CN107036982A - 一种基于循环酶法的无标记比色传感检测腺苷的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于循环酶法的无标记比色传感检测腺苷的方法，发卡DNA1(HP1)内含腺苷适配体序列，发卡DNA2(HP2)内含富鸟嘌呤(G)序列，加入目标物腺苷，与HP1特异性结合，发卡结构打开，HP1与HP2杂交，随后加入核酸外切酶III(ExoIII)，发生特异性的酶切，使得HP2中富G序列释放，并释放出HP1重新与体系中过量HP2结合引发循环酶切过程。循环结束后，释放出的富G序列形成G四联体，继而催化其无色底物TMB形成有颜色的底物oxTMB。这种颜色变化程度与体系中存在腺苷的浓度相关，实现比色传感检测腺苷。

Description

一种基于循环酶法的无标记比色传感检测腺苷的方法
技术领域
本发明属于分析检测技术领域，具体涉及基于适配体引发的Exo III循环酶切信号放大的无标记比色传感检测腺苷的方法。
背景技术
腺苷是一种内源性核苷，能参与血管神经舒张活动，具有抗心律失常的功效，在中枢神经和周围神经系统信号表达中具有重要作用。有大量的研究表明，实体瘤细胞因其快速生长导致缺氧和坏死，导致腺嘌呤核苷酸降解释放大量腺苷，释放的腺苷又为肿瘤的快速生长提供了环境，从而导致更高浓度的腺苷在实体瘤中蓄积，证实了腺苷作为肿瘤的潜在生物标志物的重要意义。此外，在生理状态下直接监测腺苷波动在心、脑生理功能的研究中扮演着不可忽视的角色。目前已建立的腺苷检测方法大多数存在仪器设备昂贵、操作费时且需要复杂的样本前处理等缺陷，因此建立腺苷检测新方法有着重要的现实意义。
核酸适配体是通过指数富集配体系统进化技术(SELIX)从人工构建的随机序列的核苷酸文库里通过体外筛选分离出来的核苷酸序列，具有针对目标物特异性强、亲和力高、靶分子范围广、可体外人工合成等诸多优点，这些优点使其在分析研究领域具有得天独厚的优势。
G-四联体(G-quadruplex)是一种特殊的DNA结构。在富含鸟嘌呤(G)的DNA片段中，四个鸟嘌呤通过Hoogsteen氢键形成平面正方形结构，多个这样的平面结构通过金属离子螯合在一起形成G-四联体。G四联体与血红素形成DNA酶，能够有效催化双氧水和TMB比色反应，基于此原理，G四联体被广泛应用于比色传感。
发明内容
本发明的目的在于提供一种适配体作为识别探针，G四联体作为报告分子，由ExoIII辅助循环信号放大的腺苷检测新方法，能够快速、高灵敏高选择性的检测腺苷，克服了现有检测方法灵敏度低，检测耗时，成本过高以及步骤繁琐的缺点。
本发明的目的可以通过以下措施达到：
一种基于循环酶法的无标记比色传感检测腺苷的方法，包括如下步骤：
a)合成发卡DNA：HP1(茎长12～20碱基对)和HP2(与HP1杂交部分长4～14碱基对)；
b)HP1-腺苷复合物的形成：将不同浓度的腺苷与HP1在37℃孵育1h；
c)循环酶切过程：加入HP2混合均匀后，加入Exo III，45℃孵育1h；
d)比色传感检测：加热降解过量Exo III后，加入含血红素，TMB，H2O2的Tris-HCl缓冲液，室温反应30min后加硫酸终止反应，测定溶液吸光度，建立标准曲线；
表1本发明中使用的DNA序列
注：HP1茎长18碱基对，HP1与HP2杂交部分长8碱基对。
e)样品检测：将未知浓度腺苷的样品，按上述方法检测测得吸光度值，代入标准曲线得到样品中的腺苷浓度。
在步骤a)中，HP1发卡结构茎部分碱基对数目在12～20碱基对(表1中斜体部分)。
在步骤a)中，HP2发卡结构与HP1配对的序列长度在4～14碱基(表1中下划线部分)。
在步骤b)中，HP1的浓度范围在1～4μM，体积范围在5～10μL。
在步骤c)中，HP2的浓度范围在5～10μM，体积范围在5～10μL。
步骤b)中，腺苷的浓度范围在0～10μM。
本发明与现有技术相比，具有如下显著优点：
1.本发明通过循环酶切法放大检测的信号，提高检测的灵敏度。
2.本发明中使用的DNA序列均无修饰，应用成本低。
3.本发明采用基于分光光度法原理的检测方法，仪器设备简单，操作简单、快速，有利于发明的推广应用。
附图说明
图1基于循环酶法的无标记比色传感检测腺苷的原理图
图2是本发明实施例1所构建的检测体系，不同浓度腺苷对吸的光度的标准曲线
图3是本发明实施例1所构建的检测体系对于腺苷的选择性
具体实施方式
以下通过具体实施例说明本发明，但本发明并不仅仅限定于这些实施例。
实施例1
a)合成发卡DNA：HP1(茎长18碱基对)和HP2(配对序列长为8碱基)；
表2实施例1中使用的DNA序列
b)HP1-腺苷复合物的形成：将0～10μM腺苷与10μLHP1(4μM)在37℃孵育1h；
c)循环酶切过程：加入10μLHP2(10μM)混合均匀后，加入10μLExo III(2U/μL)，45℃孵育1h；
d)比色传感检测：70℃降解过量Exo III后，加入含2μM血红素，2mMTMB，5mMH2O2的Tris-HCl缓冲液190μL，25℃反应30min后加10μL硫酸(3M)终止反应，测定溶液吸光度，建立标准曲线；
e)样品检测：将未知浓度腺苷的样品经过滤处理后，按上述方法检测测得吸光度值，代入标准曲线得到样品中的腺苷浓度。
实施例2
a)合成发卡DNA：HP1-P14(茎长14碱基对)和HP2-P14(配对序列长为8碱基)；
表3实施例2中使用的DNA序列
b)HP1-腺苷复合物的形成：将0～10μM腺苷与10μL HP1(2μM)在37℃孵育1h；
c)循环酶切过程：加入10μL HP2(5μM)混合均匀后，加入10μL Exo III(2U/μL)，45℃孵育1h；
d)比色传感检测：70℃降解过量Exo III后，加入含2μM血红素，2mM TMB，5mM H2O2的Tris-HCl缓冲液190μL，25℃反应30min后加10μL硫酸(3M)终止反应，测定溶液吸光度,建立标准曲线；
f)样品检测：将未知浓度腺苷的样品经过滤处理后，按上述方法检测测得吸光度值，代入标准曲线得到样品中的腺苷浓度。
实施例3
a)合成发卡DNA：HP1-P12(茎长12碱基对)和HP2-P12(配对序列长为8碱基)；
表4实施例3中使用的DNA序列
b)HP1-腺苷复合物的形成：将0～10μM腺苷与10μL HP1(2μM)在37℃孵育1h；
c)循环酶切过程：加入5μL HP2(8μM)混合均匀后，加入10μL Exo III(2U/μL)，45℃孵育1h；
d)比色传感检测：70℃降解过量Exo III后，加入含2μM血红素，2mM TMB，5mM H2O2的Tris-HCl缓冲液190μL，25℃反应30min后加10μL硫酸(3M)终止反应，测定溶液吸光度,建立标准曲线；
e)样品检测：将未知浓度腺苷的样品经过滤处理后，按上述方法检测测得吸光度值，代入标准曲线得到样品中的腺苷浓度。
实施例4
a)合成发卡DNA：HP1(茎长18碱基对)和HP2-C10(配对序列长为10碱基)；
表5实施例4中使用的DNA序列
b)HP1-腺苷复合物的形成：将0～10μM腺苷与10μL HP1(1μM)在37℃孵育1h；
c)循环酶切过程：加入5μL HP2(6μM)混合均匀后，加入10μL Exo III(2U/μL)，45℃孵育1h；
d)比色传感检测：70℃降解过量Exo III后，加入含2μM血红素，2mM TMB，5mM H2O2的Tris-HCl缓冲液190μL，25℃反应30min后加10μL硫酸(3M)终止反应，测定溶液吸光度,建立标准曲线；
e)样品检测：将未知浓度腺苷的样品经过滤处理后，按上述方法检测测得吸光度值，代入标准曲线得到样品中的腺苷浓度。
应用实施例
以人血清为实际样品进行测定，经过滤后，按实施例1方法测定吸光度值，代入实施例1建立的标准曲线得到样品中的腺苷浓度，每份样品重复测定3次取平均值，计算SD；以测得量为基准，在血清中分别加入测得量50％、100％、150％的腺苷标准品，按实施例1测定吸光度值，代入标准曲线得到样品中的腺苷浓度，每份样品重复测定3次取平均值，计算SD及回收率，如表6。
表6人血清中腺苷含量测定及加样回收率

Claims (8)

1.一种基于循环酶法的无标记比色传感检测腺苷的方法，其特征在于包括如下步骤：
a)合成发卡DNA：HP1和HP2；
b)HP1-腺苷复合物的形成：将腺苷与HP1在37℃孵育1 h；
c)循环酶切过程：加入HP2混合均匀后，加入Exo III，45℃孵育1 h；
d)比色传感检测：加热降解过量Exo III后，加入含血红素，TMB，H2O2的Tris-HCl缓冲液，室温反应30 min后加硫酸终止反应，测定溶液吸光度，建立标准曲线；
e)样品检测：将未知浓度的腺苷样品，按上述方法检测测得吸光度值，代入标准曲线得到样品中的腺苷浓度。
2.根据权利要求1所述的基于循环酶法的无标记比色传感检测腺苷的方法，其特征在于步骤a)中，发卡结构茎部分碱基对数目在12～20碱基对。
3.根据权利要求1所述的基于循环酶法的无标记比色传感检测腺苷的方法，其特征在于步骤a)中，HP2发卡结构与HP1配对的序列长度在4～14碱基。
4.根据权利要求1所述的基于循环酶法的无标记比色传感检测腺苷的方法，其特征在于步骤b)中，HP1的浓度范围在1～4μM。
5.根据权利要求1所述的基于循环酶法的无标记比色传感检测腺苷的方法，其特征在于步骤b)中，HP1的体积范围在5～10μL。
6.根据权利要求1所述的基于循环酶法的无标记比色传感检测腺苷的方法，其特征在于步骤c)中，HP2的浓度范围在5～10μM。
7.根据权利要求1所述的基于循环酶法的无标记比色传感检测腺苷的方法，其特征在于步骤c)中，HP2的体积范围在5～10μL。
8.根据权利要求1所述的基于循环酶法的无标记比色传感检测腺苷的方法，其特征在于步骤b)中，腺苷的浓度范围在0～10μM。
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