CN107870242B - 一种基于核酸适体的荧光检测试剂盒 - Google Patents

一种基于核酸适体的荧光检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于核酸适体的荧光检测试剂盒，包括核酸外切酶Ⅲ，反应缓冲液，DNA1、DNA2和茎环结构核酸H1。使用核酸适体为分子识别元件进行特异性识别，形成具有平末端的3'双链核酸结构，加入核酸外切酶Ⅲ后进行循环信号扩增，从而使大量的双链DNA变成单链DNA，加入荧光染料后，通过区分荧光强度变化检测待测分子含量。该发明对马拉硫磷检测的线性范围为10pM到100nM，检测限为5pM，同时检测体系具有很好的特异性，常见其他类似物不会干扰检测结果。检测过程无需分离纯化过程，简单混合即可检测，具有操作简单，成本低廉，响应迅速等优点，可用于食品、水源、土壤等样品中农药残留的快速高灵敏检测。

Description

一种基于核酸适体的荧光检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种检测试剂盒，特别涉及一种基于核酸适体的荧光检测试剂盒。
背景技术
核酸适体(aptamer)是经体外筛选技术SELEX(指数富集配体系统进化)筛选出的能特异结合蛋白质或其他小分子物质的寡聚核苷酸片段。核酸适体作为一种新型的分子识别工具，与传统的抗体相比不仅具有亲和力高，特异性好，还具有易合成、易修饰、稳定性好等优点，在蛋白质、分子检测领域具有良好的应用潜力。近年来，结合核酸适体的分子特性，将蛋白质的检测转换为特异识别的核酸适体的检测，不仅避免了传统蛋白质检测方法中操作复杂、常需对蛋白质进行标记、不易保持活性等缺点，还有效地提高了蛋白质检测的效率与灵敏度。
现有基于核酸适体的检测方法，一般比较复杂，难以通过变更核酸适体序列的方式实现对不同物质的检测，导致其设计较为困难，限制了其使用范围。开发出一种具有良好通用性的检测试剂盒具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供克服现有技术的不足，提供一种基于核酸适体的荧光检测试剂盒。
本发明所采取的技术方案是：
一种基于核酸适体的荧光检测试剂盒，包括可区分单链和双链DNA荧光染料，核酸外切酶Ⅲ，反应缓冲液，DNA1、DNA2和茎环结构核酸H1，其中：
DNA1为待测分子的核酸适体；
DNA2与DNA1部分互补，互补配对后DNA2的3’末端具有凸起；
H1包含a、b、c、b*以及d五个部分，a部分为5'端凸起，d部分为3'端凸起，b及b*互补形成H1茎环结构的茎，c为H1茎环结构的环；d可与DNA2的5'端部分互补配对形成双链DNA，并在H1的3’端形成3'平末端或3'凹陷末端。
作为上述荧光检测试剂盒的进一步改进，H1的a与DNA2的3’端部分互补配对形成双链DNA，并在DNA2的3’端形成凸起。
作为上述荧光检测试剂盒的进一步改进，DNA1和DNA2互补配对后，DNA1的3’端具有凸起。
作为上述荧光检测试剂盒的进一步改进，互补配对后DNA2的3’末端至少6个碱基是凸起的。
作为上述荧光检测试剂盒的进一步改进，a部分的碱基数为8到12个。
作为上述荧光检测试剂盒的进一步改进，c部分的碱基数为12到21个。
作为上述荧光检测试剂盒的进一步改进，d部分的碱基数为10到15个。
作为上述荧光检测试剂盒的进一步改进，b以及b*部分的碱基数为7到12个。
作为上述荧光检测试剂盒的进一步改进，DNA1和DNA2互补的碱基数为16～27个。
作为上述荧光检测试剂盒的进一步改进，反应缓冲液包含15mM Tris-HCl，50mMNaCl，10mM MgCl2,pH 7.0。
一种马拉硫磷残留检测试剂盒，包括：
(1)核酸DNA1、DNA2、茎环结构核酸H1，其序列如下：
马拉硫磷适体DNA1：5'-ATCCGTCACACCTGCTCTTATACACAATTGTTTTTCTCTTAACTTCTTGACTGCTGGTGTTGGCTCCCGTAT-3'(SEQ ID NO：1)；
DNA2：5'-AAGTTAAGAGAAAAACAATTGACACAC-3'(SEQ ID NO：2)；
H1：5'-CAATTGTTT-GCTTACGGT-ATACCTACGTCGATCGCA-ACCGTAAGC-TTCTCTTAACTT-3'(SEQ ID NO：3)；
(2)核酸外切酶Ⅲ
(3)马拉硫磷标准溶液
(4)反应缓冲液，含15mM Tris-HCl，50mM NaCl，10mM MgCl2,pH 7.0。
本发明的有益效果是：
1)无需使用抗体，以核酸适体为分子识别元件，易于保存，稳定性好，便于制备试剂盒，可在室温下长期保存；
2)灵敏度高，加入核酸外切酶III进行信号扩增，可提高检测灵敏度，有利于检测痕量分子，特别是农药残留；
3)无需标记，以双链DNA荧光染料为荧光信号指示剂，大大简化了操作，降低了成本，反应过程无需洗涤分离过程，简单混合即可检测，适合大多数企业和单位快速检测不同样品中的待测物质含量。
附图说明
图1是本发明检测试剂盒的检测原理图；
图2是是不同浓度马拉硫磷检测结果图；
图3是特异性实验结果。
具体实施方式
一种基于核酸适体的荧光检测试剂盒，包括核酸外切酶Ⅲ，反应缓冲液，DNA1、DNA2和茎环结构核酸H1，其中：
DNA1为待测分子的核酸适体；
DNA2与DNA1部分互补，互补配对后DNA2的3’末端具有凸起；
H1包含a、b、c、b*以及d五个部分，a部分为5'端凸起，d部分为3'端凸起，b及b*互补形成H1茎环结构的茎，c为H1茎环结构的环；d可与DNA2的5'端部分互补配对形成双链DNA，并在H1的3’端形成3'平末端或3'凹陷末端。
作为上述荧光检测试剂盒的进一步改进，H1的a与DNA2的3’端部分互补配对形成双链DNA，并在DNA2的3’端形成凸起。
作为上述荧光检测试剂盒的进一步改进，DNA1和DNA2互补配对后，DNA1的3’端具有凸起。
作为上述荧光检测试剂盒的进一步改进，互补配对后DNA2的3’末端至少6个碱基是凸起的。
作为上述荧光检测试剂盒的进一步改进，a部分的碱基数为8到12个，优选的为9个。
作为上述荧光检测试剂盒的进一步改进，c部分的碱基数为12到21个，优选的为18个。
作为上述荧光检测试剂盒的进一步改进，d部分的碱基数为10到15个，优选的为12个。
作为上述荧光检测试剂盒的进一步改进，b以及b*部分的碱基数为7到12个，优选的为9个。这样既可以保证H1茎环结构中茎的稳定，也可以保证荧光染料可以很好地插入在DNA双链中。
作为上述荧光检测试剂盒的进一步改进，DNA1和DNA2互补的碱基数为16～27个，优选的为18个。这样可以避免在没有核酸适体底物存在的情况下，DNA1和DNA2可以形成较为稳定的双链复合物。
检测试剂盒对反应缓冲液没有特殊要求，一般而言，只要能保持反应pH的稳定，具有核酸外切酶Ⅲ反应时所需要的离子，且不与待测物质发生反应即可。作为上述荧光检测试剂盒的进一步改进，反应缓冲液包含15mM Tris-HCl，50mM NaCl，10mM MgCl2,pH 7.0。
以马拉硫磷残留的检测为例，本发明检测试剂盒的检测原理如图1所示。
1)DNA1是马拉硫磷的核酸适体，DNA2与DNA1部分互补，DNA2的3'端凸起。当检测体系存在马拉硫磷时，马拉硫磷与DNA1结合，从而把DNA2置换下来；
2)茎环结构的H1包含五个部分，分别是a、b、c、b*以及d，a部分位于5'端凸起，d部分位于3'端凸起。步骤(1)置换下来的DNA2可与H1的a部分和d部分互补，使H1的3'端变成平末端，同时DNA2的3'末端是凸起的；
3)加入核酸外切酶Ⅲ，核酸外切酶Ⅲ只能切割双链DNA中的3'平末端或3'凹陷末端，不能切割3'凸起，也不能切割单链DNA。因此，加入核酸外切酶Ⅲ后，可从H1的3'平末端开始切割H1，释放单个碱基，切割后H1的a-b-c部分被释放，同时DNA2也被释放
4)释放的DNA2可不断循环与H1结合，进行信号扩增
5)加入SyBr Green I进行染色检测，由于SyBr Green I跟单链结合后荧光强度很弱，只有跟双链DNA结合，才能发出强荧光。没有马拉硫磷时，体系核酸存在很多双链DNA结构(图1左下角图示)，体系具有较强的荧光；当体系纯在马拉硫磷，双链结构被核酸外切酶Ⅲ切割变成单链结构，此时荧光强度达到下降，马拉硫磷的浓度与SyBr Green I的荧光强度成反比，从而达到检测马拉硫磷的目的。
SyBr Green I可以使用其他可区分单链和双链DNA的荧光染料替代，可区分单链和双链DNA的荧光染料包括但不限于EB、Gene Finder等。
实施例1：
一种马拉硫磷残留检测试剂盒，包括：
(1)核酸DNA1、DNA2、茎环结构核酸H1，其序列如下：
马拉硫磷适体DNA1：5'-ATCCGTCACACCTGCTCTTATACACAATTGTTTTTCTCTTAACTTCTTGACTGCTGGTGT TGGCTCCCGTAT-3'；
DNA2：5'-AAGTTAAGAGAAAAACAATTGACACAC-3'；
H1：5'-CAATTGTTT(a)-GCTTACGGT(b)-ATACCTACGTCGATCGCA(c)-ACCGTAAGC(b*)-TTCTCTTAACTT(d)-3'；
(2)核酸外切酶Ⅲ
(3)马拉硫磷标准溶液
(4)反应缓冲液，含15mM Tris-HCl，50mM NaCl，10mM MgCl2,pH 7.0。
检测方法如下：
1)先用反应缓冲液(15mM Tris-HCl，50mM NaCl，10mM MgCl2,pH 7.0)分别溶解DNA1、DNA2、H1；
2)300nM的DNA1和DNA2充分混匀，室温反应30分钟，形成DNA1-DNA2混合物；
3)加入不同浓度的马拉硫磷于步骤(2)中，充分混匀，室温反应40分钟；
4)500nM的H1加入到步骤(3)中，充分混匀，室温反应30分钟；
5)在步骤(4)中加入20U的核酸外切酶Ⅲ，充分混匀，室温反应90分钟；
6)加入可区分单链和双链DNA的荧光染料1x SyBr Green I，充分混匀，室温反应15分钟后于荧光分光光度计上检测，激发峰为495nm，发射峰为525nm。随着马拉硫磷浓度的增加，荧光强度逐渐下降，二者具有很好的相关性，从而可实现定量检测马拉硫磷。
不同浓度马拉硫磷的检测实验：
配制马拉硫磷标准溶液，浓度分别为10pM、100pM、1nM、10nM、100nM、200nM、400nM
马拉硫磷溶液分别加到实施例1中所述的反应体系中，充分反应后检测荧光强度。如图2所示，随着马拉硫磷浓度的增加，对应的荧光强度逐渐下降，当马拉硫磷浓度超过100nM时，体系逐渐达到饱和，荧光下降至平稳。以马拉硫磷浓度的对数(lgC)为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线，二者具有很好的线性关系，线性范围是从10pM到100nM，线性方程是：F＝40-8lgC(R2＝0.994)(F为荧光强度，C为马拉硫磷浓度)，按照3倍信噪比标准(3S/N)，检测限为5pM。
特异性实验：
选取其他农药残留为对照物，考察检测体系的特异选择性，包括啶虫脒、DDT、氯丹、乐果、敌百虫、西维因、毒杀酚。
将100nM的啶虫脒、DDT、氯丹、乐果、敌百虫、西维因、毒杀酚标准溶液和100nM的马拉硫磷标准溶液分别加到实施例1中所述的反应体系中，充分反应后检测荧光强度，如图3所示，100nM的啶虫脒、DDT、氯丹、乐果、敌百虫、西维因、毒杀酚的荧光强度与空白样品相比，变化不大，对检测不产生影响。只有当加入马拉硫磷时才会使荧光强度显著下降，这证明该方法对马拉硫磷的检测具有很好的特异性，其他农药残留类似物对检测不产生影响。
序列表
<110> 广东省生态环境技术研究所
<120> 一种基于核酸适体的荧光检测试剂盒
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atccgtcaca cctgctctta tacacaattg tttttctctt aacttcttga ctgctggtgt 60
tggctcccgt at 72
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aagttaagag aaaaacaatt gacacac 27
<210> 3
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caattgtttg cttacggtat acctacgtcg atcgcaaccg taagcttctc ttaactt 57

Claims (2)

1.一种基于核酸适体的荧光检测试剂盒，包括核酸外切酶Ⅲ，反应缓冲液，DNA1、DNA2和茎环结构核酸H1，其中：
DNA1为待测分子的核酸适体；
DNA2可与所述DNA1部分序列连续互补，互补配对后DNA2的3’末端具有凸起，DNA1的3’端具有凸起；
H1依次由a、b、c、b*以及d五个部分组成，所述a部分为5'端凸起，H1的a部分可与DNA2的3’端部分互补配对形成双链DNA，并在DNA2的3’端形成凸起；d部分为3'端凸起，b及b*部分互补形成H1茎环结构的茎，c部分为H1茎环结构的环；d部分可与DNA2的5'端部分互补配对形成双链DNA，并在H1的3’端形成3'平末端或3'凹陷末端；
其中，DNA1、DNA2和H1的序列如下：
DNA1：5'-ATCCGTCACACCTGCTCTTATACACAATTGTTTTTCTCTTAACTTCTTGACTGCTGGTGTTGGCTCCCGTAT-3'；
H1：5'-CAATTGTTT-GCTTACGGT-ATACCTACGTCGATCGCA-ACCGTAAGC-TTCTCTTAACTT-3'。
2.一种马拉硫磷残留检测试剂盒，包括：
(1)核酸DNA1、DNA2、茎环结构核酸H1，其序列如下：
马拉硫磷适体DNA1：5'-ATCCGTCACACCTGCTCTTATACACAATTGTTTTTCTCTTAACTTCTTGACTGCTGGTGTTGGCTCCCGTAT-3'；
DNA2：5'-AAGTTAAGAGAAAAACAATTGACACAC-3'；
H1：5'-CAATTGTTT-GCTTACGGT-ATACCTACGTCGATCGCA-ACCGTAAGC-TTCTCTTAACTT-3'；
(2)核酸外切酶Ⅲ
(3)马拉硫磷标准溶液
(4)反应缓冲液，含15mMTris-HCl，50mMNaCl，10mM MgCl2,pH 7.0。
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