CN111607388A - 一种石墨烯量子点-稀土上转换复合物的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种石墨烯量子点‑稀土上转换复合物的制备方法及应用，属于生物传感器技术领域。本发明按照柠檬酸与五乙烯六胺的摩尔比为1:0.01‑1:1，制备了五乙烯六胺功能化石墨烯量子点(PEHA‑GQD)，并成功将其与稀土上转换纳米粒子复合，得到PEHA‑GQD/稀土上转换复合物，即石墨烯量子点‑稀土上转换复合物。本发明所制备的PEHA‑GQD/稀土上转换复合物具有上转换荧光强、表面功能基团丰富和水分散性良好的特点。同时，以其作为光学探针，能够实现有机磷农药的定量测定，方法简单、易于推广。

Description

一种石墨烯量子点-稀土上转换复合物的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及一种石墨烯量子点-稀土上转换复合物的制备方法及应用，属于生物传感器技术领域。
背景技术
稀土掺杂上转换纳米粒子(RE-UCNP)在低能量的近红外光激发下，能够通过多光子吸收过程，发射出高能量的紫外、可见和近红外光。与半导体量子点和有机荧光染料相比，RE-UCNP具有背景荧光干扰低、抗光漂白和光闪烁能力强、光稳定性优异等优点。迄今为止，RE-UCNP已被广泛应用于癌症治疗、生物成像、光学生物传感和光电设备等领域。然而，RE-UCNP水分散性差和上转换发光效率低的缺陷给其在生物医学领域的应用带来了不便。
为了提高RE-UCNP的水分散性，人们尝试了许多对RE-UCNP进行亲水改性的方法。RE-UCNP最常用的亲水改性方法为包覆二氧化硅壳：将RE-UCNP分散在四乙氧基硅烷溶液中，利用四乙氧基硅烷的水解作用，在RE-UCNP表面形成二氧化硅层。该方法简单环保。但是，所制备的RE-UCNP@SiO2在水中稳定性较差，且其表面缺乏生物分析所需要的功能基团。为了进一步改善RE-UCNP的水分散性和功能性，许多亲水性材料如亲水性聚合物、多孔硅、生物分子、蛋白质和DNA等被广泛用于RE-UCNP的表面修饰。然而，这些方法的使用不仅增加了RE-UCNP的合成难度，而且还可能会降低RE-UCNP的上转换发光效率。RE-UCNP的上转换发光机制决定了其低的上转换发光效率，这严重制约了其在光学生物分析领域检测灵敏度。因此，人们一直致力于增强RE-UCNP的上转换发光，主要方法包括尺寸/相位控制、掺杂金属离子、基质修饰、表面等离子体耦合发射、核-壳结构和发射染料敏化。Park等人报道了金属/绝缘体/金属纳米颗粒的合成。将NaYF4:Yb,Er作为绝缘体夹在两层金的中间，由这种特殊结构激发的等离子体在绝缘子层中产生强局域场，从而导致NaYF4:Yb,Er上转换发光效率的提高。尽管在这方面已经取得了很大的进展，但要合成一种理想的分子尺寸小、在水中分散性好、上转换发光强、功能基团丰富的RE-UCNP还面临着巨大的挑战。
发明内容
【技术问题】
石墨烯量子点需要在紫外光下激发，容易受到生物组织自身背景荧光的干扰。而现有技术制备的稀土上转换发光材料存在水分散性差、表面缺乏功能基团和上转换发光效率低的缺陷，严重限制了其在生物医学领域的应用。
【技术方案】
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种石墨烯量子点-稀土上转换复合物(即PEHA-GQD/稀土上转换复合物)的制备方法及应用。本发明所制备的PEHA-GQD/稀土上转换复合物具有水分散性良好、表面功能基团丰富和上转换荧光发射强度高的特点，且制备方法简单、易于推广。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种PEHA-GQD/稀土上转换复合物，所述PEHA-GQD/稀土上转换复合物的制备方法包括如下步骤：
(1)将摩尔比为1:0.01-1:1的柠檬酸和五乙烯六胺溶于超纯水中得到混合液，将混合液150-200℃加热1-8h，调节pH至6.8-7.2，透析12-60h以去除分子量在3kD以下的物质，将透析后收集到的溶液冷冻干燥，得到固体五乙烯六胺功能化石墨烯量子点PEHA-GQD；将固体PEHA-GQD分散于超纯水中制备PEHA-GQD分散液；
(2)制备稀土上转换纳米晶体，在稀土上转换纳米晶体的表面包覆PVP，获得PVP(聚乙烯吡咯烷酮)包覆稀土上转换纳米晶体；所述稀土上转换纳米晶体为NaGdF4:Yb,Er、NaGdF4:Yb,Er@NaGdF4、NaYF4:Yb,Er@NaYF4或NaYF4:Yb,Er；
(3)将步骤(2)制得的PVP包覆稀土上转换纳米晶体分散在超纯水中，向其中加入0.1-25mg/mL步骤(1)制得的PEHA-GQD分散液；15-30℃搅拌0.1-12h后，离心处理，洗涤，获得PEHA-GQD/稀土上转换复合物。
进一步地，步骤(2)中，所述PVP包覆稀土上转换纳米晶体的制备方法是：
①将稀土元素Gd和/或Y、Er、Yb分散在油酸和1-十八烯溶液中，通过加热使其形成镧系元素络合物a；加入氢氧化钠和氟化铵的甲醇溶液，升温至280-320℃并保温1-1.5小时；最终得到稀土上转换纳米晶体；所述稀土上转换纳米晶体以Gd和/或Y为基质，以Er为激活剂、以Yb为敏化剂，所述基质、敏化剂和激活剂的摩尔比为1:0.01:0.1-1:0.5:1；
②将稀土元素Gd或Y分散于油酸和1-十八烯溶液中，通过加热形成镧系元素络合物b；再向其中加入步骤①制得的稀土上转换纳米晶体、氢氧化钠和氟化铵的甲醇溶液，280-320℃并保温1-1.5小时，得到核壳结构的稀土上转换纳米晶体；
③将步骤②制备的核壳结构的稀土上转换纳米晶体分散于环己烷中，用乙醇沉淀，然后向其中加入0.8-1.2mol/L HCl(溶剂：水、乙醇，V水/V乙醇＝1:1)，超声处理以去除纳米颗粒晶体表面的油酸配体；将超声处理后得到的溶液离心得到无配体稀土上转换纳米晶体，然后向其中加入0.8-1.2mol/L HCl(溶剂：乙醇)进行纯化，最后分散于乙醇中；持续搅拌下，将PVP的乙醇溶液滴加到无配体稀土上转换纳米晶体的乙醇分散液中；持续搅拌后，获得PVP包覆稀土上转换纳米晶体。
本发明还提供了一种基于上述PEHA-GQD/稀土上转换复合物的生物荧光传感器，所述生物荧光传感器的制备方法包括：
(一)通过末端羧基化的连接DNA LDNA与PEHA-GQD/稀土上转换复合物表面氨基之间的酰胺化反应，使LDNA与PEHA-GQD/稀土上转换复合物偶联：将EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)添加到LDNA溶液中，30-40℃下孵育1-3h孵育以活化LDNA上的末端羧基；向其中加入PEHA-GQD/稀土上转换复合物分散于超纯水中得到的分散液，3-5℃振荡8-12h；离心去除多余的LDNA，获得LDNA封端的PEHA-GQD/稀土上转换复合物的分散液；
(二)将等物质的量的适配体AS溶液和辅助链AP溶液混合，孵育，加入待测样品，35-39℃孵育1-3h；加入羧基四甲基罗丹明修饰的发夹TMR-H1、发夹H2和Cutsmart缓冲液，35-39℃下孵育30-60min后，加入Nt.AlwI溶液，35-39℃下孵育1-2h后灭酶；加入步骤(一)制得的LDNA封端的PEHA-GQD/稀土上转换复合物的分散液、互补链CS溶液混合摇匀，35-39℃孵育60-150分钟，即得生物荧光传感器。
进一步地，步骤(一)中所述LDNA封端的PEHA-GQD/稀土上转换复合物的体积为50-500μL，浓度为0.1-10mg/mL。
进一步地，步骤(一)中所述AS的浓度为0.1-10μM，所述AP的浓度为0.1-10μM，所述TMR-H1的浓度为0.1-100μM，所述H2的浓度为0.1-100μM。
进一步地，步骤(一)中所述LDNA封端的PEHA-GQD/稀土上转换复合物的体积为50-500μL，浓度为0.1-10mg/mL。
进一步地，步骤(二)中，发夹TMR-H1和H2在使用前，分别在90-95℃下加热4-6min，缓慢冷却至35-39℃。
进一步地，步骤(二)中所述AS的浓度为0.1-10μM，所述AP的浓度为0.1-10μM，所述TMR-H1的浓度为0.1-100μM，所述H2的浓度为0.1-100μM。
进一步地，所述LDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述AP的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述AS的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述TMR-H1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述CS的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
本发明还提供了上述生物荧光传感器在马拉硫磷含量检测中的应用。
进一步地，以加入不同浓度的马拉硫磷标准溶液的生物荧光传感器在541nm处的上转换荧光强度作为参数，与浓度对数值建立线性模型，得到标准曲线；测量加入马拉硫磷待测样品的传感体系的上转换荧光强度，代入标准曲线，获得马拉硫磷含量。
本发明中以PEHA-GQD/稀土上转换复合物作为光学探针，用于马拉硫磷含量的测定。首先，适配体(AP)与其辅助链(AS)结合形成双链DNA(AP-AS)。在马拉硫磷存在的情况下，目标物与AP-AS双链体中的适配体片段AP特异性结合，从而导致AP-AS去杂化，并释放出游离的DNA片段AS。被释放的AS与发夹TMR-H1中预先设计的区域结合，并形成具有限制性核酸内切酶Nt.AlwI识别位点的双链DNA(TMR-H1-AS)。随后，Nt.AlwI在识别位点处将TMR-H1-AS切割成DNA片段BS和FS。DNA片段AS将再次与发夹TMR-H1杂化以启动回收过程，从而产生大量的BS和FS(循环I)。所形成的BS与H2特异性结合，形成具有Nt.AlwI识别位点的H2-BS双链体，从而引发H2的循环切割(循环II)，以释放DNA片段BS和AS。在周期II中释放的AS将触发TMR-H1的循环裂解，并启动新的回收过程(周期III)。多个循环过程后，将产生大量的DNA片段FS。PEHA-GQD/稀土上转换复合物表面的LDNA与DNA片段FS通过碱基互补配对结合。DNA片段FS末端连有荧光染料TAMRA。TAMRA和PEHA-GQD/稀土上转换复合物之间存在荧光共振能量转移作用，使PEHA-GQD/稀土上转换复合物上转换荧光显著猝灭，从而实现目标的定量测定。
本发明成功合成了五乙烯六胺功能化石墨烯量子点PEHA-GQD和PEHA-GQD/稀土上转换复合物。该复合物具有水分散性良好、表面功能基团丰富、上转换荧光强度高的特点。石墨烯量子点的引入一方面为复合物表面提供了丰富的功能基团，这不仅为生物分子的连接提供了便利，还增加了纳米晶体的水分散性；另一方面，石墨烯量子点吸收近红外光的能力，使其作为天线，实现了纳米晶体上转换荧光的增强。利用杂交材料作为光学探针，构建了基于级联循环扩增策略的用于马拉硫磷含量测定的荧光生物传感器。该分析方法具有灵敏度高、选择性好、重复性好等优点。可广泛应用于马拉硫磷含量的高灵敏检测。
本发明的有益效果在于：
(1)PEHA-GQD/稀土上转换复合物水分散性好，复合物良好的水分散性和生物相容性拓展了其在生物医学领域的应用范围；
(2)PEHA-GQD/稀土上转换复合物表面功能基团丰富，复合物表面丰富的功能基团为生物分子的连接提供了便利，这不仅拓宽了复合物的应用领域，还能够提高分析方法的检测灵敏度；
(3)PEHA-GQD/稀土上转换复合物上转换荧光强，复合物强烈的荧光发射为其在更多领域的应用提供了可能，且能够提高分析方法的信噪比，从而提高检测的灵敏度。
(4)本发明构建的生物荧光传感器具有较高的灵敏度。生物荧光传感器具有高灵敏度的原因除了PEHA-GQD/稀土上转换复合物表面基团丰富和上转换荧光发射强以外，还包括稀土上转换发光材料自身的光学特性。稀土上转换发光材料采用近红外激发，具有生物背景荧光干扰小、抗光闪烁和光漂白能力强和生物组织损伤小的特点。这些特点使其在生物分析方面具有独特优势。
附图说明
图1为本发明实施例1中PEHA-GQD/NaGdF4:Yb,Er@NaGdF4复合物的透射电镜。
图2为本发明实施例1中PEHA-GQD/NaGdF4:Yb,Er@NaGdF4复合物的高分辨透射电镜。
图3为本发明实施例1中PEHA-GQD/NaGdF4:Yb,Er@NaGdF4复合物的mapping。
图4为本发明实施例1中PEHA-GQD/NaGdF4:Yb,Er@NaGdF4复合物的XRD。
图5为本发明实施例1中PEHA-GQD/NaGdF4:Yb,Er@NaGdF4复合物的FT-IR谱图。
图6为本发明中不同浓度马拉硫磷存在的情况下，荧光传感体系的荧光光谱。
图7为本发明中不同浓度马拉硫磷存在的情况下，荧光传感体系的线性相关曲线。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明作进一步的描述。
本发明所使用的柠檬酸(即一水合柠檬酸)、五乙烯六胺、油酸、1-十八烯均购于Sigma-Aldrich。马拉硫磷购于Dr.Ehrenstorfer公司。所有寡核苷酸均由生工生物工程有限公司(上海)合成和纯化，其序列列于表1中。在含有10mM Tris-HCl，4mM MgCl2和15mMKCl(pH 8.0)的Tris/Mg/K缓冲液中制备DNA储备溶液，所配制的DNA溶液储存于-20℃。使用前，需将DNA序列在95℃加热10分钟，并以1℃min-1缓慢冷却至室温，形成稳定的发夹结构。其他试剂购自国药试剂(中国上海)。除非另有说明，否则所用的所有化学品均为分析级或最高纯度，无需进一步纯化即可按原样使用。
本发明中所述的室温均指的是15-30℃。
表1实施例中涉及的序列
Figure BDA0002553032460000051
Figure BDA0002553032460000061
下述实施例中PVP包覆稀土上转换纳米晶体的制备方法是：
①将稀土元素Gd、Y、Er和/或Yb分散在油酸和1-十八烯溶液中，通过加热使其形成镧系元素络合物a；加入氢氧化钠和氟化铵的甲醇溶液，升温至280-320℃并保温1-1.5小时；最终得到稀土上转换纳米晶体；所述稀土上转换纳米晶体以Gd和/或Y为基质，以Er为激活剂、以Yb为敏化剂，所述基质、敏化剂和激活剂的摩尔比为1:0.01:0.1-1:0.5:1；
②将稀土元素Gd或Y分散于油酸和1-十八烯溶液中，通过加热形成镧系元素络合物b；再向其中加入步骤①制得的稀土上转换纳米晶体、氢氧化钠和氟化铵的甲醇溶液，280-320℃并保温1-1.5小时，得到核壳结构的稀土上转换纳米晶体；
③将步骤②制备的稀土上转换纳米晶体分散于环己烷中，用乙醇沉淀，然后向其中加入0.8-1.2mol/L HCl(溶剂：水、乙醇，V水/V乙醇＝1:1)，超声处理以去除纳米颗粒晶体表面的油酸配体；将超声处理后得到的溶液离心得到无配体稀土上转换纳米晶体，然后向其中加入0.8-1.2mol/L HCl(溶剂：乙醇)进行纯化，最后分散于乙醇中；持续搅拌下，将PVP的乙醇溶液滴加到无配体稀土上转换纳米晶体的乙醇分散液中；持续搅拌后，获得表面涂覆PVP的稀土上转换纳米晶体。
实施例1
1.PEHA-GQD/稀土上转换复合物的制备：将摩尔比为1:0.1的柠檬酸和五乙烯六胺溶于超纯水中，将混合液移入高压反应器，180℃加热2小时，用NaOH调节pH至7.0，用分子量为3kD的透析袋透析48h，每6h换一次水，将透析袋中收集到的溶液冷冻干燥，得到固体PEHA-GQD；将所得固体分散于超纯水中制备PEHA-GQD分散液(pH＝7)，并在4℃下冷藏；制备NaGdF4:Yb,Er@NaGdF4，利用调节溶液pH、超声处理和表面包覆PVP等手段获得水分散性良好的PVP包覆稀土上转换纳米晶体，即NaGdF4:Yb,Er@NaGdF4/PVP；将NaGdF4:Yb,Er@NaGdF4/PVP分散在5mL超纯水中，向其中加入4mL 0.4mg/mL PEHA-GQD分散液；室温搅拌30min后，离心处理并水洗三次，获得PEHA-GQD/NaGdF4:Yb,Er@NaGdF4固体。
2.生物荧光传感器的制备：通过末端羧基化的LDNA与PEHA-GQD/NaGdF4:Yb,Er@NaGdF4表面氨基之间的酰胺化反应，使LDNA与PEHA-GQD/NaGdF4:Yb,Er@NaGdF4偶联：将EDC(20mg/mL，50μL，MES缓冲液)和NHS(20mg/mL，50μL，MES缓冲液)添加到LDNA溶液(10μM，50μL)中，并在37℃下孵育90分钟以活化LDNA上的末端羧基；向其中加入PEHA-GQD/NaGdF4:Yb,Er@NaGdF4固体分散于超纯水中得到的PEHA-GQD/NaGdF4:Yb,Er@NaGdF4分散液，4℃振荡10h；使用Vivaspin浓缩器(Sartorius，10000MW)以3000rpm的转速于4℃离心15分钟，以去除多余的LDNA，获得的LDNA封端的PEHA-GQD/NaGdF4:Yb,Er@NaGdF4溶液于4℃储存；
将等量的AS(1μM)和AP(1μM)溶液混合，在37℃下孵育2小时，向其中加入5μL马拉硫磷标准溶液于1.5mL离心管中，37℃孵育2小时；加入TMR-H1(10μM，5μL)、H2(10μM，5μL)(发夹TMR-H1和H2使用前，分别在95℃下加热5分钟，缓慢冷却至37℃)和Cutsmart缓冲液(5μL)；在37℃下孵育45分钟后，加入Nt.AlwI溶液(2U/μL，5μL)，在37℃下孵育1小时；然后在80℃下使Nt.AlwI失活20分钟以终止反应；加入LDNA封端的PEHA-GQD/NaGdF4:Yb,Er@NaGdF4分散液(400μL)与CS溶液(1μM，50μL)混合摇匀，37℃孵育90分钟。以980nm激光为激发光源，在荧光光谱仪上测量其上转换荧光，狭缝宽度为2nm、2nm，功率为1.0W。
实施例2
1.PEHA-GQD/稀土上转换复合物的制备：将摩尔比为1:1的柠檬酸和五乙烯六胺分散在水中，溶于超纯水中，将混合液移入高压反应器，150℃加热3小时，用NaOH调节pH至7.0，用分子量为3kD的透析袋透析60h，每6h换一次水，将透析袋中收集到的溶液冷冻干燥，得到固体PEHA-GQD；将所得固体分散于超纯水中制备PEHA-GQD分散液(pH＝7)，并在4℃下冷藏；制备NaYF4:Yb,Er，利用调节溶液pH、超声处理和表面包覆PVP等手段获得水分散性良好的NaYF4:Yb,Er/PVP；将上述固体产物分散在5mL超纯水中，向其中加入2mL 1mg/mLPEHA-GQD分散液；室温搅拌70min后，离心处理并水洗三次，获得PEHA-GQD/NaYF4:Yb,Er固体。
2.生物荧光传感器的制备：通过末端羧基化的LDNA与PEHA-GQD/NaYF4:Yb,Er表面氨基之间的酰胺化反应，使LDNA与PEHA-GQD/NaYF4:Yb,Er偶联：将EDC(20mg/mL，50μL，MES缓冲液)和NHS(20mg/mL，50μL，MES缓冲液)添加到LDNA溶液(10μM，50μL)中，并在37℃下孵育90分钟以活化LDNA上的末端羧基；向其中加入PEHA-GQD/NaYF4:Yb,Er固体分散于超纯水中得到的PEHA-GQD/NaYF4:Yb,Er分散液，4℃振荡8h；使用Vivaspin浓缩器(Sartorius，10000MW)以3000rpm的转速于4℃离心15分钟，以去除多余的LDNA，获得的LDNA封端的PEHA-GQD/NaYF4:Yb,Er溶液于4℃储存；
将等量的AS(5μM)和AP(5μM)溶液混合，在37℃下孵育2小时，向其中加入5μL马拉硫磷标准溶液于1.5mL离心管中，37℃孵育2小时；加入TMR-H1(50μM，5μL)、H2(50μM，5μL)(发夹TMR-H1和H2使用前，分别在95℃下加热5分钟，缓慢冷却至37℃)和Cutsmart缓冲液(5μL)；在37℃下孵育45分钟后，加入Nt.AlwI溶液(2U/μL，5μL)，在37℃下孵育1小时；然后在80℃下使Nt.AlwI失活20分钟以终止反应；加入LDNA封端的PEHA-GQD/NaYF4:Yb,Er分散液(350μL)与CS溶液(1μM，50μL)混合摇匀，37℃孵育90分钟。以980nm激光为激发光源，在荧光光谱仪上测量其上转换荧光，狭缝宽度为2nm、2nm，功率为1.0W。
实施例3
1.PEHA-GQD/稀土上转换复合物的制备：将摩尔比为1:0.5的柠檬酸和五乙烯六胺溶于超纯水中，将混合液移入高压反应器，200℃加热1小时，用NaOH调节pH至7.0，用分子量为3kD的透析袋透析48h，每6h换一次水，将透析袋中收集到的溶液冷冻干燥，得到固体PEHA-GQD；将所得固体分散于超纯水中制备PEHA-GQD分散液(pH＝7)，并在4℃下冷藏；制备NaYF4:Yb,Er@NaGdF4，通过调节溶液pH、超声处理和表面包覆PVP等手段获得水分散性良好的NaYF4:Yb,Er@NaGdF4/PVP；将上述固体产物分散在5mL超纯水中，向其中加入3mL 5mg/mLPEHA-GQD分散液；室温搅拌90min后，离心处理并水洗三次，获得PEHA-GQD/NaYF4:Yb,Er@NaGdF4固体。
2.生物荧光传感器的制备：通过末端羧基化的LDNA与PEHA-GQD/NaYF4:Yb,Er@NaGdF4表面氨基之间的酰胺化反应，使LDNA与PEHA-GQD/NaYF4:Yb,Er@NaGdF4偶联：将EDC(20mg/mL，50μL，MES缓冲液)和NHS(20mg/mL，50μL，MES缓冲液)添加到LDNA溶液(10μM，50μL)中，并在37℃下孵育90分钟以活化LDNA上的末端羧基；向其中加入PEHA-GQD/NaYF4:Yb,Er@NaGdF4固体分散于超纯水中得到的PEHA-GQD/NaYF4:Yb,Er@NaGdF4分散液，4℃振荡12h；使用Vivaspin浓缩器(Sartorius，10000MW)以3000rpm的转速于4℃离心15分钟，以去除多余的LDNA，获得的LDNA封端的PEHA-GQD/NaYF4:Yb,Er@NaGdF4溶液于4℃储存；
将等量的AS(10μM)和AP(10μM)溶液混合，在37℃下孵育2小时，向其中加入5μL马拉硫磷标准溶液于1.5mL离心管中，37℃孵育2小时；加入TMR-H1(75μM，5μL)、H2(75μM，5μL)(发夹TMR-H1和H2使用前，分别在95℃下加热5分钟，缓慢冷却至37℃)和Cutsmart缓冲液(5μL)；在37℃下孵育45分钟后，加入Nt.AlwI溶液(2U/μL，5μL)，在37℃下孵育1小时；然后在80℃下使Nt.AlwI失活20分钟以终止反应；加入LDNA封端的PEHA-GQD/NaYF4:Yb,Er@NaGdF4分散液(500μL)与CS溶液(1μM，50μL)混合摇匀，37℃孵育90分钟。以980nm激光为激发光源，在荧光光谱仪上测量其上转换荧光，狭缝宽度为2nm、2nm，功率为1.0W。
测试例1
取实施例1制备得到的PEHA-GQD/NaGdF4:Yb,Er@NaGdF4复合物进行表征，由图1中TEM图可知，PEHA-GQD/NaGdF4:Yb,Er@NaGdF4复合物是由平均尺寸为25nm的六方相晶体组成。该复合物的HRTEM图(图2)中可以明显观察到两种晶格条纹，晶格间距为0.51nm的晶格条纹对应于NaGdF4:Yb,Er@NaGdF4的晶面，晶格间距为0.2nm的晶格条纹对应于石墨烯的(100)晶面。元素mapping分析(图3)的结果证明该复合物中含有Gd、Yb、Er和N元素。Gd、Yb和Er元素仅存在于NaGdF4:Yb,Er@NaGdF4中，而N元素仅存在于PEHA-GQD中。上述结果证实PEHA-GQD/NaGdF4:Yb,Er@NaGdF4的成功合成。
图4和图5分别是PEHA-GQD/NaGdF4:Yb,Er@NaGdF4复合物的XRD和FT-IR谱图。核壳结构的NaGdF4:Yb,Er@NaGdF4与NaGdF4:Yb,Er拥有相似的XRD谱图，它们都具有(100)、(110)、(101)、(210)和(102)晶面。这与六方相NaGdF4的XRD谱图(JCPDS No.27-0699)相一致，而且从图中可以看出与NaGdF4:Yb,Er相比，NaGdF4:Yb,Er@NaGdF4结晶性较好。PEHA-GQD/NaGdF4:Yb,Er@NaGdF4的FT-IR谱图中存在很多吸收峰和吸收带。3500cm-1至3000cm-1波数范围内的宽IR吸收峰是由O-H和N-H键的拉伸振动引起的。酰胺键C＝O的伸缩振动在1650cm-1处具有IR吸收峰。1550cm-1处的强烈IR吸收峰归因于伯胺N-H键平面的弯曲振动以及C-O键的不对称拉伸振动。1700-700cm-1的范围内，吸收峰可归因于五乙烯六胺中的功能基团。1000cm-1附近的吸收峰归因于Yb3+在980nm处的强吸收。从图5可以看出，PEHA-GQD/NaGdF4:Yb,Er@NaGdF4的IR光谱中存在PEHA-GQD的所有IR吸收峰和谱带。这证实了PEHA-GQD已成功连接于NaGdF4:Yb,Er@NaGdF4表面。
测试例2
将5μL AS(10μM)和5μL AP(10μM)溶液混合，在37℃下孵育2小时，向其中加入5μL浓度分别为1.0×10-17、5.0×10-17,1.0×10-16、5.0×10-16、1.0×10-15、5.0×10-15、1.0×10-14、5.0×10-14、1.0×10-13、5.0×10-13和1.0×10-12M的马拉硫磷标准溶液于1.5mL离心管中，37℃孵育2小时。然后加入TMR-H1(75μM，5μL)、H2(75μM，5μL)和Cutsmart缓冲液(5μL)。在37℃下孵育45分钟后，加入Nt.AlwI溶液(2U/μL，5μL)，在37℃下孵育1小时。然后在80℃下使Nt.AlwI失活20分钟以终止反应；加入LDNA封端的PEHA-GQD/NaYF4:Yb,Er@NaGdF4分散液(500μL)与CS溶液(1μM，50μL)混合摇匀，37℃孵育90分钟。以980nm激光为激发光源，在荧光光谱仪上测量其上转换荧光，狭缝宽度为2nm、2nm，功率为1.0W。随着啶虫脒浓度的增加，PEHA-GQD/NaGdF4:Yb,Er@NaGdF4在541nm处的上转换荧光逐渐减弱。根据其荧光强度，实现马拉硫磷的定量测定，结果如图6和7所示。图6是马拉硫磷标准溶液浓度分别为1.0×10-17、5.0×10-17,1.0×10-16、5.0×10-16、1.0×10-15、5.0×10-15、1.0×10-14、5.0×10-14、1.0×10-13、5.0×10-13和1.0×10-12M(以540nm为横坐标，自上而下)所对应传感体系的荧光曲线。从图中可以看出，随着目标浓度的增加，体系的荧光强度逐渐减弱。这说明传感体系的上转换荧光强度依赖于目标物的浓度。图7是体系峰值荧光强度值Fp与目标浓度的对数之间的关系曲线。Fp与目标物浓度的对数在1.0×10-17至1.0×10-12M之间具有良好的线性关系。相应的线性回归方程为Fp＝-2257.8×LOG[C马拉硫磷，M]-15932，相关系数为0.995。根据3σ法则，检出限为4.5×10-18M。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (9)

1.一种PEHA-GQD/稀土上转换复合物，其特征在于，所述PEHA-GQD/稀土上转换复合物的制备方法包括如下步骤：
(1)将摩尔比为1:0.01-1:1的柠檬酸和五乙烯六胺溶于超纯水中得到混合液，将混合液150-200℃加热1-8h，调节pH至6.8-7.2，透析12-60h以去除分子量在3kD以下的物质，将透析后收集到的溶液冷冻干燥，得到固体五乙烯六胺功能化石墨烯量子点PEHA-GQD；将固体PEHA-GQD分散于超纯水中制备PEHA-GQD分散液；
(2)制备稀土上转换纳米晶体，在稀土上转换纳米晶体的表面包覆PVP，获得PVP包覆稀土上转换纳米晶体；所述稀土上转换纳米晶体为NaGdF4:Yb,Er、NaGdF4:Yb,Er@NaGdF4、NaYF4:Yb,Er@NaYF4或NaYF4:Yb,Er；
(3)将步骤(2)制得的PVP包覆稀土上转换纳米晶体分散在超纯水中，向其中加入0.1-25mg/mL步骤(1)制得的PEHA-GQD分散液；15-30℃搅拌0.1-12h后，离心，洗涤，获得PEHA-GQD/稀土上转换复合物。
2.根据权利要求1所述的PEHA-GQD/稀土上转换复合物，其特征在于，步骤(2)中，所述PVP包覆稀土上转换纳米晶体的制备方法是：
①将稀土元素Gd和/或Y、Er、Yb分散在油酸和1-十八烯溶液中，通过加热使其形成镧系元素络合物a；加入氢氧化钠和氟化铵的甲醇溶液，升温至280-320℃并保温1-1.5小时；最终得到稀土上转换纳米晶体；所述稀土上转换纳米晶体以Gd和/或Y为基质，以Er为激活剂、以Yb为敏化剂，所述基质、敏化剂和激活剂的摩尔比为1:0.01:0.1-1:0.5:1；
②将稀土元素Gd或Y分散于油酸和1-十八烯溶液中，通过加热形成镧系元素络合物b；再向其中加入步骤①制得的稀土上转换纳米晶体、氢氧化钠和氟化铵的甲醇溶液，280-320℃并保温1-1.5小时，得到核壳结构的稀土上转换纳米晶体；
③将步骤②制备的核壳结构的稀土上转换纳米晶体分散于环己烷中，用乙醇沉淀，然后向其中加入0.8-1.2mol/L HCl溶液，超声处理以去除纳米颗粒晶体表面的油酸配体；将超声处理后得到的溶液离心得到无配体稀土上转换纳米晶体，然后向其中加入0.08-0.12mol/L HCl溶液进行纯化，最后分散于乙醇中；持续搅拌下，将PVP的乙醇溶液滴加到无配体稀土上转换纳米晶体的乙醇分散液中；持续搅拌后，获得PVP包覆稀土上转换纳米晶体。
3.一种基于权利要求1所述的PEHA-GQD/稀土上转换复合物的生物荧光传感器，其特征在于，所述生物荧光传感器的制备方法包括：
(一)将EDC和NHS添加到连接DNA LDNA溶液中，30-40℃下孵育1-3h孵育以活化LDNA上的末端羧基；向其中加入权利要求1所述的PEHA-GQD/稀土上转换复合物分散于超纯水中得到的分散液，3-5℃振荡8-12h；离心去除多余的LDNA，获得LDNA封端的PEHA-GQD/稀土上转换复合物的分散液；
(二)将等物质的量的适配体AS溶液和辅助链AP溶液混合，孵育，加入待测样品，35-39℃孵育1-3h；加入羧基四甲基罗丹明修饰的发夹TMR-H1、发夹H2和Cutsmart缓冲液，35-39℃下孵育30-60min后，加入Nt.AlwI溶液，35-39℃下孵育1-2h后灭酶；加入步骤(一)制得的LDNA封端的PEHA-GQD/稀土上转换复合物的分散液、互补链CS溶液混合摇匀，35-39℃孵育60-150分钟，即得生物荧光传感器。
4.根据权利要求3所述的生物荧光传感器，其特征在于，步骤(一)中所述LDNA封端的PEHA-GQD/稀土上转换复合物的体积为50-500μL，浓度为0.1-10mg/mL。
5.根据权利要求3所述的生物荧光传感器，其特征在于，步骤(一)中所述AS的浓度为0.1-10μM，所述AP的浓度为0.1-10μM，所述TMR-H1的浓度为0.1-100μM，所述H2的浓度为0.1-100μM；步骤(一)中所述LDNA封端的PEHA-GQD/稀土上转换复合物的体积为50-500μL，浓度为0.1-10mg/mL。
6.根据权利要求3所述的生物传感器，其特征在于，步骤(二)中所述AS的浓度为0.1-10μM，所述AP的浓度为0.1-10μM，所述TMR-H1的浓度为0.1-100μM，所述H2的浓度为0.1-100μM。
7.根据权利要求3-6任一所述的生物传感器，其特征在于，所述LDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述AP的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述AS的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述TMR-H1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述CS的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
8.权利要求7所述的生物荧光传感器在检测马拉硫磷含量中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，以加入不同浓度的马拉硫磷标准溶液的生物荧光传感器在541nm处的上转换荧光强度作为参数，与浓度对数值建立线性模型，得到标准曲线；测量加入马拉硫磷待测样品的传感体系的上转换荧光强度，代入标准曲线，获得马拉硫磷含量。
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