CN112391493A

CN112391493A - 柑橘黄龙病亚洲种的raa荧光检测方法、引物探针及试剂盒

Info

Publication number: CN112391493A
Application number: CN202011435308.0A
Authority: CN
Inventors: 陈吴健; 任琰; 林晓佳; 张明哲; 吴志毅; 程帆; 吴颖; 李月红; 应清界; 郭利川
Original assignee: Jiangsu Qitian Gene Biotechnology Co ltd; Zhejiang Academy Of Science & Technology For Inspection & Quarantine
Current assignee: Jiangsu Qitian Gene Biotechnology Co ltd; Zhejiang Academy Of Science & Technology For Inspection & Quarantine
Priority date: 2020-12-10
Filing date: 2020-12-10
Publication date: 2021-02-23

Abstract

本发明属于分子生物学检测领域，具体涉及一种检测柑橘黄龙病亚洲种RAA荧光法检测的引物、探针和试剂盒。本发明基于RAA技术开发的柑橘黄龙病病菌亚洲种检测方案解决了现有技术检测方法在检测柑橘黄龙病病菌亚洲种中所存在的费时费力、时间周期长且效率低、需要专业人员及昂贵仪器、假阳性率高等问题。具有检测时间短、灵敏度高、特异性强、操作简单等特点。只需在39℃下反应5～20分钟便可分析结果。具有快速、灵敏、操作简便等特点，对未来检测柑橘黄龙病病菌亚洲种传播具有非常重要的意义，具有较大的应用前景。

Description

柑橘黄龙病亚洲种的RAA荧光检测方法、引物探针及试剂盒

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，具体涉及一种检测柑橘黄龙病亚洲种RAA荧光法检测的引物、探针和试剂盒。

背景技术

柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing，HLB)是柑橘生产中危害最严重的检疫性病害之一，黄龙病病原属于韧皮部杆菌属的一种革兰氏阴性菌，其中亚洲种CandidatusLiberibacter asiaticus(Las)是全世界柑橘的主要致病菌种。柑桔感染黄龙病后，出现叶片斑驳型黄化，果实变小、畸形，部分品种出现红鼻子果、青果等症状，树势衰弱，产量下降，果实品质变劣，很快失去经济价值。目前，中国19个柑橘生产省(市、自治区)中已有11个受到该病危害，受害面积占柑橘总栽培面积的80％以上，产量占总产量的85％左右严重制约柑橘产业的健康发展。

柑橘黄龙病病菌明确的传播方式主要有带病接穗和通过带菌柑橘木虱取食，亦有报道称菟丝子可以进行传播；尚未明确种子是否能够传菌，也不明确有无其他传播途径，木虱、土壤、种植环境对其传播和流行的影响也无系统的研究；第二，柑橘种苗接穗、出苗周期短，检测需求集中，有很强的时效性，目前常规的核酸检测方法很难满足现有的检测需求。

目前柑橘黄龙病无法进行人工培养，而传统的指示植物、电镜、血清学等诊断方法，耗时耗力，且效率低下，因此国际上通常采用常规PCR\巢式PCR、实时荧光PCR等分子生物学技术来进行诊断。

1、聚合酶链式反应法(PCR)

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)利用基因组DNA或者cDNA在95℃高温下发生变性由双链变成单链，60℃左右时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，72℃左右时DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。PCR检测方法以其快速、准确和灵敏的特点受到广泛应用。

2、实时荧光定量PCR法

实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法，通过内参对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。实时荧光PCR技术已经用于柑橘黄龙病亚洲种的定量检测。

3、环介导等温扩增(LAMP)

环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种快速核酸扩增方法是一种快速核酸扩增方法，该方法针对靶基因序列的6个不同区域设计4种特异性LAMP引物，利用一种链置换活性的Bst DNA聚合酶在等温条件(65℃左右)孵育30～60min，即可完成核酸扩增反应，黄丽等人通过该技术检测柑橘黄龙病亚洲种。

综上所述，采用PCR技术，具有快速、特异性强、灵敏度高的优点，是目前国内外筛检柑橘黄龙病亚洲种的重要手段，但需昂贵仪器，装备精良的实验室和专业的操作人员。LAMP法不需要昂贵的PCR仪，等温灵敏、特异性强、操作简单且易于观察结果，但是LAMP技术要求多对引物且对靶基因的要求较高，较难在基层实验室推广应用。

发明内容

针对现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种柑橘黄龙病病菌亚洲种RAA荧光法检测试剂盒及其制备与应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种基于RAA技术开发的柑橘黄龙病病菌亚洲种检测试剂。所述试剂包括适用于RAA荧光法检测柑橘黄龙病病菌亚洲种的探针，所述探针的结构中包括：5’-第一序列片段-荧光报告基团-C-THF-C-淬灭基团-第二序列片段-3’。所述第一序列片段包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。第二序列片段包括如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。SEQ ID NO.3所示序列为：ATTCGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGCT。SEQ ID NO.4所示序列为TGGCCTGATACTGAC。荧光报告基团和淬灭基团不占据碱基位置，荧光报告基团修饰在第一序列片段上离5'端碱基数31bp的位置上，即T碱基上；淬灭基团修饰在第二序列片段上离3'端碱基数15bp的位置上，即另一T碱基上。

一种实施方式中，所述探针设有3’端阻断。3’端阻断用于阻断DNA链的延伸。所述3’端阻断可以是磷酸盐(phosphate)。

一种实施方式中，所述荧光报告基团选自FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5中的任一种。例如，实施例中使用了FAM。

一种实施方式中，所述淬灭基团选自TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL中的任一种。例如，实施例中使用了BHQ1。

一种实施方式中，所述THF占据1个碱基位置，在所述探针上形成缺口。所述THF是指四氢呋喃残基。

一种实施方式中，所述探针的制备方法，包括步骤：对SEQ ID NO.5所示的序列进行修饰，在离5'端碱基数31bp的T碱基上修饰荧光报告基团，在离3'端碱基数15bp的T碱基上修饰淬灭基团，离5'端碱基数33bp的A碱基替换为四氢呋喃残基。

进一步地，所述检测试剂还包括上游引物和下游引物。所述上游引物包括如SEQID NO.1所示的序列。所述下游引物包括如SEQ ID NO.2所示的序列。

SEQ ID NO.1所示的序列为：5’-CTAGAGTTTAGGAGAGGTGAGTGGAATTCCGAG-3’。

SEQ ID NO.2所示的序列为：5’-GTGCTTAATGCGTTAGCTGCGCCACTGAATG-3’。

本发明的第二方面，提供前述检测试剂用于制备柑橘黄龙病病菌亚洲种检测试剂盒的用途。

本发明的第三方面，提供一种柑橘黄龙病病菌亚洲种检测试剂盒，包括前述检测试剂。

本发明的试剂盒采用RAA技术对柑橘黄龙病病菌亚洲种进行检测，根据扩增及检测情况可分析判断柑橘黄龙病病菌亚洲种感染情况。因此，引物及探针的设计是本发明试剂盒的关键。

本发明探针的设计要点在于，荧光修饰于探针的中间位置，其中荧光报告基团修饰在离5'端碱基数31bp的位置上(亦即，修饰于T碱基上)，淬灭基团修饰在离3'端碱基数15bp的位置上(亦即，修饰于另一T碱基上)荧光报告基团与淬灭基团之间隔3个碱基位置(CAC)，四氢呋喃残基替换了A碱基。

当探针为单链，核酸外切酶不识别。当探针和目的DNA结合后，核酸外切酶识别缺口，切除四氢呋喃残基(THF)，并解除3’端阻断。荧光报告基团和淬灭基团分离，发出荧光，同时，在聚合酶、上游引物和下游引物完成链的延伸与扩增。

本发明对探针和引物在试剂盒中的储存浓度不做限定，为了试验的准确性，一般情况下，所述的探针使用时在反应体系中的终浓度为0.02～0.05mM，所述上游引物及下游引物使用时在反应体系中的终浓度为0.05～0.1mM。

基于本发明所述试剂盒是采用RAA技术来进行检测的，所以试剂盒中还可以包括其他一些RAA检测所需要的常规试剂。如RAA基础荧光通用反应试剂、反应缓冲液中的一种或多种。由于此类RAA检测常用试剂均可经市场途径单独购得或者自行配置，因此具体需要将哪些试剂装配入试剂盒，可以根据客户实际需要配置，为方便起见，也可全部装配入试剂盒。

一种实施方式中，所述的RAA基础荧光通用反应试剂是经过低温冷冻干燥的冻干粉，由江苏奇天基因生物科技有限公司提供；是商品货号为F08018的基础反应单元。本领域技术人员，也可以根据RAA荧光法检测方法的原理，选择其他能够作为RAA基础荧光通用反应试剂的产品作为替换。所述RAA基础荧光通用反应试剂中包括核酸外切酶、聚合酶等。

一种实施方式中，反应缓冲液由以下试剂组成：在此对其在试剂盒中的储存浓度不做限定，为了试验的准确性，一般情况下，所述反应缓冲液中各组分的使用浓度为450mM的Tris-HCl Buffer(PH7.6)、260mM的MgAc和10％W/V(即，10g/100ml)的PEG 10000；余量为作为溶剂的水。

在使用本发明的试剂盒进行检测时，RAA反应体系可自行配置，也可直接以市售的不含引物及探针的RAA基础荧光通用反应试剂加入引物及探针获得。例如，在RAA基础荧光通用反应试剂和反应缓冲液中，加入本发明的引物及探针、待检样本即可获得RAA反应体系。

所述试剂盒中还可含有阳性质控品。所述阳性质控品含为柑橘黄龙病病菌亚洲种的基因组DNA片段，在此对其在试剂盒中的储存浓度不做限定，检测时，一般情况下，阳性质控品的使用浓度为1.0×10⁴copies/uL；也可以选择高于此浓度的任意一个浓度作为阳性质控品。

所述试剂盒中还可含有临界阳性质控品。所述临界阳性质控品为含柑橘黄龙病病菌亚洲种的基因组DNA片段，在此对其在试剂盒中的储存浓度不做限定，检测时，一般情况下，临界阳性质控品的使用浓度为1.0×10³copies/uL。所述阴性质控品为不含有柑橘黄龙病病菌亚洲种的基因组片段的试剂(即，不含有柑橘黄龙病病菌亚洲种的基因组片段的DNA质粒)。

本发明的第四方面，提供了前述柑橘黄龙病病菌亚洲种检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

(1)提取样品基因组DNA；

(2)加样：将待测样品的DNA、阳性质控品或阴性质控品分别加入至装有RAA反应体系的反应管中，获得对应的待测样品反应管、阳性反应管或阴性反应管，所述RAA反应体系中含有前述上游引物、下游引物及探针；

(3)RAA反应：反应管置于荧光检测仪器中进行实时RAA荧光法反应；

(4)结果分析。

步骤(1)中，提取样品基因组DNA为现有技术。可以用CTAB法进行柑橘黄龙病病菌亚洲种DNA的提取，也可以采用商业化的DNA提取试剂盒提取待测样品的DNA。

步骤(3)中，实时RAA荧光法反应条件可设定为：反应温度39℃，反应时间5～20min。

步骤(4)中，一般地，在20min之内FAM荧光检测仪器检测到信号明显增加，增加量为荧光起始量的30％，显示有扩增判定为阳性；在20min之内FAM荧光仪器信号无增加，判定为阴性。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明解决了现有技术检测方法在检测柑橘黄龙病病菌亚洲种中所存在的费时费力、时间周期长且效率低、需要专业人员及昂贵仪器、假阳性率高等问题。本发明采用RAA技术，具有检测时间短、灵敏度高、特异性强、操作简单、设备便宜、技术要求低等特点。只需在39℃下反应5～20分钟便可分析结果。具有快速、灵敏、操作简便等特点，对未来检测柑橘黄龙病病菌亚洲种传播具有非常重要的意义，具有较大的应用前景。目前三个黄龙病标准，有两个都存在假阳性的问题，从这个角度来说，本方法具有优势。

综上所述，本发明的利用RAA技术能够快速检测柑橘黄龙病病菌亚洲种，操作简便，所用时间大大缩减，不需要大型仪器设备，适用于大规模的筛选。本发明所提供的检测方法灵敏度高、特异性好、操作简便、迅速，并且对检测材料质量要求低。

附图说明

图1为本发明实施例1的灵敏度检测扩增图，横坐标是指反应时间，单位为min，纵坐标是指荧光值，单位为mV。

图2为本发明柑橘黄龙病病菌亚洲种实际样本检测扩增图，横坐标是指反应时间，单位为min，纵坐标是指荧光值，单位为mV。

图3为本发明柑橘黄龙病病菌亚洲种样本特异性实施例检测扩增图，横坐标是指反应时间，单位为min，纵坐标是指荧光值，单位为mV。

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

实施例1试剂盒的制备及使用方法

分别设计并合成柑橘黄龙病病菌亚洲种检测引物及探针，其结构与核苷酸序列如下表1所示。

表1

在合成探针时，可先合成如SEQ ID NO.5所示的序列：

5’-ATTCGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGCCTGATACTGAC-3’。

然后对SEQ ID NO.5所示的序列进行修饰。具体的，荧光报告基团FAM修饰在离5'端碱基数31bp的位置上(亦即，修饰于T碱基上)，淬灭基团修饰在离3'端碱基数15bp的位置上(亦即，修饰于另一T碱基上)，荧光报告基团与淬灭基团之间隔3个碱基位置(CAC)，其中四氢呋喃残基替换A碱基。

上述各组引物对及探针可单独包装，也可以组合探针与引物混合液。所述探针引物混合液中，所含上述各引物及探针的量采用本领域技术人员所知悉的常规用量即可。

也就是说，本发明的试剂盒，可以是含有上述独立包装的各组引物对及探针，也可以是含有配置好的含有各组引物对及探针的引物探针混合液。

进一步地，所述试剂盒还可以含有RAA基础荧光通用反应试剂(包括核酸外切酶、聚合酶等)、反应缓冲液、阴性质控品(如ddH₂O)、阳性质控品(如1.0×10⁴Copies/ul柑橘黄龙病病菌亚洲种基因重组DNA质粒)、临界阳性质控品(如1.0×10³Copies/ul柑橘黄龙病病菌亚洲种基因重组DNA质粒)等等。

采用本发明的试剂盒进行检测的原理：当探针为单链，核酸外切酶不识别。当探针和目的DNA结合后，核酸外切酶识别缺口，切除四氢呋喃残基(THF)，并解除3’端阻断。荧光报告基团和淬灭基团分离，发出荧光，同时，在聚合酶、上游引物和下游引物完成链的延伸与扩增。

使用本发明柑橘黄龙病病菌亚洲种试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

(1)提取待测样品的DNA；

(3)RAA反应：反应管置于FAM荧光检测仪器中进行实时RAA荧光法反应；

(4)结果分析。

实施例2试剂盒的灵敏度分析

(一)获取待测样品的DNA

选择柑橘黄龙病病菌亚洲种的特异性保守基因作为目标检测基因，通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，获得柑橘黄龙病病菌亚洲种基因序列，并进行多序列比对，并从中选出一段保守序列，该序列如下：

CGATTAAGTTAGAGGTGAAATCCCAGGGCTCAACCTTGGAACTGCCTTTAATACTGGTTGTCTAGAGTTTAGGAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGCCTGATACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGCTGTTGGGTGGTTTACCATTCAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGA(SEQ ID NO.6)。

根据以上序列委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成DNA质粒，质粒大小313bp。

为了方便进行试剂盒的灵敏度测定，将由生工生物工程(上海)股份有限公司合成的柑橘黄龙病病菌亚洲种DNA质粒转化至大肠杆菌中，37℃扩培8小时，采用商品化的质粒提取试剂盒进行柑橘黄龙病病菌亚洲种DNA质粒，经浓度测定后将其浓度稀释至10¹⁰Copies/ul备用。

将5ul 10¹⁰Copies/ul柑橘黄龙病病菌亚洲种DNA质粒制备成不同梯度的工作标准品，分别为：

工作标准品1，含有1.0×10⁷Copies/ul柑橘黄龙病病菌亚洲种的基因DNA片段。

工作标准品2，含有1.0×10⁶Copies/ul柑橘黄龙病病菌亚洲种的基因DNA片段。

工作标准品3，含有1.0×10⁵Copies/ul柑橘黄龙病病菌亚洲种的基因DNA片段。

工作标准品4，含有1.0×10⁴Copies/ul柑橘黄龙病病菌亚洲种的基因DNA片段。

工作标准品5，含有1.0×10³Copies/ul柑橘黄龙病病菌亚洲种的基因DNA片段。

工作标准品6，含有1.0×10²Copies/ul柑橘黄龙病病菌亚洲种的基因DNA片段。

(二)加样

使用本发明试剂盒中的试剂(表1、表2)，配制反应Buffer。具体步骤包括：按吸取376μL反应缓冲液，加入16μL探针与引物的混合物，充分混均；吸取混均后49μL试剂分别加入到7个RAA基础荧光通用反应试剂管(50μL体系冻干粉)中，使冻干粉充分溶解并混均。

表2

在7个配制好的管中分别加入1μL阴性质控品、标准工作品6、标准工作品5、标准工作品4、标准工作品3、标准工作品2、标准工作品1为模板，每个反应管进行充分混均，每个反应管总体积为50μL。

(三)RAA反应

检测仪器采用江苏奇天基因生物科技有限公司提供的RAA-F1620荧光检测仪；

仪器设置为：反应温度39℃，反应时间20分钟。

将混均的反应管放入RAA-F1620荧光检测仪中，在39℃反应20分钟。

(四)结果分析

在20min之内FAM荧光检测仪器检测到信号明显增加，增加量为荧光起始量的30％，显示有扩增判定为阳性；在20min之内FAM荧光仪器信号无增加，判定为阴性。

检测结果如图1所示。结果显示最快2分钟明显有扩增，10分钟内所有标准工作品均有扩增。本发明试剂盒的检测灵敏度(或检测限)为10拷贝/反应。而市面上尚无相关商品化的试剂盒。

实施例3试剂盒的实际样品检测分析

(一)样本来源及DNA提取

样本由浙江省检验检疫科学技术研究院提供，为柑橘叶片(pcr阳性)、柠檬叶片、橙子叶片的DNA，提取好的DNA在-80℃保存备用。

(二)加样

使用本发明试剂盒中的试剂(表1、表2)，配制反应Buffer。具体步骤包括：取5个反应管，分别按如下操作，吸取47μL反应缓冲液，加入2μL探针与引物的混合物，充分混均；将混均后的49μL试剂加入到RAA基础荧光通用反应试剂管(50μL体系冻干粉)中，使冻干粉充分溶解并混均；

在5个配制好的管中分别加入1μL阴性质控品、1μL提取好的样本DNA(浓度为20ng/μL)，1μL阳性质控品为模板，每个反应管进行充分混均，每个反应管总体积为50μL。

(三)RAA反应

仪器设置为：反应温度39℃，反应时间20分钟。

(四)结果分析

检测结果如图2所示。结果显示3分钟明显有扩增。充分说明本发明的试剂盒可以检测实际样本中的亚洲黄龙病菌。

实施例3试剂盒的特异性分析

(一)样本来源及DNA提取

柑橘黄龙病亚洲种Candidatus Liberibacter asiaticus(Las)、柑橘溃疡病菌Xanthomonas axonopodis pv.citri、柑橘链格孢Alternaria citri、链格孢Alternariaalternata、富氏葡萄孢盘菌Botryotinia fuckeliana、、灰葡萄孢Botrytis cinerea、丁香疫霉Phytophthora syringae、胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides的DNA由浙江省检科院提供，提取好DNA在-80℃保存备用。

提取待测样品的DNA：用CTAB法进行柑橘黄龙病亚洲种样品DNA的提取，也可以采用商业化的DNA提取试剂盒提取待测样品的DNA。

(二)加样

使用本发明试剂盒中的试剂(表1、表2)，配制反应Buffer。具体步骤包括：取一个1.5ml的PE管，按如下操作，吸取423μL反应缓冲液加入PE管，再吸取18μL探针与引物的混合物加入423μL反应缓冲液中，充分混均；

取9个RAA基础荧光通用反应试剂管(50μL体系冻干粉)，分别加入混均后的配制反应液49μL，使冻干粉充分溶解并混均；将混均后的缓冲液49μL试剂加入到RAA基础荧光通用反应试剂管中，使冻干粉充分溶解并混均；

在9个配制好的管中分别加入1μL阴性质控品、柑橘黄龙病亚洲种CandidatusLiberibacter asiaticus(Las)、柑橘溃疡病菌Xanthomonas axonopodis pv.citri、柑橘链格孢Alternaria citri、链格孢Alternaria alternata、富氏葡萄孢盘菌Botryotiniafuckeliana、、灰葡萄孢Botrytis cinerea、丁香疫霉Phytophthora syringae、胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides的DNA各1μL为模板，每个反应管进行充分混均，每个反应管总体积为50μL。

(三)RAA反应

仪器设置为：反应温度39℃，反应时间20分钟。

检测结果如图3所示。结果显示只有柑橘黄龙病样本DNA明显有扩增，其他样本及阴性质控品均没有扩增，均为阴性。实施例3显示本发明的试剂盒特异性好，可以区分柑橘黄龙病与柑橘上常见的病害。现行标准的两种方法在实际使用中，经常出现假阳性和扩增曲线翘尾的情况，容易造成误判。而本发明检测方案的优势就是快、设备便宜、操作简单的情况下，保持较高的灵敏度和特异性。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

序列表

<110> 浙江省检验检疫科学技术研究院

江苏奇天基因生物科技有限公司

<120> 柑橘黄龙病亚洲种的RAA荧光检测方法、引物探针及试剂盒

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctagagttta ggagaggtga gtggaattcc gag 33

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtgcttaatg cgttagctgc gccactgaat g 31

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

attcggagga acaccggtgg cgaaggcggc t 31

<210> 4

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tggcctgata ctgac 15

<210> 6

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

attcggagga acaccggtgg cgaaggcggc tcactggcct gatactgac 49

<210> 5

<211> 313

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgattaagtt agaggtgaaa tcccagggct caaccttgga actgccttta atactggttg 60

tctagagttt aggagaggtg agtggaattc cgagtgtaga ggtgaaattc gtagatattc 120

ggaggaacac cggtggcgaa ggcggctcac tggcctgata ctgacgctga ggcgcgaaag 180

cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgagtgctag 240

ctgttgggtg gtttaccatt cagtggcgca gctaacgcat taagcactcc gcctggggag 300

tacggtcgca aga 313

Claims

1.一种柑橘黄龙病病菌亚洲种检测试剂，包括适用于RAA荧光法检测柑橘黄龙病病菌亚洲种的探针，所述探针的结构中包括：5’-第一序列片段-荧光报告基团-C-THF-C-淬灭基团-第二序列片段-3’，所述第一序列片段包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，第二序列片段包括如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，荧光报告基团和淬灭基团不占据碱基位置，荧光报告基团修饰在第一序列片段上离5'端碱基数31bp的T碱基上，淬灭基团修饰在第二序列片段上离3'端碱基数15bp的T碱基上。

2.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述探针设有3’端阻断，用于阻断DNA链的延伸。

3.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述荧光报告基团选自FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5中的任一种。

4.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述淬灭基团选自TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL中的任一种。

5.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述THF占据1个碱基位置，在所述探针上形成缺口。

6.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂还包括上游引物和下游引物，所述上游引物包括如SEQ ID NO.1所示的序列，所述下游引物包括如SEQ ID NO.2所示的序列。

7.如权利要求1-6任一项所述检测试剂用于制备柑橘黄龙病病菌亚洲种检测试剂盒的用途。

8.一种柑橘黄龙病病菌亚洲种检测试剂盒，包括如权利要求1-6任一项所述检测试剂。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，还包括RAA基础荧光通用反应试剂、反应缓冲液、阳性质控品、临界阳性质控、阴性质控品中的任一种或多种。

10.如权利要求8或9所述试剂盒的使用方法，包括如下步骤：(1)提取样品基因组DNA；(2)加样：将待测样品的DNA、阳性质控品或阴性质控品分别加入至装有RAA反应体系的反应管中，获得对应的待测样品反应管、阳性反应管或阴性反应管，所述RAA反应体系中含有上游引物、下游引物及探针；(3)RAA反应：反应管置于荧光检测仪器中进行实时RAA荧光法反应；(4)结果分析。