CN107870242A - 一种基于核酸适体的荧光检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于核酸适体的荧光检测试剂盒,包括核酸外切酶Ⅲ,反应缓冲液,DNA1、DNA2和茎环结构核酸H1。使用核酸适体为分子识别元件进行特异性识别,形成具有平末端的3'双链核酸结构,加入核酸外切酶Ⅲ后进行循环信号扩增,从而使大量的双链DNA变成单链DNA,加入荧光染料后,通过区分荧光强度变化检测待测分子含量。该发明对马拉硫磷检测的线性范围为10pM到100nM,检测限为5pM,同时检测体系具有很好的特异性,常见其他类似物不会干扰检测结果。检测过程无需分离纯化过程,简单混合即可检测,具有操作简单,成本低廉,响应迅速等优点,可用于食品、水源、土壤等样品中农药残留的快速高灵敏检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测试剂盒,特别涉及一种基于核酸适体的荧光检测试剂盒。
背景技术
核酸适体(aptamer)是经体外筛选技术SELEX(指数富集配体系统进化)筛选出的能特异结合蛋白质或其他小分子物质的寡聚核苷酸片段。核酸适体作为一种新型的分子识别工具,与传统的抗体相比不仅具有亲和力高,特异性好,还具有易合成、易修饰、稳定性好等优点,在蛋白质、分子检测领域具有良好的应用潜力。近年来,结合核酸适体的分子特性,将蛋白质的检测转换为特异识别的核酸适体的检测,不仅避免了传统蛋白质检测方法中操作复杂、常需对蛋白质进行标记、不易保持活性等缺点,还有效地提高了蛋白质检测的效率与灵敏度。
现有基于核酸适体的检测方法,一般比较复杂,难以通过变更核酸适体序列的方式实现对不同物质的检测,导致其设计较为困难,限制了其使用范围。开发出一种具有良好通用性的检测试剂盒具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供克服现有技术的不足,提供一种基于核酸适体的荧光检测试剂盒。
本发明所采取的技术方案是:
一种基于核酸适体的荧光检测试剂盒,包括可区分单链和双链DNA荧光染料,核酸外切酶Ⅲ,反应缓冲液,DNA1、DNA2和茎环结构核酸H1,其中:
DNA1为待测分子的核酸适体;
DNA2与DNA1部分互补,互补配对后DNA2的3’末端具有凸起;
H1包含a、b、c、b*以及d五个部分,a部分为5'端凸起,d部分为3'端凸起,b及b*互补形成H1茎环结构的茎,c为H1茎环结构的环;d可与DNA2的5'端部分互补配对形成双链DNA,并在H1的3’端形成3'平末端或3'凹陷末端。
作为上述荧光检测试剂盒的进一步改进,H1的a与DNA2的3’端部分互补配对形成双链DNA,并在DNA2的3’端形成凸起。
作为上述荧光检测试剂盒的进一步改进,DNA1和DNA2互补配对后,DNA1的3’端具有凸起。
作为上述荧光检测试剂盒的进一步改进,互补配对后DNA2的3’末端至少6个碱基是凸起的。
作为上述荧光检测试剂盒的进一步改进,a部分的碱基数为8到12个。
作为上述荧光检测试剂盒的进一步改进,c部分的碱基数为12到21个。
作为上述荧光检测试剂盒的进一步改进,d部分的碱基数为10到15个。
作为上述荧光检测试剂盒的进一步改进,b以及b*部分的碱基数为7到12个。
作为上述荧光检测试剂盒的进一步改进,DNA1和DNA2互补的碱基数为16~27个。
作为上述荧光检测试剂盒的进一步改进,反应缓冲液包含15mM Tris-HCl,50mMNaCl,10mM MgCl2,pH 7.0。
一种马拉硫磷残留检测试剂盒,包括:
(1)核酸DNA1、DNA2、茎环结构核酸H1,其序列如下:
马拉硫磷适体DNA1:5'-ATCCGTCACACCTGCTCTTATACACAATTGTTTTTCTCTTAACTTCTTGACTGCTGGTGTTGGCTCCCGTAT-3'(SEQ ID NO:1);
DNA2:5'-AAGTTAAGAGAAAAACAATTGACACAC-3'(SEQ ID NO:2);
H1:5'-CAATTGTTT-GCTTACGGT-ATACCTACGTCGATCGCA-ACCGTAAGC-TTCTCTTAACTT-3'(SEQ ID NO:3);
(2)核酸外切酶Ⅲ
(3)马拉硫磷标准溶液
(4)反应缓冲液,含15mM Tris-HCl,50mM NaCl,10mM MgCl2,pH 7.0。
本发明的有益效果是:
1)无需使用抗体,以核酸适体为分子识别元件,易于保存,稳定性好,便于制备试剂盒,可在室温下长期保存;
2)灵敏度高,加入核酸外切酶III进行信号扩增,可提高检测灵敏度,有利于检测痕量分子,特别是农药残留;
3)无需标记,以双链DNA荧光染料为荧光信号指示剂,大大简化了操作,降低了成本,反应过程无需洗涤分离过程,简单混合即可检测,适合大多数企业和单位快速检测不同样品中的待测物质含量。
附图说明
图1是本发明检测试剂盒的检测原理图;
图2是是不同浓度马拉硫磷检测结果图;
图3是特异性实验结果。
具体实施方式
一种基于核酸适体的荧光检测试剂盒,包括核酸外切酶Ⅲ,反应缓冲液,DNA1、DNA2和茎环结构核酸H1,其中:
DNA1为待测分子的核酸适体;
DNA2与DNA1部分互补,互补配对后DNA2的3’末端具有凸起;
H1包含a、b、c、b*以及d五个部分,a部分为5'端凸起,d部分为3'端凸起,b及b*互补形成H1茎环结构的茎,c为H1茎环结构的环;d可与DNA2的5'端部分互补配对形成双链DNA,并在H1的3’端形成3'平末端或3'凹陷末端。
作为上述荧光检测试剂盒的进一步改进,H1的a与DNA2的3’端部分互补配对形成双链DNA,并在DNA2的3’端形成凸起。
作为上述荧光检测试剂盒的进一步改进,DNA1和DNA2互补配对后,DNA1的3’端具有凸起。
作为上述荧光检测试剂盒的进一步改进,互补配对后DNA2的3’末端至少6个碱基是凸起的。
作为上述荧光检测试剂盒的进一步改进,a部分的碱基数为8到12个,优选的为9个。
作为上述荧光检测试剂盒的进一步改进,c部分的碱基数为12到21个,优选的为18个。
作为上述荧光检测试剂盒的进一步改进,d部分的碱基数为10到15个,优选的为12个。
作为上述荧光检测试剂盒的进一步改进,b以及b*部分的碱基数为7到12个,优选的为9个。这样既可以保证H1茎环结构中茎的稳定,也可以保证荧光染料可以很好地插入在DNA双链中。
作为上述荧光检测试剂盒的进一步改进,DNA1和DNA2互补的碱基数为16~27个,优选的为18个。这样可以避免在没有核酸适体底物存在的情况下,DNA1和DNA2可以形成较为稳定的双链复合物。
检测试剂盒对反应缓冲液没有特殊要求,一般而言,只要能保持反应pH的稳定,具有核酸外切酶Ⅲ反应时所需要的离子,且不与待测物质发生反应即可。作为上述荧光检测试剂盒的进一步改进,反应缓冲液包含15mM Tris-HCl,50mM NaCl,10mM MgCl2,pH 7.0。
以马拉硫磷残留的检测为例,本发明检测试剂盒的检测原理如图1所示。
1)DNA1是马拉硫磷的核酸适体,DNA2与DNA1部分互补,DNA2的3'端凸起。当检测体系存在马拉硫磷时,马拉硫磷与DNA1结合,从而把DNA2置换下来;
2)茎环结构的H1包含五个部分,分别是a、b、c、b*以及d,a部分位于5'端凸起,d部分位于3'端凸起。步骤(1)置换下来的DNA2可与H1的a部分和d部分互补,使H1的3'端变成平末端,同时DNA2的3'末端是凸起的;
3)加入核酸外切酶Ⅲ,核酸外切酶Ⅲ只能切割双链DNA中的3'平末端或3'凹陷末端,不能切割3'凸起,也不能切割单链DNA。因此,加入核酸外切酶Ⅲ后,可从H1的3'平末端开始切割H1,释放单个碱基,切割后H1的a-b-c部分被释放,同时DNA2也被释放
4)释放的DNA2可不断循环与H1结合,进行信号扩增
5)加入SyBr Green I进行染色检测,由于SyBr Green I跟单链结合后荧光强度很弱,只有跟双链DNA结合,才能发出强荧光。没有马拉硫磷时,体系核酸存在很多双链DNA结构(图1左下角图示),体系具有较强的荧光;当体系纯在马拉硫磷,双链结构被核酸外切酶Ⅲ切割变成单链结构,此时荧光强度达到下降,马拉硫磷的浓度与SyBr Green I的荧光强度成反比,从而达到检测马拉硫磷的目的。
SyBr Green I可以使用其他可区分单链和双链DNA的荧光染料替代,可区分单链和双链DNA的荧光染料包括但不限于EB、Gene Finder等。
实施例1:
一种马拉硫磷残留检测试剂盒,包括:
(1)核酸DNA1、DNA2、茎环结构核酸H1,其序列如下:
马拉硫磷适体DNA1:5'-ATCCGTCACACCTGCTCTTATACACAATTGTTTTTCTCTTAACTTCTTGACTGCTGGTGTTGGCTCCCGTAT-3';
DNA2:5'-AAGTTAAGAGAAAAACAATTGACACAC-3';
H1:5'-CAATTGTTT(a)-GCTTACGGT(b)-ATACCTACGTCGATCGCA(c)-ACCGTAAGC(b*)-TTCTCTTAACTT(d)-3';
(2)核酸外切酶Ⅲ
(3)马拉硫磷标准溶液
(4)反应缓冲液,含15mM Tris-HCl,50mM NaCl,10mM MgCl2,pH 7.0。
检测方法如下:
1)先用反应缓冲液(15mM Tris-HCl,50mM NaCl,10mM MgCl2,pH 7.0)分别溶解DNA1、DNA2、H1;
2)300nM的DNA1和DNA2充分混匀,室温反应30分钟,形成DNA1-DNA2混合物;
3)加入不同浓度的马拉硫磷于步骤(2)中,充分混匀,室温反应40分钟;
4)500nM的H1加入到步骤(3)中,充分混匀,室温反应30分钟;
5)在步骤(4)中加入20U的核酸外切酶Ⅲ,充分混匀,室温反应90分钟;
6)加入可区分单链和双链DNA的荧光染料1x SyBr Green I,充分混匀,室温反应15分钟后于荧光分光光度计上检测,激发峰为495nm,发射峰为525nm。随着马拉硫磷浓度的增加,荧光强度逐渐下降,二者具有很好的相关性,从而可实现定量检测马拉硫磷。
不同浓度马拉硫磷的检测实验:
配制马拉硫磷标准溶液,浓度分别为10pM、100pM、1nM、10nM、100nM、200nM、400nM
马拉硫磷溶液分别加到实施例1中所述的反应体系中,充分反应后检测荧光强度。如图2所示,随着马拉硫磷浓度的增加,对应的荧光强度逐渐下降,当马拉硫磷浓度超过100nM时,体系逐渐达到饱和,荧光下降至平稳。以马拉硫磷浓度的对数(lgC)为横坐标,荧光强度为纵坐标,绘制标准曲线,二者具有很好的线性关系,线性范围是从10pM到100nM,线性方程是:F=40-8lgC(R2=0.994)(F为荧光强度,C为马拉硫磷浓度),按照3倍信噪比标准(3S/N),检测限为5pM。
特异性实验:
选取其他农药残留为对照物,考察检测体系的特异选择性,包括啶虫脒、DDT、氯丹、乐果、敌百虫、西维因、毒杀酚。
将100nM的啶虫脒、DDT、氯丹、乐果、敌百虫、西维因、毒杀酚标准溶液和100nM的马拉硫磷标准溶液分别加到实施例1中所述的反应体系中,充分反应后检测荧光强度,如图3所示,100nM的啶虫脒、DDT、氯丹、乐果、敌百虫、西维因、毒杀酚的荧光强度与空白样品相比,变化不大,对检测不产生影响。只有当加入马拉硫磷时才会使荧光强度显著下降,这证明该方法对马拉硫磷的检测具有很好的特异性,其他农药残留类似物对检测不产生影响。
序列表
<110> 广东省生态环境技术研究所
<120> 一种基于核酸适体的荧光检测试剂盒
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atccgtcaca cctgctctta tacacaattg tttttctctt aacttcttga ctgctggtgt 60
tggctcccgt at 72
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aagttaagag aaaaacaatt gacacac 27
<210> 3
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caattgtttg cttacggtat acctacgtcg atcgcaaccg taagcttctc ttaactt 57
Claims (10)
1.一种基于核酸适体的荧光检测试剂盒,包括核酸外切酶Ⅲ,反应缓冲液,DNA1、DNA2和茎环结构核酸H1,其中:
DNA1为待测分子的核酸适体;
DNA2与DNA1部分互补,互补配对后DNA2的3’末端具有凸起;
H1包含a、b、c、b*以及d五个部分,a部分为5'端凸起,d部分为3'端凸起,b及b*互补形成H1茎环结构的茎,c为H1茎环结构的环;d可与DNA2的5'端部分互补配对形成双链DNA,并在H1的3’端形成3'平末端或3'凹陷末端。
2.根据权利要求1所述的荧光检测试剂盒,其特征在于:H1的a与DNA2的3’端部分互补配对形成双链DNA,并在DNA2的3’端形成凸起。
3.根据权利要求1所述的荧光检测试剂盒,其特征在于:DNA1和DNA2互补配对后,DNA1的3’端具有凸起。
4.根据权利要求1所述的荧光检测试剂盒,其特征在于:互补配对后DNA2的3’末端至少6个碱基是凸起的。
5.根据权利要求1所述的荧光检测试剂盒,其特征在于:a部分的碱基数为8到12个。
6.根据权利要求1所述的荧光检测试剂盒,其特征在于:c部分的碱基数为12到21个。
7.根据权利要求1所述的荧光检测试剂盒,其特征在于:d部分的碱基数为10到15个。
8.根据权利要求1所述的荧光检测试剂盒,其特征在于:b以及b*部分的碱基数为7到12个。
9.根据权利要求1所述的荧光检测试剂盒,其特征在于:DNA1和DNA2互补的碱基数为16~27个。
10.一种马拉硫磷残留检测试剂盒,包括:
(1)核酸DNA1、DNA2、茎环结构核酸H1,其序列如下:
马拉硫磷适体DNA1:5'-ATCCGTCACACCTGCTCTTATACACAATTGTTTTTCTCTTAACTTCTTGACTGCTGGTGTTGGCTCCCGTAT-3';
DNA2:5'-AAGTTAAGAGAAAAACAATTGACACAC-3';
H1:5'-CAATTGTTT-GCTTACGGT-ATACCTACGTCGATCGCA-ACCGTAAGC-TTCTCTTAACTT-3';
(2)核酸外切酶Ⅲ
(3)马拉硫磷标准溶液
(4)反应缓冲液,含15mM Tris-HCl,50mM NaCl,10mM MgCl2,pH 7.0。
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