領域と相補的である配列を有する第１の相補体分岐点移動領域；第１の相補体分岐点移動領域の５’に隣接し；かつ第１の標的核酸配列の３’に隣接した第２の標的核酸配列と相補的である配列を有するトーホールド領域；トーホールド領域の５’に隣接し；かつ第２の標的核酸配列の３’に隣接した第３の標的核酸配列と相補的である配列を有する第２の相補体分岐点移動領域；第２の相補体分岐点移動領域の５’に隣接し；第３の標的核酸配列（存在する場合）の３’に隣接した配列と相補的でない配列を有する第２の相補体バランス領域を有する相補体鎖；第２の相補体バランス領域の５’に隣接したヘアピン領域；および第２のヘアピン領域の５’に隣接し；かつ第２の相補体バランス領域と相補的である配列を有する第２の保護体バランス領域；および第２の保護体バランス領域の５’に隣接し；かつ第２の相補体分岐点移動領域と相補的である配列を有する第２の保護体分岐点移動領域を有する第２の保護体鎖を有する核酸を含み；第１の相補体バランス領域および第２の相補体バランス領域は、下記式のような配列を有し：

式中、ΔＧ°_１は、第１の保護体バランス領域と第１の相補体バランス領域とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり；ΔＧ°_２は、第１の相補体バランス領域と第１の標的核酸配列（存在する場合）の５’に隣接した配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり；ΔＧ°_３は、第２の保護体バランス領域と第２の相補体バランス領域とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり；ΔＧ°_４は、第２の相補体バランス領域と第３の標的核酸配列（存在する場合）の３’に隣接した配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり；およびΔＧ°_５は、トーホールド領域と第２の標的核酸配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり；ΔＧ°_６は、ヘアピン領域の保持の標準自由エネルギーであり；およびΔＧ°_Ｒは３．５ｋｃａｌ／ｍｏｌである、プライマーデュプレックスシステムである。

別の態様では、本明細書で提供されるのは、第１の保護体鎖、相補体鎖および第２の保護体鎖を含むプライマーデュプレックスシステムであって、第１の保護体鎖は、第１の標的核酸配列と一致する配列を有する第１の保護体分岐点移動領域；および第１の保護体分岐点移動領域の５’に隣接し；かつ第１の標的核酸配列（存在する場合）の５’に隣接した配列と一致しない配列を有する第１の保護体バランス領域を有する核酸を含み；相補体鎖は、第１のヘアピン領域の５’に隣接し；かつ第１の保護体バランス領域の配列と相補的である配列を有する第１の相補体バランス領域；第１の相補体バランス領域の５’に隣接し；かつ第１の保護体分岐点移動領域と相補的である配列を有する第１の相補体分岐点移動領域；第１の相補体分岐点移動領域の５’に隣接し；かつ第１の標的核酸配列の３’に隣接した第２の標的核酸配列と相補的である配列を有するトーホールド領域；トーホールド領域の５’に隣接し；かつ第２の標的核酸配列の３’に隣接した第３の標的核酸配列と相補的である配列を有する第２の相補体分岐点移動領域；第２の相補体分岐点移動領域の５’に隣接し；第３の標的核酸配列（存在する場合）の３’に隣接した配列と相補的でない配列を有する第２の相補体バランス領域を有する核酸を含み；第２の保護体鎖は、第２の相補体バランス領域と相補的である配列を有する第２の保護体バランス領域；および第２の保護体バランス領域の５’に隣接し；かつ第２の相補体分岐点移動領域と相補的である配列を有する第２の保護体分岐点移動領域を含み；第１の相補体バランス領域および第２の相補体バランス領域は、下記式のような配列を有し：

式中、ΔＧ°_１は、第１の保護体バランス領域と第１の相補体バランス領域とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり；ΔＧ°_２は、第１の相補体バランス領域と第１の標的核酸配列（存在する場合）の５’に隣接した配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり；ΔＧ°_３は、第２の保護体バランス領域と第２の相補体バランス領域とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり；ΔＧ°_４は、第２の相補体バランス領域と第３の標的核酸配列（存在する場合）の３’に隣接した配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり；およびΔＧ°_５は、トーホールド領域と第２の標的核酸配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり；Ｒは理想気体定数であり；Ｔは、プライマーデュプレックスシステムを使用する温度であり；ｃは、プライマーデュプレックスシステムを使用する濃度であり；ΔＧ°_Ｒは３．５ｋｃａｌ／ｍｏｌであるプライマーデュプレックスシステムである。

なお別の態様では、本明細書で提供されるのは、３’から５’方向に、第１の保護体鎖、第１のヘアピン領域、相補体鎖、第２のヘアピン領域および第２の保護体鎖を含むプライマーデュプレックスシステムであって、第１の保護体鎖は第１の標的核酸配列と一致する配列を有し；第１のヘアピン領域は第１の保護体鎖の５’に隣接し；相補体鎖は、第１のヘアピン領域の５’に隣接し；かつ第１の保護体鎖の配列と相補的である配列を有する第１の相補体分岐点移動領域；第１の相補体分岐点移動領域の５’に隣接し；かつ第１の標的核酸配列の３’に隣接した第２の標的核酸配列と相補的である配列を有するトーホールド領域；およびトーホールド領域の５’に隣接し；かつ第２の核酸配列の３’に隣接した第３の標的核酸配列と相補的である配列を有する第２の相補体分岐点移動領域を含み；第２のヘアピン領域は第２の相補体分岐点移動領域の５’に隣接し；第２の保護体鎖は、第２の相補体分岐点移動領域の配列と相補的である配列を有するプライマーデュプレックスシステムである。

前述の態様のいずれか１つでは、ΔＧ°_Ｒは、２．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、１．０ｋｃａｌ／ｍｏｌまたは０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌであってもよく；および／またはｃは約１０ｎＭであってもよく；および／またはＴは約２９３Ｋまたは約３３８Ｋであってもよく；および／またはトーホールド領域は、４〜２０ヌクレオチド長、約４〜１５ヌクレオチド長または約４〜１０ヌクレオチド長であってもよく；および／または保護体分岐点移動領域の第１の末端は、５’または３’であってもよく；および／またはプライマーデュプレックスシステムは官能性を有する蛍光基または色素をさらに含んでもよく；および／またはプライマーデュプレックスシステムは固体支持体に固定化してもよく；および／またはヘアピン領域は２０ヌクレオチド長以下または１０ヌクレオチド長以下であってもよく；および／またはヘアピン領域の配列はポリアデノシン配列、ポリデオキシアデノシン配列、ポリ５’−メチルウリジン配列、ポリチミジン配列、ポリグアノシン配列、ポリデオキシグアノシン配列、ポリシチジン配列、ポリデオキシシチジン配列、ポリウリジン配列、およびポリデオキシウリジン配列からなる群から選択されてもよく；および／または第１の標的核酸配列および／または第２の標的核酸配列は、生物またはウイルスに天然に存在する配列であってもよく；および／または第１の標的核酸配列および／または第２の標的核酸配列は、マイクロＲＮＡに天然に存在する配列であってもよい。

一態様では、本明細書で提供されるのは、サンプル中の標的核酸を検出する方法であって、本明細書に記載の実施形態のいずれか１つのプライマーデュプレックスシステムと標的核酸を接触させること；および標的核酸とプライマーデュプレックスシステムの少なくとも一部との複合体の形成を検出することを含む方法である。いくつかの実施形態では、プライマーデュプレックスシステムは、官能性を有する蛍光基または色素をさらに含む。いくつかの実施形態では、プライマーデュプレックスシステムを固体支持体に固定化する。いくつかの実施形態では、接触は細胞内で起こる。いくつかの実施形態では、標的核酸は、生物またはウイルスに天然に存在する核酸である。いくつかの実施形態では、標的核酸はマイクロＲＮＡである。

別の態様では、本明細書で提供されるのは、標的核酸中に含まれる配列を増幅させる方法であって、標的核酸；本明細書に記載の実施形態のいずれか１つのプライマーデュプレックスシステム；および増幅反応を実施するための試薬を含む溶液を形成すること；および標的核酸中に含まれる配列が増幅されるような条件下で溶液をインキュベートすることを含む方法である。いくつかの実施形態では、標的核酸は、生物またはウイルスに天然に存在する核酸である。

前述ならびに本発明の他の態様および実施形態について、本明細書に詳細に説明する。

例示的な核酸プローブシステムを図示する。 例示的な核酸プローブシステムを図示する。 例示的な核酸プローブシステムを図示する。 例示的な核酸プローブシステムを図示する。 例示的な核酸プローブシステムを図示する。 例示的な核酸プローブシステムを図示する。 例示的な核酸プローブシステムを図示する。 例示的な核酸プローブシステムを図示する。 例示的な核酸プローブシステムを図示する。 核酸プローブシステムの例示的な使用方法を図示する。 核酸プローブシステムの例示的な使用方法を図示する。 核酸プローブシステムの例示的な使用方法を図示する。 核酸プローブシステムの例示的な使用方法を図示する。 核酸プローブシステムの例示的な使用方法を図示する。 本明細書で提供されるプライマーデュプレックスを使用した高度に特異的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を図示する。 単１ヌクレオチド識別によるプライマーハイブリダイゼーションの実験的証明を示す。 プライマーデュプレックスの単１塩基識別能に関する別の実験結果および統計を示す。 デュプレックスプライマーを用いて類似反復標的のＰＣＲの収率を向上させた実験結果を示す。

プローブを用いた核酸アッセイの重要な課題は、標的の配列に類似した配列を有する核酸が、強い熱力学および速い反応速度（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）で標的の相補体にハイブリダイズすることである。しかしながら、本明細書に記載するように、鎖置換反応の反応速度（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）および熱力学が部分的に分離され得るため、ごくわずか熱力学的に有利であるか、または不利でさえある反応でも、２本の相補鎖のハイブリダイゼーションと同じ速さの反応速度（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を有することができる。本明細書に記載の組成物および方法は、この分離機構を利用して改善された特異性および反応速度（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を有する核酸プローブシステムを提供する。

本明細書で提供されるのは、高度に特異的な核酸プローブシステム、およびこうしたプローブシステムの使用方法である。ある種の実施形態では、本明細書に記載の核酸プローブシステムは、相補体プローブの一部と相補的な保護体領域により擬似標的とのハイブリダイゼーションを防止する、標的配列と相補的な領域を有する相補体プローブを含む。標的と保護されたプローブとの結合の自由エネルギーは、標的核酸配列またはその相補体と一致しない配列を有する１つ以上のバランシング領域の合理的に設計される塩基により精密に制御される。ある種の実施形態では、保護体および相補体プローブは、単一核酸分子上にいくつかの領域を形成し、１つ以上の核酸ヘアピンにより相互に隔てられる。

本明細書に記載の方法および組成物は、ハイブリダイゼーションアッセイにおいてそれらを使用しやすくするいくつかの独特の特性を有する。第１に、本明細書に記載の核酸プローブシステムは、標的と擬似標的との間のわずかな配列の違いを、プローブと標的とのハイブリダイゼーションと、プローブと擬似標的とのハイブリダイゼーションとの間の結合親和性および反応速度における大きな違いに確実に変換する。第２に、本明細書に記載の核酸プローブシステムは、広範囲に及ぶ温度および塩濃度のいずれでも作動するように設計することが可能であり、したがって多様な実験条件下で確実に機能することができる。第３に、本明細書に記載の核酸プローブシステムを使用すると、室温でも反応速度的に（ｋｉｎｅｔｉｃａｌｌｙ）速いハイブリダイゼーション反応を起こすことができ、核酸の迅速でハイスループットな解析が容易になる。第４に、本明細書に記載の核酸プローブシステムは合理的に設計され、したがって他の生体分子と不都合にまたは予想外に相互作用するとは考えにくい。

よって、本明細書で提供されるのは、プライマー組成物、そうした組成物の製造方法、およびその使用方法である。本明細書に記載の実施形態は、一部が二本鎖で一部が一本鎖であるプライマー（たとえば、部分的にハイブリダイズしたプライマーの対、または単一の自己ハイブリダイズプライマー）を、たとえば、核酸合成反応に使用すると、完全に相補的な標的と１つ以上のミスマッチを有する標的（すなわち、擬似標的）とを識別することができるという発見に一部基づく。本明細書に証明されたように、本明細書に記載のプライマーデュプレックスは、たとえば、類似反復配列を有する標的などの擬似標的を使用するＰＣＲ反応において標準的なプライマーより優れている。

本明細書のプライマーデュプレックスは、プライマーデュプレックスが標的に対する結合を開始する、本明細書で「トーホールド」という一本鎖領域と、単一のプライマー鎖が標的と（プライマーの全長に沿って）ハイブリダイゼーションを完了しないように自然に解離する二本鎖「バランス領域」と、トーホールド領域とバランス領域との間に標的核酸配列と完全に相補的である二本鎖分岐点移動領域と、を含む。機構的には、標的とのハイブリダイゼーションは、トーホールドから始まり、プライマーがもはや「二本鎖」でなくなるまで相補体鎖の長さに沿って継続すると考えられる。これは、標的と分岐領域との間の相補性も想定している。本明細書で使用する場合、核酸「領域」または「ドメイン」は、任意の長さの一続きのヌクレオチドの連続である。「標的」と相補体鎖との間にヌクレオチドのミスマッチが存在する場合、第２の鎖（すなわち、保護体鎖）の置換は熱力学的に不利であり、相補体鎖と「標的」との間の結合が消失する。この後者の説明では、「標的」は、相補体鎖と異なるヌクレオチドまたはミスマッチを含むことから、実際には擬似標的であることが理解されよう。

標準自由エネルギーは、ミスマッチ（たとえば、単１ヌクレオチド変化）よりもむしろ、核酸の標的配列と、プライマーの分岐点移動領域にトーホールド領域を加えた領域との間の完全な一致（完全に相補的）に有利に働くため、プライマーの第１の（相補体）鎖は、ミスマッチの非存在下では標的に安定に結合するが、ミスマッチの存在下では標的に安定に結合しない。プライマーの第１の（相補体）鎖と標的との間にミスマッチが存在する場合、プライマーデュプレックスは、新たに露出された一本鎖バランス領域により再編成することをより好む。こうして、標的中（または、さらにはサンプル中）の誤った位置で核酸合成反応が開始される頻度が低下する。こうした反応においてミスマッチのプライマー鎖が結合することをより好む競合核酸鎖（保護体鎖など）が存在しないため、この種の識別は典型的には、従来技術の標準的な一本鎖プライマーを使用しても不可能である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のプライマーは、従来のプライマー（たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅に使用されるプライマー）より著しく長くてもよい。本プライマーは、融解温度ではなく、特異性において競合する保護体鎖の存在に依存して相補配列とミスマッチ配列とを識別するためである。したがって、本プライマーは、温度非依存的な形で選択および使用してもよい。

よって、本明細書に記載のプライマーデュプレックスは、たとえば核酸合成反応の特異性を高め、いくつかの実施形態では、プライマーのマルチプレックス化の程度を大きくすることができる。結果を本明細書に示した予備実験から、本明細書で提供されるプライマーデュプレックスを用いると、標準的なプライマーと比較して類似反復標的のＰＣＲの収率を著しく向上させることができることが示される（たとえば、７５％対３０％）。本明細書に記載のプライマーデュプレックスはまた、たとえば、ヒトＤＮＡからなるサンプルから細菌ＤＮＡを検出および増幅するなど不均一な核酸群からの特定の核酸の検出および増幅にも対応し、生物兵器用病原体などの稀な生物の検出に対する適用性が広い。

プライマーデュプレックス
本明細書で使用する場合、本発明のプライマーは、本発明のプライマーが二本鎖領域を含む構造物として提供および／または存在してもよいこと伝えるため、「プライマーデュプレックス」と呼ぶ場合がある。したがって、「プライマー」および「プライマーデュプレックス」という用語は、同義で使われることがある。

プライマーデュプレックスは、既存のプライマーより特異性および反応速度（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を向上させる。本明細書の「プライマーデュプレックス」とは、第１の鎖（本明細書で「相補体鎖」という）および第１の鎖と部分的に相補的な第２の鎖（本明細書で「保護体鎖」という）を含むプライマーをいう。いくつかの実施形態では、相補体鎖および保護体鎖は、別々の一本鎖核酸分子である（図１Ａおよび１Ｂ）。他の実施形態では、相補体鎖および保護体鎖は相互に連結され、ヘアピン領域で隔てられ、単一核酸分子の連続する領域を形成する（図２Ａおよび２Ｂ）。本明細書で使用する場合、「ヘアピン領域」は、核酸の２つの二本鎖領域を連結するヌクレオチドの一本鎖ループである。例示的なプライマーデュプレックスの一般的な構造は、各図に示し、本明細書に記載する。相補体領域または保護体領域（またはその逆）を参照すると、多くの場合、各領域が典型的には単一の「プライマーデュプレックス」（または単一のプライマーシステム）内にあることが理解されよう。たとえば、本発明のプライマーの相補体バランス領域は、同じプライマーの保護体バランス領域と相補的であるため、本発明のあるプライマー相補体バランス領域は、物理的に分離した別のプライマーの保護体バランス領域とハイブリダイズしない。

本発明のプライマーが一本鎖のみからなる複数の実施形態では、相補体「鎖」を相補体領域という場合があり、保護体「鎖」を保護体領域という場合がある。

ある種の実施形態では、相補体鎖（または領域）はトーホールド領域と、相補体分岐点移動領域と、相補体バランス領域とを含むのに対し、保護体鎖（または領域）は保護体分岐点移動領域と保護体バランス領域とを含む。本明細書で使用する場合、核酸「領域」は、任意の長さの一続きのヌクレオチドの連続である。トーホールド領域および分岐点移動領域は各々、標的核酸中の隣接領域と相補的であるように設計され、したがって標的核酸中の隣接領域と「塩基対を形成する」（たとえば、ハイブリダイズする）。標的核酸中の領域と塩基対を形成する相補体鎖の領域を「標的特異的」領域という。バランス領域は、標的核酸と相補的でないように設計され、したがって標的核酸と塩基対を形成しない。よって、バランス領域を「標的非特異的」領域という。ある態様では、相補体鎖（または領域）および保護体鎖（または領域）が相互にハイブリダイズする（二本鎖である）と、プライマーデュプレックスが形成される。このため、いくつかの態様では、プライマーデュプレックスは、標的特異的一本鎖トーホールド領域と、標的特異的二本鎖分岐点移動領域と、標的非特異的二本鎖バランス領域とを含む（図１Ａおよび１Ｂ）。場合によっては、プライマーデュプレックスはまた、以下により詳細に記載するようにヘアピンループも含む。

本明細書に記載のプライマーデュプレックスは、標的核酸と特異的にハイブリダイズするように設計してもよい。たとえば、核酸増幅反応におけるプライマーの有効性は、プライマーの特異性、効率および忠実度に依存する。典型的な核酸プライマーは、多くの場合、ミスマッチのデュプレックスおよび完全にハイブリダイズしたデュプレックスの融解温度を除いて、その目的の特異的標的核酸と結合する同じプライマーの熱力学的および反応速度的（ｋｉｎｅｔｉｃ）プロファイルと同程度の熱力学的および反応速度的（ｋｉｎｅｔｉｃ）プロファイルで擬似標的に結合する。したがって、ミスマッチのデュプレックスと完全なデュプレックスとは、それらの融解温度により区別することができる。これに対し、本発明のプライマーは、相対的に温度非依存的に擬似標的と本当の標的とを区別する。

本明細書の「擬似標的」とは、相補体鎖とハイブリダイズする領域内の少なくとも１つのヌクレオチドが標的核酸分子と異なる核酸分子をいう。たとえば、標的が

である場合、

は擬似標的である。ある種の実施形態では、擬似標的は、標的に対して少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ以上のヌクレオチド変化を含む。擬似標的に結合するプライマーは、たとえば、核酸増幅の忠実度（正確性）を低下させる。本明細書に示したプライマーデュプレックスは、擬似標的との鎖置換の標準自由エネルギーを変化させ、正しい標的と、正しい標的と１ヌクレオチドのみ異なる擬似標的を含む擬似標的との識別をできるように設計される。本明細書に記載するように、標準自由エネルギーを変化させて相補体鎖が正しい標的と擬似標的とを識別できるようにするには、保護体鎖が関わっている。

本明細書に記載のプライマーは、鎖置換反応の反応速度（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）および熱力学が部分的に分離するように反応速度（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）および熱力学を微調整して鎖置換反応を容易にするように合理的に設計される。この分離の結果、反応がごくわずかに熱力学的に有利または不利であっても、反応は２つの相補鎖のハイブリダイゼーションと同じ速さの反応速度（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を有する。

たとえば、プライマーと完全に相補的な（正しいまたは特異的な）標的（すなわち、１００％一致のヌクレオチド）とのハイブリダイゼーションの濃度調整標準自由エネルギーは、３７℃および１ＭのＮａ^＋で擬似標的が目的の標的と異なるヌクレオチドごとに、同じプライマーと擬似標的とのハイブリダイゼーションの濃度調整標準自由エネルギーより１．９ｋｃａｌ／ｍｏｌ〜６．６ｋｃａｌ／ｍｏｌ有利である。ある種の実施形態では、本プライマーデュプレックスは、トーホールド交換の鎖置換反応を使用してこの濃度調整標準自由エネルギーの１．９〜６．６ｋｃａｌ／ｍｏｌの差を標的と擬似標的との最適な識別に置き換える。標的核酸に結合するプライマーデュプレックスの熱力学／反応速度（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）の例を、図３Ａおよび３Ｂを参照しながら以下の通り記載する。

この例では、標的核酸は、少なくとも２つの領域（１）および（２）を有する。ある種の実施形態では、領域（１）は、約１０〜約２００（１４〜２００または２０〜２００など）ヌクレオチド長であってもよく、一方、領域２はより短く、たとえば、約４〜約２０ヌクレオチド長であってもよい。本明細書で使用する場合、「ヌクレオチド」および「塩基」という用語は、同義で使われる。保護体鎖は、保護体バランス領域（３）に隣接する保護体分岐点移動領域を含む。保護体分岐点移動領域は標的領域１と一致するのに対し、保護体バランス領域（３）は、領域（１）または領域（２）または標的領域の５’に隣接した任意の領域と一致しない。核酸配列、ドメインまたは領域と、もう１つの配列とが同じ核酸分子の一部であり、かつ塩基が２つの配列を隔てない場合、核酸配列、ドメインまたは領域は、もう１つの配列「に直接隣接する」、もう１つの配列の「５’に隣接する」、または「３’に隣接する」。相補体鎖は、相補体バランス領域

と、相補体分岐点移動領域

と、トーホールド領域

とを含む。相補体バランス領域

は、保護体バランス領域（３）と相補的であり、相補体分岐点移動領域

は、保護体分岐点移動領域および標的領域（１）と相補的である（すなわち、保護体分岐点移動領域および標的領域（１）は配列が同一であり、この２つはどちらも相補体分岐点移動領域

に結合し、トーホールド領域

は標的領域（２）と相補的である。

ある種の実施形態では、バランス領域は、その濃度調整標準自由エネルギー

が、標的領域（２）に結合するトーホールド領域の濃度調整標準自由エネルギー

と同じまたはほぼ同じになるように設計される。場合によっては、３７℃の反応に使用する１０ナノモル（ｎＭ）のプライマーの場合、

（縦棒は絶対値を示す）は各々、標的からの全保護体鎖の解離を確実なものにするため約１１．３ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満にすべきである。

いくつかの実施形態では、プライマーデュプレックスが特異的（正しい）標的核酸分子と相互作用する場合（図３Ａ）、

の解離および

の結合は相互に釣り合っており、

ハイブリダイゼーションの熱力学は、相補体鎖と相互作用している標的核酸、および相補体鎖と相互作用している保護体鎖と同一である。２つの状態間の全自由エネルギー変化は、比較的に小さく（たとえば、約１ｋｃａｌ／ｍｏｌ）、反応は速やかに（たとえば、１分未満で）約５０：５０の平衡状態に到達する。ある種の実施形態では、バランス領域は、平衡状態のバランスが、たとえば、６０：４０または７０：３０になるように、標的領域２に結合するトーホールド領域に非常近い標準自由エネルギーを有するように設計してもよい。いくつかの実施形態では、バランス領域の設計は、反応中の自由エネルギー変化の他の寄与因子、たとえば保護体バランス領域と上流標的配列とのハイブリダイゼーション（場合によっては無視し得る）、ヘアピンの保持（存在する場合）、使用予定の温度および予定のプライマー濃度をさらに考慮に入れてもよい。

いくつかの実施形態では、プライマーデュプレックスが代わりに擬似標的核酸分子と相互作用する場合（図３Ｂ）、擬似標的領域（２ｍ）がトーホールド領域と完全には相補的でないため、

の解離および（２ｍ）：（２）の結合は釣り合わない。その結果、平衡状態はプライマーデュプレックスが擬似標的に結合しない状態に移動する。

別の方法で説明すると、場合によっては、保護体鎖に結合した相補体鎖の自由エネルギーは

であり（任意選択のヘアピン領域および他の考慮すべき事項からの寄与を無視）、これは特異的標的に結合した相補体鎖の自由エネルギー

と釣り合う。この例では、その理由は、プライマーデュプレックスのバランス領域（３）が、標的領域（２）と等しい（またはほぼ等しい）濃度調整標準自由エネルギーを有するように設計されているからである。プライマーデュプレックスが標的領域（２ｍ）内に１ヌクレオチド（塩基）変化を有する擬似標的と相互作用すると、システムの自由エネルギー

は、プライマーデュプレックスの自由エネルギーより負に小さくなり、したがって平衡状態において不利になる。

本明細書で使用する場合、標準自由エネルギーに関する「〜とほぼ等しい」という用語は、第１に言及した自由エネルギーが第２に言及した自由エネルギーの１０％以内であることを意味する。いくつかの実施形態では、第２の自由エネルギーとほぼ等しい第１の自由エネルギーは、第２の自由エネルギーの約＋３ｋｃａｌ／ｍｏｌ〜約−３ｋｃａｌ／ｍｏｌ以内である。いくつかの実施形態では、第１の真のエネルギーと第２の真のエネルギーとの差は、約１ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下、約２ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下、または約３ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下、約３．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下、またはそれ以上であってもよいことが理解されよう。

図３Ｂは、標的核酸分子の領域（２）／（２ｍ）に対応する単１ヌクレオチド変化を図示するものであるが、本プライマーデュプレックスはまた、特異的標的と領域（１）にヌクレオチド変化を有する擬似標的とを識別することもできる。擬似標的が標的領域１に単１塩基変化を有する場合、結合後のプライマーデュプレックスの標準自由エネルギーは、

となり、

は、プライマーデュプレックスの相補体領域

結合に結合するミスマッチの標的領域（１）の標準自由エネルギーである。１塩基変化により、プライマーデュプレックスの自由エネルギーは、

（保護体に結合した相補体プライマーの自由エネルギー）より負に小さくなるため、平衡状態は、プライマーデュプレックスが擬似標的領域に結合しない状態に移動する。標準自由エネルギーは、当該技術分野における知識および本明細書で提供される教示内容に基づき理論的に算出することができる。

相補体鎖、領域またはドメインおよび保護体鎖、領域またはドメイン
本明細書に記載の核酸プローブシステムの相補体ドメインは各々、トーホールド領域および１つ以上の相補体標的領域など複数の領域を含む。トーホールド領域および１つ以上の相補体標的領域はどちらも、標的核酸の核酸配列と相補的である核酸配列を有する。したがってトーホールド領域および相補体標的領域は、核酸プローブシステムが適切なハイブリダイゼーション条件下、標的核酸と接触すると、標的核酸の配列と塩基対を形成し、よって複合体を形成することができる。相補体ドメインはまた、１つ以上の相補体バランス領域も含む。１つ以上の相補体バランス領域は、合理的に設計される。このため、１つ以上の相補体バランス領域の配列は、標的核酸配列と相補的であるように設計されない。

トーホールド領域は、標的核酸分子内の配列と相補的である（したがってハイブリダイズする）一方、トーホールド領域は、保護体鎖にハイブリダイズしない。このため、相補体鎖が標的核酸分子にハイブリダイズすると、トーホールド領域も標的核酸分子にハイブリダイズするが、相補体鎖が保護体鎖にハイブリダイズすると、トーホールド領域は一本鎖のままである。トーホールド領域は、相補体鎖の３’末端に配置しても、または５’末端に配置してもよい（たとえば、トーホールド領域は、相補体鎖の３’末端または５’末端の伸長部である）。

ある種の実施形態では、トーホールド領域は、約４ヌクレオチド長から約２０ヌクレオチド長、約４ヌクレオチド長から約１５ヌクレオチド長、または約４ヌクレオチド長から約１０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、トーホールド領域は、４ヌクレオチド長、５ヌクレオチド長、６ヌクレオチド長、７ヌクレオチド長、８ヌクレオチド長、９ヌクレオチド長、１０ヌクレオチド長、１１ヌクレオチド長、１２ヌクレオチド長、１３ヌクレオチド長、１４ヌクレオチド長、１５ヌクレオチド長、１６ヌクレオチド長、１７ヌクレオチド長、１８ヌクレオチド長、１９ヌクレオチド長または２０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、トーホールド領域は、２０ヌクレオチド長より大きく、たとえば約２５ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、３５ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、４５ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、５５ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、６５ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、７５ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、８５ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、９５ヌクレオチド、１００以上のヌクレオチドである。

相補体分岐点移動領域は、標的核酸分子および保護体分岐点移動領域の配列と相補的である。このため、相補体鎖が標的核酸分子にハイブリダイズすると、相補体分岐点移動領域も標的核酸にハイブリダイズする。相補体鎖がその保護体鎖にハイブリダイズすると、相補体分岐点移動領域は保護体分岐点移動領域にハイブリダイズする。

ある種の実施形態では、分岐点移動領域は、２００ヌクレオチド長以下、１００ヌクレオチド長以下、７５ヌクレオチド長以下、５０ヌクレオチド長以下、４０ヌクレオチド長以下、３０ヌクレオチド長以下、２５ヌクレオチド長以下または２０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、分岐点移動領域は約１０ヌクレオチド長から約２００ヌクレオチド長である。ある種の実施形態では、分岐点移動領域は、約１０ヌクレオチド長から約１５０ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド長から約１００ヌクレオチド、または約１０ヌクレオチド長から約５０ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、分岐点移動領域は、１０ヌクレオチド長、１１ヌクレオチド長、１２ヌクレオチド長、１３ヌクレオチド長、１４ヌクレオチド長、１５ヌクレオチド長、１６ヌクレオチド長、１７ヌクレオチド長、１８ヌクレオチド長、１９ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、２１ヌクレオチド長、２２ヌクレオチド長、２３ヌクレオチド長、２４ヌクレオチド長、２５ヌクレオチド長、２６ヌクレオチド長、２７ヌクレオチド長、２８ヌクレオチド長、２９ヌクレオチド長、３０ヌクレオチド長、３１ヌクレオチド長、３２ヌクレオチド長、３３ヌクレオチド長、３４ヌクレオチド長、３５ヌクレオチド長、３６ヌクレオチド長、３７ヌクレオチド長、３８ヌクレオチド長、３９ヌクレオチド長、４０ヌクレオチド長、４１ヌクレオチド長、４２ヌクレオチド長、４３ヌクレオチド長、４４ヌクレオチド長、４５ヌクレオチド長、４６ヌクレオチド長、４７ヌクレオチド長、４８ヌクレオチド長、４９ヌクレオチド長、５０ヌクレオチド長、５１ヌクレオチド長、５２ヌクレオチド長、５３ヌクレオチド長、５４ヌクレオチド長、５５ヌクレオチド長、５６ヌクレオチド長、５７ヌクレオチド長、５８ヌクレオチド長、５９ヌクレオチド長、６０ヌクレオチド長、６１ヌクレオチド長、６２ヌクレオチド長、６３ヌクレオチド長、６４ヌクレオチド長、６５ヌクレオチド長、６６ヌクレオチド長、６７ヌクレオチド長、６８ヌクレオチド長、６９ヌクレオチド長、７０ヌクレオチド長、７１ヌクレオチド長、７２ヌクレオチド長、７３ヌクレオチド長、７４ヌクレオチド長、７５ヌクレオチド長、７６ヌクレオチド長、７７ヌクレオチド長、７８ヌクレオチド長、７９ヌクレオチド長、８０ヌクレオチド長、８１ヌクレオチド長、８２ヌクレオチド長、８３ヌクレオチド長、８４ヌクレオチド長、８５ヌクレオチド長、８６ヌクレオチド長、８７ヌクレオチド長、８８ヌクレオチド長、８９ヌクレオチド長、９０ヌクレオチド長、９１ヌクレオチド長、９２ヌクレオチド長、９３ヌクレオチド長、９４ヌクレオチド長、９５ヌクレオチド長、９６ヌクレオチド長、９７ヌクレオチド長、９８ヌクレオチド長、９９ヌクレオチド長、１００ヌクレオチド長、１０１ヌクレオチド長、１０２ヌクレオチド長、１０３ヌクレオチド長、１０４ヌクレオチド長、１０５ヌクレオチド長、１０６ヌクレオチド長、１０７ヌクレオチド長、１０８ヌクレオチド長、１０９ヌクレオチド長、１１０ヌクレオチド長、１１１ヌクレオチド長、１１２ヌクレオチド長、１１３ヌクレオチド長、１１４ヌクレオチド長、１１５ヌクレオチド長、１１６ヌクレオチド長、１１７ヌクレオチド長、１１８ヌクレオチド長、１１９ヌクレオチド長、１２０ヌクレオチド長、１２１ヌクレオチド長、１２２ヌクレオチド長、１２３ヌクレオチド長、１２４ヌクレオチド長、１２５ヌクレオチド長、１２６ヌクレオチド長、１２７ヌクレオチド長、１２８ヌクレオチド長、１２９ヌクレオチド長、１３０ヌクレオチド長、１３１ヌクレオチド長、１３２ヌクレオチド長、１３３ヌクレオチド長、１３４ヌクレオチド長、１３５ヌクレオチド長、１３６ヌクレオチド長、１３７ヌクレオチド長、１３８ヌクレオチド長、１３９ヌクレオチド長、１４０ヌクレオチド長、１４１ヌクレオチド長、１４２ヌクレオチド長、１４３ヌクレオチド長、１４４ヌクレオチド長、１４５ヌクレオチド長、１４６ヌクレオチド長、１４７ヌクレオチド長、１４８ヌクレオチド長、１４９ヌクレオチド長、１５０ヌクレオチド長、１５１ヌクレオチド長、１５２ヌクレオチド長、１５３ヌクレオチド長、１５４ヌクレオチド長、１５５ヌクレオチド長、１５６ヌクレオチド長、１５７ヌクレオチド長、１５８ヌクレオチド長、１５９ヌクレオチド長、１６０ヌクレオチド長、１６１ヌクレオチド長、１６２ヌクレオチド長、１６３ヌクレオチド長、１６４ヌクレオチド長、１６５ヌクレオチド長、１６６ヌクレオチド長、１６７ヌクレオチド長、１６８ヌクレオチド長、１６９ヌクレオチド長、１７０ヌクレオチド長、１７１ヌクレオチド長、１７２ヌクレオチド長、１７３ヌクレオチド長、１７４ヌクレオチド長、１７５ヌクレオチド長、１７６ヌクレオチド長、１７７ヌクレオチド長、１７８ヌクレオチド長、１７９ヌクレオチド長、１８０ヌクレオチド長、１８１ヌクレオチド長、１８２ヌクレオチド長、１８３ヌクレオチド長、１８４ヌクレオチド長、１８５ヌクレオチド長、１８６ヌクレオチド長、１８７ヌクレオチド長、１８８ヌクレオチド長、１８９ヌクレオチド長、１９０ヌクレオチド長、１９１ヌクレオチド長、１９２ヌクレオチド長、１９３ヌクレオチド長、１９４ヌクレオチド長、１９５ヌクレオチド長、１９６ヌクレオチド長、１９７ヌクレオチド長、１９８ヌクレオチド長、１９９ヌクレオチド長または２００ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、分岐点移動領域は、目的の標的核酸分子に応じて２００ヌクレオチド長を超えてもよい。

相補体鎖および保護体鎖のバランス領域は、相互に相補的である（すなわち、二本鎖核酸を形成する）が、目的の標的と相補的ではない（すなわち、どちらも標的と二本鎖核酸を形成しない）。このため、相補体鎖が標的核酸分子にハイブリダイズすると、相補体バランス領域は、標的核酸分子にハイブリダイズしない。相補体鎖がその保護体鎖にハイブリダイズすると、相補体バランス領域は保護体バランス領域にハイブリダイズする。

バランス領域の設計は、トーホールド領域の設計により決まる。いくつかの実施形態では、バランス領域は、バランス領域の熱力学的プロファイルがトーホールド領域のそれと同程度であるように設計される。いくつかの実施形態では、熱力学的プロファイルは、たとえば、ＲＰＩのｂｉｏｉｎｆｏウェブサイトで入手可能なソフトウェアＭｆｏｌｄを使用した理論的モデルに基づく。バランス領域内のヌクレオチドの数および／または性質は、トーホールド領域のそれと同様である。たとえば、トーホールド領域が４０％ＡおよびＴヌクレオチドと、６０％ＧおよびＣヌクレオチドとからなる場合、バランス領域も、４０％ＡおよびＴヌクレオチドと、６０％ＧおよびＣヌクレオチドとからなるべきである。複数の実施形態では、バランス領域は、標的核酸へのバランス領域の結合を回避するため、３つまでの連続したヌクレオチドが標的核酸の配列と相補的でないように設計される。

いくつかの実施形態では、バランス領域の長さは、相補体および保護体が相互に自然に解離するように十分に短い。いくつかの実施形態では、バランス領域は、約４ヌクレオチド長から約２０ヌクレオチド長、約４ヌクレオチド長から約１５ヌクレオチド長、または約４ヌクレオチド長から約１０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、バランス領域は、４ヌクレオチド長、５ヌクレオチド長、６ヌクレオチド長、７ヌクレオチド長、８ヌクレオチド長、９ヌクレオチド長、１０ヌクレオチド長、１１ヌクレオチド長、１２ヌクレオチド長、１３ヌクレオチド長、１４ヌクレオチド長、１５ヌクレオチド長、１６ヌクレオチド長、１７ヌクレオチド長、１８ヌクレオチド長、１９ヌクレオチド長または２０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、バランス領域は、たとえば約２５未満のヌクレオチド、３０未満のヌクレオチド、３５未満のヌクレオチド、４０未満のヌクレオチド、４５未満のヌクレオチド、５０未満のヌクレオチド、５５未満のヌクレオチド、６０未満のヌクレオチド、６５未満のヌクレオチド、７０未満のヌクレオチド、７５未満のヌクレオチド、８０未満のヌクレオチド、８５未満のヌクレオチド、９０未満のヌクレオチド、９５未満のヌクレオチド、１００以上未満のヌクレオチドなど２０ヌクレオチドより大きい。いくつかの実施形態では、バランス領域が標的核酸に結合しないのであれば、標的核酸中のヌクレオチド配列と相補的である連続したヌクレオチドの数は、３より大きくてもよい。

いくつかの実施形態、たとえばプライマーデュプレックスが２つの別々の核酸鎖を含む実施形態では、バランス領域の設計は、プライマーデュプレックスの濃度またはプライマーデュプレックスが形成／使用される温度に左右されない。いくつかの実施形態では、バランス領域は、保護体鎖が、標的核酸分子により相補体鎖から除去される反応の標準自由エネルギーは、０ｋｃａｌ／ｍｏｌに近くなるように設計される。本明細書で使用する場合、「ゼロに近い」とは、反応の標準自由エネルギーが０ｋｃａｌ／ｍｏｌから３．５ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲内であることを意味する。ある種の実施形態では、この置換反応の標準自由エネルギーは、０ｋｃａｌ／ｍｏｌから３．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、３．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、２．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、２．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、０．９ｋｃａｌ／ｍｏｌ、０．８ｋｃａｌ／ｍｏｌ、０．７ｋｃａｌ／ｍｏｌ、０．６ｋｃａｌ／ｍｏｌ、０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、０．４ｋｃａｌ／ｍｏｌ、０．３ｋｃａｌ／ｍｏｌ、０．２ｋｃａｌ／ｍｏｌ、または０．１ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲内である。

他の実施形態、たとえばプライマーデュプレックスが単一核酸分子（たとえば、相補体鎖（または領域またはドメイン）と保護体鎖（または領域またはドメイン）とを隔てるヘアピン領域）により形成される実施形態では、バランス領域の設計は、プライマーデュプレックスの濃度および反応温度に左右される。そうした実施形態では、バランス領域は、保護体鎖が標的核酸により相補体鎖から除去される反応の標準自由エネルギーにＲＴｌｎ（ｃ）を加えた値が０ｋｃａｌ／ｍｏｌに近くなるように設計され、式中、Ｒは一般気体定数（０．００１９８５８７７５（３４）ｋｃａｌ／ｍｏｌ・Ｋ）、Ｔはプライマーデュプレックスを使用する温度、ｃはプライマーデュプレックスを使用する濃度である。いくつかの実施形態では、プライマーデュプレックスを使用する温度は約２７３Ｋ（０℃）、２７７Ｋ、２８３Ｋ、２８８Ｋ、２９３Ｋ、２９８Ｋ、３０３Ｋ、３０８Ｋ、３１３Ｋ、３１８Ｋ、３２３Ｋ、３２８Ｋ、３３３Ｋ、３３８Ｋ、３４３Ｋ、３４８Ｋ、３５３Ｋ、３５８Ｋまたは３６３Ｋ（９０℃）である。いくつかの実施形態では、プライマーデュプレックスを使用する濃度（ｃ）は、約１ｎＭ、２ｎＭ、３ｎＭ、４ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、１５ｎＭ、２０ｎＭ、２５ｎＭ、３０ｎＭ、３５ｎＭ、。４０ｎＭ、４５ｎＭ、。５０ｎＭ、５５ｎＭ、６０ｎＭ、６５ｎＭ、７０ｎＭ、７５ｎＭ、８０ｎＭ、８５ｎＭ、９０ｎＭ、９５ｎＭ、１００ｎＭ、１２５ｎＭ、１５０ｎＭ、１７５ｎＭ、２００ｎＭ、２２５ｎＭ、２５０ｎＭ、３００ｎＭ、３５０ｎＭ、４００ｎＭ、４５０ｎＭ、５００ｎＭ、６００ｎＭ、７００ｎＭ、８００ｎＭ、９００ｎＭまたは１μＭである。ある種の実施形態では、この置換反応の標準自由エネルギーにＲＴｌｎ（ｃ）を加えた値は、０ｋｃａｌ／ｍｏｌから３．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、３．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、２．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、２．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、０．９ｋｃａｌ／ｍｏｌ、０．８ｋｃａｌ／ｍｏｌ、０．７ｋｃａｌ／ｍｏｌ、０．６ｋｃａｌ／ｍｏｌ、０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、０．４ｋｃａｌ／ｍｏｌ、０．３ｋｃａｌ／ｍｏｌ、０．２ｋｃａｌ／ｍｏｌまたは０．１ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲内である。

いくつかの実施形態では、プライマーデュプレックスは、相補体鎖を保護体鎖に連結する１つ以上のヘアピン領域を含んでもよい。ある種の実施形態では、プライマーデュプレックスのヘアピン領域は、どのような長さであってもよい。いくつかの実施形態では、ヘアピン領域は、３０ヌクレオチド長超、２５ヌクレオチド長超、２０ヌクレオチド長超、１９ヌクレオチド長超、１８ヌクレオチド長超、１７ヌクレオチド長超、１６ヌクレオチド長超、１５ヌクレオチド長超、１４ヌクレオチド長超、１３ヌクレオチド長超、１２ヌクレオチド長超、１１ヌクレオチド長超、１０ヌクレオチド長超、９ヌクレオチド長超、８ヌクレオチド長超、７ヌクレオチド長超、６ヌクレオチド長超、５ヌクレオチド長超、４ヌクレオチド長超または３ヌクレオチド長超である。いくつかの実施形態では、ヘアピンの配列は、標的核酸分子の配列と相補的でない。

ある種の実施形態では、ヘアピン領域は、ポリモノヌクレオチド配列、たとえばポリアデノシン配列、ポリデオキシアデノシン配列、ポリ５’−メチルウリジン配列、ポリチミジン配列、ポリグアノシン配列、ポリデオキシグアノシン配列、ポリシチジン配列、ポリデオキシシチジン配列、ポリウリジン配列またはポリデオキシウリジン配列を有する。

本明細書に記載のプライマーデュプレックスは、少なくとも２つの配向の１つであってもよい。たとえば、ある配向では、トーホールド領域は、相補体分岐点移動領域に直接隣接する５’末端に位置し（すなわち、２つの領域の間に介在するヌクレオチドが存在しない）、相補体バランス領域は、相補体分岐点移動領域に直接隣接し、３’末端に位置する。この配向では、保護体バランス領域は、保護体分岐点移動領域に直接隣接し、保護体鎖の５’末端にある（図１Ａ）。もう１つの配向では、トーホールド領域は、相補体分岐点移動領域に直接隣接する３’末端に位置し、相補体バランス領域は、相補体分岐点移動領域に直接隣接する５’末端に位置する。この配向では、保護体バランス領域は、保護体分岐点移動領域に直接隣接し、保護体鎖の３’末端に位置する（図１Ｂ）。

相補体バランス領域の配列は配向に関係なく、下記式のようになり：

式中、
ΔＧ°_１は、保護体バランス領域と相補体バランス領域とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり；
ΔＧ°_２は、保護体バランス領域と標的核酸配列（存在する場合）に第１の方向で直接隣接する配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり；
ΔＧ°_３は、トーホールド領域と第２の標的核酸配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり；
ΔＧ°_Ｒは３．５ｋｃａｌ／ｍｏｌである。

いくつかの実施形態では、プライマーデュプレックスは、保護体より長い相補体鎖を含み、長さの差は、相補体鎖のトーホールド領域の長さによって異なる。プライマーの長さは、相補体と目的の標的とのハイブリダイゼーションがゼロに近い標準自由エネルギー（ΔＧ°）を有するように設計される。保護体鎖の（プライマーデュプレックスからの）遊離は、このハイブリダイゼーション反応において、エントロピー的に中立であり、濃度の影響を受けにくいようにする。その結果、いくつかの実施形態では、室温（たとえば、約２５℃または約２９８Ｋ）でのこの反応は、多くの条件において融解温度付近で達成されるハイブリダイゼーションの特異性と同等である。

本明細書に意図するように、「ゼロに近い」ΔＧ°（標準自由エネルギーの変化）とは、約１ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下、約２ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下、約３ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下、約３．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下の絶対値（量）をいう。いくつかの実施形態では、バランス領域またはトーホールド領域の標準自由エネルギーが＞−１ｋｃａｌ／ｍｏｌ〜＜１ｋｃａｌ／ｍｏｌ、＞−３ｋｃａｌ／ｍｏｌ〜＜３ｋｃａｌ／ｍｏｌまたは＞−３．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ〜＜３．５ｋｃａｌ／ｍｏｌである。

プライマーデュプレックスは、保護体鎖と相補体鎖との比率約２：１〜約５：１で調製してもよい。いくつかの実施形態では、保護体鎖と相補体鎖との比率は約２：１、約３：１、約４：１または約５：１である。いくつかの実施形態では、保護体鎖と相補体鎖との比率は２：１、２．１：１、２．２：１、２．３：１、２．４：１、２．５：１、２．６：１、２．７：１、２．８：１、２．９：１、３：１、３．１：１、３．２：１、３．３：１、３．４：１、３．５：１、３．６：１、３．７：１、３．８：１、３．９：１、４：１、４．２：１、４．３：１、４．４：１、４．５：１、４．６：１、４．７：１、４．８：１、４．９：１または５：１である。プライマーデュプレックスはまた、本明細書に記載のアッセイまたは反応のいずれで過剰の保護体鎖と共に使用してもよい。保護体鎖は、プライマーに対して約２倍以上のモル過剰、約５倍以上のモル過剰、約１０倍以上のモル過剰、約２０倍以上のモル過剰、約５０倍以上のモル過剰、約１００倍以上のモル過剰または約５００倍以上のモル過剰であってもよい。

ヘアピンプライマーデュプレックスシステム（たとえば、一本鎖システム）
ある種の実施形態では、プライマーデュプレックスは、相補体領域またはドメインと、ヘアピン領域と、保護体領域またはドメインとを含む単一の核酸を含む。いくつかの実施形態では、相補体ドメインは、保護体ドメインにハイブリダイズして、その間にヘアピンループ領域を有するプライマーデュプレックスを形成する。本明細書に開示した他のプライマーシステムと同様、こうしたヘアピンプライマーシステムは、標的核酸分子に特異的にハイブリダイズするように設計される。本明細書の「ヘアピンプライマーデュプレックスシステム」または「ヘアピンシステム」は、相補体バランス領域と、相補体分岐点移動領域と、トーホールド領域と、保護体バランス領域と、保護体分岐点移動領域とを含む。上記のように、相補体バランス領域は保護体バランス領域と相補的であり；相補体分岐点移動領域は保護体分岐点移動領域および標的核酸領域と相補的であり；トーホールド領域は標的核酸領域と相補的である。保護体分岐点移動領域は標的核酸領域と一致し、かつ相補体分岐点移動領域と相補的である。本明細書に記載のヘアピンプライマーデュプレックスシステムは単一核酸分子により形成され、相補体バランス領域の設計は、本明細書に記載するように、プライマーシステムを使用する温度および濃度によって決定される。標的核酸分子の配列を用いてプライマーシステムの特徴を説明してもよいが、いくつかの実施形態では、標的核酸自体がプライマーシステムの成分である場合もあれば、そうでない場合もある（たとえば、二本鎖システムである場合、あるいは一本鎖システムである場合）ことが理解されよう。

ヘアピン領域を有するプライマーデュプレックスの場合、ヘアピン領域の保持の標準自由エネルギーは、保護体鎖が、標的核酸により相補体鎖から除去される反応の標準自由エネルギーを決定するときに考慮してもよい。様々な大きさのヘアピンのヘアピン保持の標準自由エネルギーを表１に示す（ＳａｎｔａＬｕｃｉａ ａｎｄ Ｈｉｃｋｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．，３３：４１４−４４０，（２００４）から）。

表１に示していない長さ（たとえば、ｎの長さ）を有するヘアピン領域の保持の標準自由エネルギーは、以下の式を用いて推計することができる：
ΔＧ°（ループ−ｎ）＝ΔＧ°（ループ−ｘ）＋２．４４ＲＴｌｎ（ｎ／ｘ）
式中、ΔＧ°（ループ−ｎ）は、長さｎのヌクレオチドのヘアピン領域の保持の未知の標準自由エネルギーであり、ΔＧ°（ループ−ｘ）は、長さｎのヌクレオチドのヘアピン領域の保持の既知の標準自由エネルギー（たとえば、表１に示したもの）であり、Ｒは理想気体定数であり、Ｔは、プライマーデュプレックスを使用する温度である。ヘアピン領域保持の標準自由エネルギーの算出に関する追加情報は、その全体を本明細書に援用するＳａｎｔａＬｕｃｉａ ａｎｄ Ｈｉｃｋｓ，ｉｄ．に記載されている。

本明細書に記載のヘアピンプライマーデュプレックスシステムは、少なくとも２つの配向の１つであってもよい。たとえば、図２Ａに示した１つの配向では、トーホールド領域は、核酸分子の５’末端に位置する。相補体分岐点移動領域の５’末端はトーホールド領域の３’末端に直接隣接し；相補体バランス領域の５’末端は相補体分岐点移動領域の３’末端に直接隣接し；ヘアピン領域の５’末端は相補体バランス領域の３’末端に直接隣接し；保護体バランス領域の５’末端はヘアピン領域の３’末端に直接隣接し；保護体分岐点移動領域の５’末端は保護体バランス領域の３’末端に直接隣接する。この配向では、核酸分子がアニーリングを可能にする条件に付されると、ヘアピン領域が、相補体バランス領域および保護体バランス領域から延在するループを形成する。図２Ｂに示したもう１つの配向では、トーホールド領域は、核酸分子の３’末端に位置する。相補体分岐点移動領域の３’末端はトーホールド領域の５’末端に直接隣接し；相補体バランス領域の３’末端は相補体分岐点移動領域の５’末端に直接隣接し；ヘアピン領域の３’末端は相補体バランス領域の５’末端に直接隣接し；保護体バランス領域の３’末端はヘアピン領域の５’末端に直接隣接し；保護体分岐点移動領域の３’末端は保護体バランス領域の５’末端に直接隣接する。

配向に関係なく、ヘアピンプライマーデュプレックスシステムの相補体バランス領域は、下記式のような配列を有し：

式中、
ΔＧ°_１は、保護体バランス領域と相補体バランス領域とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり；
ΔＧ°_２は、保護体バランス領域と標的核酸配列（存在する場合）に第１の方向で直接隣接する配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり；
ΔＧ°_３は、トーホールド領域と第２の標的核酸配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり；
ΔＧ°_４は、ヘアピン領域の保持の標準自由エネルギーであり；
Ｒは理想気体定数であり；
Ｔはプライマーシステムを使用する温度であり；
ｃはプライマーシステムを使用する濃度であり；
ΔＧ°_Ｒは３．５ｋｃａｌ／ｍｏｌである。

他のプライマーシステム
他のプライマーシステムを図４〜７に図示する。これらのプライマーシステムは各々、１つの相補体ドメインおよび２つの保護体ドメインを含む。相補体ドメインは、２つの相補体分岐点移動領域および２つの相補体バランス領域に挟まれた１つのトーホールド領域を有する。保護体ドメインは各々、相補体分岐点移動領域の配列と相補的である配列を有する保護体分岐点移動領域と、相補体バランス領域の１つの配列と相補的である配列を有する保護体バランス領域とを含む。図４〜７のプライマーシステムの相違は、ヘアピン領域の数および位置であり、それがまた相補体バランス領域の設計に影響を与える。本明細書に開示された他のプライマーシステムと同様、これらのプライマーシステムは、標的核酸に特異的にハイブリダイズするように設計される。標的核酸の配列を用いてプライマーシステムの特徴を説明しているが、いくつかの実施形態では、標的核酸はプライマーシステムの成分ではない。

図４に図示するように、プライマーシステムは、３’から５’方向に第１の保護体ドメイン、第１のヘアピン領域、相補体ドメイン、第２のヘアピン領域および第２の保護体ドメインを有してもよい。

そうした実施形態では、第１の保護体ドメインは、第１の保護体分岐点移動領域および第１の保護体バランス領域を含む。第１の保護体分岐点移動領域は第１の標的核酸配列と一致する配列を有する。第１の保護体バランス領域は第１の保護体分岐点移動領域の５’に隣接し、標的核酸の第１の標的核酸配列（存在する場合）の５’に隣接した配列と一致しない配列を有する。

この実施形態では、第１のヘアピン領域は、第１の保護体バランス領域の５’に隣接している。

こうした標的核酸の相補体ドメインは、第１の相補体バランス領域と、第１の相補体分岐点移動領域と、トーホールド領域と、第２の相補体分岐点移動領域と、第２の相補体バランス領域とを含む。第１の相補体バランス領域は第１のヘアピン領域の５’に隣接し、第１の保護体バランス領域の配列と相補的である配列を有する。第１の相補体分岐点移動領域は第１の相補体バランス領域の５’に隣接し、第１の保護体分岐点移動領域と相補的である配列を有する。トーホールド領域は第１の相補体分岐点移動領域の５’に隣接し、標的核酸の第１の標的核酸配列の３’に隣接した第２の標的核酸配列と相補的である配列を有する。第２の相補体分岐点移動領域はトーホールド領域の５’に隣接し、標的核酸の第２の標的核酸配列の３’に隣接した第３の標的核酸配列と相補的である配列を有する。第２の相補体バランス領域は第２の相補体分岐点移動領域の５’に隣接し、標的核酸の第３の標的核酸配列（存在する場合）の３’に隣接した配列と相補的でない配列を有する。

そうした実施形態では、第２のヘアピン領域は、第２の相補体バランス領域の５’に隣接している。

この実施形態では、第２の保護体ドメインは、第２の保護体バランス領域および第２の保護体分岐点移動領域を含む。第２の保護体バランス領域は第２のヘアピン領域の５’に隣接し、第２の相補体バランス領域と相補的である配列を有する。第２の保護体分岐点移動領域は、第２の保護体バランス領域の５’に隣接し、第２の相補体分岐点移動領域と相補的である配列を有する。

この実施形態によれば、第１の相補体バランス領域および第２の相補体バランス領域は、下記式のような配列を有し：

式中、
ΔＧ°_１は、第１の保護体バランス領域と第１の相補体バランス領域とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり；
ΔＧ°_２は、第１の相補体バランス領域と第１の標的核酸配列（存在する場合）の５’に隣接した配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり；
ΔＧ°_３は、第２の保護体バランス領域と第２の相補体バランス領域とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり；
ΔＧ°_４は、第２の相補体バランス領域と第３の標的核酸配列（存在する場合）の３’に隣接した配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり；
ΔＧ°_５は、トーホールド領域と第２の標的核酸配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり；
ΔＧ°_６は第１のヘアピン領域の保持の標準自由エネルギーであり；
ΔＧ°_７は第２のヘアピン領域の保持の標準自由エネルギーであり；
Ｒは理想気体定数であり；
Ｔはプライマーシステムを使用する温度であり；
ｃはプライマーシステムを使用する濃度であり；
ΔＧ°_Ｒは３．５ｋｃａｌ／ｍｏｌである。

図５に図示したように、ある種の実施形態では、プライマーシステムはヘアピンプライマーおよび保護体を有してもよく、ヘアピンプライマーは第１の保護体ドメインと、第１のヘアピン領域と、相補体ドメインとを含み、保護体は第２の保護体ドメインを含む核酸である。

そうした実施形態では、第１の保護体ドメインは、第１の保護体分岐点移動領域および第１の保護体バランス領域を含む。第１の保護体分岐点移動領域は第１の標的核酸配列と一致する配列を有する。第１の保護体バランス領域は第１の保護体分岐点移動領域の５’に隣接し、標的核酸の第１の標的核酸配列（存在する場合）の５’に隣接した配列と一致しない配列を有する。

この実施形態では、ヘアピン領域は第１の保護体バランス領域の５’に隣接する。

こうした標的核酸の相補体ドメインは、第１の相補体バランス領域と、第１の相補体分岐点移動領域と、トーホールド領域と、第２の相補体分岐点移動領域と、第２の相補体バランス領域とを含む。第１の相補体バランス領域はヘアピン領域の５’に隣接し、第１の保護体バランス領域の配列と相補的である配列を有する。第１の相補体分岐点移動領域は第１の相補体バランス領域の５’に隣接し、第１の保護体分岐点移動領域と相補的である配列を有する。トーホールド領域は第１の相補体分岐点移動領域の５’に隣接し、標的核酸の第１の標的核酸配列の３’に隣接した第２の標的核酸配列と相補的である配列を有する。第２の相補体分岐点移動領域はトーホールド領域の５’に隣接し、標的核酸の第２の標的核酸配列の３’に隣接した第３の標的核酸配列と相補的である配列を有する。第２の相補体バランス領域は第２の相補体分岐点移動領域の５’に隣接し、標的核酸の第３の標的核酸配列（存在する場合）の３’に隣接した配列と相補的でない配列を有する。

この実施形態では、第２の保護体ドメインは第２の保護体バランス領域および第２の保護体分岐点移動領域を含む。第２の保護体バランス領域は、第２の相補体バランス領域と相補的である配列を有する。第２の保護体分岐点移動領域は、第２の保護体バランス領域の５’に隣接し、第２の相補体分岐点移動領域と相補的である配列を有する。

この実施形態によれば、第１の相補体バランス領域および第２の相補体バランス領域は、下記式のような配列を有し：

式中、
ΔＧ°_１は、第１の保護体バランス領域と第１の相補体バランス領域とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり；
ΔＧ°_２は、第１の相補体バランス領域と第１の標的核酸配列（存在する場合）の５’に隣接した配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり；
ΔＧ°_３は、第２の保護体バランス領域と第２の相補体バランス領域とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり；
ΔＧ°_４は、第２の相補体バランス領域と第３の標的核酸配列（存在する場合）の３’に隣接した配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり；
ΔＧ°_５は、トーホールド領域と第２の標的核酸配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり；
ΔＧ°_６は、ヘアピン領域の保持の標準自由エネルギーであり；
ΔＧ°_Ｒは３．５ｋｃａｌ／ｍｏｌである。

図６に図示するように、ある種の実施形態では、プライマーシステムは保護体およびヘアピンプライマーを有してもよく、保護体は第１の保護体ドメインを含む核酸であり、ヘアピンプライマーは、相補体ドメインとヘアピン領域と第２の保護体ドメインとを含む核酸である。

そうした実施形態では、第１の保護体ドメインは第１の保護体分岐点移動領域および第１の保護体バランス領域を含む。第１の保護体分岐点移動領域は第１の標的核酸配列と一致する配列を有する。第１の保護体バランス領域は第１の保護体分岐点移動領域の５’に隣接し、標的核酸の第１の標的核酸配列（存在する場合）の５’に隣接した配列と一致しない配列を有する。

こうした標的核酸の相補体ドメインは、第１の相補体バランス領域と、第１の相補体分岐点移動領域と、トーホールド領域と、第２の相補体分岐点移動領域と、第２の相補体バランス領域とを含む。第１の相補体バランス領域は、第１の保護体バランス領域の配列と相補的である配列を有する。第１の相補体分岐点移動領域は第１の相補体バランス領域の５’に隣接し、第１の保護体分岐点移動領域と相補的である配列を有する。トーホールド領域は第１の相補体分岐点移動領域の５’に隣接し、標的核酸の第１の標的核酸配列の３’に隣接した第２の標的核酸配列と相補的である配列を有する。第２の相補体分岐点移動領域はトーホールド領域の５’に隣接し、標的核酸の第２の標的核酸配列の３’に隣接した第３の標的核酸配列と相補的である配列を有する。第２の相補体バランス領域は第２の相補体分岐点移動領域の５’に隣接し、標的核酸の第３の標的核酸配列（存在する場合）の３’に隣接した配列と相補的でない配列を有する。

こうした実施形態によれば、ヘアピン領域は第２の相補体バランス領域の５’に隣接する。

この実施形態では、第２の保護体ドメインは第２の保護体バランス領域および第２の保護体分岐点移動領域を含む。第２の保護体バランス領域はヘアピン領域の５’に隣接し、第２の相補体バランス領域と相補的である配列を有する。第２の保護体分岐点移動領域は、第２の保護体バランス領域の５’に隣接し、第２の相補体分岐点移動領域と相補的である配列を有する。

この実施形態によれば、第１の相補体バランス領域および第２の相補体バランス領域は、下記式のような配列を有し：

式中、
ΔＧ°_１は、第１の保護体バランス領域と第１の相補体バランス領域とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり；
ΔＧ°_２は、第１の相補体バランス領域と第１の標的核酸配列（存在する場合）の５’に隣接した配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり；
ΔＧ°_３は、第２の保護体バランス領域と第２の相補体バランス領域とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり；
ΔＧ°_４は、第２の相補体バランス領域と第３の標的核酸配列（存在する場合）の３’に隣接した配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり；
ΔＧ°_５は、トーホールド領域と第２の標的核酸配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり；
ΔＧ°_６は、ヘアピン領域の保持の標準自由エネルギーであり；
ΔＧ°_Ｒは３．５ｋｃａｌ／ｍｏｌである。

図７に図示するように、ある種の実施形態では、プライマーシステムは第１の保護体と、相補体プライマーと、第２の保護体とを有してもよく、第１の保護体は第１の保護体ドメインを含む核酸であり、相補体プライマーは相補体ドメインを含む核酸であり、第２の保護体は、第２の保護体ドメインを含む核酸である。

そうした実施形態では、第１の保護体ドメインは第１の保護体分岐点移動領域および第１の保護体バランス領域を含む。第１の保護体分岐点移動領域は、第１の標的核酸配列と一致する配列を有する。第１の保護体バランス領域は第１の保護体分岐点移動領域の５’に隣接し、標的核酸の第１の標的核酸配列（存在する場合）の５’に隣接した配列と一致しない配列を有する。

こうした標的核酸の相補体ドメインは、第１の相補体バランス領域と、第１の相補体分岐点移動領域と、トーホールド領域と、第２の相補体分岐点移動領域と、第２の相補体バランス領域とを含む。第１の相補体バランス領域は、第１の保護体バランス領域の配列と相補的である配列を有する。第１の相補体分岐点移動領域は第１の相補体バランス領域の５’に隣接し、第１の保護体分岐点移動領域と相補的である配列を有する。トーホールド領域は第１の相補体分岐点移動領域の５’に隣接し、標的核酸の第１の標的核酸配列の３’に隣接した第２の標的核酸配列と相補的である配列を有する。第２の相補体分岐点移動領域はトーホールド領域の５’に隣接し、標的核酸の第２の標的核酸配列の３’に隣接した第３の標的核酸配列と相補的である配列を有する。第２の相補体バランス領域は第２の相補体分岐点移動領域の５’に隣接し、標的核酸の第３の標的核酸配列（存在する場合）の３’に隣接した配列と相補的でない配列を有する。

この実施形態では、第２の保護体ドメインは第２の保護体バランス領域および第２の保護体分岐点移動領域を含む。第２の保護体バランス領域は、第２の相補体バランス領域と相補的である配列を有する。第２の保護体分岐点移動領域は、第２の保護体バランス領域の５’に隣接し、第２の相補体分岐点移動領域と相補的である配列を有する。

この実施形態によれば、第１の相補体バランス領域および第２の相補体バランス領域は、下記式のような配列を有し：

式中、
ΔＧ°_１は、第１の保護体バランス領域と第１の相補体バランス領域とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり；
ΔＧ°_２は、第１の相補体バランス領域と第１の標的核酸配列（存在する場合）の５’に隣接した配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり；
ΔＧ°_３は、第２の保護体バランス領域と第２の相補体バランス領域とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり；
ΔＧ°_４は、第２の相補体バランス領域と第３の標的核酸配列（存在する場合）の３’に隣接した配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり；
ΔＧ°_５は、トーホールド領域と第２の標的核酸配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり；
Ｒは理想気体定数であり；
Ｔはプライマーシステムを使用する温度であり；
ｃはプライマーシステムを使用する濃度であり；
ΔＧ°_Ｒは３．５ｋｃａｌ／ｍｏｌである。

バランスドメインを欠いたプライマーデュプレックスシステム
いくつかの実施形態では、プライマーシステムはバランスドメインを欠いていてもよい。こうした核酸は、標的核酸がプライマーシステムのトーホールド領域の配列と相補的な配列を有する場合、速い反応速度（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）で標的核酸とハイブリダイズするが、標的核酸が変異していてプライマーシステムのトーホールド領域と相補的な配列を含まない場合、遅い反応速度（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）でハイブリダイズする。したがって、こうしたプライマーシステムは、たとえば、反応速度的（ｋｉｎｅｔｉｃ）識別を用いて核酸標的の相違および／または突然変異を探し出すのに有用である。

図８に図示するように、ある種の実施形態では、プライマーシステムは、３’から５’方向に第１の保護体ドメインと、第１のヘアピン領域と、相補体ドメインと、第２のヘアピン領域と、第２の保護体ドメインとを有する核酸を含んでもよい。こうしたプライマーシステムの第１の保護体ドメインは第１の標的核酸配列と一致する配列を有する。第１のヘアピン領域は第１の保護体ドメインの５’に隣接する。相補体ドメインは第１の相補体分岐点移動領域と、トーホールド領域と、第２の相補体分岐点移動領域とを有する。第１の相補体分岐点移動領域は第１のヘアピン領域の５’に隣接し、第１の保護体ドメインの分岐点移動配列と相補的な配列を有する。トーホールド領域は第１の相補体分岐点移動領域の５’に隣接し、標的核酸分子の第１の標的核酸配列の３’に隣接した第２の標的核酸配列と相補的な配列を有する。第２の相補体分岐点移動領域はトーホールド領域の５’に隣接し、第２の核酸配列の３’に隣接した第３の標的核酸配列と相補的な配列を有する。第２のヘアピン領域は第２の相補体分岐点移動領域の５’に隣接する。第２の保護体ドメインは、第２の相補体分岐点移動領域の配列と相補的である配列を有する。

一般的なプライマーの修飾
本明細書に記載の各プライマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡもしくはそれらのアナログ、および／またはそれらの組み合わせからなっていてもよい。ある種の実施形態では、プライマーは１つ以上の非天然ヌクレオチドを含む。プライマーに非天然ヌクレオチドを導入すると、プライマーデュプレックスの性能をさらに増強することができる。特に、保護体鎖は、転写の開始に役立つことを意図するものではないが、期せずして標的の他の領域または他のバックグラウンド分子と相補的であったり、擬似的な複製／転写を開始させたりすることがある。これを防止するには、非天然ヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドを第２の保護体鎖の３’末端に使用すると、その鎖による意図せぬプライマー結合を防止する働きをすることがある。非天然ヌクレオチドの例として、イソ−Ｃ、イソ−Ｇ、デオキシウリジンがあるが、これに限定されるものではない（非天然ヌクレオチドに関連する教示内容を本明細書に援用するＫｒｕｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．１６：２４２−４８（２００９）参照されたい）。

いくつかの実施形態では、たとえば、繰り返してプライマー結合する酵素機能を使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）では、伸長した相補体鎖がその後のプライマーハイブリダイゼーションの標的になり得る。その後の数ラウンドの増幅におけるプライマーハイブリダイゼーションの特異性を維持するには、プライマーのバランス領域を複製されてはならない。たとえば、相補体鎖の分岐点移動領域とバランス領域との界面に非天然ヌクレオチドを導入すると、バランス領域が複製されるのを防止することができる。

ある種の実施形態では、本明細書に記載のプライマーは、ポリメラーゼ伸長の開始点として機能する。増幅された（核酸）フラグメントを解析しやすくするには、ＰＣＲ反応に標識プライマーを使用してもよい。標識プライマーは、検出可能な部分に連結された（またはコンジュゲートされた）プライマーである。例として、蛍光色素、放射性標識ならびに特定可能な金属、核酸配列およびタンパク質がある。蛍光標識プライマーを用いて反応を行う場合、蛍光標識を含む単位複製配列（核酸産物）が生成され得る。

本明細書に記載のプライマーは、当該技術分野において公知の任意の方法により合成することができる（たとえば、本明細書に援用するＯｇｉｌｖｉｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９９（２３）：７７４１−７７４３；Ｒｅｅｓｅ，Ｃ．Ｂ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３４（２１）：３１４３（１９７８）；Ｅｆｉｍｏｖ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１（２３）：８３６９−８３８７（１９８３）；Ｇａｒｅｇｇ ｅｔ ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２７（３４）：４０５１（１９８６）；Ｂｅａｕｃａｇｅ ｅｔ ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４８（１２）：２２２３（１９９２）；Ｅｆｉｍｏｖ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ２６（８−９）：１０８７−９３（２００７）を参照されたい）。

標的核酸分子
「標的」は一本鎖（ｓｓ）核酸でも、または二本鎖（ｓｓ）核酸でもよい。標的核酸は、たとえば、ＤＮＡでも、ＲＮＡでも、または逆転写に供したＲＮＡのＤＮＡ産物でもよい。いくつかの実施形態では、標的はＤＮＡとＲＮＡとの混合物（キメラ）である。他の実施形態では、標的は、人工核酸アナログ、たとえば、ペプチド核酸（Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４（５０３７）：１４９７−５００（１９９１））またはロックド核酸（Ａｌｅｘｅｉ ｅｔ ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５４（１４）：３６０７−３０（１９９８））を含む。いくつかの実施形態では、標的は天然に存在してもよいし（たとえば、ゲノムＤＮＡ）、または標的は合成であってもよい（たとえば、ゲノムライブラリー由来）。本明細書で使用する場合、「天然に存在する」核酸配列は、人的介入の非存在下で自然界に存在する生物またはウイルスの核酸分子中に存在する配列である。いくつかの実施形態では、標的はゲノムＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、プレ−マイクロＲＮＡ、プロ−マイクロＲＮＡ、ウイルスＤＮＡ、ウイルスＲＮＡまたはｐｉｗｉ−ＲＮＡである。ある種の実施形態では、標的核酸は、生物またはウイルスに天然に存在する核酸である。いくつかの実施形態では、標的核酸は病原生物またはウイルスの核酸である。ある種の実施形態では、被検体における標的核酸の有無から、この被検体が疾患または障害を有するか、または疾患または障害に罹患しやすいかが示唆される。ある種の実施形態では、被検体における標的核酸の有無から、この被検体が疾患または障害を処置するための薬剤などの処置剤に十分に応答するか、または不十分に応答するかが示唆される。

「ポリヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」という用語は、同義で使われる。これらは、任意の長さのヌクレオチドの重合体をいい、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはそれらのアナログのいずれかである。ポリヌクレオチドはどのような三次元構造を有してもよく、どのような機能を発揮してもよい。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子フラグメントのコード領域または非コード領域、連鎖解析から規定された遺伝子座（単数または複数）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマー。ポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド、たとえばメチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログを含んでもよい。ヌクレオチド構造に修飾が存在する場合、修飾はポリマーの構築の前に付与しても、または後に付与してもよい。ポリヌクレオチドは、標識成分とのコンジュゲーションなどによりさらに修飾してもよい。「組換え」ポリヌクレオチドという用語は、自然界に存在しないか、あるいは非天然の配置で別のポリヌクレオチドに連結されたゲノム由来、ｃＤＮＡ由来、半合成由来または合成由来のポリヌクレオチドである。「単離された核酸」という用語は、（１）「単離された核酸」が自然界に見出される細胞と結合していない、および／または（２）「単離された核酸」が自然界で連結してないポリヌクレオチドに作動可能に連結された、天然または合成由来、またはそれらの何らかの組み合わせのポリヌクレオチドをいう。

核酸はさらに、一本鎖および二本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡのほか、修飾塩基、糖および骨格を含む他の核酸のあらゆる形態も包含する。したがって「核酸」という用語は、以下に限定されるものではないが、一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ（および部分一本鎖または部分二本鎖であってもよいそれらの形態）、ｃＤＮＡ、アプタマー、ペプチド核酸（「ＰＮＡ」）、２’−５’ＤＮＡ（ＤＮＡのＡコンフォメーションに適合する塩基スペーシングを有する短縮された骨格を持つ合成材料；２’−５’ＤＮＡは通常Ｂ形態のＤＮＡとハイブリダイズしないが、ＲＮＡと容易にハイブリダイズする）、およびロックド核酸（「ＬＮＡ」）を含むことが理解されよう。核酸アナログは、塩基対形成性の類似または改善された結合、ハイブリダイゼーションを有する天然ヌクレオチドの既知のアナログを含む。プリンおよびピリミジンの「アナログ」形態は、当該技術分野において周知であり、アジリジニルシトシン、４−アセチルシトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルプソイドウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ^６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキュエオシン、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、プソイドウラシル、キュエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸および２，６−ジアミノプリンがあるが、これに限定されるものではない。本明細書で提供されるＤＮＡ骨格アナログは、ホスホジエステル、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、メチルホスホネート、ホスホルアミデート、アルキルホスホトリエステル、スルファマート、３’−チオアセタール、メチレン（メチルイミノ）、３’−Ｎ−カルバメート、モルホリノカルバメートおよびペプチド核酸（ＰＮＡ）、メチルホスホネート結合、またはメチルホスホネートとホスホジエステルとの交互結合（Ｓｔｒａｕｓｓ−Ｓｏｕｋｕｐ，１９９７，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６：８６９２−８６９８）、および米国特許第６，６６４，０５７号明細書で考察されたベンジルホスホネート結合を含む。さらにＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ ＡＮＤ ＡＮＡＬＯＧＵＥＳ，Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）；Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ６００，Ｅｄｓ．Ｂａｓｅｒｇａ ａｎｄ Ｄｅｎｈａｒｄｔ（ＮＹＡＳ １９９２）；Ｍｉｌｌｉｇａｎ，１９９３，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：１９２３−１９３７；Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９３，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）も参照されたい。本明細書の核酸は、細胞から抽出してもよいし、または当業者に公知の任意の手段に従い人工的に調製してもよい。たとえば、核酸は、化学的に合成もしくは転写してもよいし、またはいくつかある元となるもの中でも特にｃＤＮＡもしくはｍＲＮＡから逆転写してもよい。

本明細書で使用する場合、２つの核酸または核酸領域が共に同じ核酸配列と相補的である場合、それらは相互に「一致している」。２つの核酸または核酸領域が相互に塩基対を形成して二本鎖核酸分子を形成する場合、それらは相互に「相補的」である。

本明細書に利用される標的核酸は、任意の核酸、たとえば、ヒトの核酸でも、細菌の核酸でも、またはウイルスの核酸でもよい。標的核酸サンプルは、たとえば、１つ以上の細胞、組織または体液由来の核酸サンプルであってもよい。標的サンプルは、以下に限定されるものではないが、真核生物、植物、動物、脊椎動物、魚、哺乳動物、ヒト、非ヒト、細菌、微生物、ウイルス、生物源、血清、血漿、血液、尿、精液、リンパ液、脳脊髄液、羊水、生検材料、穿刺吸引細胞診材料、癌、腫瘍、組織、細胞、細胞ライセート、粗細胞ライセート、組織ライセート、組織培養細胞、口腔スワブ、洗口剤、糞便、ミイラ化した組織、法医学的資料、剖検材料、考古学的資料、感染体、院内感染体、産生源、薬剤調製物、生体分子産物、タンパク質調製物、脂質調製物、炭水化物調製物、無生物、空気、土壌、樹液、金属、化石、発掘物、ならびに／または他の地球もしくは地球外物質および起源物質など、どのような供給源から得てもよい。サンプルは、１つの起源または様々な起源由来の物質の混合物をさらに含んでもよい。たとえば、感染細菌またはウイルスの核酸は、そうした感染細胞または組織由来の核酸を本開示方法を用いて増幅する場合、ヒト核酸と一緒に増幅してもよい。有用な標的サンプルとして、真核生物サンプル、植物サンプル、動物サンプル、脊椎動物サンプル、魚サンプル、哺乳動物サンプル、ヒトサンプル、非ヒトサンプル、細菌サンプル、微生物サンプル、ウイルスサンプル、生物学的サンプル、血清サンプル、血漿サンプル、血液サンプル、尿サンプル、精液サンプル、リンパ液サンプル、脳脊髄液サンプル、羊水サンプル、生検サンプル、穿刺吸引細胞診サンプル、癌サンプル、腫瘍サンプル、組織サンプル、細胞サンプル、細胞ライセートサンプル、粗細胞ライセートサンプル、組織ライセートサンプル、組織培養細胞サンプル、口腔スワブサンプル、洗口剤サンプル、糞便サンプル、ミイラ化した組織サンプル、法医学的サンプル、考古学的サンプル、感染体サンプル、院内感染体サンプル、産生サンプル、薬剤調製物サンプル、生体分子産物サンプル、タンパク質調製物サンプル、脂質調製物サンプル、炭水化物調製物サンプル、無生物サンプル、空気サンプル、土壌サンプル、樹液サンプル、金属サンプル、化石サンプル、発掘物サンプル、および／または他の地球もしくは地球外サンプルが挙げられる。

いくつかの実施形態では、本明細書に利用される標的核酸は、反復配列、二次構造、および／または高Ｇ／Ｃ含量を含む。

ある種の実施形態では、目的の標的核酸分子は、約１００〜約１，０００，０００ヌクレオチド（ｎｔ）長である。いくつかの実施形態では、標的は、約１００〜約１０００ヌクレオチド長、約１０００〜約１０，０００ヌクレオチド長、約１０，０００〜約１００，０００ヌクレオチド長または約１００，０００〜約１，０００，０００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、標的は、約１００ヌクレオチド長、約２００ヌクレオチド長、約３００ヌクレオチド長、約４００ヌクレオチド長、約５００ヌクレオチド長、約６００ヌクレオチド長、約７００ヌクレオチド長、約８００ヌクレオチド長、約９００ヌクレオチド長、約１，０００ヌクレオチド長、約２，０００ヌクレオチド長、約３，０００ヌクレオチド長、約４，０００ヌクレオチド長、約５，０００ヌクレオチド長、約６，０００ヌクレオチド長、約７，０００ヌクレオチド長、約８，０００ヌクレオチド長、約９０００ヌクレオチド長、約１０，０００ヌクレオチド長、約２０，０００ヌクレオチド長、約３０，０００ヌクレオチド長、約４０，０００ヌクレオチド長、約５０，０００ヌクレオチド長、約６０，０００ヌクレオチド長、約７０，０００ヌクレオチド長、約８０，０００ヌクレオチド長、約９０，０００ヌクレオチド長、約１００，０００ヌクレオチド長、約２００，０００ヌクレオチド長、約３００，０００ヌクレオチド長、約４００，０００ヌクレオチド長、約５００，０００ヌクレオチド長、約６００，０００ヌクレオチド長、約７００，０００ヌクレオチド長、約８００，０００ヌクレオチド長、約９００，０００ヌクレオチド長または約１，０００，０００ヌクレオチド長である。標的核酸は、より長い核酸（たとえば、染色体または染色体フラグメント内のコード配列または遺伝子など）の文脈で用意されてもよいことが理解されよう。

ある種の実施形態では、目的の標的は直鎖状である一方、他の実施形態では、標的は、環状である（たとえば、プラスミドＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡまたは色素体ＤＮＡ）。

プライマー−標的組み合わせシステム
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、プライマー−標的システムである。プライマー−標的システムは、１つ以上の核酸標的、ポリメラーゼおよび１つ以上のプライマー（たとえば、プライマーデュプレックスおよび／またはヘアピンプライマーデュプレックス）を含む。「プライマー」という用語は、本明細書に記載のプライマーまたはプライマーシステム（たとえば、一本鎖プライマー、二本鎖プライマーデュプレックスおよびヘアピンプライマーデュプレックス）のいずれか１つを包含する。ある種の実施形態では、本明細書に記載のプライマー−標的システムは、複数の異なるプライマーを含む。いくつかの実施形態では、プライマー−標的システムは、標的核酸分子の同定、および、たとえば増幅に使用し得る少なくとも２つのプライマーを含んでもよい。標的核酸分子は、たとえば、単一コピーとしてまたは低コピー数で複数の非標的核酸分子内に存在してもよい。本明細書に記載のプライマー−標的システムのいずれか１つは、核酸増幅反応またはシーケンシング反応に使用されるのと同様の条件（たとえば、同様の試薬、反応温度等）を含んでもよい。

使用方法
本明細書に記載のプライマーシステムは、熱力学的機構または反応速度的（ｋｉｎｅｔｉｃ）機構により特定の標的と擬似標的とを識別することができる。標的と擬似標的とを熱力学的機構（下記に記載）を用いて区別する場合、鎖置換反応を終了まで行い、平衡状態における結合親和性の違いに基づき標的を擬似標的と区別する。反応速度的（ｋｉｎｅｔｉｃ）機構（下記に記載）を用いて標的を擬似標的と区別するには、鎖置換反応を平衡状態になる前に停止し、反応終了における差速を用いて標的を擬似標的と区別する。

熱力学的分離
熱力学的機構および反応速度的（ｋｉｎｅｔｉｃ）機構の一般的な戦略はどちらも、トーホールド交換による鎖置換反応を使用する。一般に、トーホールド交換は、標的の相補体を標的と相補的でない追加領域で伸長させることと、保護体鎖を、この伸長した相補体鎖および伸長領域に隣接する多くの塩基にプレハイブリダイズするが、一本鎖トーホールド領域にはプレハイブリダイズしないことを含む。

図９は、トーホールド交換の１つの実装を図示する。この実装では、二本鎖プライマーデュプレックスシステム（上記および図１Ａに示したようなもの）を使用して、標的核酸と擬似標的とを区別する。相補体鎖の相補体分岐点移動領域およびトーホールド領域はそれぞれ、第１の標的配列および第２の標的配列に対応する配列を有する。相補体バランス領域は、トーホールド領域と同じ長さおよびヌクレオチド塩基分布になるように設計した。この方法では、正しい標的と保護された相補体との間の図９Ａに示した鎖置換反応の標準自由エネルギーは、およそΔＧ°＝０ｋｃａｌ／ｍｏｌである。

この鎖置換反応は、以下のように記載することができる：
標的＋相補体／保護体⇔標的／相補体＋保護体
ΔＧ°は、以下の関係式で平衡定数Ｋ_ｅｑに関係する：
ΔＧ°＝ＲＴｌｎ（Ｋ_ｅｑ）。

ΔＧ°＝０の反応では、平衡定数（Ｋ_ｅｑ）は１である。平衡定数はまた平衡状態とも関係し、この反応では、Ｋ_ｅｑ＝［ＴＣ］［Ｐ］／［Ｔ］［ＰＣ］＝１である。［ＰＣ］および［Ｐ］が［Ｔ］より過剰であるアッセイでは、［ＴＣ］／［Ｔ］＝１であり、平衡状態で全標的分子のちょうど半数がハイブリダイズすることを意味する。図９Ａに示した例では、ΔＧ°＝＋０．１ｋｃａｌ／ｍｏｌであり、Ｋ_ｅｑ＝０．８５に相当し、これは、平衡状態で標的分子の４６％がハイブリダイズすることを意味する。

保護体鎖は、擬似標的との鎖置換反応の標準自由エネルギーをそれに対応して変化させる。図９Ｂに示した例では、擬似標的は正しい標的と１塩基異なり、結果として同じ二本鎖核酸プライマーシステムとの鎖置換反応が＋３．７ｋｃａｌ／ｍｏｌのΔＧ°を有し、これはＫ_ｅｑ＝１．９＊１０^−３に相当する。平衡状態では、擬似標的の０．１９％のみが相補体にハイブリダイズする。このため、図８に示した例示的な核酸プライマーシステムは、単１ヌクレオチドのみのミスマッチを有する擬似標的に対して２００倍超優先的にその標的に結合する。

図１０は、平衡状態における結合親和性を反応の標準自由エネルギーの関数としてプロットしたものである。反応の標準自由エネルギーが負に大きいと（純粋なハイブリダイゼーション反応の場合のように）、標的および擬似標的の両方が非常に強く結合し、この２つを区別することが難しく、偽陽性が生じる。一方、反応の標準自由エネルギーが正に大きいと、プライマーは非常に弱く標的に結合し、偽陰性が生じる。プライマーデュプレックスシステムをほぼ０の標準自由エネルギーを有するように設計すると、標的と擬似標的との最適な識別が得られ、それにより偽陽性および偽陰性が最小限に抑えられる。

反応速度的（ｋｉｎｅｔｉｃ）分離
反応速度的（ｋｉｎｅｔｉｃ）分離は、トーホールド交換の反応速度（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）の差を利用する。トーホールド交換反応の反応速度（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）は、トーホールド領域の結合強度によって決まる。トーホールド結合エネルギーにおけるｋｃａｌ／ｍｏｌ毎の差が、反応速度（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）に５．４倍影響を与え得るため（図１１）、図９Ｂに示した＋３．６ｋｃａｌ／ｍｏｌのミスマッチは、反応速度的（ｋｉｎｅｔｉｃ）に４３４減速させると考えられる。

熱力学的な識別と異なり、反応速度的（ｋｉｎｅｔｉｃ）識別は、ミスマッチがトーホールド領域にあるときにのみ起こる。相補体分岐点移動領域と相補的な位置で正しい標的と異なる擬似標的は、大きく異なる反応速度（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）が生じるとは考えにくい。そのため、標的を擬似標的と区別する反応速度的（ｋｉｎｅｔｉｃ）機構を使用する方法は、標的／プライマーのミスマッチの位置を正確に決定する手段として熱力学的分離との併用が有用である。

重要な点として、反応速度的（ｋｉｎｅｔｉｃ）機構を利用する方法において、図８に示したプライマーシステムなど相補体バランス領域がないプライマーデュプレックスシステムを使用して標的／プライマーのミスマッチの位置を正確に決定してもよい。

マイクロアレイ
核酸マイクロアレイは、多くの場合、ハイスループットな核酸検出に使用されるが、密接に関連する核酸配列を区別できないことが多い。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のプライマーデュプレックスシステムを、たとえば、マイクロアレイ解析の特異性を高めるために核酸マイクロアレイに使用してもよい。いくつかの例では、従来の核酸プライマーの代わりに本明細書に記載のプライマーデュプレックスシステムを使用してもよいこと以外は、当該技術分野において周知の方法を用いてマイクロアレイアッセイを実施してもよい。

たとえば、図１２Ａ図示するように、ある種の実施形態では、ヘアピンプライマーデュプレックスシステム形態を、標準的技術を用いて直接合成してもよいし、またはマイクロアレイチップ上に固定化してもよい。他の実施形態では、二本鎖プライマーデュプレックスシステムを核酸マイクロアレイに使用してもよい。ある実施形態では、図１２Ａの場合と同様に、事前に設定した位置に２つの光切断性塩基を含むヘアピン構造を合成してもよい。その後光を照射してヘアピンを切断して、アレイ表面に一体化した二本鎖複合体を得る（図１２Ｂ）。二本鎖複合体の調製には、ニッキングまたは制限酵素の使用など、他の方法を使用してもよい。

増幅反応を含む核酸合成反応
いくつかの実施形態では、本明細書に開示したプライマーデュプレックスおよびシステムにより、当該技術分野において公知のプライマーによる増幅反応における核酸プライマーの代わりに本明細書に記載のプライマーデュプレックスシステムを使用することで、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅または転写による増幅などのプライマーを用いた増幅反応の特異性を高めてもよい。

たとえば、図１３に図示するように、図４に図示した種類のヘアピンプライマーデュプレックスシステムをＰＣＲプライマーとして使用することで、種々の（たとえば、生物工学的）用途のＰＣＲの特異性を高めることが可能である。この例では、増幅反応を実施するための標的核酸および標準的な試薬と共にプライマーデュプレックスシステムを含む溶液を形成し、増幅反応が生じるような条件下で溶液をインキュベートすることにより標的核酸配列を増幅する。ある種の実施形態では、ヘアピン自体の複製を防止するため、非天然塩基をヘアピンプライマーデュプレックスプライマーシステムに組み込む。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のプライマーデュプレックスは、典型的には以下のＰＣＲ法の任意の１つ以上による増幅を必要とする標的核酸の増幅に使用できるように適合させてもよい：アレル特異的ＰＣＲ、アセンブリーＰＣＲ、非対称ＰＣＲ、ヘリカーゼ依存型増幅、配列間特異的ＰＣＲ（ＩＳＳＲ）、逆ＰＣＲ、ライゲーション媒介ＰＣＲ、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）、ミニプライマーＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、オーバーラップエクステンションＰＣＲ、定量ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、固相ＰＣＲ、ｔｈｅｒｍａｌ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｉｎｔｅｒｌａｃｅｄ ＰＣＲ（ＴＡＩＬ−ＰＣＲ）またはタッチダウンＰＣＲ。場合によっては、本明細書に記載のプライマーデュプレックスおよび方法を、前述のＰＣＲ方法のいずれか１つに使用しても、または使用できるように適合させてもよいし、あるいは、前述のＰＣＲ方法のいずれか１つに代用して（代わりに使用して）もよい。前述の各ＰＣＲ方法の簡単な説明を下記に示す。

アレル特異的ＰＣＲは、一塩基多型（ＳＮＰ）（ＤＮＡの１塩基の相違）に基づく診断またはクローニング技術である。アレル特異的ＰＣＲは典型的には、対立遺伝子間の相違などＤＮＡ配列について事前に知っている必要がある。

アセンブリーＰＣＲまたはポリメラーゼサイクリングアセンブリー（ＰＣＡ）は、短い重複セグメントを含む長いオリゴヌクレオチドのプールを用いてＰＣＲを行うことによる長いＤＮＡ配列の人工合成法である。オリゴヌクレオチドは、センス方向とアンチセンス方向とに配置され、重複セグメントによりＰＣＲフラグメントの順序が決定され、それにより最終的な長いＤＮＡ産物を選択的に作製する（Ｓｔｅｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ １６４（１）：４９−５３（１９９５））。

非対称ＰＣＲは、二本鎖ＤＮＡ標的の一本のＤＮＡ鎖を優先的に増幅する。非対称ＰＣＲは、二本の相補鎖のうちの一本のみの増幅が必要とされるシーケンシングおよびハイブリダイゼーションプロ−ビングに使用してもよい（Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５（２４）：９４３６−４０（１９８８））。

ヘリカーゼ依存型増幅は従来のＰＣＲに類似しているが、典型的には変性およびアニーリング／伸長サイクルを通じて温度サイクルではなく一定温度を使用する。ＤＮＡを巻き戻す酵素、ＤＮＡヘリカーゼを熱変性の代わりに使用する（Ｖｉｎｃｅｎｔ ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｒｅｐｏｒｔｓ ５（８）：７９５−８００（２００４））。

配列間特異的ＰＣＲ（ＩＳＳＲ）は、単純反復配列間の領域を増幅して増幅フラグメント長さに特有のフィンガープリントを得るＤＮＡフィンガープリンティングのためのＰＣＲ方法である（Ｚｉｅｔｋｉｅｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２０（２）：１７６−８３（１９９４））。

逆ＰＣＲは、ゲノムインサートの近くのフランキング配列を同定するのに一般に使用される。逆ＰＣＲは、一連のＤＮＡ消化および自己ライゲーションにより、未知の配列を両末端に有する既知の配列が得られる（Ｏｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １２０（３）：６２１−６２３（１９８８））。

ライゲーション媒介ＰＣＲは、目的のＤＮＡにライゲートした小さなＤＮＡリンカー、およびＤＮＡリンカーにアニーリングした複数のプライマーを使用する。ライゲーション媒介ＰＣＲは、ＤＮＡシーケンシング、ゲノムウォーキング、およびＤＮＡフットプリントに使用されてきた（Ｍｕｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６（４９３１）：７８０−７８６（１９８８））。

メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）は、ゲノムＤＮＡのＣｐＧ島のメチル化を検出するのに使用される。ＤＮＡをまず重亜硫酸ナトリウムで処理し、非メチル化シトシン塩基をウラシルに変換し、これがプライマーによりチミンとして認識される。

ミニプライマーＰＣＲは、耐熱性ポリメラーゼ（Ｓ−Ｔｂｒ）を使用し、１６Ｓ（または真核生物の１８Ｓ）ｒＲＮＡ遺伝子などの保存されたＤＮＡ配列の増幅に用いられる（Ｉｓｅｎｂａｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ７４（３）：８４０−９．（２００８））。

マルチプレックスＰＣＲは、一度に複数の遺伝子を標的とし、本来ならば試薬を数回、およびより多くの実施時間を必要とすると考えられる１回の試験実施から追加情報が得られる。

ネステッドＰＣＲは、ＤＮＡの非特異的増幅に起因するバックグラウンドを低下させることによりＤＮＡ増幅の特異性を高める。２回の連続ＰＣＲで２組のプライマーを使用する。第１の反応では一対のプライマーを使用して、目的の標的に加えてさらに非特異的に増幅されたＤＮＡフラグメントからなるＤＮＡ産物を得る。次いで第１の反応に使用したプライマーと結合部位が完全にまたは部分的に異なり、かつそのそれぞれの３’側に位置する１組のプライマーを用いた第２のＰＣＲでこの産物（単数または複数）を使用する。

オーバーラップエクステンションＰＣＲまたはｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ（ＳＯＥ）は、相補配列を含む２つ以上のＤＮＡフラグメントを一緒にスプライスするのに使用される遺伝子工学技術である。オーバーラップエクステンションＰＣＲは、遺伝子、調節配列または突然変異を含むＤＮＡ断片を連結するのに使用される。この技術を用いれば、特異的で長いＤＮＡコンストラクトを作製することができる。

定量ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）は、ＰＣＲ産物の量を（一般にリアルタイムで）測定するのに使用される。定量ＰＣＲは、ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡの初期量を定量的に測定する。Ｑ−ＰＣＲは、ＤＮＡ配列がサンプル中に存在するかどうかと、サンプル中のそのコピー数とを判定するのに一般に使用される。

逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）は、ＲＮＡからＤＮＡを増幅するのに使用される。逆転写酵素がＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、次いでｃＤＮＡがＰＣＲにより増幅される。ＲＴ−ＰＣＲは、遺伝子の発現を判定するため、または転写開始および終結部位などＲＮＡ転写物の配列を特定するため、発現プロファイリングに広く使用されている。遺伝子のゲノムＤＮＡ配列が既知である場合、ＲＴ−ＰＣＲを使用して遺伝子内のエクソンおよびイントロンの位置をマッピングしてもよい。遺伝子の５’末端（転写開始部位に相当）は典型的にはＲＡＣＥ−ＰＣＲ（Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ）により特定される。

固相ＰＣＲは、ポロニー増幅（たとえばＰＣＲのコロニーをゲルマトリックスから得る）、ブリッジＰＣＲ（プライマーが固体支持体表面に共有結合している）、従来の固相ＰＣＲ（水性プライマーの１つに一致する配列を含むプライマーを有する固体支持体の存在下で非対称ＰＣＲを行う）、および改良型固相ＰＣＲ（固体支持体のプライマー結合に有利に働く熱「ステップ」を任意選択的に適用し、高融解温度（Ｔ_ｍ）およびネステッド固体支持体プライマーを利用することにより従来の固相ＰＣＲを改良することができる）など複数の意味を包含する。

Ｔｈｅｒｍａｌ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｉｎｔｅｒｌａｃｅｄ ＰＣＲ（ＴＡＩＬ−ＰＣＲ）は、既知の配列に隣接する未知の配列の単離に使用される。既知の配列において、ＴＡＩＬ−ＰＣＲは、異なるアニーリング温度を持つネステッドプライマー対を使用し、未知の配列から逆方向に増幅するには縮重プライマーを使用する（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２５（３）：６７４−８１．（１９９５））。

タッチダウンＰＣＲ（ステップダウンＰＣＲ）は、ＰＣＲのサイクルが進むにつれ、アニーリング温度を徐々に低下させることにより非特異的バックグラウンドを低下させることを目的としたＰＣＲの変形である。初期のサイクルのアニーリング温度は通常、使用するプライマーのＴｍより数度（３〜５℃）高いのに対し、後のサイクルでは、アニーリング温度はプライマーのＴｍより数度（３〜５℃）低い。温度が高くなるほどプライマーの結合特異性が高くなり、温度が低くなるほど初期のサイクルで形成された特異的産物からのより効率的な増幅が可能になる。

反応液の温度は、所定のサイクル数で変性状態と、アニーリング状態と、伸長状態との間で連続的に繰り返してもよい。実際の時間および温度は、酵素、プライマーおよび標的により異なってもよい。

ある種の実施形態では、任意の特定の反応の場合、変性状態は、約７５℃〜約１００℃の範囲である。アニーリングの温度および時間は、標的核酸中の特定の遺伝子座に対するプライマー結合の特異性および効率に影響することがあり、個々のＰＣＲ反応に重要であり得る。

ある種の実施形態では、任意の特定の反応の場合、アニーリング状態は約２０℃〜約７５℃の範囲である。いくつかの実施形態では、アニーリング状態は、約２０℃〜約２５℃、約２５℃〜約３０℃、約３０℃〜約３５℃または約３５℃〜約４０℃、約４０℃〜約４５℃、約４５℃〜約５０℃で実施してもよい。ある種の実施形態では、アニーリング状態は、室温（たとえば、２０℃または２５℃）で実施してもよい。いくつかの実施形態では、アニーリング状態は、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃または５０℃の温度で実施してもよい。

伸長の温度および時間は、対立遺伝子産物の収率に影響を与えることがあり、検討対象の酵素に特有の特性であることが理解される。ある種の実施形態では、ある酵素の伸長状態は約６０℃〜約７５℃の範囲であってもよい。

前述の実施形態のいずれかでは、耐熱性ポリメラーゼおよび逆転写酵素（ＲＴａｓｅ）などの任意のＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼ（ヌクレオチドの核酸鎖への重合を触媒する酵素）を利用してもよい。例として、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ｐｏｌ Ｉ、サーマス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ｐｏｌ Ｉ、ピルッコックス・フリオサス（Ｐｙｒｃｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）（Ｐｆｕ）、パイロコッカス・ウォーセイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ）（Ｐｗｏ）、サーマス・フラバス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ）（Ｔｆｌ）、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｔｔｈ）、サーマス・リトリス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｌｉｔｏｒｉｓ）（Ｔｌｉ）およびサーモトガ・マリティメ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍｅ）（Ｔｍａ）がある。これらの酵素、これらの酵素の修飾形態および酵素の組み合わせは、Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｑｉａｇｅｎ、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅおよびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓなどの販売会社から市販されている。代表的な酵素には、ＰＨＵＳＩＯＮ（登録商標）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）、Ｈｏｔ ＭａｓｔｅｒＴａｑ（商標）（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）、ＰＨＵＳＩＯＮ（登録商標）Ｍｐｘ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）、ＰｙｒｏＳｔａｒｔ（登録商標）（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、ＫＯＤ（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｚ−Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）およびＣＳ３ＡＣ／ＬＡ（ＫｌｅｎＴａｑ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｉｔｙ，ＭＯ）がある。

塩および緩衝液は、それぞれＭｇＣｌ_２およびトリス−ＨＣｌおよびＫＣｌを含むものなど当業者によく知られたものを含む。緩衝液は、界面活性剤、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のほか、当業者に知られた他のものなど添加剤を含んでもよい。ヌクレオチドは一般に、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）およびデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）などのデオキシリボヌクレオシド三リン酸であり、また標的核酸の増幅に十分な量で反応に加える。

本明細書でさらに提供されるのは、（１）プライマーデュプレックスの相補体鎖を標的核酸にハイブリダイズし、それにより相補体鎖をその保護体鎖から解離すること、および（２）ポリメラーゼの存在下で相補体鎖をその３’末端から標的と相補的に伸長させることを含む方法である。

本明細書でさらに提供されるのは、標的核酸、ポリメラーゼ、および本明細書に記載の実施形態のいずれか１つのプライマーデュプレックスの１つ以上の存在下で核酸合成反応を行うことを含む方法である。

「核酸合成反応」とは、核酸が合成される任意の反応をいう。例として、核酸増幅反応、たとえばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはその変形（本明細書の他の箇所に記載）、転写反応、逆転写反応、ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓまたは他のプライマー伸長反応が挙げられる（援用するＬｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９：２２５−３２（１９９８）も参照されたい）。

いくつかの例では、（１）標的非特異的バランス領域、標的特異的分岐点移動領域および標的特異的トーホールド領域を有する相補体鎖を合成すること；（２）相補体鎖と相補的なバランス領域および相補体鎖と相補的な分岐点移動領域を有する保護体鎖を合成すること；および（３）相補体鎖を保護体鎖にハイブリダイズしてプライマーデュプレックスを形成することを含む方法を提供する。

いくつかの例では、（１）標的非特異的バランス領域、標的特異的分岐点移動領域および標的特異的トーホールド領域を有する相補体鎖を用意すること；（２）相補体鎖と相補的なバランス領域および相補体鎖と相補的な分岐点移動領域を有する保護体鎖を用意すること；および（３）相補体鎖を保護体鎖に組み合わせてプライマーデュプレックスを形成することを含む方法を提供する。

いくつかの例では、（１）標的核酸を含む複数の核酸分子を用意すること；（２）（ｉ）バランス領域、（ｉｉ）標的核酸と相補的な分岐点移動領域および（ｉｉｉ）トーホールド領域を有する少なくとも１つのプライマーデュプレックスを用意すること；および（３）核酸ハイブリダイゼーションに好適な条件下、複数の標的核酸、少なくとも１つのプライマーデュプレックスおよびポリメラーゼを１回の反応で組み合わせることを含む方法を提供する。

本明細書でさらに提供されるのは、目的の少なくとも１つの標的核酸を増幅する方法であって、（１）少なくとも１つの標的核酸を含む複数の核酸分子を用意すること、（２）（ｉ）バランス領域、（ｉｉ）分岐点移動領域、および（ｉｉｉ）トーホールド領域を有する少なくとも１つのプライマーデュプレックスを用意すること；および（３）少なくとも１つの標的核酸の増幅に好適な条件下、複数の標的核酸分子、少なくとも１つのプライマーデュプレックス、およびポリメラーゼを１回の反応で組み合わせることを含む方法である。ある種の実施形態では、複数の特有の標的核酸を１回の反応または複数回の反応で、たとえば、１回または２回以上のマルチプレックスによるＰＣＲ増幅反応で増幅する。いくつかの実施形態では、約１０〜１００の核酸標的、約１００〜約１０００の核酸標的、約１０００〜約１０，０００の核酸標的または約１０，０００〜約１００，０００の核酸標的を増幅する。反応における異なるプライマーデュプレックスの数は、所望の標的によって異なる。

いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、標的核酸分子と比較して１つ以上のヌクレオチド変化を有する擬似核酸分子を識別する方法であって、（１）少なくとも１つの標的核酸を含む複数の核酸分子を用意すること、（２）（ｉ）バランス領域、（ｉｉ）分岐点移動領域、および（ｉｉｉ）トーホールド領域を有する少なくとも１つのプライマーデュプレックスを用意すること；および（３）少なくとも１つの標的核酸分子の増幅に好適な条件下、複数の標的核酸分子、少なくとも１つのプライマーデュプレックス、およびポリメラーゼを１回の反応で組み合わせることを含む方法である。

本明細書に記載の方法のいずれか１つは、以下の試薬の１つ以上を１回の反応で用意または組み合わせることをさらに含んでもよい：緩衝液（たとえば、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、トリス−ＨＣｌ）、ｄＮＴＰ（たとえば、たとえば、約５０〜約１００μＭの濃度のｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、ポリメラーゼ（たとえば、５０μｌの反応当たり約０．５〜２．０単位）および／または水。１回の反応におけるプライマーデュプレックスの各鎖の濃度は、たとえば、標的核酸の濃度に応じて異なる。いくつかの実施形態では、約５〜約５０ｐｇのプラスミドまたはウイルス標的を使用してもよいし、または約５０ｎｇ〜約５００ｎｇのゲノム標的を使用してもよい。こうした例では、各プライマー（第１の鎖および第２の鎖）の濃度は、たとえば、約０．０５μＭ〜約１μＭであってもよい。特定の実施形態では、各プライマーの濃度は約１ｎＭ〜約１μＭである。

本明細書に記載の実施形態のいずれか１つでは、たとえば、標準的なＰＣＲに使用される条件と同様に、１回の反応を周期的な温度変化にさらして、ｄｓＤＮＡ構造が複数回の変性を起こし、次いでプライマーがアニーリングし、ポリメラーゼによる伸長が起きるようにしてもよい。いくつかの実施形態では、変性ステップの温度範囲は約９０〜約９５℃である。ある種の実施形態では、繰り返しサイクルの前に約１〜約５分の最初の変性ステップを必要とする。正確な時間の量は、目的の核酸標的のＧＣ含量によって異なることがある。ある種の実施形態では、サイクル反応における変性ステップは約１５〜約３０秒である。いくつかの実施形態では、アニーリングステップの温度範囲は約５０℃〜約６０℃である。いくつかの実施形態では、アニーリングステップは約２０℃〜約４０℃である。特定の実施形態では、アニーリングステップは室温（約２０℃または約２５℃）である。ある種の実施形態では、サイクル反応におけるアニーリングステップは約１５〜約３０秒である。いくつかの実施形態では、伸長ステップの温度範囲は約７０℃〜約７５℃である。ある種の実施形態では、サイクル反応における伸長ステップは約４５〜約６０秒である。各ステップの温度、時間、およびサイクル反応のサイクル数は、目的の核酸標的（単数または複数）の長さのほか、使用するポリメラーゼによって異なってもよい。標的が長くなると、たとえば、より長い伸長時間を要することがある。５００ヌクレオチド標的のサイクル条件の１つの例を表２に示す。

本明細書に記載の実施形態のいずれか１つでは、１回の反応（たとえば、核酸増幅）が室温（たとえば、約２０℃または約２５℃）で進行する。ある種の実施形態では、１回の反応が室温で約１時間進行する。

本明細書に記載の方法のいずれか１つでは、プライマーデュプレックスの第２の保護体鎖を第１の相補鎖より過剰に、またはアニーリングしたプライマーデュプレックスより過剰に用意してもよい。たとえば、いくつかの実施形態では、第１の鎖の濃度の約１×〜約１０×濃度（たとえば、１×濃度、２×濃度、３×濃度、４×濃度、５×濃度、６×濃度、７×濃度、８×濃度、９×濃度、または１０×濃度）、またはアニーリングしたプライマーデュプレックスの濃度の約１×〜約１０×濃度（たとえば、１×濃度、２×濃度、３×濃度、４×濃度、５×濃度、６×濃度、７×濃度、８×濃度、９×濃度、または１０×濃度）で第２の鎖を用意する。いくつかの実施形態では、第１の鎖を約０．０５μＭ〜約１μＭの濃度で用意するのに対し、第２の鎖を約０．１０μＭ〜約２μＭの濃度、または約０．１５μＭ〜約３μＭの濃度、約０．２μＭ〜約４μＭの濃度、または約０．２５μＭ〜約５μＭの濃度で用意する。

本明細書に記載の方法のいずれか１つは、アレル特異的ＰＣＲ、アセンブリーＰＣＲ、非対称ＰＣＲ、ヘリカーゼ依存型増幅、配列間特異的ＰＣＲ（ＩＳＳＲ）、逆ＰＣＲ、ライゲーション媒介ＰＣＲ、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）、ミニプライマーＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、オーバーラップエクステンションＰＣＲ、定量ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、固相ＰＣＲ、ｔｈｅｒｍａｌ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｉｎｔｅｒｌａｃｅｄ ＰＣＲ（ＴＡＩＬ−ＰＣＲ）、およびタッチダウンＰＣＲから選択される方法を含んでもよい。

本明細書に記載の方法のいずれか１つでは、増幅された核酸標的の収率は、約３０％〜約１００％であってもよい。いくつかの実施形態では、収率は、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または少なくとも１００％である。

本明細書に記載の方法のいずれか１つでは、増幅された核酸産物を精製してもよい。核酸精製法は当業者よく知られており、フェノール抽出、グアニジニウムイソチオシアネート、アルコール沈殿、ＤＥＡＥ（イオン交換）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、塩化セシウム、アガロース、シリカからの抽出、および他のカラムを用いた精製法がある。

本明細書に記載の方法のいずれか１つでは、精製された増幅標的核酸は約３０％〜約１００％純粋であってもよい。いくつかの実施形態では、純度は少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％である。

イメージング
本明細書に記載のプライマーデュプレックスおよびシステムはまた、ｉｎ ｓｉｔｕイメージングアッセイの特異性を高めるために使用してもよい。生体ＲＮＡとフルオロフォア標識プライマーとの非特異的相互作用は、頻繁にバックグラウンドノイズの原因になる。このため、いくつかの実施形態では、図１４に図示したように、従来のプライマーの代わりにフルオロフォア標識した本明細書に記載の核酸プライマーシステムを使用すると、既存のｉｎ ｓｉｔｕ画像技術の性能が大きく向上する。とりわけ、相補体鎖またはドメインをフルオロフォアで、保護体鎖またはドメインをクエンチャーで標識することにより、プライマーデュプレックスシステムは、標的に結合したときのみ、検出可能なシグナルを発生する。

単一塩基多型（ＳＮＰ）検出
単一塩基多型（ＳＮＰ）の位置および種類の正確な検出には、研究目的および治療目的の両方から大きな関心が集まっている。よって、本明細書に記載の反応速度的（ｋｉｎｅｔｉｃ）識別方法は、ＳＮＰの簡便な同定に有用である。

キット
本明細書で提供されるのは、（１）バランス領域、分岐点移動領域およびトーホールド領域を有する少なくとも１つの相補体鎖、および（２）バランス領域および分岐点移動領域を有する少なくとも１つの保護体鎖を含むキットである。

本明細書で提供されるのは、（１）バランス領域、分岐点移動領域およびトーホールド領域を有する少なくとも１つの相補体鎖または領域、および（２）バランス領域および分岐点移動領域を有する少なくとも１つの保護体鎖または領域を含む少なくとも１つのプライマーデュプレックスを含むキットである。

本明細書に記載のキットのいずれか１つは、ポリメラーゼをさらに含んでもよい。本明細書で提供されるキットのいずれか１つは、緩衝液（たとえば、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、トリス−ＨＣｌ）、ｄＮＴＰ（たとえば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）および水から選択される１つ以上の作用薬をさらに含んでもよい。本明細書で提供されるキットのいずれか１つは、プライマーよりモル過剰の保護体鎖を含んでもよい。本明細書で提供されるキットのいずれか１つは、キットの成分を使用するための説明書または（たとえば、ウェブサイトから）説明書を入手するための指示書をさらに含んでもよい。本明細書で提供されるキットのいずれか１つは、少なくとも１つの反応チューブ、ウェル、チャンバーまたは同種のものをさらに含んでもよい。

本明細書に記載のプライマーまたはプライマーシステムのいずれか１つは、キットの形態で提供しても、またはキット内に入れられていてもよい。

本発明によれば、ＰＣＲ、転写および逆転写に関する上記の制約は、高度に特異的なプライマーデュプレックスを使用することにより克服することができる。本明細書に記載の実験から、プライマーデュプレックスが、ＤＮＡおよびＲＮＡ標的とプライマーとの両方（図１７）の単１塩基変化を含む標的（図１６）を確実に識別することができることが証明される。正しい標的は、およそ５０％の収率で７／５プライマーにハイブリダイズするが、単１塩基変化を含む標的は、大過剰（２００×）でも有意にハイブリダイズするには不十分である。プライマーデュプレックスを設計し、複数の異なる標的について試験したところ、各プライマーデュプレックスは、単１ヌクレオチド変化に対して高い識別率を達成した（図１７）。定量的には、単１ヌクレオチド変化を含む擬似標的とのハイブリダイゼーション収率における識別中央値は２６である。

プライマーデュプレックスを、原理証明実験のＰＣＲに使用した（図１８Ａおよび１８Ｂ）。従来のＰＣＲ（本プライマーデュプレックスを使用しないＰＣＲ）により増幅することが難しい不完全な反復標的核酸を設計した。標準的な２１ヌクレオチドプライマーおよびプライマーデュプレックスの収率を算出した。機能の範囲を調べるため、多様なサーマルサイクリングスケジュールを測定した。プライマーデュプレックスの長さおよびヌクレオチド含有量に基づく標準的なＰＣＲ条件から、プライマーのアニーリング温度は５５℃であろうと予測されることになる。驚いたことに、一例を挙げると、プライマーデュプレックスを用いて増幅された正しい長さの産物の割合（５０．２％）は、プライマーデュプレックスのアニーリングの最も不利な条件下でも（３５℃および４０℃）、標準的なプライマーを用いてその最も有利なＰＣＲ条件下で（４５℃）増幅された正しい長さの産物の割合（３１．０％）より高かった。さらに、この特定の実験では、プライマーデュプレックスを任意に設計し（７ヌクレオチドのトーホールド領域および５ヌクレオチドのバランス領域）、ＰＣＲの収率性について最適化しなかった。したがって、本プライマーデュプレックスの最適化により、さらに高いＰＣＲ特異性が得られる可能性がある。

図１５は、本明細書で提供されるプライマーデュプレックスを用いた高度に特異的なＰＣＲを示す。図５Ａでは、プライマー「ＰＣ」は、相補体鎖「Ｃ」および保護体鎖「Ｐ」からなる。ＰＣが目的の標的に正しい位置「Ｘ」で結合すると、一本鎖保護体オリゴヌクレオチド「Ｐ」は不活性な廃棄物として遊離し、プライマー結合した標的はＤＮＡポリメラーゼにより伸長される。図５Ｂでは、プライマーＰＣが意図していない標的または正しい標的に不適切な位置（どちらの場合も、「Ｙ」で示す）で結合すると、相補鎖「Ｃ」からの保護体の移動は熱力学的に不利であり、反応速度的に速やかに逆戻りする。その結果、標的外の増幅（たとえば、ＸはでなくＹの増幅）が大きくが減少すると予想される。

図１６．は、プライマーハイブリダイゼーションによる単１ヌクレオチド識別の実験的証明を示す。図１６Ａでは、短い合成ＤＮＡ標的「Ｘ」または擬似標的「Ｙ」をプライマーと反応させる。（保護体鎖「Ｐ」のポリＴテールは、産物をゲル上の反応物と区別する働きをする）。擬似標的Ｙの単１塩基変化の位置を赤枠で示す。図１６Ｂは、未変性ポリアクリルアミドゲルの結果を示す。プライマー「ＰＣ」は、保護体Ｐと相補体Ｃとの比２：１で調製し、ＰＣの濃度１μＭでアニーリングした。正しい標的または擬似標的のいずれも、標的（ＸまたはＹ）が２００ｎＭ、ＰＣが１００ｎＭ、Ｐが１００ｎＭの最終濃度になるように加えた。いくつかの実施形態では、反応は、過剰の保護体（Ｐ）プライマーを含んでもよい。たとえば、いくつかの実施形態では、保護体鎖を相補体鎖の約１×〜約１０×（たとえば、１×、２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×または１０×）の濃度で加えてもよい。反応はすべて室温（２５℃）で１時間進行させた。一例を挙げると、設計「７／４」は、標的とのハイブリダイゼーションを開始する７ヌクレオチドの一本鎖ヌクレオチドを（３’オーバーハングとして）有し、保護体が自然に解離して４ヌクレオチドが遊離するプライマーを意味する。図１６Ｃは、図１６Ｂに示したデータから推測されるハイブリダイゼーション収率をプロットしたものである。プライマーと正しい標的Ｘとのハイブリダイゼーションをプロット「Ｘ」で示し、残りの「点の付いた」プロットは擬似標的Ｙとのハイブリダイゼーションを示す。７／４、７／５および７／６のプライマーはすべてそのハイブリダイゼーション収率（χ）において正しい標的と擬似標的とを識別する。７／０標的は識別しない。図１６Ｄの識別率（Ｑ）は、プライマーの特異性の定量的測定値であり、正しい標的のハイブリダイゼーション収率（χ）を擬似標的のハイブリダイゼーション収率（χ）で割った商として算出する。１６Ｅでは、擬似標的が大過剰（すなわち、２００倍）で存在しても、７／５プライマーとそうした標的Ｙとのハイブリダイゼーションがほとんど存在しない。

図１７．は、プライマーデュプレックスの単１塩基識別能に関する追加の実験結果および統計を示す。図１７Ａは、４つの追加の標的およびプライマーセットを構築し、試験したことを示す。そのうち２つは、天然に存在するマイクロＲＮＡ配列に基づき、２つは、意図的に顕著な二次構造を有するように設計した。図１７Ｂは、各標的に対して７／５プライマーにより得られた識別率（Ｑ）のヒストグラムを示す。ゲルスキャナーの限界により、１００を超える識別率を確実に測定することができなかったため、これらをすべて「１００＋」に分類した。図１７Ｃは、ＲＮＡ標的およびプライマーを示す。標的配列は、ヒトｌｅｔ７ｇマイクロＲＮＡと同一の配列を含む合成ＲＮＡオリゴヌクレオチドである。図１７Ｄは、未変性ＰＡＧＥの結果を示す。ＰＣプライマーは、保護体Ｐと相補体Ｃとの比２：１で調製し、３μＭの濃度でアニーリングした。正しい標的または擬似標的のいずれも、ＸまたはＹが２μＭ、ＰＣが１μＭ、Ｐが１μＭの最終濃度になるように加えた。正しい標的はプライマーへの結合に成功するが、単１ヌクレオチドのミスマッチを含む標的とのハイブリダイゼーション収率は低い。

図１８は、類似反復標的のＰＣＲの収率を高めるためにデュプレックスプライマーを使用した実験結果を示す。図１８Ａは、従来のＰＣＲプライマーが高い収率で増幅するのに苦労する類似反復ＰＣＲ標的（１６８ｎｔ）を示す。ここで、ａ＊はＸ１の正しい標的である。残りの符号ａ＊ｍ１（Ｘ１−ｍ１７Ｇである）、ａ＊ｍ２（Ｘ１−ｍ９Ｔである）、およびａ＊ｍ３（Ｘ１−ｍ１１Ｇである）の部位は、正しい標的ではない。同様に、ｂ＊はＸ２の正しい標的であり、ｂ＊ｍ１（Ｘ２−ｍ３Ｔである）、ｂ＊ｍ２（Ｘ２−ｍ１１Ｃである）、およびｂ＊ｍ３（Ｘ２−ｍ１８Ｔである）は正しい標的ではない。よって、最外側の結合部位は、プライマーの完全な結合部位であるが、完全な部位の間には他に３つの単１塩基ミスマッチのプライマー結合部位も存在する。プライマーデュプレックスは標的に７ヌクレオチド結合し、保護体は自然に解離して５ヌクレオチドを遊離しなければならない。プライマーデュプレックスは、その３’末端がポリメラーゼにより伸長できないように設計した。相補体鎖のトーホールド領域は、以前の設計と同様に５’末端ではなく３’末端に設計した。図１８Ｂでは、プライマーデュプレックスは、標準的なプライマーと比較して正しい長さの産物について著しく高い収率を示す。各レーンには、使用したプライマーのほか、温度サイクリングスケジュール（たとえば、「９８−４０−７２」は、９８℃での変性、４０℃でのアニーリング、および７２℃での伸長を示す）を表記した。最も左側のレーンは、合成オリゴヌクレオチド基準物質を示す。「適切性の割合（％）」と表記した下の数字は、レーンの全バンドの積分強度と比較した、正しい長さの産物に対応するバンドの相対強度を示す。プライマーデュプレックスのＰＣＲ産物は、各プライマーの５ヌクレオチドのオーバーハング（トーホールド領域）が原因で、基準物質および標準的なＰＣＲ産物より１０ヌクレオチド長いように見える。

等価物
当業者であれば、ごく通常の実験を用いるのみで、本明細書に記載した具体的な実施例に対する等価物を数多く認識するか、あるいは確認することができるであろう。

冠詞「１つの（ａ、ａｎ）」は、冠詞の文法上の目的語の１つ以上（すなわち、少なくとも１つ）をいう。たとえば、「１つの構成要件（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの構成要件または２つ以上の構成要件を意味する。

ある群の１つ以上の構成要素の間に「または」を含む請求項または記載は、異なる記載がない限り、あるいは、文脈から明らかである場合を除き、その群の構成要素の１つ、２つ以上または全部が、ある物または方法に存在している、利用されている、または他の点で関連している場合、十分であると見なされる。本発明は、群の正確な１つの構成要素が、ある物または方法に存在している、利用されている、または他の点で関連している実施形態を含む。本発明は、群の構成要素の２つ以上または全部が、ある物または方法に存在している、利用されている、または他の点で関連している実施形態を含む。さらに、本発明は、記載された請求項の１つ以上における１つ以上の限定、構成要件、各箇条、記述的用語等が別の請求項に挿入される変形、組み合わせおよび順列をすべて包含することも理解されよう。たとえば、別の請求項に従属した任意の請求項は、同じ基本請求項に従属した他の任意の請求項に記載された１つ以上の限定を含むように改変してもよい。

構成要件がたとえば、マーカッシュ群形式のリストとして提示される場合、構成要件の下位群も各々開示され、その群から任意の構成要件（単数または複数）を除去してもよいことが理解されよう。一般に、本発明または本発明の態様が特定の構成要件、特徴を含むものとして言及される場合、本発明のある種の実施形態または本発明の態様は、そうした構成要件および／または特徴からなる、または本質的になることを理解されたい。簡潔にするため、本明細書ではそのような実施形態をそうした表現で具体的に記載していない。また、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、オープンランゲージであることを意図しており、追加の構成要件またはステップを含み得ることも留意されたい。

範囲が記載されている場合、端点が含まれる。さらに、他に記載がない限り、あるいは、文脈および当業者の理解から明らかである場合を除き、本発明の異なる実施形態では、範囲で表現される値は、文脈上明らかに他の意味に解すべき場合を除き、記載した範囲内の任意の特定の値または下位の範囲をその範囲の下限の単位の１０分の１まで想定し得ることが理解されよう。

本明細書で使用する場合、「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は一般に、記載した値の１０％の範囲内の任意の値をいう場合がある。ただし、一部の例では、「約（ａｂｏｕｔ）」は、記載した値の２０％の範囲を包含してもよい。

さらに、従来技術に包含される本発明の任意の特定の実施形態は、請求項の任意の１つ以上から明示的に除外してもよいことが理解されよう。こうした実施形態は、当業者に公知であると見なされるため、本明細書に除外が明示的に記載されていなくても除外してもよい。本発明の方法の任意の特定の実施形態は、従来技術が存在するか否かに関係なく、いかなる理由であれ、任意の１つ以上の請求項から除外してもよい。本発明は、その用途において、以下の説明に記載したまたは図面に示した構成の詳細および要素の配置に限定されない。本発明は他の実施形態が可能であり、様々な方法で実施または実行することができる。また、本明細書に使用される表現および用語は説明を目的としており、限定的なものとして見なしてはならない。本明細書の「を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「を有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「を含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「を含む（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、およびそれらの変形は、その後に記載される項目およびその等価物のほか、追加項目を包含することを意図している。

前述の特許、特許出願および参考文献は、特に本明細書に引用した教示内容について本明細書に援用する。

参考文献
［１］ Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｍ．＆ Ｗｅｎｇｅｌ，Ｊ．ＬＮＡ：ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ ｇｅｎｏｍｉｃｓ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１，７４−８１，（２００３）．
［２］ Ｋｒｕｅｇｅｒ，Ａ．Ｔ．＆ Ｋｏｏｌ，Ｅ．Ｔ．Ｒｅｄｅｓｉｇｎｉｎｇ ｔｈｅ Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｓｅ Ｐａｉｒ：Ｔｏｗａｒｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｗ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｅｔｓ．Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．１６，２４２−２４８（２００９）．
［３］ Ｌｉｚａｒｄｉ，Ｐ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｍｕｔａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ｒｏｌｌｉｎｇ−ｃｉｒｃｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９，２２５−２３２（１９９８）．
［４］ Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．，Ｇｅｌｆａｎｄ，Ｄ．Ｈ．，Ｓｔｏｆｆｅｌ，Ｓ．，Ｓｃｈａｒｆ，Ｓ．Ｊ．，Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｒ．，Ｈｏｒｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｍｕｌｌｉｓ，Ｋ．Ｂ．＆ Ｅｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．Ｐｒｉｍｅｒ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｗｉｔｈ ａ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９，４８７−４９１（１９８８）．
［５］ Ｚｈａｎｇ，Ｄ．Ｙ．，Ｃｈｅｎ，Ｘ．＆ Ｙｉｎ，Ｐ．Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ（２０１１）．

Claims (35)

1. 第１および第２の核酸鎖からなる部分二本鎖プライマーであって、
   （１）１つの二本鎖標的非特異的領域、
   （２）１つの二本鎖標的特異的領域、および
   （３）前記第１の核酸鎖に含まれる１つの一本鎖標的特異的領域、
   がこの順で配置され、
   前記二本鎖標的非特異的領域は、標的核酸の完全相補領域に結合した前記一本鎖標的特異的領域の標準自由エネルギーとほぼ等しい標準自由エネルギーを有し、前記（１）の領域を形成する前記第１の核酸鎖の配列は、前記標的核酸と完全に相補的ではなく、前記（２）および（３）の領域を形成する第１の核酸鎖の配列は標的核酸と相補的かつ標的核酸と結合し、前記第２の核酸鎖が前記第１の核酸鎖よりも短い、部分二本鎖プライマー。
2. 前記第２の核酸鎖はその３’末端に非伸長性ヌクレオチドを含み、および／または前記第１の核酸鎖はその標的非特異的領域の３’末端または３’末端付近に非天然ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の部分二本鎖プライマー。
3. 前記非伸長性ヌクレオチドは非天然ヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドである、請求項２に記載の部分二本鎖プライマー。
4. 前記非天然ヌクレオチドはイソ−Ｃ、イソ−Ｇまたはデオキシウリジンである、請求項３に記載の部分二本鎖プライマー。
5. 前記二本鎖標的非特異的領域は４〜２１ヌクレオチド長である、請求項１から４のいずれか１項に記載の部分二本鎖プライマー。
6. 前記一本鎖標的特異的領域は４〜２０ヌクレオチド長である、請求項１から５のいずれか１項に記載の部分二本鎖プライマー。
7. 前記第１および第２の核酸鎖はＤＮＡまたはＲＮＡからなる、請求項１から６のいずれか１項に記載の部分二本鎖プライマー。
8. 核酸標的、
   ポリメラーゼ、ならびに
   第１および第２の核酸鎖からなる部分二本鎖プライマーであって、
   （１）１つの二本鎖標的非特異的領域、
   （２）１つの二本鎖標的特異的領域、および
   （３）前記第１の核酸鎖に含まれる１つの一本鎖標的特異的領域
   をこの順で含む部分二本鎖プライマー
   を含むシステムであって、
   前記二本鎖標的非特異的領域は、標的核酸の完全相補領域に結合した前記一本鎖標的特異的領域の標準自由エネルギーとほぼ等しい標準自由エネルギーを有し、前記（１）の領域を形成する前記第１の核酸鎖の配列は、前記標的核酸と完全に相補的ではなく、前記（２）および（３）の領域を形成する第１の核酸鎖の配列は標的核酸と相補的かつ標的核酸と結合し、前記第２の核酸鎖が前記第１の核酸鎖よりも短い、システム。
9. 前記核酸標的は一本鎖である、請求項８に記載のシステム。
10. 前記核酸標的はＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項８または９に記載のシステム。
11. 前記システムは複数の異なる部分二本鎖プライマーを含む、請求項８から１０のいずれか１項に記載のシステム。
12. 前記システムは、前記核酸標的の領域を増幅するために一緒に使用することができる少なくとも２つの部分二本鎖プライマーを含む、請求項８から１１のいずれか１項に記載のシステム。
13. 前記核酸標的は反復配列、二次構造および／または高ＧＣ含量を含む、請求項８から１２のいずれか１項に記載のシステム。
14. 前記核酸標的は複数の異なる核酸標的に存在する、請求項８から１３のいずれか１項に記載のシステム。
15. 前記核酸標的は複数の異なる核酸標的に単一コピーとしてまたは低コピーで存在する、請求項１４に記載のシステム。
16. 請求項１に記載の部分二本鎖プライマーをサンプルに接触させること、および
    前記プライマーと前記サンプル中の標的とのハイブリダイゼーションを検出すること
    を含む方法。
17. 前記部分二本鎖プライマーは検出可能な部分で標識される、請求項１６に記載の方法。
18. 前記検出可能な部分はフルオロフォアまたは放射性同位元素を含む、請求項１７に記載の方法。
19. 前記標的は前記サンプル中に単一コピーとして存在する、請求項１６から１８のいずれか１項に記載の方法。
20. 請求項１に記載の部分二本鎖プライマーの第１の鎖の一本鎖標的特異的領域を核酸標的にハイブリダイズし、それにより前記プライマーの前記第１の鎖を前記プライマーの第２の鎖から解離すること、および
    ポリメラーゼの存在下で標的と相補的に前記第１の鎖をその３’末端から伸長させること
    を含む方法。
21. 核酸標的、ポリメラーゼおよび請求項１に記載の１つ以上の部分二本鎖プライマーの存在下で核酸合成反応を行うこと
    を含む方法。
22. 前記核酸合成反応は核酸増幅反応である、請求項２１に記載の方法。
23. 前記核酸増幅反応はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である、請求項２２に記載の方法。
24. 前記核酸合成反応は転写反応である、請求項２１に記載の方法。
25. 前記転写反応は逆転写反応である、請求項２４に記載の方法。
26. ２つの部分二本鎖プライマーが使用される、請求項２０から２５のいずれか１項に記載の方法。
27. 請求項１に記載の１つ以上の部分二本鎖プライマー、および
    １種以上の核酸合成試薬
    を含むキット。
28. 前記１種以上の核酸合成試薬は緩衝液、ヌクレオチドおよびポリメラーゼからなる群から選択される、請求項２７に記載のキット。
29. 使用説明書をさらに含む、請求項２７または２８に記載のキット。
30. 第１の容器中の第１の一本鎖核酸、および
    第２の容器中の、前記第１の一本鎖核酸の領域と相補的である第２の一本鎖核酸、
    を含み、
    前記第１および第２の一本鎖核酸が相互にハイブリダイズすると、
    （１）二本鎖標的非特異的領域、
    （２）二本鎖標的特異的領域および
    （３）前記第１の核酸に含まれる一本鎖標的特異的領域
    をこの順で含む部分二本鎖核酸が形成されるキットであって、
    前記二本鎖標的非特異的領域は、標的核酸の完全相補領域に結合した前記一本鎖標的特異的領域の標準自由エネルギーとほぼ等しい標準自由エネルギーを有し、前記（１）の領域を形成する前記第１の核酸鎖の配列は、前記標的核酸と完全に相補的ではなく、前記（２）および（３）の領域を形成する第１の核酸鎖の配列は標的核酸と相補的かつ標的核酸と結合し、前記第２の核酸鎖が前記第１の核酸鎖よりも短い、キット。
31. 使用説明書をさらに含む、請求項３０に記載のキット。
32. １種以上の核酸合成試薬をさらに含む、請求項３０または３１に記載のキット。
33. 前記１種以上の核酸合成試薬は緩衝液、ヌクレオチドおよびポリメラーゼからなる群から選択される、請求項３２に記載のキット。
34. 部分的に自己ハイブリダイズして下記の
    （１）１つ以上の二本鎖標的非特異的領域、
    （２）１つ以上の二本鎖標的特異的領域、
    （３）１つ以上の一本鎖標的特異的領域、および
    （４）１つ以上のヘアピンループ領域、
    を形成する一本鎖プライマーであって、部分的に自己ハイブリダイズした際に、前記領域（１）、（２）および（３）はこの順で存在し、
    前記１つ以上の二本鎖標的非特異的領域は、標的核酸の完全相補領域に結合した前記１つ以上の一本鎖標的特異的領域の濃度調整標準自由エネルギーとほぼ等しい濃度調整標準自由エネルギーを有する
    一本鎖プライマー。
35. 請求項１から７および３４のいずれか１項に記載のプライマーを用いて複数の特有の核酸分子を増幅させること
    を含む、マルチプレックスによる核酸増幅反応を行う方法。

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