CN104884634A - 利用链置换交换反应检测非核酸分析物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于检测不同于DNA和RNA的分析物的分析物检测系统。该系统包含能以特异性方式彼此杂交且能基于特异性杂交事件生成信号的一组寡核苷酸。该系统依赖于在存在分析物的情况中寡核苷酸之间的杂交平衡的变化，其导致信号变化。
Description
发明领域
本发明涉及一种分析物检测系统。具体地，本发明涉及一种分析物检测系统，其中分析物不是核酸(即DNA和RNA)。
发明背景
多种不同方法可用于检测样品中的肽/蛋白质和其他分子，如ELISA、SPR、QCM、电化学传感器等。这些基于表面的方法赋有较高的灵敏性和多重传感能力，但固定化规程可能干扰蛋白质-配体结合，而且经常需要仔细清洗和封闭以对抗非特异性吸附。仅有少数完善确立的同质性测定法(homogeneous assay)，其中荧光偏振被广泛用于研究小分子-蛋白质相互作用(Analysis of protein-ligand interactions by fluorescence polarization,Ana Rossi&Colin Taylor,Nature protocols,2011)。
电化学生物传感器通常基于产生或消耗电子的反应的酶促催化。酶联免疫吸附测定法(ELISA)是基于板的测定法，其设计用于检测和量化物质如肽、蛋白质、抗体和激素。表面等离振子共振(SPR)检测固定化配体在其结合较大蛋白质时的尺寸增加，其通过记录薄金属膜表面处折射系数的变化进行。石英晶体微天平(QCM)检测方案基于对堆积于晶体表面上的薄层的质量变化和物理特性的测量。荧光偏振检测小荧光配体对较大蛋白质的结合，其使用平面偏振光来检测有效分子体积的变化进行。
还存在一系列能检测样品中的核酸分子的测定法，如PCR、Southern印迹、Northern印迹和FISH。最近的一种办法是DNA立足点交换(toeholdexchange)反应。DNA立足点交换反应是一种系统，其中各具有特定立足点区的两个DNA链彼此竞争以与充当底物的第三DNA链杂交。由于其极大的模块性、可设计性和灵敏性，已将其用于建立催化性DNA网络(Zhang等Engineering entropy-driven reactions and networks catalyzed by DNA.Science2007,318,1121-1125)、控制DNA链置换动力学(Zhang等Control of DNAstrand displacement kinetics using toehold exchange.J Am Chem Soc 2009,131,17303-17314)、和优化核酸杂交的特异性(Zhang等Optimizing the specificityof nucleic acid hybridization.Nat Chem 2012,4,208-214)。然而，这些系统仅涉及检测核酸分子。
因此，用于检测不同于DNA和RNA的分子的改进检测系统将是有利的，特别是一种用于检测不同于DNA和RNA的小分子的更有效和/或更可靠的检测系统将是有利的。
发明概述
本发明提供用于检测不同于DNA和RNA的分析物的分析物检测系统。该系统包含可以以特异性方式彼此杂交且能基于特异性杂交事件生成信号的一组寡核苷酸。该系统依赖于在存在分析物时寡核苷酸之间的杂交平衡的变化，其导致信号变化。
本文中我们呈现了一种利用DNA立足点交换反应来进行非核酸靶物检测的检测系统，其通过将小分子(例如抗原或半抗原)附接于三条DNA链的一条或多条上。小分子与其受体蛋白质或抗体之间的特异性结合使初始平衡迁移，且可通过例如FRET(共振能量转移)信号监测溶液中每种组分的群体变化。该方案显示如下：
此处A、B和S是三种DNA寡核苷酸，其中A和B两者均部分互补于S。X代表A上标记的小分子，而Y是其相应的结合蛋白质。例如，没有Y时，A和B具有相等或几乎相等的与S杂交的能力，而有Y时，该蛋白质的大体积(bulkiness)、电荷或其他作用将影响杂交能量，如此它们的百分数将例如从50:50变为20:80。该概念基本上利用了以下事实，即用于每种杂交形成的能量的小扰动将导致两种DNA杂合物之间的平衡的相对较大的迁移。
在典型的立足点交换反应系统中，两个共享相同分支迁移区(branchmigration region)但立足点区不同的DNA链将彼此动态竞争以与第三DNA杂交。完整的置换循环例示于图2。例如，开始时链A(A)与链S(S)配对以形成AS双链体。由于S具有用于链B(B)的另一个立足点区，B上的立足点有机会与S上的立足点杂交。由于序列对称性，A和B两者刚与S结合就会发生分支迁移过程。在该过程中，A和B具有相等的置换彼此的机会，从而一半的产物将是B完全具有S的分支迁移区，而A仅经由立足点与S结合。由于立足点通常较短，该杂交不稳定且短暂，最终留下溶液中的BS加A的组分。上述所有步骤均可逆。注意这里B通常在分支迁移区中具有经标记的结合模块。
在存在分析物时，分析物对连接于B的小分子的结合可能对立足点结合没有较大影响，但将对B实施分支迁移过程产生增加的能量障碍，从而使B相比于A在对S的竞争性结合中不利(或偶尔有利)。因此，在终产物中，热动力平衡被移向形成更多AS双链体(偶尔更多的BS双链体)以及与靶分析物结合的单链B的方向，而且这种群体变化可通过FRET或其他光学方法检测到。
在实施例部分，不同的研究类型显示这一概念对于检测不同于RNA和DNA的分析物确实有功能。
总之，已开发了一种新的检测系统，其可以基于微调(fine-tuned)的立足点交换反应来检测蛋白质和小分子两者。该测定法是无酶的，且与传统测定法如ELISA相比，它避免了蛋白质修饰和寻找二价抗原/抗体的工作。
这类测定法可以用作灵敏、特异、强力和高通量的平台以检测健康、食品、兽医和环境相关活动中的多种靶物。
如此，本发明的一个目的涉及提供一种检测系统，其可以检测不同于DNA和RNA的分子。另一个目的是提供一种检测系统，其可以检测不同于DNA和RNA的小分子且仅需要分析物上的一个结合位点来检测分析物。这与例如需要分析物上的两个结合位点的ELISA测定法形成对比。对于小分析物，可能不存在两个结合位点。
如此，本发明的一个方面涉及用于检测不同于DNA和RNA的分析物的分析物检测系统，该系统包含至少第一寡核苷酸A、第二寡核苷酸B和第三寡核苷酸S，其中：
寡核苷酸A和B各自包含与寡核苷酸S上的序列互补或部分互补的序列，且其中寡核苷酸A和B在动态平衡中竞争与寡核苷酸S的杂交，且任选地其中寡核苷酸A和B的至少一种包含能与不同于DNA和RNA的分析物相互作用的共价连接的结合模块；且
寡核苷酸A和B的至少一种或结合于所述寡核苷酸的共价连接的结合模块能与不同于DNA和RNA的分析物相互作用，从而所述分析物与所述寡核苷酸或结合模块的相互作用导致杂交平衡的迁移，所述平衡的迁移提供可检测信号。
分析物检测系统的例示性例子呈现于图1和2。
如背景部分中描述的，描述了类似于本测定法的用于DNA检测的测定法。然而，所述设置不适用于检测不同于DNA和RNA的分析物，如蛋白质和小有机分子。对于这类目的，更适用不同的系统如ELISA。
本发明的另一个方面涉及成套试剂盒(kit of parts)，其包含依照本发明的分析物检测系统。
本发明的又一个方面提供了一种成套试剂盒，其包含依照本发明的第一寡核苷酸、第二寡核苷酸和第三寡核苷酸。
本发明的再一个方面提供了一种用于检测样品中不同于DNA和RNA的分析物的存在或水平的方法，所述方法包括：
a)提供包含或怀疑包含感兴趣分析物的样品；
b)提供依照本发明的分析物检测系统；
c)将所述样品与所述分析物检测系统一起温育；
d)将分析物的检测水平与参照水平比较；和
e)测定所述样品中分析物的存在或水平。
附图简述
图1
图1显示了本发明的一个具体实施方案，其具有依照本发明的第一寡核苷酸1(SEQ ID NO:1)、第二寡核苷酸3(SEQ ID NO:2)和第三寡核苷酸5(SEQ ID NO:3)的特定序列。8、8’和9、9’指示立足点区而7、7’指示分支迁移区。箭头指示寡核苷酸的5’至3’方向。
图2
图2显示当分析物结合结合模块(4)时平衡如何变化的例子。编号如图1中所示。a)没有靶分析物，A和B可设计为具有相等或接近相等的与S杂交的概率，产生对于AS和BS而言的50/50比率。b)在存在分析物时，分析物(在此情况中为靶物)的空间或静电效应导致对B在分支迁移过程中运行的能量屏障，产生对于AS和BS而言的80/20比率。
图3
图3显示了当生物素是结合模块而链霉亲合素(STV)是分析物时的检测系统。呈现了包含对依照本发明的第一寡核苷酸1(SEQ ID NO:4)、第二寡核苷酸3(SEQ ID NO:5)和第三寡核苷酸5(SEQ ID NO:6)的修饰的特定序列。编号如图1中指示。另外，2和6指示信号传导系统(siganlling system)，而4指示结合模块。
图4
图4显示用于链霉亲合素(STV)检测和用于生物素检测的三链系统的结果。(a)对于分别有和无STV的两份样品的标准化FRET效率。(b)对于分别有和无STV的两份样品的荧光谱。(c)STV检测的滴定曲线。(d)STV检测测定法的非变性凝胶分析。头两道是具有单生物素的系统，而最后两道是具有双生物素的系统。嵌入图(inset)是通过两位点相互作用结合于链B上的STV的图示。(e)通过抑制性策略对生物素的定量检测。分析物(生物素)首先与STV混合，然后将混合物添加到测定法。分析物将占据STV上的结合位点，其因此被失活。
图5
图5显示了传感器测定法的3种策略。在策略1中，通过与ABS系统上的结合模块相互作用获得对分析物/靶物(例如蛋白质或抗体)的直接检测。在抑制性策略2中，将未知的标本和相应的蛋白质预混合，接着添加到正常测定法中。如果标本包括游离配体，那么它们将阻断蛋白质的结合位点，使其不能在测定法上发挥功能。在竞争性策略3中，首先将相应蛋白质与正常DNA测定法混合以形成新测定法，然后添加未知的标本以与链B上的配体竞争以结合蛋白质，如此对平衡具有相反效果。
图6
图6显示了对照实验。A)添加物对图3中描述但无结合模块的ABS系统的影响。3种荧光团设置。B)添加物对图3中描述但具有生物素结合模块的ABS系统的影响。2种荧光团设置。在添加任意分析物后没有观察到可检测的变化，但当向含有生物素结合模块的系统添加链霉亲合素时除外。
图7
图7显示了链霉亲合素结合测定法的动力学。分别具有4nt(左)和6nt(右)的立足点长度的两种测定法的比较。在这两种测定法中，生物素修饰位于B的立足点区上，且A和S具有一对荧光团(Alexa488&Alexa555)。结果指示更长的立足点(在A和B两者上)确保更快的平衡，其代价是导致更小的STV结合效果，这由(b)中的FRET结果确认。最终设计优选为动力学和信噪比的折中。另外，FRET测量表明3小时温育足以使4nt系统在添加STV后达到平衡(数据未显示)。
图8
图8例示了当洋地黄毒苷(DIG)是结合模块而抗洋地黄毒苷(aD)是分析物时的检测系统。图A)显示包含依照本发明的第一寡核苷酸1(SEQ ID NO:7)、第二寡核苷酸3(SEQ ID NO:8)和第三寡核苷酸5(SEQ ID NO:6)的修饰的特定序列。编号如图1中指示。另外，2和6指示信号传导系统，而4指示结合模块。条形图B)显示在检测aD时的原始FRET信号变化。C)洋地黄毒苷的化学结构。图D)显示在aD滴定到寡核苷酸1,3和5时的FRET信号变化。E)显示天然聚丙烯酰胺凝胶的荧光图像，其中仅寡核苷酸A可见。在添加aD时看到AS群体的增加。
图9
图9例示了当洋地黄毒苷(DIG)是结合模块而抗洋地黄毒苷(aD)是分析物时人血浆中的检测系统。图A)编号与图8A相同。图B)是三重对照实验的结果，其与具有人血浆的样品比较没有任何添加人血浆的传感器(ABS)的设置。第1和3栏显示在没有人血浆的情况下检测aD时的FRET变化，而第2和5栏显示人血浆中的FRET变化。第4和6栏分别显示在没有和具有人血浆的情况下检测游离洋地黄毒苷的竞争性测定法。
图10
图10例示了当洋地黄毒苷(DIG)是结合模块而抗洋地黄毒苷(aD)是分析物时人唾液中的检测系统。图A)编号与图8A相同。条形图B)显示在唾液样品中检测aD时AS群体中的变化。
图11
图11例示了当几种洋地黄毒苷(DIG)分子充当结合模块而抗洋地黄毒苷(aD)是分析物时的检测系统。图A)显示了包含依照本发明的第一寡核苷酸1(SEQ ID NO:7)、第二寡核苷酸3(SEQ ID NO:9)和第三寡核苷酸5(SEQ IDNO:6)的修饰的特定序列。该图还例示了用于aD结合的几种DIG模块。条形图B)显示了检测aD时AS群体中的变化。
图12
图12例示了当充当竞争性/抑制性传感器时的检测系统。这里洋地黄毒苷(DIG)与抗洋地黄毒苷(aD)一起充当结合模块而游离DIG充当分析物。图A)编号与图8A相同。条形图B)显示检测缓冲液、人血浆和人唾液中的游离DIG的抑制性测定法中的AS群体变化。
图13
图13例示了通过抑制性测定法或竞争性测定法的DIG滴定曲线。
图14
图14例示了当维生素D(VD)是结合模块而维生素D结合蛋白(DBP)是分析物时的检测系统。此外，它还显示在抑制性和竞争性测定法中作为靶物的游离维生素D。该示意图显示通过DBP对B上VD的结合辅助的B链置换。条带迁移测定法显示天然聚丙烯酰胺凝胶的荧光图像，其中仅寡核苷酸A可见。在添加DBP时看到AS群体的增加。第一个图显示DBP到传感器的滴定。第二和第三个图分别显示对VD的抑制性和竞争性检测。
图15
图15显示了用于DNA检测的三链适体系统的设计和结果。呈现了包含依照本发明的第一寡核苷酸1(SEQ ID NO:10)、第二寡核苷酸3(SEQ ID NO:11)和第三寡核苷酸5(SEQ ID NO:12)的修饰的特定序列。编号如图1和3中指示的。(A)通过结构-转换适体的ATP检测方案。ATP的结合将缩短B上的有效立足点，由此阻碍BS的形成。(B)ATP检测的滴定曲线。
图16
图16显示了当使用拆分DNA过氧化物酶(split DNA peroxidase)信号传导系统时的系统。呈现了包含依照本发明的第一寡核苷酸1(SEQ ID NO:13)、第二寡核苷酸3(单生物素：SEQ ID NO:5和双生物素：SEQ ID NO:14)和第三寡核苷酸5(SEQ ID NO:15)的修饰的特定序列。编号如图1和3中指示的。使用两生物素系统，甚至可以肉眼检查。显示了使用一个生物素和两个生物素的检测。(A)通过使用拆分DNA过氧化物酶信号传导系统的STV检测的方案和结果。当在B上掺入两个生物素时，颜色差异在存在STV时是明显的，甚至可由肉眼区分。(B)在一个或两个生物素的情况下有或无STV的样品的吸光度。
图17
图17显示依照本发明的单链系统的设计。编号如图1和3中指示的。另外，11指示接头区。
图18
图18呈现了用于STV检测的单链系统和当使用实施例12中呈现的序列时获得的结果。(a)通过使用单链系统的STV检测方案。立足点交换反应在分子内发生，且所得构象可通过来自拆分DNA过氧化物酶的颜色变化来鉴定。(b)有或无STV的单链样品的吸光度。
图19
图19呈现了用于检测特殊小分子或离子的策略。(a)通过利用经由氢键键合的两面三聚氰胺-胸腺嘧啶识别的三聚氰胺检测方案(嵌入图)。没有三聚氰胺，链A比链B具有更长的立足点，如此具有更高的与S结合的优先权。当有三聚氰胺(其可充当T-T错配的连接物)时，链B比A具有更长的立足点，因此预期更多的BS双链体。(b)使用与(a)相同的设置，可检测二价汞阳离子，因为Hg2+因其在DNA中的T-T错配位点形成高度特异性的“夹心”复合物而出名，其中Hg2+在任一侧上的胸腺嘧啶残基的N1氮之间线性键合(嵌入图)。
图20
图20例示了更先进的策略，其中链S在内部具有一个(a)或两个(b)发夹。内部发夹的功能是在经标记配体及其结合蛋白质的位置周围构建多臂汇合点(junction)，目的是通过其三维构象生成更大的空间阻碍以阻止S与具有结合蛋白质的B之间的杂交。
现将以更多细节在下文描述本发明。
发明详述
分析物检测系统
在一个方面，本发明涉及一种分析物检测系统，其基于3种寡核苷酸之间的杂交平衡且能检测样品中的非核酸分析物。
本发明的该方面的一个实施方案是包含第一寡核苷酸(1)、第二寡核苷酸(3)和第三寡核苷酸(5)的分析物检测系统；其中：
●所述第一或第二寡核苷酸包含形成信号传导系统的第一部分的第一基团(first group)(2)；
●所述第三核苷酸包含形成所述信号传导系统第二部分的第二基团(second group)(6)；
●至少一种共价连接的结合模块(4)位于所述第一或第二寡核苷酸上；
其中所述第一或第二寡核苷酸与所述第三寡核苷酸之间的杂交生成信号或能催化信号生成，所述信号不同于当所述第一或第二寡核苷酸与所述第三寡核苷酸不杂交时；
且其中所述分析物的存在改变所述检测系统的杂交平衡，导致信号的变化。
所述分析物检测系统可以是例如一种以下系统，其中：
所述第一寡核苷酸(1)包含
○位于分支迁移区(branch migration region)(7)的5’侧的第一立足点区(first toehold region)(8)；
●所述第二寡核苷酸(3)包含
○位于分支迁移区(7)的3’侧的第二立足点区(second toeholdregion)(9)；和
●所述第三寡核苷酸(5)包含
○第一立足点区(8’)；
○第二立足点区(9’)；和
○分支迁移区(7’)；
其中：
●所述第一寡核苷酸(1)中的第一立足点区(8)和所述第三寡核苷酸(5)中的第一立足点区(8’)包含互补序列；
●所述第一寡核苷酸(1)中的分支迁移区(7)和所述第三寡核苷酸(5)中的分支迁移区(7’)包含一段互补核苷酸；
●所述第二寡核苷酸(3)中的第二立足点区(9)和所述第三寡核苷酸(5)中的第二立足点区(9’)包含一段互补核苷酸；和
●所述第二寡核苷酸(3)中的分支迁移区(7)和所述第三寡核苷酸(5)中的分支迁移区(7’)包含一段互补核苷酸。
在一个具体的实施方案中，本发明涉及用于检测不同于DNA和RNA的分析物的分析物检测系统，所述系统包含：
-第一寡核苷酸(1)，其包含：
●位于分支迁移区(7)的5’侧的第一立足点区(8)；
●任选地至少一种共价连接的结合模块(covalently linked bindingmoiety)(4)；
●任选地第一基团(2)，所述第一基团形成信号传导系统的第一部分：
-第二寡核苷酸(3)，其包含：
●位于分支迁移区(7)的3’侧的第二立足点区(9)；
●任选地至少一种共价连接的结合模块(4)；
●任选地第一基团(2)，所述第一基团形成信号传导系统的第一部分；
-第三寡核苷酸(5)，其包含：
●第一立足点区(8’)；
●第二立足点区(9’)；
●分支迁移区(7’)；
●任选地至少一种共价连接的结合模块(4)；
●第二基团(6)，所述第二组形成所述信号传导系统的第二部分；
条件是形成信号传导系统的第一部分的所述第一基团(2)包含在所述第一寡核苷酸(1)和/或所述第二寡核苷酸(3)中；
条件是至少一种共价连接的结合模块(4)位于所述第一寡核苷酸(1)和/或所述第二寡核苷酸(3)和/或所述第三寡核苷酸(5)上；
其中所述第一寡核苷酸(1)中的第一立足点区(8)和所述第三寡核苷酸(5)中的第一立足点区(8’)包含互补序列；
其中所述第一寡核苷酸(1)中的分支迁移区(7)和所述第三寡核苷酸(5)中的分支迁移区(7’)包含一段互补核苷酸；
其中所述第二寡核苷酸(3)中的分支迁移区(7)和所述第三寡核苷酸(5)中的分支迁移区(7’)包含一段互补核苷酸；
其中所述第二寡核苷酸(3)中的第二立足点区(9)和所述第三寡核苷酸(5)中的第二立足点区(9’)包含一段互补核苷酸；
其中所述第一寡核苷酸(1)与所述第三寡核苷酸(5)之间的杂交生成信号或能催化信号生成，所述信号不同于当所述第一寡核苷酸(1)与所述第三寡核苷酸(5)不杂交时，条件是形成信号传导系统的第一部分的所述第一基团(2)包含在所述第一寡核苷酸(1)上；或
其中所述第二寡核苷酸(3)与所述第三寡核苷酸(5)之间的杂交生成信号或能催化信号生成，所述信号不同于当所述第二寡核苷酸(3)与所述第三寡核苷酸(5)不杂交时产生或催化的信号，条件是形成信号传导系统的第一部分的所述第一基团(2)包含在所述第二寡核苷酸(3)上。
如本文中使用的，术语“检测”意图不仅涵盖使用本发明对分析物的存在或缺乏的定性检测，而且还涵盖对分析物量的定量。
对如本文中使用的“分析物”的提述包括检测单种分析物以及在适用时，检测两种或更多种分析物。
尽管寡核苷酸A,B和S将经常在不同的核苷酸链上，但本发明还可以在两种或更多种寡核苷酸通过共价键部分或完全连接的情况下实施本发明。
另外，虽然为了简洁使用3种寡核苷酸(一般称为A,B或S)来一般性描述了本发明，但清楚的是所述方法可使用另外的寡核苷酸实施，例如另外的寡核苷酸C或两种另外的寡核苷酸C和D，其中这类另外的核苷酸可以类似于如本文中描述的寡核苷酸A和/或B。或者/另外地，本发明可使用一种或多种类似于如本文所述的寡核苷酸S的别的寡核苷酸来实施。举例而言，本发明可使用用于检测第一分析物的一组寡核苷酸(A,B,S)连同用于检测第二分析物的第二组寡核苷酸(C,D,S’)来实施。
另一个备选方案是其中寡核苷酸S包含超过一个杂交域的。该备选方案的一个例子例示于图20，其中显示S具有一个或多个发夹转角(hairpin turn)，由此形成多个杂交域。尽管多个杂交域在图20中显示为单个寡核苷酸S的部分，但也可以使用其中两个或更多个这类结合域位于不同核苷酸链上的布置。
如先前提述的，本系统基于系统中寡核苷酸之间的杂交平衡的变化。如此，在一个实施方案中，分析物的存在改变了检测系统的杂交平衡，从而导致信号的变化，例如相比于当不存在分析物时。如此，本发明呈现了一种独特系统，其利用了在寡核苷酸(例如DNA)之间发生的杂交事件来检测样品中非DNA(或非RNA)的存在或水平。该测定法相比于例如ELISA检验具有几个优点。
-需要非常少的“手动”工作，从而使得该测定法快捷且廉价。
-组分在较长时间内稳定。
-测定法可在等温条件下实施，使得所需的设备廉价。
-可以更容易地检测小分析物，因为仅需要对分析物的一个结合事件。这与例如其中通常需要分析物上的两个结合位点的ELISA形成对比。
-该测定法是同质的，如此避免了固定化和清洗过程，以及非特异性吸附的问题。
-该测定法避免了抗体标记或蛋白质修饰。
第一寡核苷酸
第一寡核苷酸(1)形成检测系统的一部分。在一个实施方案中，第一寡核苷酸(1)的长度在8-100个核苷酸，如10-100，如15-100，如20-100，如30-100，如40-100，如50-100，如60-100，如70-100，如80-100，如90-100，如8-90，如8-80，如8-70，如8-60，如8-50，如8-40，如8-30，如8-20，或如8-15个核苷酸的范围内。在又一个实施方案中，第一寡核苷酸(1)选自下组：SEQ ID NO:1,4,7,10和13。尽管提供了特定的序列，但本发明完全不受这些序列的限制，因为可以选择不同的序列组合。这以分析物不依赖于序列检出的事实为基础。如果多重测定法设计为检测样品中的超过一种分析物，那么不同序列可以是有用的。在实施例部分，呈现了使用不同寡核苷酸组的结果。
在本发明背景中，术语“5’侧”指位于在核酸分子内特定位点或区域5’的位置处的核酸序列。类似地，术语“3’侧”指位于在核酸分子内特定位点或区域3’的位置处的核酸序列。
第二寡核苷酸
第二寡核苷酸(3)形成检测系统的一部分。在一个实施方案中，第二寡核苷酸(3)的长度范围为8-100个核苷酸，如10-100，如15-100，如20-100，如30-100，如40-100，如50-100，如60-100，如70-100，如80-100，如90-100，如8-90，如8-80，如8-70，如8-60，如8-50，如8-40，如8-30，如8-20，或如8-15个核苷酸。在又一个实施方案中，第二寡核苷酸(3)选自下组：SEQ ID NO:2,5,8,9,11和14。如上文提述的，本发明完全不受这些序列限制。
第三寡核苷酸
第三寡核苷酸(5)形成检测系统的一部分。在一个实施方案中，第三寡核苷酸(5)的长度范围为8-100个核苷酸，如10-100，如15-100，如20-100，如30-100，如40-100，如50-100，如60-100，如70-100，如80-100，如90-100，如8-90，如8-80，如8-70，如8-60，如8-50，如8-40，如8-30，如8-20，或如8-15个核苷酸。在又一个实施方案中，第三寡核苷酸(5)选自特定的SEQ IDNO:3,6,12和15。如上文提到的，本发明完全不受这些序列限制。
寡核苷酸(1,3,5)的每一个可包含天然和/或非天然核苷酸两者。如此，在一个实施方案中，寡核苷酸(1,3,5)包含天然和/或非天然核苷酸。在又一个实施方案中，非天然核苷酸选自下组：含PNA、LNA、木-LNA(xylo-LNA)、硫代磷酸酯、2’-甲氧基、2’-甲氧基乙氧基、吗啉代和氨基磷酸酯(phosphoramidate)的分子等。非天然核苷酸的一个优点是它们可以更加生物稳定，因为它们不那么受例如核酸酶降解。然而，寡核苷酸还可以由DNA和/或RNA构成。如此，在又一个实施方案中，寡核苷酸由天然核酸构成，如DNA或RNA，优选DNA。
如本文中使用的术语“寡核苷酸”、“核酸”、“核酸分子”或“核酸序列”指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)或其模拟物的寡聚物或聚合物。该术语包括由天然存在的核碱基、糖和共价核苷间(骨架)磷酸二酯键连接构成的分子，以及具有非天然存在的核碱基、糖和共价核苷间(骨架)连接的功能相似的分子，或其组合。相对于天然形式，这类经修饰或取代的核酸经常是优选的，因为其具有期望的特性如例如增强的细胞摄取、增强的对核酸靶物的亲和力和在存在核酸酶和其他酶情况下的增加的稳定性，而且在此背景中其由术语“核酸类似物”或“核酸模拟物”描述。核酸模拟物的优选的例子为含肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、木-LNA、硫代磷酸酯、2’-甲氧基、2’-甲氧基乙氧基、吗啉代和氨基磷酸酯的分子等。
所述核酸、核酸分子或核酸序列可以例如完全由脱氧核糖核苷酸、完全由核糖核苷酸、完全由核酸模拟物或类似物或其嵌合混合物构成。单体通常由核苷酸间磷酸二酯键连接相连。核酸通常的大小范围为从几个单体单元例如5-40个(此时它们通常称为寡核苷酸)到几千个单体单元。在任何时候提到核酸或核酸序列时，应理解核苷酸从左到右为5’至3’次序，且“A”指脱氧腺苷，“C”指脱氧胞苷，“G”指脱氧鸟苷，而“T”指胸苷，除非另有指示。
非天然核苷酸
如本文中使用的，“非天然核苷酸”或“核酸类似物”或“人工核苷酸”理解为意指DNA或RNA的结构类似物，其设计为与互补的核酸序列(1)杂交。经由对核苷酸间连接、糖和/或核碱基的修饰，核酸类似物可以获得以下任一种或所有的期望特性：1)优化的杂交特异性或亲和力，2)核酸酶抗性，3)化学稳定性，4)溶解性，5)膜通透性，和6)合成或纯化的容易或低成本。核酸类似物的例子包括但不限于肽核酸(PNA)、锁核酸"LNA"、2'-O-甲基核酸、2'-氟核酸、硫代磷酸酯和金属膦酸盐(metal phosphonate)。
立足点区
在本发明背景中，“立足点区”指能形成Watson-Crick碱基配对的两个互补的寡核苷酸区，或者立足点区可以指位于寡核苷酸中的单链序列。如此，应理解当关于单链寡核苷酸而使用术语“立足点区”时，其指单链立足点区，而当关于双链(当两个单链立足点区彼此杂交时)而使用术语“立足点区”时，其指双链区。在本发明背景中，双链立足点区的每个互补序列可以标示为X和X’。
立足点区可以具有不同的位置。在一个实施方案中，第三寡核苷酸(5)中的第一(单链)立足点区(8’)和(单链)第二立足点区(9’)位于分支迁移区(7’)的相反侧。将单链立足点区8’和9’定位于分支迁移区的相反侧可以使测定加速。
为了使不同立足点区之间的交叉杂交最小化，两个立足点区[8,8’]和[9,9’]可以具有不同序列。如此，在一个实施方案中，第一寡核苷酸(1)中的第一立足点区(7)和第二寡核苷酸(1)中的第二立足点区(8)是不相似(dissimilar)的。在本发明背景中，措辞不相似还可以理解为具有不同序列，因而不是100％相同。
两个单链立足点区还可以在长度上彼此不同。这样，可以更容易地识别杂交的迁移。如此，在另一个实施方案中，第一立足点区(8)的长度范围为1-10个核苷酸，如1-8个核苷酸，如1-6个核苷酸，如1-4,个核苷酸，如2-10个核苷酸，如3-10个核苷酸，如4-10个核苷酸，如5-10个核苷酸，如7-10个核苷酸，如3个核苷酸，如4个核苷酸，如5个核苷酸，或如6个核苷酸。
如本文中使用的，术语“杂交”或“退火”指单链核苷酸的联合以形成双链结构，从而双链结构的一条链中的核苷酸经历与相对链上的核苷酸的特异性Watson-Crick碱基配对。该术语还包括核苷类似物的配对，所述核苷类似物如脱氧肌苷、具有2-氨基嘌呤碱基的核苷等，其可以掺入到依照本发明的寡核苷酸中。
在又一个实施方案中，第一寡核苷酸(1)中的第一立足点区(8)和第三寡核苷酸(5)中的第一立足点区(8’)包含1-10个互补核苷酸，如2-10，如3-10，如4-10，如5-10，如2-8，如2-7，如2-6，如2-5，如2-4的区段。
在又一个实施方案中，第一寡核苷酸(1)中的第一立足点区(8)和第三寡核苷酸(5)中的第一立足点区(8’)至少为70％互补，如70-100％互补，如75-100％互补，如80-100％互补，如85-100％互补，如90-100％互补，如95-100％互补，如97-100％互补，如99-100％互补，或如100％互补。
在另一个实施方案中，第二立足点区(9,9’)的长度范围为1-10个核苷酸，如1-8个核苷酸，如1-6个核苷酸，如1-4,个核苷酸，如2-10个核苷酸，如3-10个核苷酸，如4-10个核苷酸，如5-10个核苷酸，如7-10个核苷酸，如3个核苷酸，如4个核苷酸，如5个核苷酸，或如6个核苷酸。
在一个实施方案中，第二寡核苷酸(3)中的第二立足点区(9)和第三寡核苷酸(5)中的第二立足点区(9’)包含1-10互补个核苷酸，如2-10，如3-10，如4-10，如5-10，如2-8，如2-7，如2-6，如2-5，如2-4的区段。
分支迁移区
在本发明背景中，“分支迁移”指其中第一和第三寡核苷酸之间的杂交平衡经由两个立足点区和分支迁移区中的杂交朝第二和第三寡核苷酸之间杂交迁移，且反之亦然的情况。图2例示了分支迁移和在分析物结合时平衡情况如何变化。
由于互补区，分支迁移区促进第一和第三寡核苷酸以及第二和第三寡核苷酸之间的分支迁移。如此，在一个实施方案中，分支迁移区(7,7’)的长度范围为3-30个核苷酸，如4-30，如5-30，如7-30，如9-30，如11-30，如15-30，如20-30，如25-30，如3-25，如3-20，如3-15，如3-11，如3-9，如3-7，如3-5，或如3-4个核苷酸。期望的长度可适合于不同温度和具体序列。在又一个实施方案中，第二寡核苷酸(3)中的分支迁移区(7)和第三寡核苷酸(5)中的分支迁移区(7’)包含3-30个互补核苷酸，如4-30，如5-30，如7-30，如9-30，如11-30，如15-30，如20-30，如25-30，如3-25，如3-20，如3-15，如3-11，如3-9，如3-7，如3-5，或如3-4个互补核苷酸的区段。
在又一个实施方案中，第二寡核苷酸(3)中的分支迁移区(7)和第三寡核苷酸(5)中的分支迁移区(7’)至少70％互补，如70-100％互补，如75-100％互补，如80-100％互补，如85-100％互补，如90-100％互补，如95-100％互补，如97-100％互补，如99-100％互补，或如100％互补。在又一个实施方案中，第一寡核苷酸(1)中的分支迁移区(7)和第二寡核苷酸(3)中的分支迁移区(7)包含3-30互补个核苷酸，如4-30，如5-30，如7-30，如9-30，如11-30，如15-30，如20-30，如25-30，如3-25，如3-20，如3-15，如3-11，如3-9，如3-7，如3-5，或如3-4互补个核苷酸的区段。
在另一个实施方案中，第一寡核苷酸(1)中的分支迁移区(7)和第二寡核苷酸(3)中的分支迁移区(7)至少70％相同，如70-100％相同，如75-100％相同，如80-100％相同，如85-100％相同，如90-100％相同，如95-100％相同，如97-100％相同，如99-100％相同，或如100％相同。如此，在第一和第二寡核苷酸中的两个分支迁移区7不需要完全相同。
在一个另外的实施方案中，第一寡核苷酸(1)中的分支迁移区(7)和第三寡核苷酸(5)中的分支迁移区(7’)包含3-30个互补核苷酸，如4-30，如5-30，如7-30，如9-30，如11-30，如15-30，如20-30，如25-30，如3-25，如3-20，如3-15，如3-11，如3-9，如3-7，如3-5，或如3-4个互补核苷酸的区段。在又一个实施方案中，第一寡核苷酸(1)和第三寡核苷酸(5)中的分支迁移区(7’)至少70％互补，如70-100％互补，如75-100％互补，如80-100％互补，如85-100％互补，如90-100％互补，如95-100％互补，如97-100％互补，如99-100％互补，或如100％互补。
术语“序列同一性”指示对具有相等长度的两个氨基酸序列之间或两个核酸序列之间的同源性程度的定量测量。如果要比较的两个序列长度不相等，则必须将其比对以产生最佳可能拟合，从而允许插入缺口，或者在多肽序列或核苷酸序列末端处截短。序列同一性可计算为其中Ndif是当比对时两个序列中不相同的残基的总数，且其中Nref是一个序列中的残基数。因此，DNA序列AGTCAGTC将与序列AATCAATC(Ndif＝2和Nref＝8)具有75％的序列同一性。缺口记为具体残基的非同一性，即DNA序列AGTGTC将与DNA序列AGTCAGTC具有75％的序列同一性(Ndif＝2和Nref＝8)。
在本发明的所有基于多肽或氨基酸的实施方案中，一个或多个序列之间序列同一性的百分数基于相应序列的比对，如通过clustalW软件(www.ebi.ac.uk/clustalW/index.html)使用程序的缺省设置实施的。对于本发明的基于核苷酸的实施方案，一个或多个序列之间序列同一性的百分数也基于使用缺省设置的clustalW软件的比对。例如，对于核苷酸序列比对，这些设置为：Alignment＝3Dfull、Gap Open 10.00、Gap Ext.0.20、Gap separation Dist.4、DNA权重矩阵：identity(IUB)。
应理解可以以类似的方式计算互补性程度，例如通过使用所述寡核苷酸之一的互补序列。
在一个实施方案中，分支迁移区7和分支迁移区7’之间的杂交包含分支迁移区中的一个或多个发夹，如1-5个发夹，如1-3个发夹，如1-2个发夹或如1个发夹。不受理论束缚地，假设在S中部具有两个相邻发夹时，AS的完整混合物将具有holiday汇合(junction)的构象，其在Mg2+存在下将扩展特定的3D结构，如此可能对于蛋白质结合的B链与A竞争以与S杂交产生更大的空间阻碍(图20)。在一个实施方案中，一个或多个发夹具有1-20个核苷酸，如3-20，如5-20个核苷酸，如10-20个核苷酸，如3-15个核苷酸，如3-10个核苷酸，或如5-15个核苷酸的长度。
结合模块
依照本发明的结合模块允许测定法检测不形成Watson-Crick碱基配对的分析物。类似地，它允许检测不结合DNA或RNA的分析物，如DNA结合蛋白。
所述一个或多个结合模块在原理上可以位于这3种寡核苷酸的任一种上。在一个实施方案中，至少个共价连接的结合模块(4)位于第一寡核苷酸(1)上。在另一个实施方案中，至少一个共价连接的结合模块(4)位于第二寡核苷酸(3)上。在第三实施方案中，至少一个共价连接的结合模块(4)位于第三寡核苷酸(5)上。在一个实施方案中，结合检测系统包含1-5，如1-4，如1-3，如1-2，如1，如2-5，或如3-5个结合模块。
所述一个或多个结合模块可以位于不同的位置处。在一个实施方案中，至少一个共价连接的结合模块(4)共价连接于第一寡核苷酸(1)、第二寡核苷酸(3)或第三寡核苷酸(5)中的分支迁移区(7)的部分。
根据要检测的特定分析物可以采用不同的结合模块类型。如此，在一个实施方案中，至少一个共价连接的结合模块(4)选自下组：有机分子、抗体、抗原、适体、生物素和半抗原。在另一个实施方案中，抗原是蛋白质抗原、肽抗原或糖抗原。在一些情况中，不需要共价缀合，因为一些分析物可以能直接结合一个或几个核苷酸。这些分析物包括DNA结合蛋白、一些离子(图19b)或嵌入剂、和小分子如三聚氰胺(图19a)。在一个实施方案中，结合模块还可以具有夹心结构，意味着共价连接的第一模块充当可以共价或非共价结合至第一模块的第二结合模块的把手(handle)。如此，第二结合模块可以具有双重功能：I)结合第一模块和II)作为分析物的结合位点。在例如形成一个或多个寡核苷酸的一部分且能结合分析物的适体的情况下，可以不需要分开的共价连接的结合模块。
小有机分子是优选的结合模块。在一个实施方案中，有机分子具有范围为150-1500Da(Dalton)，如150-1200Da，如150-1000Da，如150-800Da，如150-600Da，如150-400Da，如150-300Da，如300-1500Da，如400-1500Da，如600-1500Da，如800-1500Da，如1000-1500Da，或如1200-1500Da的分子量。小有机分子也是本发明的优选分析物。在一个更具体的实施方案中，所述至少一个共价连接的结合模块(4)选自下组：维生素D、叶酸、恩氟沙星(enrofloxacin)、洋地黄毒苷。依照本发明的小有机分子和/或共价连接的结合模块的别的例子是：
毒素：葡萄球菌肠毒素B(SEB)、葡萄球菌肠毒素A(SEA)、软骨藻酸(Domoic acid)(DA)、黄曲霉毒素(Aflatoxin)(AFB1、AFG1、AFB2、AFG2、AFM1)、脱氧雪腐镰孢烯醇(deoxynivalenol)、赭曲霉素(ochratoxin)A(OTA)。
药物：吗啡-3-葡糖苷酸(M3G)、口服抗凝血剂warfarin、胰岛素。
杀虫剂：atrazine、simazine、chlorpyrifos、carbaryl、二氯二苯三氯乙烷(dichlorodiphenyltrichloroethane)(DDT)、2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)。
其他环境分析物：2-羟基联苯(HBP)、苯并芘(benzo[a]pyrene)(BaP)、酚(双酚A、Atrazine、多氯化联苯、3,7,8-TCDD)、三聚氰胺和相关化合物。
兽用药物/抗生素：青霉素和头孢菌素、氯霉素和氯霉素葡糖甘酸、苯丙醇(fenicol)抗生素残基、四环素、泰乐菌素(tylosin)、红霉素、磺胺剂(sulfonamide)抗生素。
化学污染物：贝类(shellfish)中的4-壬基酚(4-nonylphenol)、牛中的胰岛素样生长因子1(IGF-1)。
维生素：维生素B2(核黄素)、维生素B5(泛酸)、维生素B8(生物素)、维生素B9(叶酸)、维生素B12(钴胺素)。
激素：孕酮、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、17β-雌二醇、R-胎蛋白(AFP)、睾酮、19-降睾酮(19-nortestosterone)、甲睾酮、勃地酮(boldenone)和甲基勃地酮(methylboldenone)。
爆炸物：2,4,6-三硝基甲苯(TNT)、2,4,6-三硝基酚(TNP)、1,3,5-三硝基苯(TNB)、三丙酮三过氧化物(triacetonetriperoxide)(TATP)、六亚甲基三过氧化二胺(HMTD)、季戊四醇四硝酸酯(pentaerythritol tetranitrate)(PETN)、环三亚甲基三硝胺(cyclotrimethylenetrinitramine)(RDX)。
应理解上文化合物的列表也可以是依照本发明要检测的分析物。
抗体和其他蛋白质分析物：
诊断性抗体：猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)抗体、猪瘟病毒(Classical swine fever virus)(CSFV)抗体。
针对病毒性病原体的抗体：针对庚型肝炎的抗体、针对人乙肝病毒(hHBV)的抗体、针对1型和2型单纯性疱疹病毒(HSV-1、HSV-2)的抗体、针对Epstein-Barr病毒的抗体(抗EBNA)、针对人呼吸道合胞病毒(RSV)的抗体、抗腺病毒抗体。
药物诱导的抗体：针对胰岛素orgranulocyte巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的抗体、针对其他重组或非重组蛋白质或抗体药物的抗体。
蛋白质：酪蛋白、免疫球蛋白G、叶酸结合蛋白、乳铁蛋白和乳过氧化物酶(lactoperoxidase)。
过敏原或过敏标志物：花生过敏原、面团中的伴清蛋白/原肌球蛋白(Tropomyosin)、芝麻种子蛋白、原肌球蛋白、免疫球蛋白E(IgE)抗体、组胺
癌症标志物：前列腺特异性抗原(PSA)、PSA-ACT复合物(α1-抗糜蛋白酶)、碳水化合物抗原(CA 19-9)、蛋白质血管内皮生长因子(VEGF)、白介素-8(IL-8)、癌胚抗原(CEA)、纤连蛋白。
其他标志物：肌钙蛋白(cTn I)、针对葡萄糖6-磷酸异构酶的抗体(GPI)、抗谷氨酸脱羧酶(GAD)抗体、c-反应性蛋白质(CRP)、cystatin C、乙肝表面抗原(HBsAg)。
结合模块可以使其结合配偶体结合于该结合模块(The binding moietymay have its binding partner bound to the binding moiety)。在本发明背景中，应理解术语“结合配偶体”指可以非共价结合于结合模块的分子。如此，在一个实施方案中，结合配偶体非共价结合于结合模块。“结合模块”-“结合配偶体”对的非限制性例子是抗体-抗原、链霉亲合素-生物素、叶酸受体-叶酸。如此，在一个实施方案中，结合模块使其结合配偶体结合于该结合模块。
部分根据所检测的分析物类型，本发明的检测系统可以采用3种策略。下文列出了这些策略，参照例如蛋白质或抗体(策略1)或小分子分析物(策略2和3)的检测例示。
策略1：直接测定
在一个实施方案(策略1)中，蛋白质或抗体是要检测的分析物(图5，策略1)。使用该策略，蛋白质或抗体(分析物)对结合模块的结合迁移杂交平衡，然后其随后可被检测到。该策略在图3-5和相应实施例1和2中更详细地描述。
策略2：抑制性测定
在另一个实施方案(策略2)中，首先将包含(或怀疑包含)小分子分析物(靶分子)的样品与结合模块的结合配偶体(例如蛋白质如抗体)混合，然后将混合物添加到检测系统的剩余部分(图5，策略2)。如果有样品中包含的靶物小分子(分析物)，那么它们将占据蛋白质(结合配偶体)的结合位点，如此导致蛋白质具有很小或没有结合能力来通过与寡核苷酸B上连接的相同共价连接小分子的相互作用去干扰杂交平衡。如此，样品中分析物的存在将导致检测系统的寡核苷酸之间的杂交平衡的变化。这称为抑制性测定法。图4e显示这类测定法用于生物素检测的结果。
策略3：竞争性测定
在又一个实施方案(策略3)中，首先将结合配偶体(蛋白质)添加到测定中且导致与策略1相同的平衡迁移，接着添加怀疑包含分析物(靶分子)的未知样品。如果存在游离的分析物分子，那么其可以替换结合于寡核苷酸B上的结合配偶体(蛋白质)的共价连接的结合模块来与该蛋白质结合，如此改变杂交平衡(图5，策略3)。如此，该策略是竞争性策略。在抑制性和竞争性策略两者中，与初始测定相比信号变化越大，则样品中存在的靶分子越少。
分析物
可由本发明检测不同种类的分析物。如先前提述的，分析物不是DNA或RNA。类似地，分析物可以不是DNA相互作用分析物如DNA或RNA结合蛋白。不形成Watson-Crick碱基配对但的确结合DNA的分析物的例子是DNA结合蛋白如组蛋白。在一个实施方案中，所述分析物是非DNA和非RNA结合分析物。
在一个实施方案中，所述分析物选自下组：蛋白质、肽、有机分子、抗体、抗原、糖、脂质和半抗原。在另一个实施方案中，分析物是蛋白质抗原、肽抗原或糖抗原。在又一个实施方案中，分析物是具有以下范围中的分子量的有机分子：150-1500Da，如150-1200Da，如150-1000Da，如150-800Da，如150-600Da，如150-400Da，如150-300Da，如300-1500Da，如400-1500Da，如600-1500Da，如800-1500Da，如1000-1500Da，或如1200-1500Da。在一个具体的实施方案中，分析物选自下组：维生素、毒素、过敏原、爆炸剂、药物，如可卡因、抗生素如enrofloxacin、杀虫剂、激素、化学污染物、生物标志物。另外，上文是更广泛的依照本发明的分析物的列表。
信号传导系统
依照本发明的检测系统包含信号传导系统，其在检测到分析物时提供信号或信号的变化。该信号传导系统基于以下原理，即当寡核苷酸杂交时生成或催化信号，其构成信号传导系统的不同部分。如例如实施例1中例示的，当信号传导系统的两个部分接近时寡核苷酸1(A)和5(S)的杂交生成增加的信号，而寡核苷酸3和5的杂交不导致信号生成。如此，在一个实施方案中，第二寡核苷酸(3)包含第一基团(2)，所述第一基团形成信号传导系统的第一部分，而第三寡核苷酸(5)包含第二基团(6)，所述第二基团形成信号传导系统的第二部分。
类似地，信号传导系统可在第一和第三寡核苷酸之间分开。如此，在一个实施方案中，第一寡核苷酸(1)包含第一基团(2)，所述第一基团形成信号传导系统的第一部分，而第三寡核苷酸(5)包含第二基团(6)，所述第二基团形成信号传导系统的第二部分。
信号传导系统还可以包含第三部分，其根据哪些寡核苷酸彼此杂交来提供不同信号，意味着每种寡核苷酸包含检测系统的一部分。如此，在一个实施方案中，
-第一寡核苷酸(1)包含第一基团(2)，所述第一基团形成信号传导系统的第一部分；
-第二寡核苷酸(3)包含第三基团(10)，所述第三基团(10)形成信号传导系统的第三部分；和
-第三寡核苷酸(5)包含第二基团(6)，所述第二基团形成信号传导系统的第二部分。
该设置例示于图4和相应的例子中。
可以采用不同的信号传导系统类型。如此，在一个实施方案中，由所述第一基团(2)和所述第二基团(6)形成的信号传导系统是猝灭剂-荧光团信号传导系统、荧光团-猝灭剂信号传导系统、FRET信号传导系统、DNA过氧化物酶催化信号传导系统、或猝灭剂和单线态氧(singlet oxygen)敏化剂。所述信号传导系统可以采用荧光纳米颗粒，尤其在FRET或猝灭剂系统的情况中。实施例部分提供了依照本发明可采用的设置的不同例子。在又一个实施方案中：
I.形成信号传导系统的第一部分的第一基团(2)是猝灭剂，而形成所述信号传导系统的第二部分的第二基团(6)是荧光团，或
II.形成信号传导系统第一部分的第一基团(2)是荧光团，而形成所述信号传导系统的第二部分的第二基团(6)是猝灭剂，或
III.形成信号传导系统的第一部分的第一基团(2)是FRET供体，而形成所述信号传导系统的第二部分的第二基团(6)是FRET接受体，或
IV.形成信号传导系统的第一部分的第一基团(2)是FRET接受体，而形成所述信号传导系统的第二部分的第二基团(6)是FRET供体，或
V.形成信号传导系统的第一部分的第一基团(2)是DNA过氧化物酶信号传导系统的第一半(first half)，而形成所述信号传导系统的第二部分的第二组(6)是DNA过氧化物酶信号传导系统的第二半。
当使用DNA过氧化物酶信号传导系统时，检测系统可以包含别的组分。如此，在又一个实施方案中，检测系统包含氯化血红素(hemin)和/或ABTS2-和/或H2O2和/或鲁米诺(luminol)。还可以将比色方法整合到依照本发明的测定法，如金纳米颗粒(AuNP)或量子点(QD)中。
信号传导系统的不同部分可以在寡核苷酸的不同位置处共价连接。如此，在一个实施方案中，信号传导系统的第一部分和/或信号传导系统的第二部分和/或信号传导系统的第三部分共价连接于其所偶联的寡核苷酸上的分支迁移区(7,7’)的部分。
在另一个实施方案中，信号传导系统的第一部分和/或信号传导系统的第二部分和/或信号传导系统的第三部分共价连接于其所偶联的寡核苷酸上的立足点区(7,8)的部分。
本领域技术人员知晓如何设计例如FRET对，从而当FRET对接近时生成或增加信号。类似地，技术人员知晓如何设计荧光团-猝灭剂对，从而当荧光团-猝灭剂对接近时信号消失或减弱。在实施例3和相应的附图中，显示可以如何设计DNA过氧化物酶测定法从而当包含DNA过氧化物酶信号传导系统的一部分的每个寡核苷酸接近时催化信号的生成。DNA过氧化物酶信号传导系统的一个优点是其构成放大反应，这可允许检测非常少量的分析物。另一个优点是更容易地合成寡核苷酸，因为需要更少的修饰。在上述所有例子中，由于包含信号传导系统的每一部分的两个寡核苷酸的杂交使得不同的对接近。如上文描述的，该测定法基于平衡反应，如此，当杂交平衡变化时信号可能加强或减弱，例如由于共价连接的结合模块的结合配偶体的结合或释放。
在一个特定的实施方案中，分析物可以是核酸分子如DNA或RNA，条件是信号传导系统是DNA过氧化物酶信号传导系统。
在另一个特定的实施方案中，分析物可以是三聚氰胺和结构相关的化合物，其可与寡核苷酸(1)、(3)和/或(5)任一种的1、2或3个胸腺嘧啶碱基相互作用。
共价连接的寡核苷酸
在一些情况中，检测系统由几种寡核苷酸构成可能是一个缺点，因为这可能增加达到杂交平衡前的时间。依照本发明的寡核苷酸还可以彼此共价连接，意味着检测系统仅由一种或两种单独的寡核苷酸构成，而不是由3种单独的寡核苷酸构成。该原理例示在实施例12和相应的图17和18中。如此，在一个实施方案中，第一寡核苷酸、第二寡核苷酸和第三寡核苷酸共价连接。
如此，在一个实施方案中，所述第一寡核苷酸(1)共价连接于第二寡核苷酸(3)。在另一个实施方案中，第三寡核苷酸(5)共价连接于第一寡核苷酸(1)。在又一个实施方案中，第二寡核苷酸(3)共价连接于第三寡核苷酸(5)。在又一个实施方案中，所述第一寡核苷酸(1)共价连接于第二寡核苷酸(3)而第二寡核苷酸(3)共价连接于第三寡核苷酸。在又一个实施方案中，第一寡核苷酸(1)的3’端共价连接于第二寡核苷酸(3)的5’端。在又一个实施方案中，第二寡核苷酸(3)的3’端共价连接于第三寡核苷酸(5)的5’端。
应理解当两种或更多种寡核苷酸彼此共价连接时，检测系统仍包含依照本发明的第一、第二和第三寡核苷酸。
在一个特定的实施方案中，分析物可以是核酸分子如DNA或RNA，条件是两种或更多种寡核苷酸如上文描述地共价连接。
在又一个实施方案中，寡核苷酸通过接头共价连接。在另一个实施方案中，接头选自下组：磷酸二酯键连接，核苷酸，如1-20，如1-10、1-5、3-10个核苷酸，寡核苷酸，肽，C-接头，如C1-C20接头，PEG接头，二硫化物接头和硫化物接头。本领域技术人员可以找到其他适宜的接头。
成套试剂盒
检测系统可以以成套试剂盒的形式提供。如此，本发明的一个方面涉及包含依照本发明的分析物检测系统的成套试剂盒。
在另一个方面，本发明涉及包含依照本发明的第一寡核苷酸1、第二寡核苷酸3和第三寡核苷酸5的成套试剂盒。
所述试剂盒可以包含别的组分。如此，在一个实施方案中，试剂盒还包含氯化血红素和/或ABTS2-和/或H2O2。当使用DNA过氧化物酶测定法时，这些组分可以是试剂盒的部分。如先前描述的，在试剂盒中包括结合模块的结合配偶体可以是有利的。如此，在又一个实施方案中，试剂盒包含结合模块的结合配偶体。在又一个实施方案中，结合配偶体非共价偶联于一个或多个结合模块。在又一个实施方案中，结合配偶体在与包含共价连接的结合模块的寡核苷酸不同的试剂盒区室中。
用于检测样品中分析物的存在或水平的方法
本发明还提供一种用于检测样品中分析物的存在的方法。如此，本发明的一个方面涉及一种用于检测样品中不同于DNA和RNA的分析物的存在或水平的方法，所述方法包括：
a)提供包含或怀疑包含感兴趣分析物的样品；
b)提供依照本发明的分析物检测系统；
c)将所述样品与所述分析物检测系统一起温育；
d)将分析物的检测水平与参照水平比较；和
e)测定所述样品中分析物的存在或水平。
应理解样品可已知包含样品或分析物是否存在于样品中可以是未知的。在第一种情况中，定量是目的，而对于第二种情况，仅检测存在可以是足够的。
在又一个实施方案中，不同于DNA和RNA的分析物不是核酸分子。
优选地，持续温育步骤直至达到杂交平衡。如此，在一个实施方案中，持续温育步骤c)直到达到平衡。然而，还可以实时监测测定法。杂交平衡在分析物结合结合模块时可能变化。如此，在一个实施方案中，第一寡核苷酸(1)和第三寡核苷酸(5)之间及第二寡核苷酸(3)和第三寡核苷酸(5)之间的杂交平衡在分析物结合结合模块时迁移。
在测定法中包括针对结合模块的结合配偶体的情况中，以不同方式改变杂交平衡。如此，在另一个实施方案中，第一寡核苷酸(1)和第三寡核苷酸(5)之间及第二寡核苷酸(3)和第三寡核苷酸(5)之间的杂交平衡在结合模块(4)的结合配偶体从该结合模块释放时迁移。
结合模块的结合配偶体可以在不同的时间点包括于测定法中。在又一个实施方案中，将结合模块的结合配偶体与样品一起温育，之后将样品与检测系统的寡核苷酸一起温育。在另一个实施方案中，在将样品与检测系统的寡核苷酸温育之后，将结合模块的结合配偶体与样品一起温育。在又一个实施方案中，将结合模块的结合配偶体与检测系统的寡核苷酸一起温育，之后与样品一起温育。根据结合亲和力，上述每种解决办法可能是最适宜的。更多细节亦见图13。
在又一个实施方案中，结合配偶体从结合模块的释放由分析物对结合配偶的结合所导致。
根据样品类型、分析物和采用的准确寡核苷酸，温育时间可以在各测定法之间不同。如此，在一个实施方案中，温育步骤c)发生1分钟–24小时，如1分钟–12小时，如1分钟–6小时，如1分钟–2小时，如1-60分钟，如1-30分钟，如1-15分钟如1-5分钟，如5-60分钟，如10-60分钟，如15-60分钟，如30-60分钟，如1-6小时，如2-6小时或如4-6小时的时段。
本测定法的一个优点是温度在测定期间可以不需要改变。如此，在又一个实施方案中，所述方法在等温条件下进行。这意味着仅使用加热室或加热板来实施测定。类似地，测定法可以实地在室温实施。然后，可使用需要的设备来随后分析测定法。在使用DNA过氧化物酶信号传导系统时，可通过肉眼检查来确定结果。在又一个实施方案中，所述方法在范围4-50℃，如10-50℃，如20-50℃，如25-50℃，如30-50℃，如35-50℃，如40-50℃，如4-40℃，如4-35℃，如4-30℃，如4-25℃，或如4-20℃的温度进行。在又一个实施方案中，测定法在等温条件下进行。
样品
样品可来自不同起源。在一个实施方案中，样品是获自环境的样品，如水样品。在另一个实施方案中，样品是生物学样品。在又一个实施方案中，样品是食物样品或塑料制品。可以对塑料制品测试可能有毒的软化剂的存在。
在又一个实施方案中，生物学样品获自哺乳动物，如人。在又一个实施方案中，生物学样品是血液样品，如血清或血浆、尿液样品、粪样品、活组织检查样品或唾液样品。为了提供测定法的最优条件，样品在依照本发明的测定法中采用之前可以经纯化或基本纯化。如此，在又一个实施方案中，样品是纯化的样品。纯化样品的一个优点是能更容易地控制反应条件。
可通过不同方法来解读测定法。如此，在一个实施方案中，分析物的存在或水平通过肉眼检查、光密度、光谱学、吸光度光谱学、荧光光谱学、电化学、QCM、SPR或显微术来确定。
为了能测定水平或存在，样品可能需要与参照水平比较。如此，在又一个实施方案中，参照水平是预确定的值、标准曲线或阴性对照。参照水平可基于不同标准设定，例如通过利用经常用于例如诊断测试的ROC曲线。
诊断测试的准确性可由接受者操作特征(Receiver OperatingCharacteristic)曲线(“ROC曲线”)来表征。ROC为对于诊断测试的不同可能截留点，真阳性率对假阳性率的图。ROC曲线显示灵敏性和特异性之间的关系。亦即，灵敏性的增加将伴随有特异性的降低。曲线沿着左轴及然后ROC空间的顶部边缘越紧密，测试就越准确。相反地，曲线离ROC图的45度对角线越近，则测试就越不准确。ROC下的面积是对测试准确性的量度。测试的准确性依赖于该测试多么好地将测试的组分成有和无所讨论疾病的。曲线下面积(称为“AUC”)为1代表完美测试，而0.5的面积代表不太可用的测试。如此，本发明的生物标志物和诊断方法具有超过0.50的AUC，更优选的测试具有超过0.60的AUC，仍更优选的测试具有超过0.70的AUC。
其他可用的对测试效用的量度是阳性预测值和阴性预测值。阳性预测值是测试为阳性实际为阳性的人的百分数。阴性预测值是测试为阴性实际为阴性的人的百分数。如此，技术人员将能基于特定需要的标准来确定参照水平。
应注意在本发明的方面之一的背景中描述的实施方案和特征也适用于本发明的其他方面。还应注意当在说明书和权利要求中使用参照数字通过参照附图来例示本发明时，这些仅用于例示性目的且不应理解为限制本发明。
本申请中引用的所有专利和非专利文献均通过提述完整并入本文。
本发明现将以更多细节在下面非限制性实施例中描述。
实施例
实施例1
蛋白质的检测：链霉亲合素(STV)
材料
该实验中使用3种DNA链，分别称为A、B和S。A和S具有内部胺修饰，其被用作Alexa荧光团标记的把手，而B具有内部生物素修饰。序列在下文给出(下划线指示立足点区)：
所有寡核苷酸购自丹麦的DNA Technology A/S。在合成后直接由该公司完成RP-HPLC纯化。
Alexa647琥珀酰亚胺酯(Succinimidyl Ester)和Alexa555琥珀酰亚胺酯购自Invitrogen。
包括链霉亲合素在内的所有其他试剂购自Sigma-Aldrich。
图3例示寡核苷酸如何可以彼此杂交。
方法
荧光团缀合
标记规程指由Invitrogen所给的方案，存在少量修改。更具体地，将胺修饰的DNA(16μl,100μM)与磷酸盐缓冲液(10μl,0.4M,pH 8.5)混合，然后加入溶解于DMSO的一种活化的染料-酯(100μg,约80nmol)。在该混合物中，DNA的终浓度为约40μM，且酯和胺的摩尔比为50:1。在28℃过夜温育后，通过乙醇沉淀，接着在Agilent 1200系列上进行反相HPLC纯化(0.1M TEAA中5-40％MeCN达15分钟)处理混合物。收集260nm处吸光度最大的相应峰中的样品，冻干，并重溶解于00μl H2O。在使用前通过NanoDrop 1000分光光度计测定最终浓度。
测定法的构建及其用于STV检测的功能
在典型的测定法中，将准确的化学计量比为1:1:1的链A、B和S以及作为靶蛋白的STV在1×[TAE-Mg2+]缓冲液(40mM Tris-HAc(pH 8),1mM EDTA,12.5mM Mg(Ac)2)中混合。每种DNA组分的典型终浓度为20nM，对于STV为250nM。使用过量的STV来确保单价结合，但对于实际感测不是必需的。为了方便，在测量前将混合物在室温(RT)过夜温育，尽管动力学数据已显示3小时就足以使系统达到近乎平衡(数据未显示)。
通过分光荧光计的FRET测量
将70μl的测定混合物移液到石英小杯中，将其在不同样品之间用1×[TAE-Mg2+]清洗两次。荧光测量使用扫描分光荧光计(Fluoro-Max-3,HORIBA Jobin Yvon Inc.)完成。对于Alexa555，激发在530nm进行。FRET效率计算为E＝IA/(IA+ID)，其中IA是接受体峰值荧光强度(对于Alexa647为667nm)而ID是供体峰值荧光强度(对于Alexa555为566nm)。
凝胶实验和Typhoon扫描
将用于大批FRET测量的15μl的每份样品与3μl的6×凝胶上样染料(GelLoading Dye)(NEB)混合，接着加载到6％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)凝胶(丙烯酰胺/双丙烯酰胺；19:1)的孔中并在冰箱中洗脱(70V,1.5h)。将1×TBE-Mg2+([Mg2+]＝12.5mM)用于制备凝胶本身和运行缓冲液两者。
在电泳后，使用Typhoon 9400(Amersham Biosciences)以荧光模式扫描凝胶，不染色。选择红色激光器(633nm)和670nm带通滤波器(在655nm和685nm之间发射光且具有以670nm为中心的发射峰)分别作为Alexa647染料的激发和发射的组合。对于8.3×7.3cm微型凝胶，当使用200μm像素大小时，典型的扫描时间为3min。之后，通过ImageQuant TL 7.0(GE Healthcare)分析凝胶。手动完成道创建和条带检测。
结果
没有STV，3种DNA链之间的杂交事件将达到平衡，其中BS双链体将比AS双链体更多，因为B具有4nt立足点以与S结合，而A仅具有3nt立足点。在有可经由生物素-STV相互作用与B结合的STV的情况下，初始平衡将被迁移，因为STV的大体积(bulkiness)将阻碍灵敏的分支迁移过程，而仅经由该过程B才能置换A以与S杂交，如此样品中应有更少的BS双链体和更多的AS双链体。
将形成FRET(共振能量转移)对的两个荧光团分别置于A和S上以发出代表溶液中AS双链体群体的FRET信号(亦见图3)。在添加STV后揭示了近乎成双倍的标准化的FRET效率(图4a)，而且还显示了其广泛趋异的典型原始荧光数据(图4b)。另外，制得且在图4c中显示了滴定曲线，其显示了定量检测的可能性和亚纳摩级的灵敏性。更多的证据来自非变性PAGE凝胶(图4d)，其中可以分别观察溶液中的每种组分。值得注意的是，选定的激发和发射波长确保了此处的条带强度仅反映A的量。结果完全符合预期，即留下少得多的单链A(ssA)且同时在存在STV时形成更多的AS双链体(图4d，1个生物素)。
在本实施例中，还将两个生物素置于一条B链上。这利用了STV具有四价结合能力的事实，从而生物素化的B将通过双位点相互作用卷曲和包裹在STV周围(图4d内置图)。以这种方式，立足点完全不能发挥功能，因此预期甚至更少的BS和更多的AS。确实，在添加STV后，改变比一个生物素的系统更突出(图4c，双生物素)。
评述
除了上述结果外，还进行下列观察(数据未显示)：
1.试图将荧光团-猝灭剂对作为代替FRET的备选报告物系统。这也提供了适宜的结果。
2.测试了两种阴性对照：将STV添加到无生物素的系统中，将其他蛋白质(凝血酶或其他抗体)添加到生物素化系统中。两种均未展现显著的FRET变化。
3.该传感测定法的灵敏性依赖于用于测量FRET值的仪器的灵敏性。在迄今实施的研究中，已通过使用终浓度1nM DNA的测定法成功检测到低至1nM的作为靶蛋白的STV。
结论
我们已成功使用生物素-STV相互作用作为模式系统来显示基于3种DNA链的平衡的测定法具有检测特定靶蛋白以及小分子的极大潜力。大量FRET数据和Typhoon扫描凝胶实验两者验证了我们的设计，且信号在添加STV后能成双倍(或按照设计减半)。
实施例2：
检测小分子：生物素
通过在实施例1的系统中应用抑制策略(图5；策略2)，可以检测到生物素。在该实验中，将作为靶物检测的生物素首先与预定量的STV混合，然后将全部混合物添加到标准测定法中。在存在游离生物素的情况下，STV上的所有活性结合位点将被占据，如此其对DNA平衡不能具有影响。这种信号-关闭(signal-off)检测方法通过使用14nM的DNA、20nM的STV和一系列生物素浓度来检测。滴定曲线显示于图4e。生物素和STV之间的摩尔比与STV的四价特性一致。
方法
使用与添加链霉亲合素之前实施例1中的测定法相同的测定法设置，其使用14nM DNA。将不同浓度的生物素首先与链霉亲合素(20nM)预混合。在RT温育3小时后，将混合物添加到正常测定法中并在RT在黑暗中过夜温育。
结果
在缺乏作为靶分子的生物素的情况下，STV显示与之前相同的对平衡的效果。如果样品含有生物素，那么这些游离生物素将阻断STV上的结合位点，从而使得STV不能对测定法起作用。这种信号-关闭检测方法提供针对生物素检测的平滑校正曲线，而且结果反映STV的四价(图4e)。
实施例3
生物素检测测定法的特异性
对照系统可由具有两个FRET对，但没有任何标记的结合模块的3种DNA链构成。将任一种靶物链霉亲合素、IgG、凝血酶或ATP添加到此系统中不会导致可检测的信号变化(图6a)，这不仅验证了设计，即迁移平衡的是结合事件，而且还充当该系统的较好特异性的证据。
该特异性还通过将多种靶物添加到实施例1中描述的生物素系统中来测试，且其中没有一种显示非特异性的可检测效果(图6b)。该测定法还通过将STV添加到没有配体的对照系统中来验证且未观察到FRET信号变化。
实施例4
缓冲液中的抗洋地黄毒苷(aD)检测
材料
在本实验中使用了3种DNA链，分别为A、B和S。A和S具有内部胺修饰，该修饰被用作Alexa荧光团标记的把手，而B具有内部洋地黄毒苷修饰。序列如下给出(下划线处指示立足点区)：
所有针对A、B和S的寡核苷酸均在来自Bioautomation的MerMade-12寡核苷酸合成仪上内部合成。在合成后，将DNA链经TOP-筒(cartridge)纯化并经过乙醇沉淀。
Alexa647琥珀酰亚胺酯和Alexa555琥珀酰亚胺酯购自Invitrogen。
5-氨基烯丙基-dU亚磷酰胺(phosphoramidite)购自Berry&Associates。
抗洋地黄毒苷购自Roche。
所有其他试剂购自Sigma-Aldrich。
图8A例示了寡核苷酸如何可以彼此杂交。
方法
荧光团缀合
与实施例1相同。
洋地黄毒苷缀合
将胺修饰的DNA(100μL,50μM)添加到在DMF中的活化的洋地黄毒苷酯(DIG-NHS)(100μL,150nmol)，然后向其添加三乙胺(2μL)。在该混合物中，DNA的终浓度为25μM，且酯和胺的摩尔比为30:1。在25℃温育1小时后，通过乙醇沉淀，接着为在Agilent 1200系列上的反相HPLC纯化(0.1MTEAA中的5-40％MeCN，在15分钟内)处理该混合物。收集具有260nm处最大吸收的相应峰的样品，冻干，并重溶解于200μL H2O。在使用前通过NanoDrop 1000分光光度计测定最终浓度。
测定法的构建及其用于aD检测的功能
与实施例1相同，以aD代替STV作为靶蛋白，以仅2倍过量的抗洋地黄毒苷(20nM的每种DNA组分和40nM的aD)。
通过分光荧光计的FRET测量
样品制备和FRET测量与实施例1相同
凝胶实验和Typhoon扫描
与实施例1相同。
结果
获得的结果显示于图7。观察到反映在存在aD的情况下AS的30％群体增加的FRET值。用多种浓度aD的滴定显示于图8D。通过电泳对aD的互补性检测方法显示于图8E。
实施例5
检测人血浆中的抗洋地黄毒苷(aD)。
材料
在本实验中使用了3种DNA链，即A、B和S。A和S具有内部胺修饰，该修饰被用作Alexa荧光团标记的把手，而B具有内部洋地黄毒苷(DIG)修饰。序列如下给出(下划线处指示立足点区)：
所有针对A,B和S的寡核苷酸均在来自Bioautomation的MerMade-12寡核苷酸合成仪上内部合成。在合成后，将DNA链进行TOP-筒纯化和乙醇沉淀。
Alexa647琥珀酰亚胺酯和Alexa555琥珀酰亚胺酯购自Invitrogen。
5-氨基烯丙基-dU亚磷酰胺购自Berry&Associates。
抗洋地黄毒苷购自Roche。
人全血由丹麦Skejby的Aarhus University Hospital处的血液库捐赠。
所有其他试剂购自Sigma-Aldrich。
方法
荧光团缀合
与实施例1相同。
洋地黄毒苷缀合
与实施例4相同。
人血浆制备
在自供体收集后由医院对人全血进行EDTA缓冲，并在血液收集30分钟内从全血样品分离血浆。这通过以3000g在20℃离心15分钟完成。小心移液出构成血浆的顶层，并立即冷冻为更少的等分试样。
测定法的构建及其用于aD检测的功能
与实施例5相同。然而，在过夜温育之前，对样品添加与感兴趣的抗体(aD)预混合的15％v/v纯血浆。
通过分光荧光计的FRET测量
样品制备和FRET测量与实施例4相同。然而，使用仅含有TAE-Mg缓冲液中人血浆(10μL血浆于60μL 1x[TAE-Mg2+]中)作为参照的样品从含有人血浆的光谱减去参照。
结果
从3个独立实验获得的结果显示于图9。如能观察到的，在将aD添加到缓冲液和血浆中之前的AS百分数相同(B中的样品1和2)。在添加2当量aD后，血浆(样品5)中的Fret增加相比于缓冲液中(样品3)仅逐渐降低。还包括通过策略3在缓冲液(样品4)和血浆(样品6)中检测洋地黄毒苷(DIG)的结果；这将在实施例8中有更详细的描述。
实施例6
检测人唾液中的抗洋地黄毒苷(aD)。
材料
在本实验中使用了3种DNA链，即A、B和S。A和S具有内部胺修饰，该修饰被用作Alexa荧光团标记的把手，而B具有内部洋地黄毒苷(DIG)修饰。序列如下给出(划线处指示立足点区)：
所有针对A,B和S的寡核苷酸均在来自Bioautomation的MerMade-12寡核苷酸合成仪上内部合成。在合成后，将DNA链进行TOP-筒纯化和乙醇沉淀。
Alexa647琥珀酰亚胺酯和Alexa555琥珀酰亚胺酯购自Invitrogen。
5-氨基烯丙基-dU亚磷酰胺购自Berry&Associates。
抗洋地黄毒苷购自Roche。
人唾液从禁食1小时的人供体收集。
所有其他试剂购自Sigma-Aldrich。
图10例示了寡核苷酸如何彼此杂交。
方法
荧光团缀合
与实施例1相同。
洋地黄毒苷缀合
与实施例4相同。
人唾液制备
在1小时内从已禁食1小时的男性收集唾液到Falcon管中。将唾液彻底涡旋1分钟，接着在4℃以10,000g离心10min。分开液体与固体，并使唾液过滤通过100k Amicon Ultra-0.5mL离心滤器。
测定法的构建及其用于aD检测的功能
与实施例5相同。然而，在过夜温育之前，对样品添加与感兴趣的抗体(aD)预混合的15％v/v的经过滤唾液。
通过分光荧光计的FRET测量
样品制备和FRET测量与实施例7相同。
然而，使用仅含有TAE-Mg缓冲液中经过滤唾液(10μL血浆于60μL 1x[TAE-Mg2+]中)的样品作为参照从含有人血浆的光谱减去参照。
结果
结果与实施例7的相当，其中FRET值反映了在存在人唾液中的aD的情况下AS的28％的群体增加，亦显示于图10。
实施例7
用DNA上的多处DIG修饰来检测aD
材料
在本实验中使用了3种DNA链，即A、B和S。A和S具有内部胺修饰，该修饰被用作Alexa荧光团标记的把手，而B具有内部洋地黄毒苷修饰(但不限于4处内部洋地黄毒苷修饰)。序列如下给出(下划线处指示立足点区)：
所有针对A、B和S的寡核苷酸均在来自Bioautomation的MerMade-12寡核苷酸合成仪上内部合成。在合成后，将DNA链进行TOP-筒纯化和乙醇沉淀。
Alexa647琥珀酰亚胺酯和Alexa555琥珀酰亚胺酯购自Invitrogen。
5-氨基烯丙基-dU亚磷酰胺购自Berry&Associates。
抗洋地黄毒苷购自Roche。
所有其他试剂购自Sigma-Aldrich。
图11例示了寡核苷酸如何彼此杂交。
方法
荧光团缀合
与实施例1相同。
洋地黄毒苷缀合
与实施例4相同。
测定法的构建及其用于aD检测的功能
与实施例1相同，其使用aD代替STV作为靶蛋白，且具有8倍过量的抗洋地黄毒苷(20nM的每种DNA组分，和160nM的aD)。
通过分光荧光计的FRET测量
样品制备和FRET测量与实施例1相同。
凝胶实验和Typhoon扫描
与实施例1相同。
结果
结果与实施例4的相当，其中FRET值反映了在存在aD的情况下AS的33％的群体增加。
实施例8
通过策略2和3检测洋地黄毒苷(DIG)。
图12例示了寡核苷酸如何彼此杂交。
材料
如同实施例4、5和6，添加来自Sigma-Aldrich的洋地黄毒苷。
方法
荧光团缀合
与实施例1相同。
洋地黄毒苷缀合
与实施例4相同。
测定法的构建及其用于aD检测的功能
与实施例4、5和6相同，以不同浓度向样品中另外添加游离DIG以用于竞争测定法。
通过分光荧光计的FRET测量
样品制备和FRET测量与实施例7、9和10相同，在有和无人血浆和唾液的添加的情况下进行分别的信号调整。
结果
结果与实施例4,5和6的相当，其中FRET值反映了在存在320nM DIG的情况下AS的仅0.5％的群体增加，和在存在40nM DIG的情况下11％AS群体增加，相比之下在不存在DIG时正常为30％增加。在含有40nM DIG的人血浆和唾液的情况中，AS群体增加分别为5％和2％，相比之下没有DIG为26％和28％增加。结果也显示于图12。
实施例9
检测维生素D-结合蛋白(DBP)和维生素D(VD)。
材料
在本实验中使用了3种DNA链，即A、B和S。A和S具有内部胺修饰，该修饰被用作Alexa荧光团标记的把手，而B具有内部维生素D修饰。序列如下给出(下划线处指示立足点区)：
所有针对A、B和S的寡核苷酸均在来自Bioautomation的MerMade-12寡核苷酸合成仪上内部合成。在合成后，将DNA链进行TOP-筒纯化和乙醇沉淀。
Alexa647琥珀酰亚胺酯和Alexa555琥珀酰亚胺酯购自Invitrogen。
5-氨基烯丙基-dU亚磷酰胺购自Berry&Associates。
活化的维生素D酯在室内以两步骤方式从胆钙化甾醇(cholecalciferol)合成。
所有其他试剂购自Sigma-Aldrich。
图14例示了寡核苷酸能如何彼此杂交。
方法
荧光团缀合
与实施例1相同。
维生素D缀合
与实施例4中的DIG-NHS相同，其中将活化的维生素D酯替换DIG-NHS。
测定法的构建及其用于DBP检测的功能
与实施例4相同，使用DBP代替aD作为靶蛋白。
通过分光荧光计的FRET测量
样品制备和FRET测量与实施例1相同。
凝胶实验和Typhoon扫描
与实施例1相同。
结果
结果与实施例1的相当，但FRET值反映了在存在DBP的情况下AS的20％的群体增加，亦显示于图14。
此外，将抑制性和竞争性策略两者均用于检测维生素D。在加入DBP蛋白之前(抑制策略2)或之后(竞争策略3)，将多种浓度的维生素D加入测定混合物中。两种方法均成功用于维生素D的检测，因为其从图14中的校正曲线出现。
实施例10
作为适体系统例子的ATP检测。
材料
在本实验中使用了3种DNA链，分别为A、B和S。A和S具有内部胺修饰，该修饰被用作荧光团标记的把手。B不具有任何另外的修饰，但在3’端包含ATP适体的序列。序列如下给出(斜体指示立足点区，下划线处指示适体区)：
所有寡核苷酸均购自DNA Technology A/S,Denmark。在合成后由该公司直接进行RP-HPLC纯化。
Alexa647琥珀酰亚胺酯和Alexa555琥珀酰亚胺酯购自Invitrogen。
所有其他试剂购自Sigma-Aldrich。
方法
荧光团缀合
与实施例1相同。
测定法的构建及其用于a检测的功能
与实施例1相同，使用一定浓度范围的ATP分子而非STV。
通过分光荧光计的FRET测量
与实施例1相同。
结果
该实施例的设计由所谓的结构-转换适体启发，这种适体通常经历DNA双链体和适体-靶物复合物之间的靶物诱导的转换。这里，适体的部分(8nt)充当B上的立足点，其能与S上的立足点杂交，产生溶液中占主导的双链体，因为A具有更短的立足点(4nt)。当存在靶物(ATP)时，适体-靶物结合足够强至赢得双链体中的氢键，从而不留下B上的功能性立足点。因此，AS双链体将占多数。方案显示于图15a。
在微摩尔级别上绘出滴定曲线(图15b)。在存在1mM ATP的情况下可观察到AS双链体FRET的多至60％增加。这里使用的每种DNA成分的浓度为20nM。
结论
在本实施例中，我们将立足点交换反应系统与结构-转换适体设计组合以经由适体-靶物结合来实现靶物检测。在无放大的情况下，FRET信号变化已显著到足以被观察到，且甚至可以定量。注意到适体系统是功能性的，其中在适体区置于5’端或3’端。
实施例11
使用DNA过氧化物酶信号传导系统的链霉亲合素(STV)检测
材料
在本实验中使用了3种DNA链，分别为A、B和S，其中仅B具有修饰。序列如下给出(斜体指示立足点区；下划线处指示用于DNA过氧化物酶的富含G的区域)：
所有寡核苷酸均购自DNA Technology A/S,Denmark。在合成后由该公司直接进行RP-HPLC纯化。
所有试剂均购自Sigma-Aldrich。
方法
测定法的构建及其用于STV检测的功能
在一个典型的测定法中，将确切化学计量比为1:1:1的链A、B和S以及作为靶蛋白的STV混合于1×[TAE-Mg2+]缓冲液(40mM Tris-HAc(pH 7),1mMEDTA,12.5mM Mg(Ac)2)。将混合物在室温(RT)温育3小时，接着向其添加氯化血红素(氯化高铁血红素IX)、ABTS(2,2'-连氮-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸))和H2O2(过氧化氢)。典型的终浓度对于生物素化DNA为200nM，对于STV为400nM，对于氯化血红素为2μM，而对于ABTS和H2O2为2mM。
通过Nanodrop的吸光度测量
在室温温育半小时后，将1.5μl的每种测定混合物移液到Nanodrop 1000分光光度计(Thermo Fisher Scientific Inc.)的台座上，并以UV-Vis模式测量。记录420nm处的吸光度。
结果
在本实施例中，我们给出了将分裂DNAzyme掺入A和S两者的末端的例子，当它们由于A与S之间的杂交而带到一起时，这能回复其催化能力。双生物素系统的方案显示于图16。
在没有STV时，S倾向于与B结合，因为B具有更长的立足点。由于G-四重体(quadruplex)的分开的部分，可以找到较低的过氧化物酶活性。在有STV时，链B松弛其立足点(其被包埋在蛋白质表面中)，如此AS双链体的形成导致完全功能性的G-四重体。在添加必要的反应物如H2O2,ABTS2-和氯高铁血红素后将出现绿色，且可以记录420nm处的最大吸光度。
可在图16中观察到显著的吸光度变化，且差异甚至用裸眼可区别。注意到单生物素系统中的变化也是突出的，尽管由于更强的背景而难以通过直接显现进行区分。
结论
我们采用了新的报告物系统来为我们的测定法提供光学信号。该系统的优势在于，其仅需要纯DNA延伸而非共价标记，且其催化和比色特征使得结果甚至可通过肉眼直接检测到。该方法还可用于如实施例3中描述的单链系统中。
实施例12
单链系统与DNA G-四重体过氧化物酶组合用于链霉亲合素(STV)检测。
材料
在本实验中仅使用了1种DNA链，即L。内部胺基团在特定位置处经修饰，其被用作进一步标记的把手。其序列如下给出(斜体指示立足点区；下划线指示用于DNA过氧化物酶的富含G的区域)：
该寡核苷酸均购自DNA Technology A/S,Denmark。在合成后由该公司直接进行RP-HPLC纯化。
所有其他试剂，包括链霉亲合素，购自Sigma-Aldrich。
图17例示了依赖于分析物的存在，寡核苷酸可以如何自杂交。
位置(核苷酸)1-5(2)是G4-DNA(DNA过氧化物酶)的1/4。位置6-7(8)是第一立足点。位置8-17(7或A)是第一分支迁移区。位置18-27(7或B)是第二分支迁移区，其具有与第一分支迁移区相同的序列但具有较少的分子修饰。位置28-31(9)是第二立足点。位置32-37(11)是提供柔性的环区。位置38-41(9’)是第三立足点区，其与第二立足点区互补。位置42-51(7’或S)是第三分支迁移区，其与第一或第二分支迁移区互补。位置52-53(8’)是第四立足点，其与第一立足点互补。位置54-66(6)是DNA过氧化物酶的其余3/4。
方法
生物素缀合
该规程与实施例1中的荧光团缀合规程相同，其使用生物素-NHS酯而非染料-NHS酯。
测定法的构建及其用于STV检测的功能
在一个典型的测定法中，将链L以及作为靶蛋白的STV添加到1×[TAE-Mg2+]缓冲液(40mM Tris-HAc(pH 7),1mM EDTA,12.5mM Mg(Ac)2)中。将混合物在室温(RT)温育3小时，接着添加氯化血红素(氯化高铁血红素IX)、ABTS(2,2'-连氮-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸))和H2O2(过氧化氢)。典型的终浓度对于生物素化DNA为200nM，对于STV为400nM，对于氯化血红素为2μM，而对于ABTS和H2O2为2mM。
通过Nanodrop的吸光度测量
在室温温育1小时后，将1.5μl的每种测定混合物移液到Nanodrop 1000分光光度计(Thermo Fisher Scientific Inc.)的台座上，并以UV-Vis模式测量。记录420nm处的吸光度。
结果
该设计的想法是简单将所有3种寡核苷酸掺入一条长DNA链中，其不仅避免了化学计量问题，而且还具有加速链置换动力学的潜力(由于分子内反应)。为了避免在1条DNA链上进行3个修饰的难题，选择另一种称为拆分DNA过氧化物酶的报道物系统来替换先前设计中使用的FRET系统。DNA过氧化物酶的确切序列及其拆分方式记载于Shimron,S.；Wang,F.；Orbach,R.；Willner,I.Amplified detection of DNA through the enzyme-free autonomousassembly of hemin/G-quadruplex DNAzyme nanowires.Anal Chem 2012,84,1042-1048。令人满意地，该信号传导系统对于依照本发明的基于杂交平衡的检测系统也有功能，甚至在寡核苷酸共价连接的情况下。
该实施例中的长DNA链由几个区域构成(图18)。序列中从5’至3’为：1/4的G-四重体，区a加区b(其代表最初的链A)，区b加区d(其代表最初的链B，如此其上具有生物素)，环e作为柔性铰链，区d*加区b*加区a*(其源自链S)，最后是G-四重体的3/4。
当没有STV时，d*b*将具有与bd杂交的优先权，因为立足点d长于立足点a。在该状态下，两个G-四重体部分不能联合，除非强迫第一区b进入突起(bulge)，而这不是能量上有利的。当STV结合第二区b上的生物素时，蛋白质块将阻碍局部杂交或分支迁移，促使区域b*选择第一区b作为其偏好的配偶体。因此，G-四重体的两个组分拥有恰好正确的位置以形成完全的G-四联体(tetrad)，已发现其具有在氯化血红素协助下催化H2O2介导的ABTS2-至ABTS·-氧化的能力。该反应的动力学可视觉检测或通过分光光度计检测，因为产物ABTS·-具有绿色。构象变化过程例示于图18a。
在有或无STV的情况下添加作为过氧化物酶底物的ABTS后1h的样品吸光度在图18b中给出。在添加STV后可观察到超过50％的增加。这证明了以下概念，即STV结合导致G-四联体的重配置和更多形成。还实施了对照实验，其通过将STV与具有相同序列但其上无生物素的DNA链混合，在此情况中未发现信号变化。
结论
在本实施例中，通过仅使用一条用配体标记的DNA链来实现靶蛋白检测进一步简化了检测系统。而且，使用新的催化方法作为报告物以及放大办法。在本实施例中STV的结合扰动了链置换交换反应的分子内平衡，其反映在过氧化反应产物的吸光度中。我们将该系统视作ELISA(酶联免疫吸附测定)的潜在备选，其亦靶向蛋白质或小分子(尤其是抗体和抗原)并使用颜色变化作为指示物。
实施例13
立足点长度和结合模块位置的影响。
为了优化测定法的性能，已实施了一系列的测试(数据未显示)。
认为A和B的熔解温度的接近性对于平衡的灵敏性是重要的。由于A和B共享相同的分支迁移区，因此立足点区就靶物结合事件在该系统中的影响幅度而言变成了决定性因素。我们已经微调了A上的立足点长度用于在STV的存在和缺失之间进行更好的区分。结果显示，当A具有2nt或3nt立足点时，STV的影响即相对的FRET变化最大。对于A来说4nt立足点并非最佳的原因可能是该系统中B上的两个修饰改变了平衡。我们在标准设置中对于A使用3nt立足点(实施例1)，因为A在那里也具有修饰。
除了热力学，我们还发现立足点长度还对该系统的动力学具有影响。更长的立足点能显著增加反应速率，使其快得多地达到平衡。这与以下事实一致，即更长的立足点将导致更快的立足点杂交，这是整个过程内的限速步骤。
在本实施例中还研究了生物素位置的影响。将生物素标记于B上3个典型位置之一处：立足点区(TH)、分支迁移区(BM)和3’末端(T3)。发现立足点上的生物素对于STV结合就FRET信号变化而言最灵敏，其次是BM上的生物素。在B 3’端处的生物素仅显示可忽略的STV影响。这是合理的，因为已知在存在镁时DNA分支迁移对异源性是非常响应的，因此较小的局部环境变化可能施加实质性障碍。然而，简单杂交不具有该属性。
Claims (19)
1.一种用于检测不同于DNA和RNA的分析物的分析物检测系统，该系统包含至少第一寡核苷酸A、第二寡核苷酸B和第三寡核苷酸S，其中：
寡核苷酸A和B各自包含与寡核苷酸S上的序列互补或部分互补的序列，且其中寡核苷酸A和B在动态平衡中竞争与寡核苷酸S的杂交，且任选地其中寡核苷酸A和B的至少一种包含能与不同于DNA和RNA的分析物相互作用的共价连接的结合模块；且
寡核苷酸A和B的至少一种或结合于所述寡核苷酸的共价连接的结合模块能与不同于DNA和RNA的分析物相互作用，从而所述分析物与所述寡核苷酸或结合模块的相互作用导致杂交平衡的迁移，所述平衡的迁移提供可检测信号。
2.权利要求1的分析物检测系统，其中所述寡核苷酸在不同的核苷酸链上。
3.权利要求1的分析物检测系统，其中至少两种所述寡核苷酸是通过共价键部分或完全连接的。
4.权利要求1的分析物检测系统，其中所述寡核苷酸S包含超过一个杂交域，任选地其中两个或更多个杂交域位于不同的核苷酸链上。
5.权利要求1的分析物检测系统，其包含第一寡核苷酸(1)、第二寡核苷酸(3)和第三寡核苷酸(5)；其中：
●所述第一或第二寡核苷酸包含形成信号传导系统的第一部分的第一基团(2)；
●所述第三核苷酸包含形成所述信号传导系统的第二部分的第二基团(6)；
●至少一种共价连接的结合模块(4)位于所述第一或第二寡核苷酸上；
其中所述第一或第二寡核苷酸与所述第三寡核苷酸之间的杂交生成信号或能催化信号生成，所述信号不同于当所述第一或第二寡核苷酸与所述第三寡核苷酸不杂交时；
且其中所述分析物的存在改变所述检测系统的杂交平衡，导致信号的变化。
6.权利要求5的分析物检测系统，其中：
●所述第一寡核苷酸(1)包含
○位于分支迁移区(7)的5’侧的第一立足点区(8)；
●所述第二寡核苷酸(3)包含
○位于分支迁移区(7)的3’侧的第二立足点区(9)；和
●所述第三寡核苷酸(5)包含
○第一立足点区(8’)；
○第二立足点区(9’)；和
○分支迁移区(7’)；
其中：
●所述第一寡核苷酸(1)中的第一立足点区(8)和所述第三寡核苷酸(5)中的第一立足点区(8’)包含互补序列；
●所述第一寡核苷酸(1)中的分支迁移区(7)和所述第三寡核苷酸(5)中的分支迁移区(7’)包含一段互补核苷酸；
●所述第二寡核苷酸(3)中的第二立足点区(9)和所述第三寡核苷酸(5)中的第二立足点区(9’)包含一段互补核苷酸；和
●所述第二寡核苷酸(3)中的分支迁移区(7)和所述第三寡核苷酸(5)中的分支迁移区(7’)包含一段互补核苷酸。
7.权利要求1的分析物检测系统，其包含：
-第一寡核苷酸(1)，其包含：
●位于分支迁移区(7)的5’侧的第一立足点区(8)；
●任选地至少一种共价连接的结合模块(4)；
●任选地第一基团(2)，所述第一基团形成信号传导系统的第一部分；
-第二寡核苷酸(3)，其包含：
●位于分支迁移区(7)的3’侧的第二立足点区(9)；
●任选地至少一种共价连接的结合模块(4)；
●任选地第一基团(2)，所述第一基团形成信号传导系统的第一部分；
-第三寡核苷酸(5)，其包含：
●第一立足点区(8’)；
●第二立足点区(9’)；
●分支迁移区(7’)；
●任选地至少一种共价连接的结合模块(4)；
●第二基团(6)，所述第二基团形成所述信号传导系统的第二部分；
条件是形成信号传导系统的第一部分的所述第一基团(2)包含在所述第一寡核苷酸(1)和/或所述第二寡核苷酸(3)中；
条件是至少一种共价连接的结合模块(4)位于所述第一寡核苷酸(1)和/或所述第二寡核苷酸(3)和/或所述第三寡核苷酸(5)上；
其中所述第一寡核苷酸(1)中的第一立足点区(8)和所述第三寡核苷酸(5)中的第一立足点区(8’)包含互补序列；
其中所述第一寡核苷酸(1)中的分支迁移区(7)和所述第三寡核苷酸(5)中的分支迁移区(7’)包含一段互补核苷酸；
其中所述第二寡核苷酸(3)中的第二立足点区(9)和所述第三寡核苷酸(5)中的第二立足点区(9’)包含一段互补核苷酸；
其中所述第二寡核苷酸(3)中的分支迁移区(7)和所述第三寡核苷酸(5)中的分支迁移区(7’)包含一段互补核苷酸；
其中所述第一寡核苷酸(1)与所述第三寡核苷酸(5)之间的杂交生成信号或能催化信号生成，所述信号不同于当所述第一寡核苷酸(1)与所述第三寡核苷酸(5)不杂交时，条件是形成信号传导系统的第一部分的所述第一基团(2)包含在所述第一寡核苷酸(1)上；或
其中所述第二寡核苷酸(3)与所述第三寡核苷酸(5)之间的杂交生成信号或能催化信号生成，所述信号不同于当所述第二寡核苷酸(3)与所述第三寡核苷酸(5)不杂交时生成或催化的信号，条件是形成信号传导系统的第一部分的所述第一基团(2)包含在所述第二寡核苷酸(3)上。
8.前述权利要求中任一项的分析物检测系统，其中由所述第一基团(2)和所述第二基团(6)形成的信号传导系统是猝灭剂-荧光团信号传导系统、荧光团-猝灭剂信号传导系统、FRET信号传导系统、DNA过氧化物酶催化信号传导系统、或猝灭剂和单线态氧敏化剂；且任选地其中所述信号传导系统采用荧光纳米颗粒。
9.前述权利要求中任一项的分析物检测系统，其还包含氯化血红素和/或ABTS2-和/或H2O2和/或鲁米诺。
10.前述权利要求中任一项的分析物检测系统，其中所述至少一种共价连接的结合模块(4)选自下组：有机分子、抗体、抗原、适体、生物素和半抗原。
11.前述权利要求中任一项的分析物检测系统，其中所述共价连接的结合模块(4)是具有以下范围中的分子量的有机分子：150-1500Da，如150-1200Da，如150-1000Da，如150-800Da，如150-600Da，如150-400Da，如150-300Da，如300-1500Da，如400-1500Da，如600-1500Da，如800-1500Da，如1000-1500Da，或如1200-1500Da。
12.前述权利要求中任一项的分析物检测系统，其中所述结合模块使其结合配偶体与该结合模块结合。
13.前述权利要求中任一项的分析物检测系统，其中所述分析物选自下组：蛋白质、肽、有机分子、抗体、抗原和半抗原。
14.前述权利要求中任一项的分析物检测系统，其中所述分析物是具有以下范围中的分子量的有机分子：150-1500Da，如150-1200Da，如150-1000Da，如150-800Da，如150-600Da，如150-400Da，如150-300Da，如300-1500Da，如400-1500Da，如600-1500Da，如800-1500Da，如1000-1500Da，或如1200-1500Da。
15.前述权利要求中任一项的分析物检测系统，其中所述第一寡核苷酸(1)共价连接于所述第二寡核苷酸(3)且所述第二寡核苷酸(3)共价连接于所述第三寡核苷酸。
16.一种成套试剂盒，其包含依照前述权利要求中任一项的分析物检测系统。
17.一种用于检测样品中不同于DNA和RNA的分析物的存在或水平的方法，所述方法包括：
a)提供包含或怀疑包含感兴趣分析物的样品；
b)提供依照权利要求1-15中任一项的分析物检测系统；
c)将所述样品与所述分析物检测系统一起温育；
d)将分析物的检测水平与参照水平比较；和
e)测定所述样品中分析物的存在或水平。
18.权利要求17的方法，其中当分析物结合所述结合模块时，和/或当所述结合模块的结合配偶体释放时，所述第一寡核苷酸与所述第三寡核苷酸和所述第二寡核苷酸与所述第三寡核苷酸之间的杂交平衡迁移。
19.权利要求17或18的方法，其中所述样品是生物学样品，例如血液样品如血清或血浆、尿液样品、粪样品、活组织检查样品或唾液样品。
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