JP5503062B1 - ターゲット分析用蛍光センサ、ターゲット分析用キット、およびこれを用いたターゲットの分析方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】 新たなターゲット分析用蛍光センサ、ターゲット分析用キット、およびこれを用いたターゲットの分析方法を提供する。
【解決手段】 本発明のターゲット分析用蛍光センサは、G−カルテット構造を形成するG−カルテット形成核酸領域(D)とターゲットに結合する結合核酸領域(A)とを有する核酸分子を含み、ターゲット非存在下、前記G−カルテット形成核酸領域(D)のG−カルテット形成が阻害され、ターゲット存在下、前記結合核酸領域(A)への前記ターゲットの接触により、前記G−カルテット形成核酸領域(D)においてG−カルテット構造が形成され、前記G−カルテット形成核酸領域(D)がポルフィリンと複合体を形成することにより、前記複合体が蛍光を生じることを特徴とする。
【選択図】図1
【解決手段】 本発明のターゲット分析用蛍光センサは、G−カルテット構造を形成するG−カルテット形成核酸領域(D)とターゲットに結合する結合核酸領域(A)とを有する核酸分子を含み、ターゲット非存在下、前記G−カルテット形成核酸領域(D)のG−カルテット形成が阻害され、ターゲット存在下、前記結合核酸領域(A)への前記ターゲットの接触により、前記G−カルテット形成核酸領域(D)においてG−カルテット構造が形成され、前記G−カルテット形成核酸領域(D)がポルフィリンと複合体を形成することにより、前記複合体が蛍光を生じることを特徴とする。
【選択図】図1
Description
本発明は、ターゲット分析用蛍光センサ、ターゲット分析用キット、およびこれを用いたターゲット分析方法に関する。
臨床医療、食品、環境等の様々な分野において、ターゲットの検出が必要とされている。前記ターゲットの検出は、一般的に、前記ターゲットとの相互作用を利用する方法として、前記ターゲットに特異的に結合する抗体を用いた手法が汎用されている。そして、近年、前記抗体に代えて、新たに、前記ターゲットに特異的な核酸分子(いわゆるアプタマー)を使用する方法が開発されている。
前記アプタマーを使用する方法としては、例えば、アプタマーとDNAzymeとを連結したセンサが報告されている。DNAzymeとは、G−カルテット構造をとることで、ペルオキシダーゼ等と同様の酸化還元反応の触媒活性を生起するDNA分子である。このセンサによれば、まず、前記アプタマーにターゲットを結合させ、前記ターゲットが結合したセンサにおける前記DNAzymeの触媒活性を測定することで、間接的に、ターゲットを検出できる(非特許文献1)。
また、G−カルテット構造を形成したDNAzymeは、ポルフィリンとの複合体を形成することで、蛍光を発することが報告されている(非特許文献2および非特許文献3)。そこで、新たに、アプタマーとDNAzymeとを連結したセンサにおいて、DNAzymeの酸化還元反応の触媒活性ではなく、前記複合体形成による蛍光を測定することで、ターゲットを検出する方法も報告されている。しかしながら、実用面において、より適した新たな構造の蛍光センサの提供が望まれている。
Tellerら、 Anal.Chem., 2009年、vol.81、p.9114−9119
Jiangtao Renら、Anal. Bioanal. Chem. 2011年、399、p.2763-2770
Seung Soo Ohら、PNAS、2010年、vol.107、32、p.14053-14058
そこで、本発明は、新たなターゲット分析用蛍光センサ、ターゲット分析用キット、およびこれを用いたターゲットの分析方法を提供することを目的とする。
本発明のターゲット分析用蛍光センサは、G−カルテット構造を形成するG−カルテット形成領域(D)とターゲットに結合する結合領域(A)とを有する下記(I)、(II)、(III)、(IV)および(V)からなる群から選択された少なくとも一つの核酸分子を含み、
ターゲット非存在下、前記G−カルテット形成領域(D)のG−カルテット形成が阻害され、
ターゲット存在下、前記結合領域(A)への前記ターゲットの接触により、前記G−カルテット形成領域(D)においてG−カルテット構造が形成され、前記G−カルテット形成領域(D)がポルフィリンと複合体を形成することにより、前記複合体が蛍光を生じることを特徴とする。
(I)前記G−カルテット形成領域(D)、ブロッキング領域(B)、および前記結合領域(A)をこの順序で有し、
前記ブロッキング領域(B)が、前記G−カルテット形成領域(D)における部分領域(Dp)に対して相補的であり、
前記結合領域(A)における前記ブロッキング領域(B)側の末端領域(Ab)が、前記G−カルテット形成領域(D)における前記部分領域(Dp)の隣接領域(Df)に相補的であり、且つ、前記結合領域(A)における前記ブロッキング領域(B)側とは反対側の末端領域(Af)に相補的である一本鎖核酸分子。
(II)前記G−カルテット形成領域(D)、ブロッキング領域(B)、前記結合領域(A)、および安定化領域(S)をこの順序で有し、
前記ブロッキング領域(B)が、前記G−カルテット形成領域(D)の部分領域(Dp)に対して相補的であり、
前記ブロッキング領域(B)の前結合領域(A)側の末端領域(Ba)が、前記安定化領域(S)に対して相補的である一本鎖核酸分子。
(III)前記G−カルテット形成領域(D)、ステム形成領域(SD)、前記結合領域(A)およびステム形成領域(SA)を有し、
前記ステム形成領域(SD)は、前記G−カルテット形成領域(D)に対して相補的な配列を有し、
前記ステム形成領域(SA)は、前記結合領域(A)に対して相補的な配列を有する一本鎖核酸分子。
(IV)前記G−カルテット形成領域(D)および前記結合領域(A)を有し、
前記G−カルテット形成領域(D)が、第1領域(D1)と第2領域(D2)とを含み、前記第1領域(D1)と前記第2領域(D2)とによりG−カルテットを形成する領域であり、
前記結合領域(A)の一方の末端側に前記第1領域(D1)を有し、前記結合領域(A)の他方の末端側に前記第2領域(D2)を有する一本鎖核酸分子。
(V)第1鎖(ss1)と第2鎖(ss2)とから構成される二本鎖核酸分子であり、
前記第1鎖(ss1)は、前記G−カルテット形成領域(D)と前記結合領域(A)とを有し、
前記第2鎖(ss2)は、ステム形成領域(SD)およびステム形成領域(SA)を有し、前記ステム形成領域(SD)は、前記G−カルテット形成領域(D)に対して相補的な配列を有し、前記ステム形成領域(SA)は、前記結合領域(A)に対して相補的な配列を有する二本鎖核酸分子。
ターゲット非存在下、前記G−カルテット形成領域(D)のG−カルテット形成が阻害され、
ターゲット存在下、前記結合領域(A)への前記ターゲットの接触により、前記G−カルテット形成領域(D)においてG−カルテット構造が形成され、前記G−カルテット形成領域(D)がポルフィリンと複合体を形成することにより、前記複合体が蛍光を生じることを特徴とする。
(I)前記G−カルテット形成領域(D)、ブロッキング領域(B)、および前記結合領域(A)をこの順序で有し、
前記ブロッキング領域(B)が、前記G−カルテット形成領域(D)における部分領域(Dp)に対して相補的であり、
前記結合領域(A)における前記ブロッキング領域(B)側の末端領域(Ab)が、前記G−カルテット形成領域(D)における前記部分領域(Dp)の隣接領域(Df)に相補的であり、且つ、前記結合領域(A)における前記ブロッキング領域(B)側とは反対側の末端領域(Af)に相補的である一本鎖核酸分子。
(II)前記G−カルテット形成領域(D)、ブロッキング領域(B)、前記結合領域(A)、および安定化領域(S)をこの順序で有し、
前記ブロッキング領域(B)が、前記G−カルテット形成領域(D)の部分領域(Dp)に対して相補的であり、
前記ブロッキング領域(B)の前結合領域(A)側の末端領域(Ba)が、前記安定化領域(S)に対して相補的である一本鎖核酸分子。
(III)前記G−カルテット形成領域(D)、ステム形成領域(SD)、前記結合領域(A)およびステム形成領域(SA)を有し、
前記ステム形成領域(SD)は、前記G−カルテット形成領域(D)に対して相補的な配列を有し、
前記ステム形成領域(SA)は、前記結合領域(A)に対して相補的な配列を有する一本鎖核酸分子。
(IV)前記G−カルテット形成領域(D)および前記結合領域(A)を有し、
前記G−カルテット形成領域(D)が、第1領域(D1)と第2領域(D2)とを含み、前記第1領域(D1)と前記第2領域(D2)とによりG−カルテットを形成する領域であり、
前記結合領域(A)の一方の末端側に前記第1領域(D1)を有し、前記結合領域(A)の他方の末端側に前記第2領域(D2)を有する一本鎖核酸分子。
(V)第1鎖(ss1)と第2鎖(ss2)とから構成される二本鎖核酸分子であり、
前記第1鎖(ss1)は、前記G−カルテット形成領域(D)と前記結合領域(A)とを有し、
前記第2鎖(ss2)は、ステム形成領域(SD)およびステム形成領域(SA)を有し、前記ステム形成領域(SD)は、前記G−カルテット形成領域(D)に対して相補的な配列を有し、前記ステム形成領域(SA)は、前記結合領域(A)に対して相補的な配列を有する二本鎖核酸分子。
本発明のターゲット分析用キットは、センサと試薬とを含み、前記センサが、前記本発明のターゲット分析用蛍光センサであり、前記試薬が、ポルフィリンを含むことを特徴とする。
本発明のターゲット分析方法は、前記本発明のターゲット分析用蛍光センサに試料を接触させる接触工程、および、
ポルフィリン存在下、前記センサにおける前記G−カルテット形成領域(D)とポルフィリンとの複合体による蛍光を検出することによって、前記試料中のターゲットを検出する検出工程を含むことを特徴とする。
ポルフィリン存在下、前記センサにおける前記G−カルテット形成領域(D)とポルフィリンとの複合体による蛍光を検出することによって、前記試料中のターゲットを検出する検出工程を含むことを特徴とする。
本発明のターゲット分析用蛍光センサによれば、簡便且つ効率的に、蛍光の発生により間接的にターゲットを分析できる。このため、本発明は、例えば、臨床医療、食品、環境等の様々な分野における研究および検査に、極めて有用な技術といえる。
1.ターゲット分析用蛍光センサ
本発明のターゲット分析用センサは、前述のように、G−カルテット構造を形成するG−カルテット形成領域(D)とターゲットに結合する結合領域(A)とを有する前記(I)、(II)、(III)、(IV)および(V)からなる群から選択された少なくとも一つの核酸分子を含み、
ターゲット非存在下、前記G−カルテット形成領域(D)のG−カルテット構造の形成が阻害され、
ターゲット存在下、前記結合領域(A)への前記ターゲットの接触により、前記G−カルテット形成領域(D)においてG−カルテット構造が形成され、前記G−カルテット形成領域(D)がポルフィリンと複合体を形成することにより、前記複合体が蛍光を生じることを特徴とする。
本発明のターゲット分析用センサは、前述のように、G−カルテット構造を形成するG−カルテット形成領域(D)とターゲットに結合する結合領域(A)とを有する前記(I)、(II)、(III)、(IV)および(V)からなる群から選択された少なくとも一つの核酸分子を含み、
ターゲット非存在下、前記G−カルテット形成領域(D)のG−カルテット構造の形成が阻害され、
ターゲット存在下、前記結合領域(A)への前記ターゲットの接触により、前記G−カルテット形成領域(D)においてG−カルテット構造が形成され、前記G−カルテット形成領域(D)がポルフィリンと複合体を形成することにより、前記複合体が蛍光を生じることを特徴とする。
以下、本発明のターゲット分析用センサをセンサ、領域を核酸領域ともいう。本発明における前記一本鎖核酸分子は、例えば、一本鎖核酸素子ということもできる。また、前記G−カルテット形成領域(D)について、G−カルテット構造の形成が阻害されることを、スイッチ−OFF(またはturn−OFF)、G−カルテット構造が形成されることを、スイッチ−ON(またはturn−ON)ともいう。
前記G−カルテット(G−tetradともいう)は、一般に、G(グアニン)が四量体となった面の構造として知られている。本発明において、前記G−カルテット形成領域(D)は、複数の塩基Gを有し、その領域内で、複数の塩基GによるG−カルテット構造を形成する領域である。本発明において、前記G−カルテット構造は、例えば、パラレル型およびアンチパラレル型のいずれでもよく、好ましくは、パラレル型である。本発明のセンサにおいて、前記G−カルテット形成領域(D)において形成されるG−カルテット構造の個数は、特に制限されず、例えば、1面でも、2面以上の複数でもよいが、前記G−カルテット形成領域(D)は、G−カルテットが複数面重なった、グアニン四重鎖(またはG−quadruplexという)構造を形成することが好ましい。本発明において、前記G−カルテット形成領域(D)の配列は、前記G−カルテット構造を形成する配列であればよく、より好ましくは、グアニン四重鎖構造を形成する配列である。
ポルフィリン存在下でG−カルテット構造を形成した領域は、ポルフィリンとの複合体形成により、蛍光を発する。他方、本発明のセンサは、ターゲットの非存在下では、前記G−カルテット形成領域(D)が、G−カルテット構造の形成を阻害されており、ターゲット存在下で、前記結合領域(A)にターゲットが接触することで、前記G−カルテット形成領域(D)のG−カルテット構造の形成阻害が解除され、前記G−カルテット形成領域(D)がG−カルテット構造を形成する。このため、本発明のセンサによれば、ターゲット非存在下では、前記G−カルテット形成領域(D)がG−カルテット構造を形成できないため、ポルフィリンとの複合体形成による蛍光は発することなく、ターゲット存在下で、はじめて前記G−カルテット形成領域(D)がG−カルテット構造を形成し、ポルフィリンとの複合体形成による蛍光が生じる。このため、例えば、試料におけるターゲットの存在の有無またはターゲット量を、G−カルテット形成領域(D)とポルフィリンとの複合体形成による蛍光によって、分析できる。
前記G−カルテット構造を形成する核酸分子としては、例えば、酵素の触媒機能を生じる核酸分子(触媒核酸分子)が知られている。前記触媒機能は、特に制限されず、例えば、酸化還元反応の触媒機能である。前記酸化還元反応は、例えば、基質から生成物が生成される過程において、二つの基質の間に電子の授受を生じる反応である。前記酸化還元反応の種類は、特に制限されない。前記酸化還元反応の触媒機能は、例えば、酵素と同様の活性があげられ、具体的には、例えば、ペルオキシダーゼと同様の活性(以下、「ペルオキシダーゼ様活性」という)等があげられる。前記ペルオキシダーゼ活性は、例えば、西洋わさび由来ペルオキシダーゼ(HRP)活性があげられる。前記触媒核酸分子は、一般に、DNA配列の場合、DNAエンザイムまたはDNAzymeと呼ばれ、RNA配列の場合、RNAエンザイムまたはRNAzymeと呼ばれる。本発明において、前記G−カルテット形成領域(D)は、例えば、このような前記触媒核酸分子を使用できる。なお、本発明において、前記G−カルテット形成領域(D)は、G−カルテット構造を形成できればよく、前記触媒機能の有無は制限されない。
前記DNAzymeとしては、例えば、下記論文(1)〜(4)等の核酸分子が例示できる。
(1)Travascioら, Chem. Biol., 1998年, vol.5, p.505-517
(2)Chengら, Biochimistry, 2009年, vol.48, p.7817-7823
(3)Tellerら, Anal. Chem., 2009年, vol.81, p.9114-9119
(4)Taoら, Anal. Chem., 2009年, vol.81, p.2144-2149
(1)Travascioら, Chem. Biol., 1998年, vol.5, p.505-517
(2)Chengら, Biochimistry, 2009年, vol.48, p.7817-7823
(3)Tellerら, Anal. Chem., 2009年, vol.81, p.9114-9119
(4)Taoら, Anal. Chem., 2009年, vol.81, p.2144-2149
前記G−カルテット形成領域(D)は、例えば、一本鎖型でもよいし、二本鎖型でもよい。前記一本鎖型は、例えば、一本鎖のG−カルテット形成領域(D)内で、G−カルテット構造を形成でき、前記二本鎖型は、例えば、第1領域(D1)と第2領域(D2)とからなり、前記第1領域(D1)と前記第2領域(D2)との間で、G−カルテット構造を形成できる。後者の二本鎖型は、例えば、前記第1領域と、前記第2領域とが、間接的に連結された構造があげられ、具体的には、後述する核酸分子(IV)において説明する。
前記一本鎖型のG−カルテット形成領域(D)の長さは、特に制限されず、下限は、例えば、11塩基長、好ましくは13塩基長、より好ましくは15塩基長であり、上限は、例えば、60塩基長、好ましくは36塩基長、より好ましくは18塩基長である。
前記二本鎖型のG−カルテット形成領域(D)において、前記第1領域(D1)および前記第2領域(D2)の長さは、特に制限されず、両者は同じであっても異なってもよい。前記第1領域(D1)の長さは、特に制限されず、下限は、例えば、7塩基長、好ましくは8塩基長、より好ましくは10塩基長であり、上限は、例えば、30塩基長、好ましくは20塩基長、より好ましくは10塩基長、その範囲は、例えば、7〜30塩基長、好ましくは7〜20塩基長、より好ましくは7〜10塩基長である。前記第2領域(D2)の長さは、特に制限されず、下限は、例えば、7塩基長、好ましくは8塩基長、より好ましくは10塩基長であり、上限は、例えば、30塩基長、好ましくは20塩基長、より好ましくは10塩基長、その範囲は、例えば、7〜30塩基長、好ましくは7〜20塩基長、より好ましくは7〜10塩基長である。
本発明のセンサにおいて、ターゲットは、特に制限されず、任意のターゲットが選択できる。そして、前記任意のターゲットに応じて、前記ターゲットに結合する結合核酸分子を、前記結合領域(A)として使用すればよい。
前記ターゲットは、特に制限されず、例えば、低分子化合物、微生物、ウイルス、食物アレルゲン、農薬、カビ毒、抗体等が例示できる。前記低分子化合物は、例えば、メラミン、抗生物質、農薬、環境ホルモン等があげられる。前記微生物は、例えば、サルモネラ菌、リステリア菌、大腸菌、カビ等があげられ、前記ウイルスは、例えば、ノロウイルス等があげられる。
前記結合領域(A)の長さは、特に制限されず、下限は、例えば、12塩基長、好ましくは15塩基長、より好ましくは18塩基長であり、上限は、例えば、140塩基長、好ましくは80塩基長、より好ましくは60塩基長であり、その範囲は、例えば、12〜140塩基長であり、好ましくは15〜80塩基長であり、より好ましくは18〜60塩基長である。
本発明において、ある配列に対して他の配列が相補的であるとは、例えば、両者間でアニーリングが生じ得る配列であることを意味する。前記アニーリングを、ステム形成ともいう。本発明において、相補的とは、例えば、2種類の配列をアラインメントした際の相補性が、例えば、90%以上であること、好ましくは95%以上、96%以上、97%以上、98%以上であり、より好ましくは99%以上であり、特に好ましくは100%、すなわち完全相補である。また、核酸分子内において、ある配列に対して他の配列が相補的であるとは、一方の5’側から3’側に向かう配列と、他方の3’側から5’側に向かう配列とを対比させた際に、互いの塩基が相補的であることを意味する。
本発明のセンサにおける前記核酸分子について、前記(I)、(II)、(III)、(IV)および(V)のそれぞれを、以下に説明する。なお、特に示さない限り、各核酸分子の記載を、それぞれ援用できる。
(1)核酸分子(I)
前記核酸分子(I)は、前記G−カルテット形成領域(D)、ブロッキング領域(B)、および前記結合領域(A)をこの順序で有し、
前記ブロッキング領域(B)が、前記G−カルテット形成領域(D)における部分領域(Dp)に対して相補的であり、
前記結合領域(A)における前記ブロッキング領域(B)側の末端領域(Ab)が、前記G−カルテット形成領域(D)における前記部分領域(Dp)の隣接領域(Df)に相補的であり、且つ、前記結合領域(A)における前記ブロッキング領域(B)側とは反対側の末端領域(Af)に相補的な一本鎖核酸分子である。
前記核酸分子(I)は、前記G−カルテット形成領域(D)、ブロッキング領域(B)、および前記結合領域(A)をこの順序で有し、
前記ブロッキング領域(B)が、前記G−カルテット形成領域(D)における部分領域(Dp)に対して相補的であり、
前記結合領域(A)における前記ブロッキング領域(B)側の末端領域(Ab)が、前記G−カルテット形成領域(D)における前記部分領域(Dp)の隣接領域(Df)に相補的であり、且つ、前記結合領域(A)における前記ブロッキング領域(B)側とは反対側の末端領域(Af)に相補的な一本鎖核酸分子である。
前記核酸分子(I)において、前記G−カルテット形成領域(D)は、例えば、前記一本鎖型である。
前記核酸分子(I)は、例えば、以下のようなメカニズムに基づいて、ターゲットの存否により、前記G−カルテット形成領域(D)のG−カルテット形成が、ON−OFFに制御される。なお、本発明は、このメカニズムには制限されない。一般的に、核酸配列は、形成し得る構造の間で熱力学的に揺らいでおり、相対的に安定性の高いものの存在比率が高くなると考えられている。そして、アプタマー等の結合核酸分子は、一般的に、ターゲット存在下では、ターゲットとの接触によって、より安定な立体構造に変化して、前記ターゲットに結合することが知られている。また、DNAzyme等の核酸分子も、一般的に、G−カルテット構造のような安定な立体構造によって、触媒活性を生起することが知られている。
前記核酸分子(I)において、前記G−カルテット形成領域(D)の部分領域(Dp)が、前記ブロッキング領域(B)と相補的であり、且つ、前記G−カルテット形成領域(D)における隣接領域(Df)が、前記結合領域(A)の前記末端領域(Ab)と相補的であるため、これらの相補関係において、ステム形成が可能である。このため、ターゲットの非存在下では、前記G−カルテット形成領域(D)の部分領域(Dp)と前記ブロッキング領域(B)とのステム形成および前記G−カルテット形成領域(D)の隣接領域(Df)と前記結合領域(A)の前記末端領域(Ab)とのステム形成が生じる。前者のステム形成により、前記G−カルテット形成領域(D)のG−カルテット構造の形成が阻害され、結果として、前記G−カルテット形成領域(D)とポルフィリンとの複合体形成が阻害され(スイッチ−OFF)、後者のステム形成により、前記結合領域(A)において、前記より安定な立体構造の形成がブロックされ、ターゲットと結合していない状態のブロッキング型構造が維持される。この状態の前記分子の構造を、ブロッキング型または不活性型ともいう。一方、ターゲットの存在下では、前記結合領域(A)への前記ターゲットの接触により、前記結合領域(A)がより安定な立体構造に変化する。これに伴い、前記結合領域(A)におけるステム形成が解除され、分子内アニーリングによって前記より安定な立体構造に変化した前記結合領域(A)に、前記ターゲットが結合する。そして、前記結合領域(A)におけるステム形成の解除に伴う前記結合領域(A)の前記立体構造化により、前記G−カルテット形成領域(D)のステム形成も解除され、前記G−カルテット形成領域(D)が分子内アニーリングによってより安定な立体構造に変化し、結果的に、前記G−カルテット形成領域(D)の領域内でG−カルテット構造が形成され、結果として、前記G−カルテット形成領域(D)とポルフィリンとの複合体が形成され、蛍光を発する(スイッチON)。この状態の構造を、活性型ともいう。このため、本発明のセンサによれば、ターゲット非存在下では、前記複合体形成による蛍光が発生せず、ターゲット存在下でのみ、前記複合体形成による蛍光が発生するため、定性または定量等のターゲット分析が可能となる。
前記核酸分子(I)は、さらに、安定化領域(S)を有してもよく、この場合、前記G−カルテット形成領域(D)、前記ブロッキング領域(B)、前記結合領域(A)、および前記安定化領域(S)が、この順序で連結されていることが好ましい。以下、前記核酸分子(I)として、前記安定化領域(S)を有する一本鎖核酸分子の形態を示す場合、前記安定化領域(S)は、任意であり、含まない形態でもよい。
前記安定化領域(S)は、例えば、前記結合領域(A)がターゲットと結合する際の構造を安定化するための配列である。前記安定化領域(S)は、例えば、前記ブロッキング領域(B)に相補的またはその一部に相補的であり、具体的には、前記ブロッキング領域(B)における前記結合領域(A)側の末端領域(Ba)に相補的であることが好ましい。この場合、例えば、ターゲット存在下、分子内アニーリングによる前記結合領域(A)の立体構造が形成された際、前記結合領域(A)に連結する前記安定化領域(S)と、前記結合領域(A)に連結する前記ブロッキング領域(B)の末端領域(Ba)との間でも、ステムが形成される。前記結合領域(A)に連結する領域において、このようなステムが形成されることによって、ターゲットと結合する前記結合領域(A)の立体構造が、より安定化される。
前記核酸分子(I)において、前記G−カルテット形成領域(D)、前記ブロッキング領域(B)、および前記結合領域(A)、ならびに任意の前記安定化領域(S)の順序は、特に制限されず、例えば、5’側からこの順序で連結してもよいし、3’側からこの順序で連結してもよく、好ましくは前者である。図1に、前記核酸分子(I)の一例として、5’側から前記各領域が連結している状態の一本鎖核酸分子(I)の模式図を示す。図1において、(A)が、各配列の順序を示した模式図であり、(B)が、ターゲット非存在下におけるブロッキング型の模式図であり、(C)は、ターゲット存在下における活性型の模式図である。図1において、Dは、前記G−カルテット形成領域(D)の構成単位(ヌクレオチド)、Bは、前記ブロッキング領域(B)の構成単位、Aは、前記結合領域(A)の構成単位、Sは、前記安定化領域(S)の構成単位を、それぞれ示し、各構成単位間の線は、結合を示す。なお、図1は、各領域を模式的に示したものであり、各領域の構成単位の数(配列の長さ)は、何ら制限されず、また、前記安定化領域(S)は、任意である(以下、同様)。
図1(A)に示すように、前記核酸分子(I)の一例は、前記G−カルテット形成領域(D)、前記ブロッキング領域(B)、前記結合領域(A)、および任意で前記安定化領域(S)を、この順序で有する。前記核酸分子(I)は、例えば、図1(B)に示すように、ターゲット非存在下では、前記G−カルテット形成領域(D)の一部が、前記ブロッキング領域(B)および前記結合領域(A)の一部と結合して、ステムを形成し、ブロッキング型の一本鎖核酸分子となる。他方、前記核酸分子(I)は、例えば、図1(C)に示すように、ターゲットの存在下では、前記結合領域(A)への前記ターゲットの接触により、前記結合領域(A)は、その分子内アニーリングにより立体構造を形成し、それに伴い、前記G−カルテット形成領域(D)におけるステム形成も解除され、前記G−カルテット形成領域(D)は、その分子内アニーリングにより、G−カルテット構造を形成する。また、図1(C)に示すように、例えば、前記ブロッキング領域(B)と前記安定化領域(S)とが結合することによって、前記結合領域(A)の立体構造が、より安定化される。
前記核酸分子(I)において、前記G−カルテット形成領域(D)、前記ブロッキング領域(B)、および前記結合領域(A)、ならびに任意で前記安定化領域(S)は、例えば、それぞれの間が、スペーサー配列が介在することにより間接的に連結してもよいが、前記スペーサー配列が介在することなく直接的に連結していることが好ましい。
前記G−カルテット形成領域(D)は、前述のように、前記ブロッキング領域(B)に相補的な配列を有し、且つ、前記結合領域(A)の一部にも相補的な配列を有する。また、前記ブロッキング領域(B)は、前述のように、前記G−カルテット形成領域(D)の一部と相補的であり、また、前記安定化領域(S)を有する場合は、前記安定化領域(S)にも相補的である。
前記ブロッキング領域(B)の配列および長さは、特に制限されず、例えば、前記G−カルテット形成領域(D)の配列および長さ等に応じて、適宜設定できる。
前記ブロッキング領域(B)の長さは、特に制限されず、下限は、例えば、1塩基長であり、好ましくは2塩基長であり、より好ましくは3塩基長であり、上限は、例えば、20塩基長であり、好ましくは15塩基長であり、より好ましくは10塩基長であり、その範囲は、例えば、1〜20塩基長であり、好ましくは2〜15塩基長であり、より好ましくは3〜10塩基長である。
これに対して、前記G−カルテット形成領域(D)の前記部分領域(Dp)の長さは、例えば、下限は、例えば、1塩基長であり、好ましくは2塩基長であり、より好ましくは3塩基長であり、上限は、例えば、20塩基長であり、好ましくは15塩基長であり、より好ましくは10塩基長であり、その範囲は、例えば、1〜20塩基長であり、好ましくは2〜15塩基長であり、より好ましくは3〜10塩基長である。前記ブロッキング領域(B)の長さと前記G−カルテット形成領域(D)の前記部分領域(Dp)の長さは、例えば、同じであることが好ましい。
前記核酸分子(I)において、前記G−カルテット形成領域(D)における前記部分領域(Dp)の位置、すなわち、前記G−カルテット形成領域(D)における前記ブロッキング領域(B)のアニール領域は、特に制限されない。前記G−カルテット形成領域(D)、前記ブロッキング領域(B)、および前記結合領域(A)、ならびに任意で前記安定化領域(S)が、この順序で連結している場合、前記部分領域(Dp)は、例えば、以下の条件で設定できる。
前記G−カルテット形成領域(D)における前記部分領域(Dp)の隣接領域であって、前記部分領域(Dp)のブロッキング領域(B)側末端と前記ブロッキング領域(B)における前記G−カルテット形成領域(D)側末端との間の領域(Db)の長さは、下限が、例えば、3塩基長であり、好ましくは4塩基長であり、より好ましくは5塩基長であり、上限が、例えば、40塩基長であり、好ましくは30塩基長であり、より好ましくは20塩基長であり、その範囲が、例えば、3〜40塩基長であり、好ましくは4〜30塩基長であり、より好ましくは5〜20塩基長である。
前記G−カルテット形成領域(D)における前記部分領域(Dp)の隣接領域であって、前記ブロッキング領域(B)側とは反対側の領域(Df)の長さは、下限が、例えば、0塩基長であり、好ましくは1塩基長であり、より好ましくは2塩基長であり、上限は、例えば、40塩基長であり、好ましくは30塩基長であり、より好ましくは20塩基長であり、その範囲は、例えば、0〜40塩基長であり、好ましくは1〜30塩基長であり、より好ましくは2〜20塩基長である。
前記結合領域(A)における前記ブロッキング領域(B)側の末端領域(Ab)は、前述のように、前記G−カルテット形成領域(D)の隣接領域(Df)に相補的である。ここで、前記結合領域(A)の末端領域(Ab)は、前記G−カルテット形成領域(D)の隣接領域(Df)の全領域に対して相補的でもよいし、前記隣接領域(Df)の部分領域に対して相補的でもよい。後者の場合、前記結合領域(A)の末端領域(Ab)は、前記隣接領域(Df)における、前記G−カルテット形成領域(D)の部分領域(Dp)側の末端領域に対して相補的であることが好ましい。
前記G−カルテット形成領域(D)の隣接領域(Df)に相補的な、前記結合領域(A)における末端領域(Ab)の長さは、特に制限されず、下限は、例えば、1塩基長であり、上限は、例えば、20塩基長であり、好ましくは8塩基長であり、より好ましくは3塩基長であり、その範囲は、例えば、1〜20塩基長であり、好ましくは1〜8塩基長であり、より好ましくは1〜3塩基長である。
前記安定化領域(S)は、前述のように、例えば、ブロッキング領域(B)に相補的またはその一部に相補的であり、具体的には、前記ブロッキング領域(B)における前記結合領域(A)側の末端領域(Ba)に相補的であることが好ましい。
前記安定化領域(S)の配列および長さは、特に制限されず、例えば、前記ブロッキング領域(B)の配列および長さ、前記結合領域(A)の配列および長さ等に応じて適宜決定できる。前記安定化領域(S)の長さは、下限が、例えば、0塩基長であり、好ましくは1塩基長であり、上限が、例えば、10塩基長であり、好ましくは5塩基長であり、より好ましくは3塩基長であり、その範囲は、例えば、0〜10塩基長であり、好ましくは1〜5塩基長であり、より好ましくは1〜3塩基長である。これに対して、例えば、前記安定化領域(S)が前記ブロッキング領域(B)の全体と相補的な場合、前記ブロッキング領域(B)は、前記安定化領域(S)と同じ長さであり、例えば、前記安定化領域(S)が前記ブロッキング領域(B)の一部と相補的な場合、前記ブロッキング領域(B)の一部、例えば、前記末端領域(Ba)は、前記安定化領域(S)と同じ長さである。
前記核酸分子(I)の全長の長さは、特に制限されず、下限は、例えば、25塩基長であり、好ましくは35塩基長であり、より好ましくは40塩基長であり、上限は、例えば、200塩基長であり、好ましくは120塩基長であり、より好ましくは80塩基長であり、その範囲は、例えば、25〜200塩基長であり、好ましくは35〜120塩基長であり、より好ましくは40〜80塩基長である。
前記核酸分子(I)は、例えば、一方の末端または両端に、さらにリンカー領域が付加されてもよい。前記末端に付加されたリンカー領域を、以下、付加リンカー領域ともいう。前記付加リンカー領域の長さは、特に制限されず、例えば、1〜60塩基長である。
(2)核酸分子(II)
前記核酸分子(II)は、前記G−カルテット形成領域(D)、ブロッキング領域(B)、前記結合領域(A)、および安定化領域(S)をこの順序で有し、前記ブロッキング領域(B)が、前記G−カルテット形成領域(D)の部分領域(Dp)に対して相補的であり、前記ブロッキング領域(B)の前結合領域(A)側の末端領域(Ba)が、前記安定化領域(S)に対して相補的な一本鎖核酸分子である。
前記核酸分子(II)は、前記G−カルテット形成領域(D)、ブロッキング領域(B)、前記結合領域(A)、および安定化領域(S)をこの順序で有し、前記ブロッキング領域(B)が、前記G−カルテット形成領域(D)の部分領域(Dp)に対して相補的であり、前記ブロッキング領域(B)の前結合領域(A)側の末端領域(Ba)が、前記安定化領域(S)に対して相補的な一本鎖核酸分子である。
前記核酸分子(II)において、前記G−カルテット形成領域(D)は、例えば、前記一本鎖型である。
前記核酸分子(II)において、前記結合領域(A)は、それ単独では、ターゲットとの結合に必要な分子内アニーリングが形成されない配列であることが好ましい。そして、前記核酸分子(II)は、ターゲット存在下、前記結合領域(A)に隣接する前記ブロッキング領域(B)の末端領域(Ba)と前記安定化領域(S)とのアニーリングによって、前記結合領域(A)と前記末端領域(Ba)と前記安定化領域(S)との全体から、前記立体構造が形成されることが好ましい。
前記核酸分子(II)は、例えば、以下のようなメカニズムに基づいて、ターゲットの存否により、前記G−カルテット形成領域(D)のG−カルテット形成が、ON−OFFに制御される。なお、本発明は、このメカニズムには制限されない。
前記一本鎖核酸(II)において、前記G−カルテット形成領域(D)の部分領域(Dp)が、前記ブロッキング領域(B)と相補的であるため、この相補関係において、ステム形成が可能である。このため、ターゲットの非存在下では、前記G−カルテット形成領域(D)の部分領域(Dp)と前記ブロッキング領域(B)とのステム形成が生じる。このステム形成により、前記G−カルテット形成領域(D)のG−カルテット構造の形成が阻害され、結果として、前記G−カルテット形成領域(D)とポルフィリンとの複合体形成が阻害され(スイッチOFF)る。また、前記結合領域(A)は、それ単独ではターゲットとの結合に必要な分子内アニーリングが形成されない配列であるため、ターゲットと結合するための、より安定な前記立体構造の形成がブロックされ、ターゲットと結合していない状態が維持される。つまり、ターゲット非存在下において、前記核酸分子(II)は、ブロッキング型構造が維持される。の状態の前記分子の構造を、ブロッキング型または不活性型ともいう。一方、ターゲットの存在下では、前記結合領域(A)への前記ターゲットの接触により、前記結合領域(A)がより安定な立体構造に変化する。これに伴い、前記ブロッキング領域(B)の末端領域(Ba)と前記G−カルテット形成領域(D)の部分領域(Dp)とのステム形成が解除され、新たに、前記ブロッキング領域(B)の末端領域(Ba)と前記安定化領域(S)とのアニーリングにより、ステムが形成され、このステムが、前記結合領域(A)がターゲットに結合するために必要な分子内アニーリングの役目を担い、前記ステムと前記結合領域(A)との全体から、前記立体構造が形成され、前記結合領域(A)に前記ターゲットが結合する。そして、前記ブロッキング領域(B)と前記G−カルテット形成領域(D)とのステム形成の解除により、新たに前記G−カルテット形成領域(D)が分子内アニーリングによってG−カルテット構造を形成し、結果として、前記G−カルテット形成領域(D)とポルフィリンとの複合体が形成され、蛍光を発する(スイッチON)。この状態の構造を、活性型ともいう。このため、本発明のセンサによれば、ターゲット非存在下では、前記複合体形成による蛍光が発生せず、ターゲット存在下でのみ、前記複合体形成による蛍光が発生するため、定性または定量等のターゲット分析が可能となる。
前記核酸分子(II)において、前記G−カルテット形成領域(D)、前記ブロッキング領域(B)、前記結合領域(A)、および前記安定化領域(S)の順序は、特に制限されず、例えば、5’側からこの順序で連結してもよいし、3’側からこの順序で連結してもよく、好ましくは前者である。図2に、前記核酸分子(II)の一例として、5’側から前記各領域が連結している状態の一本鎖核酸分子(II)の模式図を示す。図2において、(A)が、各領域の順序を示した模式図であり、(B)が、ターゲット非存在下におけるブロッキング型の模式図であり、(C)は、ターゲット存在下における活性型の模式図である。図2において、Dは、前記G−カルテット形成領域(D)の構成単位(ヌクレオチド)、Bは、前記ブロッキング領域(B)の構成単位、Aは、前記結合領域(A)の構成単位、Sは、前記安定化領域(S)の構成単位を、それぞれ示し、各構成単位間の線は、結合を示す。なお、図2は、各領域を模式的に示したものであり、各領域の構成単位の数(配列の長さ)は、何ら制限されない(以下、同様)。
図2(A)に示すように、前記核酸分子(II)の一例は、前記G−カルテット形成領域(D)、前記ブロッキング領域(B)、前記結合領域(A)、および前記安定化領域(S)を、この順序で有する。前記核酸分子(II)は、例えば、図2(B)に示すように、ターゲット非存在下では、前記G−カルテット形成領域(D)の一部が、前記ブロッキング領域(B)と結合して、ステムを形成し、ブロッキング型の一本鎖核酸となる。この際、前記結合領域(A)は、前記立体構造を形成していない。他方、前記核酸分子(II)は、例えば、図2(C)に示すように、ターゲットの存在下では、前記結合領域(A)への前記ターゲットの接触により、前記ブロッキング領域(B)と前記G−カルテット形成領域(D)とのステム形成が解除され、新たに、前記ブロッキング領域(B)と前記安定化領域(S)との間でステムが形成され、前記結合領域(A)と前記ブロッキング領域(B)と前記安定化領域(S)とから、立体構造が形成される。そして、例えば、前記ブロッキング領域(B)と前記G−カルテット形成領域(D)とのステム形成の解除に伴い、前記G−カルテット形成領域(D)は、その分子内アニーリングにより、G−カルテット構造を形成する。また、図2(C)に示すように、例えば、前記ブロッキング領域(B)と前記安定化領域(S)との結合によって、前記結合領域(A)と前記ブロッキング領域(B)と前記安定化領域(S)とから形成された立体構造が、より安定化される。
前記核酸分子(II)において、特に示さない限り、前記核酸分子(I)の記載を援用できる。前記核酸分子(II)において、前記G−カルテット形成領域(D)、前記ブロッキング領域(B)、および前記安定化領域(S)は、例えば、前記核酸分子(I)と同様である。
前記ブロッキング領域(B)は、前述のように、前記G−カルテット形成領域(D)と前記安定化領域(S)のそれぞれに対して、相補的な配列を有している。具体的には、前記ブロッキング領域(B)は、前記G−カルテット形成領域(D)の部分領域(Dp)に相補的であり、前記ブロッキング領域(B)の前記結合領域(A)側の末端領域(Ba)は、前記安定化領域(S)に対しても相補的である。
前記ブロッキング領域(B)において、前記安定化領域(S)と相補的な末端領域(Ba)の長さは、特に制限されず、下限は、例えば、1塩基長であり、上限は、例えば、15塩基長であり、好ましくは10塩基長であり、より好ましくは3塩基長であり、その範囲は、例えば、1〜10塩基長であり、好ましくは1〜5塩基長であり、より好ましくは1〜3塩基長である。
前記核酸分子(II)の全長の長さは、特に制限されず、下限は、例えば、25塩基長であり、好ましくは35塩基長であり、より好ましくは40塩基長であり、上限は、例えば、200塩基長であり、好ましくは120塩基長であり、より好ましくは80塩基長であり、その範囲は、例えば、25〜200塩基長であり、好ましくは35〜120塩基長であり、より好ましくは40〜80塩基長である。
(3)核酸分子(III)
前記核酸分子(III)は、前記G−カルテット形成領域(D)、ステム形成領域(SD)、前記結合領域(A)およびステム形成領域(SA)を有し、前記ステム形成領域(SD)は、前記G−カルテット形成領域(D)に対して相補的な配列を有し、前記ステム形成領域(SA)は、前記結合領域(A)に対して相補的な配列を有する一本鎖核酸分子である。
前記核酸分子(III)は、前記G−カルテット形成領域(D)、ステム形成領域(SD)、前記結合領域(A)およびステム形成領域(SA)を有し、前記ステム形成領域(SD)は、前記G−カルテット形成領域(D)に対して相補的な配列を有し、前記ステム形成領域(SA)は、前記結合領域(A)に対して相補的な配列を有する一本鎖核酸分子である。
前記核酸分子(III)において、前記G−カルテット形成領域(D)は、例えば、前記一本鎖型である。
前記核酸分子(III)は、例えば、以下のようなメカニズムに基づいて、ターゲットの存否により、前記G−カルテット形成領域(D)のG−カルテット形成が、ON−OFFに制御される。なお、本発明は、このメカニズムには制限されない。前記核酸分子(III)は、ターゲット非存在下では、前記分子内で、前記G−カルテット形成領域(D)と前記ステム形成領域(SD)とがアニーリングすることで、前記G−カルテット形成領域(D)のG−カルテット構造の形成が阻害され、結果として、前記G−カルテット形成領域(D)とポルフィリンとの複合体形成が阻害される(スイッチ−OFF)。また、前記分子内で、前記結合領域(A)と前記ステム形成領域(SA)とがアニーリングすることで、前記結合領域(A)の構造も固定されている。この状態の前記分子の構造を、不活性型ともいう。他方、前記核酸分子(III)は、ターゲット存在下では、前記結合領域(A)への前記ターゲットの接触によって、前記結合領域(A)と前記ステム形成領域(SA)とのアニーリングが解除され、前記結合領域(A)の立体構造が、より安定な構造に変化する。これに伴い、前記G−カルテット形成領域(D)と前記ステム形成領域(SD)とのアニーリングが解除され、前記G−カルテット形成領域(D)の領域内でG−カルテット構造が形成され、結果として、前記G−カルテット形成領域(D)とポルフィリンとの複合体が形成され、蛍光を発する(スイッチ−ON)。この状態の前記分子の構造を、活性型ともいう。このため、前記核酸分子(III)によれば、ターゲット非存在下では、前記複合体形成による蛍光が発生せず、ターゲット存在下でのみ、前記複合体形成による蛍光が発生するため、定性または定量等のターゲット分析が可能となる。
前記ステム形成領域(SD)は、例えば、その全部または一部が、前記G−カルテット形成領域(D)の一部に対して相補的な配列であることが好ましい。また、前記ステム形成領域(SA)は、例えば、その全部または一部が、前記結合領域(A)の一部に対して相補的な配列であることが好ましい。
前記核酸分子(III)において、前記各領域の順序は、前記分子内で、前記G−カルテット形成領域(D)と前記ステム形成領域(SD)とがアニーリングし、前記結合領域(A)と前記ステム形成領域(SA)とがアニーリングする順序であればよい。具体例としては、以下の順序が例示できる。
(1) 5’− A−SD−D−SA −3’
(2) 5’− SA−D−SD−A −3’
(3) 5’− D−SA−A−SD −3’
(4) 5’− SD−A−SA−D −3’
(1) 5’− A−SD−D−SA −3’
(2) 5’− SA−D−SD−A −3’
(3) 5’− D−SA−A−SD −3’
(4) 5’− SD−A−SA−D −3’
前記(1)−(4)の形態は、例えば、以下のように、G−カルテット構造の形成がON−OFFされる。ターゲット非存在下、前記結合核酸分子(A)と前記ステム形成領域(SA)、前記G−カルテット形成分子(D)と前記ステム形成領域(SD)が、それぞれステムを形成し、前記G−カルテット形成分子(D)のG−カルテット構造の形成を阻害する。そして、ターゲット存在下、前記結合核酸分子(A)へのターゲットの接触により、前記それぞれのステム形成が解除され、前記G−カルテット形成分子(D)において、G−カルテット構造が形成される。
前記(1)および(3)において、前記ステム形成領域(SD)は、前記G−カルテット形成分子(D)の3’側領域と相補的であり、前記ステム形成領域(SA)は、前記結合核酸分子(A)の3’側領域と相補的であることが好ましい。前記(2)および(4)において、前記ステム形成領域(SD)は、前記G−カルテット形成分子(D)の5’側領域と相補的であり、前記ステム形成領域(SA)は、前記結合核酸分子(A)の5’側領域と相補的であることが好ましい。
前記核酸分子(III)は、例えば、前記各領域間が、直接的または間接的に連結してもよい。前記直接的な連結は、例えば、一方の領域の3’末端と他方の領域の5’末端とが直接結合していることを意味し、前記間接的な連結は、例えば、一方の領域の3’末端と他方の領域の5’末端とが、前記介在リンカー領域を介して結合していることを意味する。前記介在リンカー領域は、例えば、核酸配列でもよいし、非核酸配列でもよく、好ましくは前者である。
前記核酸分子(III)は、例えば、前記介在リンカー領域として、互いに非相補的な2つの介在リンカー領域を有することが好ましい。前記2つの介在リンカー領域の位置は、特に制限されない。
具体例として、前記(1)−(4)が、さらに2つの介在リンカー領域を有する形態について、例えば、以下の順序が例示できる。以下の例示において、前記結合核酸分子(A)に連結する介在リンカー領域を(L1)、前記G−カルテット形成分子(D)に連結する介在リンカー領域を(L2)で示す。前記核酸分子(II)は、例えば、介在リンカー領域として、例えば、(L1)および(L2)の両方を有してもよいし、いずれか一方のみを有してもよい。
(1’) 5’− A−L1−SD−D−L2−SA −3’
(2’) 5’− SA−L2−D−SD−L1−A −3’
(3’) 5’− D−L2−SA−A−L1−SD −3’
(4’) 5’− SD−L1−A−SA−L2−D −3’
(1’) 5’− A−L1−SD−D−L2−SA −3’
(2’) 5’− SA−L2−D−SD−L1−A −3’
(3’) 5’− D−L2−SA−A−L1−SD −3’
(4’) 5’− SD−L1−A−SA−L2−D −3’
前記(1’)−(4’)の形態は、例えば、以下のように、G−カルテット構造の形成がON−OFFされる。ターゲット非存在下において、例えば、前記結合核酸分子(A)と前記ステム形成領域(SA)、前記G−カルテット形成分子(D)と前記ステム形成領域(SD)が、それぞれステムを形成し、これら2つのステムの間で、前記介在リンカー領域(L1)と前記介在リンカー領域(L2)が、内部ループを形成して、前記G−カルテット形成分子(D)のG−カルテット構造の形成を阻害する。そして、ターゲット存在下、前記結合核酸分子(A)へのターゲットの接触により、前記それぞれのステム形成が解除され、前記G−カルテット形成分子(D)において、G−カルテット構造が形成される。
前記(1’)−(4’)の形態を例として、ターゲット非存在下における前記核酸分子(III)の状態を、図3および図4の模式図に示す。図3および図4において、(A)と(B)とは、互いに、各領域の順序が、逆向きとなっている形態を示す。図3(A)が、形態(1’)、図3(B)が、形態(2’)、図4(A)が、形態(3’)、図4(B)が、形態(4’)である。
図3および図4において、Aは、前記結合核酸分子(A)、L1は、前記介在リンカー領域(L1)、SDは、前記ステム形成配列(SD)、Dは、前記G−カルテット形成分子(D)、L2は、前記介在リンカー領域(L2)、SAは、前記ステム形成配列(SA)を示す。図3および図4に示すように、ターゲット非存在下では、前記核酸分子(II)の自己アニーリングによって、二カ所にステムが形成され、前記ステムの間に内部ループが形成される。そして、ターゲット存在下では、前記結合核酸分子(A)にターゲットが結合することによって、前記2つのステム形成が解除され、前記G−カルテット形成分子(D)がG−カルテット構造を形成し、ポルフィリンとの複合体を形成することで、蛍光を発する。
前記核酸分子(III)において、前記ステム形成配列(SA)および前記ステム形成配列(SD)の長さは、特に制限されない。前記ステム形成配列(SA)の長さは、例えば、1〜60塩基長であり、好ましくは1〜10塩基長であり、より好ましくは1〜7塩基長である。前記ステム形成配列(SD)の長さは、例えば、1〜30塩基長であり、好ましくは0〜10塩基長、1〜10塩基長であり、より好ましくは、0〜7塩基長、1〜7塩基長である。前記ステム形成配列(SA)と前記ステム形成配列(SD)は、例えば、同じ長さでもよいし、前者が長くてもよいし、後者が長くてもよい。
前記介在リンカー領域(L1)および(L2)の長さは、特に制限されない。前記介在リンカー領域(L1)および(L2)の長さは、それぞれ、例えば、0〜30塩基長、好ましくは1〜30塩基長、より好ましくは1〜15塩基長、さらに好ましくは、1〜6塩基長である。また、前記介在リンカー領域(L1)および(L2)の長さは、例えば、同じでも、異なってもよい。前記介在リンカー領域(L1)および前記(L2)は、後者の場合、長さの差は、特に制限されず、例えば、1〜10塩基長、好ましくは1または2塩基長、より好ましくは1塩基長である。
前記核酸分子(III)の長さは、特に制限されない。前記核酸分子(II)の長さは、例えば、40〜120塩基長であり、好ましくは45〜100塩基長であり、より好ましくは、50〜80塩基長である。
前記一本鎖核酸分子(III)は、例えば、一方の末端または両端に、さらに前記付加リンカー領域が付加されてもよい。前記付加リンカー領域の長さは、特に制限されず、例えば、前述の通りである。
前記核酸分子(III)は、例えば、一方の末端が、前記付加リンカー領域を介して、基材に連結されてもよい。
(4)核酸分子(IV)
前記核酸分子(IV)は、前記G−カルテット形成領域(D)および前記結合領域(A)を有し、前記G−カルテット形成領域(D)が、第1領域(D1)と第2領域(D2)とを含み、前記第1領域(D1)と前記第2領域(D2)とによりG−カルテットを形成する領域であり、前記結合領域(A)の一方の末端側に前記第1領域(D1)を有し、前記結合領域(A)の他方の末端側に前記第2領域(D2)を有する一本鎖核酸分子である。
前記核酸分子(IV)は、前記G−カルテット形成領域(D)および前記結合領域(A)を有し、前記G−カルテット形成領域(D)が、第1領域(D1)と第2領域(D2)とを含み、前記第1領域(D1)と前記第2領域(D2)とによりG−カルテットを形成する領域であり、前記結合領域(A)の一方の末端側に前記第1領域(D1)を有し、前記結合領域(A)の他方の末端側に前記第2領域(D2)を有する一本鎖核酸分子である。
前記核酸分子(IV)において、前記G−カルテット形成領域(D)は、例えば、前記二本鎖型(以下、「スプリット型」ともいう)である。前記スプリット型のG−カルテット形成分子(D)は、前記第1領域(D1)と前記第2領域(D2)とを含み、両者が一対となりG−カルテット構造を形成する分子である。前記核酸分子(IV)において、前記第1領域(D1)および前記第2領域(D2)は、それぞれ、前記G−カルテット構造を形成する配列であればよく、より好ましくは、グアニン四重鎖構造を形成する配列である。
前記核酸分子(IV)は、例えば、以下のようなメカニズムに基づいて、ターゲットの存否により、前記G−カルテット形成領域(D)のG−カルテット形成が、ON−OFFに制御される。なお、本発明は、このメカニズムには制限されない。前記核酸分子(IV)は、前述のように、一対となってG−カルテット構造を形成する前記第1領域(D1)と前記第2領域(D2)とが、前記結合領域(A)を介して、それぞれ離れて配置されている。このように、前記第1領域(D1)と前記第2領域(D2)とが距離を置いて配置されているため、ターゲット非存在下では、前記第1領域(D1)と前記第2領域(D2)との間で、G−カルテット構造の形成が阻害され、結果として、前記G−カルテット形成分子(D)とポルフィリンとの複合体形成が阻害される(スイッチ−OFF)。この状態の前記分子の構造を、不活性型ともいう。他方、前記核酸分子(IV)は、ターゲット存在下では、前記結合領域(A)への前記ターゲットの接触によって、前記結合領域(A)の立体構造が、ステムループ構造を有するより安定な構造に変化する。この前記結合領域(A)の立体構造の変化に伴い、前記第1領域(D1)と前記第2領域(D2)とが接近し、前記第1領域(D1)と前記第2領域(D2)との間で、G−カルテット構造が形成され、結果として、前記G−カルテット形成領域(D)とポルフィリンとの複合体が形成され、蛍光を発する(スイッチ−ON)。この状態の前記分子の構造を、活性型ともいう。このため、前記核酸分子(IV)によれば、ターゲット非存在下では、前記複合体形成による蛍光が発生せず、ターゲット存在下でのみ、前記複合体形成による蛍光が発生するため、定性または定量等のターゲット分析が可能となる。
前記核酸分子(IV)は、前述のように、G−カルテット形成領域(D)として、二本鎖型を使用し、前記結合領域(A)を介して、前記第1領域(D1)と前記第2領域(D2)とを配置している。このため、例えば、アプタマーの種類ごとに条件設定を行う必要がなく、前記結合領域(A)として所望のアプタマーをセットできることから、汎用性に優れる。
前記核酸分子(IV)において、前記第1領域(D1)と前記第2領域(D2)は、前記結合領域(A)を介して配置されていればよく、いずれが前記結合領域(A)の5’側または3’側に配置されてもよい。以下、特に説明しない限り、便宜上、前記結合領域(A)の5’側に前記第1領域(D1)、前記結合領域(A)の3側に前記第2領域(D2)が配置されている例を示す。
前記核酸分子(IV)は、例えば、前記第1領域(D1)と前記結合領域(A)との間が、直接的または間接的に連結してもよいし、前記第2領域(D2)と前記結合領域(A)との間が、直接的または間接的に連結してもよい。前記直接的な連結は、例えば、一方の領域の3’末端と他方の領域の5’末端とが直接結合していることを意味し、前記間接的な連結は、例えば、一方の領域の3’末端と他方の領域の5’末端とが、前記介在リンカー領域を介して結合していることを意味し、具体的には、一方の領域の3’末端と前記介在リンカー領域の5’末端とが直接結合し、前記介在リンカー領域の3’末端と他方の領域の5’末端とが直接結合していることを意味する。前記介在リンカー領域は、例えば、核酸配列でもよいし、非核酸配列でもよく、好ましくは前者である。
前記核酸分子(IV)は、前述のように、前記第1領域(D1)と前記結合領域(A)との間に前記介在リンカー領域(第1リンカー領域(L1))を有し、前記第2領域(D2)と前記結合領域(A)との間に前記介在リンカー領域(第2リンカー領域(L2))を有することが好ましい。前記第1リンカー領域(L1)および前記第2リンカー領域(L2)は、いずれか一方でもよく、両方を有することが好ましい。前記第1リンカー領域(L1)と前記第2リンカー領域(L2)の両方を有する場合、それぞれの長さは、同じ長さでもよいし異なってもよい。
前記リンカー領域の長さは、特に制限されず、その下限は、例えば、1、3、5、7、9塩基長であり、その上限は、例えば、20、15、10塩基長である。
また、前記第1リンカー領域(L1)の5’末端側からの塩基配列と前記第2リンカー領域(L2)の3’末端側からの塩基配列とは、例えば、互いに非相補的であることが好ましい。この場合、前記第1リンカー領域(L1)の5’末端側からの塩基配列と前記第2リンカー領域(L2)の3’末端側からの塩基配列は、アライメントした状態で、前記核酸分子(IV)の分子内で内部ループを形成する領域ともいえる。このように、前記第1領域(D1)および前記第2領域(D2)と前記結合領域(A)との間に、非相補的な前記第1リンカー領域(L1)と前記第2リンカー領域(D2)を有することで、例えば、前記第1領域(D1)と前記第2領域(D2)との距離を十分に保つことができる。このため、例えば、ターゲット非存在下における、前記第1領域(D1)と前記第2領域(D2)とによるG−カルテット構造の形成を、十分に抑制し、ターゲット非存在下での、蛍光発生に基づくバックグラウンドを十分に低下することができる。
前記核酸分子(IV)として、前記第1リンカー領域(L1)と前記第2リンカー領域(L2)と有する形態について、図5の模式図を用いて、前記第1領域(D1)と前記第2領域(D2)とによる蛍光発生のON−OFFを説明する。なお、本発明は、これには制限されない。図5は、前記核酸分子(IV)における蛍光発生のON−OFFを示す概略図である。図5の左に示すように、ターゲット非存在下、前記核酸分子(IV)は、前記第1領域(D1)と前記第2領域(D2)との間でのG−カルテット構造の形成が抑制された不活性型となる。他方、ターゲット存在下では、前記結合領域(A)にターゲットが接触することで、前記結合領域(A)の立体構造が変化し、これに伴い、前記第1領域(D1)と前記第2領域(D2)とが接近して、両者の間でG−カルテット構造が形成された活性型となる。
前記核酸分子(IV)が、例えば、「D1−W−D2」で表され、リンカーとして、前記第1リンカー領域(L1)のみを有する場合、前記式におけるWは、例えば、5’側から、第1リンカー領域(L1)と前記結合領域(A)とをこの順序で有し、前記第2リンカー領域(L2)のみを有する場合、前記式におけるWは、例えば、5’側から、前記結合領域(A)と第2リンカー領域(L2)とをこの順序で有し、前記第1リンカー領域(L1)と前記第2リンカー領域(L2)の両方を有する場合、前記式におけるWは、例えば、5’側から、前記第1リンカー領域(L1)と前記結合領域(A)と前記第2リンカー領域(L2)とをこの順序で有する。この場合、D1−W−D2で表される核酸分子(IV)は、それぞれ、例えば、D1−L1−A−D2、D1−A−L2−D2またはD1−L1−A−L2−D2と表すことができる。
前記核酸分子(IV)は、例えば、前記第1領域(D1)と前記第2領域(D2)とが、それぞれ、前記結合領域(A)の位置とは反対側の末端に、互いに相補的な配列を有することが好ましい。具体的には、例えば、前記第1領域(D1)が前記結合領域(A)の5’側に配置されている場合、前記第1領域(D1)と前記第2領域(D2)とは、前記第1領域(D1)の5’末端と前記第2領域(D2)の3’末端に、互いに相補的な配列を有することが好ましい。また、例えば、前記第1領域(D1)が前記結合領域(A)の3’側に配置されている場合、前記第1領域(D1)と前記第2領域(D2)とは、前記第1領域(D1)の3’末端と前記第2領域(D2)の5’末端に、互いに相補的な配列を有することが好ましい。このように、前記第1領域(D1)と前記第2領域(D2)とが、それぞれの末端における前記相補的な配列を有することで、前記配列間で、分子内アニーリングによりステム構造の形成が可能となる。このため、例えば、ターゲット存在下、ターゲットの接触による前記結合領域(A)の立体構造の変化に伴い、前記第1領域(D1)と前記第2領域(D2)とが接近した際、前記配列間でのステム構造の形成によって、前記第1領域(D1)と前記第2領域(D2)とのG−カルテット構造の形成がより容易になる。
前記核酸分子(IV)は、例えば、前述のように、D1−W−D2で表すことができ、具体的には、下記式(I)で表すことができる。
前記式(I)中、
5’側の配列(N)n1-GGG-(N)n2-(N)n3-が、前記第1領域(D1)の配列(d1)であり、
3’側の配列-(N)m3-(N)m2-GGG-(N)m1が、前記第2領域(D2)の配列(d2)であり、
Wが、前記第1領域(D1)と前記第2領域(D2)との間の領域であって、前記結合領域(A)を含み、
Nは、塩基を示し、n1、n2およびn3ならびにm1、m2およびm3は、それぞれ塩基Nの繰り返し個数を示す。
5’側の配列(N)n1-GGG-(N)n2-(N)n3-が、前記第1領域(D1)の配列(d1)であり、
3’側の配列-(N)m3-(N)m2-GGG-(N)m1が、前記第2領域(D2)の配列(d2)であり、
Wが、前記第1領域(D1)と前記第2領域(D2)との間の領域であって、前記結合領域(A)を含み、
Nは、塩基を示し、n1、n2およびn3ならびにm1、m2およびm3は、それぞれ塩基Nの繰り返し個数を示す。
前記式(I)は、前記核酸分子(IV)において、前記第1領域(D1)と前記第2領域(D2)とを分子内アライメントした状態を示すが、これは、前記第1領域(D1)と前記第2領域(D2)との配列の関係を示すための模式図であって、本発明において、前記第1領域(D1)と前記第2領域(D2)とが、この状態を取ることを限定するものではない。
前記第1領域(D1)の配列(d1)および前記第2領域(D2)の配列(d2)は、例えば、(N)n1と(N)m1とが、下記条件(1)を満たし、(N)n2と(N)m2とが、下記条件(2)を満たし、(N)n3と(N)m3とが、下記条件(3)を満たすことが好ましい。
条件(1)
(N)n1および(N)m1は、(N)n1の5’末端側からの塩基配列と(N)m1の3’末端側からの塩基配列とが、互いに相補的であり、n1およびm1は、同じ0または正の整数である。
条件(2)
(N)n2および(N)m2は、(N)n2の5’末端側からの塩基配列と(N)m2の3’末端側からの塩基配列とが、互いに非相補的であり、n2およびm2は、それぞれ、正の整数であり、同じでも異なってもよい。
条件(3)
(N)n3および(N)m3は、n3およびm3が、それぞれ、3または4であり、同じでも異なってもよく、3つの塩基Gを有し、n3またはm3が4の場合、(N)n3および(N)m3は、2番目または3番目の塩基がG以外の塩基Hである。
(N)n1および(N)m1は、(N)n1の5’末端側からの塩基配列と(N)m1の3’末端側からの塩基配列とが、互いに相補的であり、n1およびm1は、同じ0または正の整数である。
条件(2)
(N)n2および(N)m2は、(N)n2の5’末端側からの塩基配列と(N)m2の3’末端側からの塩基配列とが、互いに非相補的であり、n2およびm2は、それぞれ、正の整数であり、同じでも異なってもよい。
条件(3)
(N)n3および(N)m3は、n3およびm3が、それぞれ、3または4であり、同じでも異なってもよく、3つの塩基Gを有し、n3またはm3が4の場合、(N)n3および(N)m3は、2番目または3番目の塩基がG以外の塩基Hである。
前記条件(1)は、前記第1領域(D1)と前記第2領域(D2)とをアライメントした場合の5’末端の(N)n1と3’末端の(N)m1との条件である。前記条件(1)において、前記(N)n1の5’末端側からの塩基配列と前記(N)m1の3’末端側からの塩基配列とは、互いに相補的であり、同じ長さである。(N)n1と(N)m1とは、同じ長さの相補的な配列であるため、アライメントした状態で、ステムを形成するステム領域ともいえる。
n1およびm1は、同じ0または正の整数であればよく、例えば、それぞれ、0、1〜10であり、好ましくは、1、2または3である。
前記条件(2)は、前記第1領域(D1)と前記第2領域(D2)とをアライメントした場合の(N)n2と(N)m2との条件である。前記条件(2)において、前記(N)n2の塩基配列と前記(N)m2の塩基配列とは、互いに非相補的であり、n2およびm2は、同じ長さでも異なる長さでもよい。 (N)n2と(N)m2とは、非相補的な配列であるため、アライメントした状態で、内部ループを形成する領域ともいえる。
n2およびm2は、正の整数であり、例えば、それぞれ、1〜10であり、好ましくは、1または2である。n2とm2とは、同じでも異なってもよく、例えば、n2=m2、n2>m2、n2<m2のいずれでもよく、好ましくはn2>m2、n2<m2である。
前記条件(3)は、前記第1領域(D1)と前記第2領域(D2)とをアライメントした場合の (N)n3と(N)m3との条件である。前記条件(3)において、前記(N)n3の塩基配列と前記(N)m3の塩基配列とは、それぞれ、3つの塩基Gを有する3塩基長または4塩基長の配列であり、同じでも異なってもよい。n3またはm3が4の場合、(N)n3および(N)m3は、2番目または3番目の塩基がG以外の塩基Hである。3つのGを有する(N)n3および(N)m3は、(N)n1と(N)n2との間のGGGおよび(N)m1と(N)m2との間のGGGとともに、G−カルテット構造を形成するG領域である。
n3およびm3は、例えば、n3=m3、n3>m3、n3<m3のいずれでもよく、好ましくはn3>m3、n3<m3である。
G以外の塩基である前記塩基Hは、例えば、A、C、TまたはUがあげられ、好ましくは、A、CまたはTである。
前記条件(3)は、具体例として、下記条件(3−1)、(3−2)または(3−3)があげられる。
条件(3−1)
(N)n3および(N)m3のうち、一方の5’側からの配列がGHGGであり、他方の5’側からの配列がGGGである。
条件(3−2)
(N)n3および(N)m3のうち、一方の5’側からの配列がGGHGであり、他方の5’側からの配列がGGGである。
条件(3−3)
(N)n3および(N)m3の両方の配列がGGGである。
条件(3−1)
(N)n3および(N)m3のうち、一方の5’側からの配列がGHGGであり、他方の5’側からの配列がGGGである。
条件(3−2)
(N)n3および(N)m3のうち、一方の5’側からの配列がGGHGであり、他方の5’側からの配列がGGGである。
条件(3−3)
(N)n3および(N)m3の両方の配列がGGGである。
前記第1領域(D1)の長さは、特に制限されず、下限は、例えば、7塩基長、好ましくは8塩基長、より好ましくは10塩基長であり、上限は、例えば、30塩基長、好ましくは20塩基長、より好ましくは10塩基長、その範囲は、例えば、7〜30塩基長、好ましくは7〜20塩基長、より好ましくは7〜10塩基長である。前記第2領域(D2)の長さは、特に制限されず、下限は、例えば、7塩基長、好ましくは8塩基長、より好ましくは10塩基長であり、上限は、例えば、30塩基長、好ましくは20塩基長、より好ましくは10塩基長、その範囲は、例えば、7〜30塩基長、好ましくは7〜20塩基長、より好ましくは7〜10塩基長である。前記第1領域(D1)と前記第2領域(D2)の長さは、それぞれ同じであっても異なってもよい。
前記核酸分子(IV)において、前記第1領域(D1)の配列(d1)と前記第2領域(D2)の配列(d2)との組み合わせを、以下に例示するが、本発明は、これらには制限されない。下記1〜49の組み合わせにおいて、Wは、前記核酸分子(IV)における前記配列(d1)および前記配列(d2)との間の領域を意味し、5’末端側および3’末端側の小文字領域は、それぞれ(N)n1および(N)m1を示し、5’側および3’側の下線部領域は、それぞれ(N)n2および(N)m2を示し、5’側および3’側の下線部領域とWとの間の領域が、それぞれ(N)n3および(N)m3を示す。
表1の組み合わせ1−24は、ステム領域となる(N)n1および(N)m1を、0−3塩基長に変化させ、内部ループ領域となる(N)n2および(N)m2を、ACの2塩基長とAの1塩基長、G領域となる(N)n3および(N)m3を、GGGの3塩基長とGTGGの4塩基長に設定した配列であり、Wは、制限されない。
表2の組み合わせ25−48は、ステム領域となる(N)n1および(N)m1を、Aの1塩基長とTの1塩基長、内部ループ領域となる(N)n2および(N)m2を、1または2塩基長に変化させ、G領域となる(N)n3および(N)m3を、GAGG、GGAG、GCGGおよびGTGGの4種類の4塩基長とGGGの3塩基長に設定した配列であり、Wは、制限されない。表2の組み合わせ49は、ステム領域となる(N)n1および(N)m1を、CAの2塩基長とTGの2塩基長、内部ループ領域となる(N)n2および(N)m2を、TおよびAの1塩基長、G領域となる(N)n3および(N)m3を、GAGGの4塩基長とGGGの3塩基長に設定した配列であり、Wは、制限されない。
ターゲット存在下、前記核酸分子(IV)における前記第1領域(D1)と前記第2領域(D2)との間で形成されるG−カルテット構造について、一例として、組み合わせ24(配列番号24)を図6に示す。図6は、組み合わせ24(配列番号24)の一本鎖核酸分子における、前記第1領域(D1)と前記第2領域(D2)との間で形成されるG−カルテット構造の概略である。図6に示すように、前記第1領域(D1)におけるGと前記第2領域(D2)におけるGとの間で、G−カルテットが3面重なったグアニン四重鎖が形成される。なお、本発明は、この例示に限定されない。
前記核酸分子(IV)の長さは、特に制限されない。前記核酸分子(IV)の長さは、下限が、例えば、25塩基長、好ましくは30塩基長、より好ましくは35塩基長であり、上限が、例えば、200塩基長、好ましくは100塩基長、より好ましくは80塩基長、その範囲が、例えば、25〜200塩基長、好ましくは30〜100塩基長、より好ましくは35〜80塩基長である。
前記核酸分子(IV)は、例えば、一方の末端または両端に、さらに前記付加リンカー領域が付加されてもよい。前記付加リンカー領域の長さは、特に制限されず、例えば、前述の通りである。
前記核酸分子(IV)は、例えば、一方の末端が、前記付加リンカー領域を介して、基材に連結されてもよい。
(5)核酸分子(V)
前記核酸分子(V)は、第1鎖(ss1)と第2鎖(ss2)とから構成される二本鎖核酸分子であり、前記第1鎖(ss1)は、前記G−カルテット形成領域(D)と前記結合領域(A)とをこの順序で有し、前記第2鎖(ss2)は、ステム形成領域(SD)およびステム形成領域(SA)をこの順序で有し、前記ステム形成領域(SD)は、前記G−カルテット形成領域(D)に対して相補的な配列を有し、前記ステム形成領域(SA)は、前記結合領域(A)に対して相補的な配列を有する二本鎖核酸分子である。
前記核酸分子(V)は、第1鎖(ss1)と第2鎖(ss2)とから構成される二本鎖核酸分子であり、前記第1鎖(ss1)は、前記G−カルテット形成領域(D)と前記結合領域(A)とをこの順序で有し、前記第2鎖(ss2)は、ステム形成領域(SD)およびステム形成領域(SA)をこの順序で有し、前記ステム形成領域(SD)は、前記G−カルテット形成領域(D)に対して相補的な配列を有し、前記ステム形成領域(SA)は、前記結合領域(A)に対して相補的な配列を有する二本鎖核酸分子である。
前記核酸分子(V)において、前記G−カルテット形成領域(D)は、例えば、前記一本鎖型である。
前記核酸分子(V)は、例えば、以下のようなメカニズムに基づいて、ターゲットの存否により、前記G−カルテット形成領域(D)のG−カルテット形成が、ON−OFFに制御される。なお、本発明は、このメカニズムには制限されない。前記核酸分子(V)は、ターゲット非存在下では、前記分子内で、前記第1鎖(ss1)の前記G−カルテット形成領域(D)と前記第2鎖(ss2)の前記ステム形成領域(SD)とがアニーリングすることで、前記G−カルテット形成領域(D)のG−カルテット構造の形成が阻害され、結果として、前記G−カルテット形成領域(D)とポルフィリンとの複合体形成が阻害される(スイッチ−OFF)。また、前記分子内で、前記第1鎖(ss1)の前記結合領域(A)と前記第2鎖(ss2)の前記ステム形成領域(SA)とがアニーリングすることで、前記結合領域(A)の構造も固定されている。この状態の前記分子の構造を、不活性型ともいう。他方、前記核酸分子(V)は、ターゲット存在下では、前記結合領域(A)への前記ターゲットの接触によって、前記結合領域(A)と前記ステム形成領域(SA)とのアニーリングが解除され、前記結合領域(A)の立体構造が、より安定な構造に変化する。これに伴い、前記G−カルテット形成領域(D)と前記ステム形成領域(SD)とのアニーリングが解除され、前記G−カルテット形成領域(D)の領域内でG−カルテット構造が形成され、結果として、前記G−カルテット形成領域(D)とポルフィリンとの複合体が形成され、蛍光を発する(スイッチ−ON)。この状態の前記分子の構造を、活性型ともいう。このため、前記核酸分子(V)によれば、ターゲット非存在下では、前記複合体形成による蛍光が発生せず、ターゲット存在下でのみ、前記複合体形成による蛍光が発生するため、定性または定量等のターゲット分析が可能となる。
前記ステム形成領域(SD)は、例えば、その全部または一部が、前記G−カルテット形成領域(D)の一部に対して相補的な配列であることが好ましい。また、前記ステム形成領域(SA)は、例えば、その全部または一部が、前記結合領域(A)の一部に対して相補的な配列であることが好ましい。
前記核酸分子(V)において、前記各領域の順序は、前記分子内で、前記G−カルテット形成領域(D)と前記ステム形成領域(SD)とがアニーリングし、前記結合領域(A)と前記ステム形成領域(SA)とがアニーリングする順序であればよい。具体例としては、以下の順序が例示できる。
(1) ss1 5’− A−D −3’
ss2 3’− SA−SD −5’
(2) ss1 5’− D−A −3’
ss2 3’− SD−SA −5’
(1) ss1 5’− A−D −3’
ss2 3’− SA−SD −5’
(2) ss1 5’− D−A −3’
ss2 3’− SD−SA −5’
前記(1)において、前記ステム形成領域(SA)は、前記結合核酸分子(A)の3’側領域と相補的であり、前記ステム形成領域(SD)は、前記G−カルテット形成分子(D)の5’側領域と相補的であることが好ましい。前記(2)において、前記ステム形成領域(SD)は、前記G−カルテット形成分子(D)の3’側領域と相補的であり、前記ステム形成領域(SA)は、前記結合核酸分子(A)の5’側領域と相補的であることが好ましい。
前記核酸分子(V)は、例えば、前記各領域間が、直接的または間接的に連結してもよい。前記直接的な連結は、例えば、一方の領域の3’末端と他方の領域の5’末端とが直接結合していることを意味し、前記間接的な連結は、例えば、一方の領域の3’末端と他方の領域の5’末端とが、前記介在リンカー領域を介して結合していることを意味する。前記介在リンカー領域は、例えば、核酸配列でもよいし、非核酸配列でもよく、好ましくは前者である。
前記核酸分子(V)は、例えば、前記第1鎖(ss1)における前記結合核酸分子(A)と前記G−カルテット形成分子(D)との間、および、前記第2鎖(ss2)における前記ステム形成領域(SD)と前記ステム形成領域(SA)との間に、前記介在リンカー領域を有することが好ましい。前記第1鎖(ss1)における介在リンカー領域(L1)と、前記第2鎖(ss2)における介在リンカー領域(L2)とは、互いに非相補的な配列であることが好ましい。
具体例として、前記(1)および(2)が、前記第1鎖(ss1)および前記第2鎖(ss2)に前記介在リンカー領域を有する形態について、例えば、以下の順序が例示できる。以下の例示において、前記結合核酸分子(A)と前記G−カルテット形成分子(D)とを連結する介在リンカー領域を(L1)、前記ステム形成領域(SD)と前記ステム形成領域(SA)とを連結する介在リンカー領域を(L2)で示す。前記核酸分子(V)は、例えば、介在リンカー領域として、例えば、(L1)および(L2)の両方を有してもよいし、いずれか一方のみを有してもよい。
(1’) ss1 5’− A−L1−D −3’
ss2 3’− SA−L2−SD −5’
(2’) ss1 5’− D−L1−A −3’
ss2 3’− SD−L2−SA −5’
(1’) ss1 5’− A−L1−D −3’
ss2 3’− SA−L2−SD −5’
(2’) ss1 5’− D−L1−A −3’
ss2 3’− SD−L2−SA −5’
前記(1’)および(2’)の形態は、例えば、以下のように、G−カルテット構造の形成がON−OFFされる。ターゲット非存在下において、例えば、前記結合核酸分子(A)と前記ステム形成領域(SA)、前記G−カルテット形成分子(D)と前記ステム形成領域(SD)が、それぞれステムを形成し、これら2つのステムの間で、前記介在リンカー領域(L1)と前記介在リンカー領域(L2)が、内部ループを形成して、前記G−カルテット形成分子(D)のG−カルテット構造の形成を阻害する。そして、ターゲット存在下、前記結合核酸分子(A)へのターゲットの接触により、前記それぞれのステム形成が解除され、前記G−カルテット形成分子(D)において、G−カルテット構造が形成される。
前記(1’)および(2’)の形態を例として、ターゲット非存在下における前記核酸分子(V)の状態を、図7の模式図に示す。図7において、(A)と(B)とは、互いに、各領域の順序が、逆向きとなっている形態を示す。図7(A)が、形態(1’)、図7(B)が、形態(2’)である。
図7において、Aは、前記結合核酸分子(A)、L1は、前記介在リンカー領域(L1)、SDは、前記ステム形成配列(SD)、Dは、前記G−カルテット形成分子(D)、L2は、前記介在リンカー領域(L2)、SAは、前記ステム形成配列(SA)を示す。図7に示すように、ターゲット非存在下では、前記核酸分子(IV)における前記第1鎖(ss1)と前記第2鎖(ss2)とのアニーリングによって、二カ所にステムが形成され、前記ステムの間に内部ループが形成される。そして、ターゲット存在下では、前記結合核酸分子(A)にターゲットが結合することによって、前記2つのステム形成が解除され、前記G−カルテット形成分子(D)がG−カルテット構造を形成し、ポルフィリンとの複合体を形成することで、蛍光を発する。
前記核酸分子(V)において、前記ステム形成配列(SA)および前記ステム形成配列(SD)の長さは、特に制限されない。前記ステム形成配列(SA)の長さは、例えば、1〜60塩基長であり、好ましくは1〜10塩基長であり、より好ましくは1〜7塩基長である。前記ステム形成配列(SD)の長さは、例えば、1〜30塩基長であり、好ましくは0〜10塩基長、1〜10塩基長であり、より好ましくは、0〜7塩基長、1〜7塩基長である。前記ステム形成配列(SA)と前記ステム形成配列(SD)は、例えば、同じ長さでもよいし、前者が長くてもよいし、後者が長くてもよい。
前記介在リンカー領域(L1)および(L2)の長さは、特に制限されない。前記介在リンカー領域(L1)および(L2)の長さは、それぞれ、例えば、0〜30塩基長、好ましくは1〜30塩基長、より好ましくは1〜15塩基長、さらに好ましくは、1〜6塩基長である。また、前記介在リンカー領域(L1)および(L2)の長さは、例えば、同じでも、異なってもよい。前記介在リンカー領域(L1)および前記(L2)は、後者の場合、長さの差は、特に制限されず、例えば、1〜10塩基長、好ましくは1または2塩基長、より好ましくは1塩基長である。
前記核酸分子(V)において、前記第1鎖(ss1)および前記第2鎖(ss2)の長さは、特に制限されない。前記第1鎖(ss1)の長さは、例えば、40〜200塩基長であり、好ましくは42〜100塩基長であり、より好ましくは、45〜60塩基長である。前記第2鎖(ss2)の長さは、例えば、4〜120塩基長であり、好ましくは5〜25塩基長であり、より好ましくは、10〜15塩基長である。
前記一本鎖核酸分子(V)は、例えば、前記第1鎖(ss1)および前記第2鎖(ss2)の前記一方の末端または両端に、さらに前記付加リンカー領域が付加されてもよい。前記付加リンカー領域の長さは、特に制限されず、例えば、前述の通りである。
前記核酸分子(V)は、例えば、前記第1鎖(ss1)または前記第2鎖(ss2)の一方の末端が、前記付加リンカー領域を介して、基材に連結されてもよい。
(6)核酸分子(VI)
本発明において、前記核酸分子は、例えば、下記核酸分子(VI)でもよい。前記核酸分子(VI)は、前記G−カルテット形成領域(D)および前記結合領域(A)をこの順序で有し、前記G−カルテット形成領域(D)と前記結合領域(A)とが、互いに相補的な配列を有する一本鎖核酸分子である。
本発明において、前記核酸分子は、例えば、下記核酸分子(VI)でもよい。前記核酸分子(VI)は、前記G−カルテット形成領域(D)および前記結合領域(A)をこの順序で有し、前記G−カルテット形成領域(D)と前記結合領域(A)とが、互いに相補的な配列を有する一本鎖核酸分子である。
前記核酸分子(VI)において、前記G−カルテット形成領域(D)は、例えば、前記一本鎖型である。
前記核酸分子(VI)は、例えば、以下のようなメカニズムに基づいて、ターゲットの存否により、前記G−カルテット形成領域(D)のG−カルテット形成が、ON−OFFに制御される。なお、本発明は、このメカニズムには制限されない。前記核酸分子(I)は、ターゲット非存在下では、前記分子内で、前記G−カルテット形成領域(D)と前記結合領域(A)とがアニーリングすることで、前記G−カルテット形成領域(D)のG−カルテット構造の形成が阻害され、結果として、前記G−カルテット形成領域(D)とポルフィリンとの複合体形成が阻害される(スイッチ−OFF)。この状態の前記分子の構造を、不活性型ともいう。他方、前記核酸分子(I)は、ターゲット存在下では、前記結合領域(A)への前記ターゲットの接触によって、前記結合領域(A)の立体構造が、より安定な構造に変化する。これに伴い、前記G−カルテット形成領域(D)と前記結合領域(A)との領域内アニーリングが解除され、前記G−カルテット形成領域(D)の領域内でG−カルテット構造が形成され、結果として、前記G−カルテット形成領域(D)とポルフィリンとの複合体が形成され、蛍光を発する(スイッチ−ON)。この状態の構造を、活性型ともいう。このため、本発明のセンサによれば、ターゲット非存在下では、前記複合体形成による蛍光が発生せず、ターゲット存在下でのみ、前記複合体形成による蛍光が発生するため、定性または定量等のターゲット分析が可能となる。
前記核酸分子(VI)において、前記G−カルテット形成領域(D)と前記結合領域(A)とは、前記G−カルテット形成領域(D)の5’側からの配列と、前記結合領域(A)の3’側からの配列とが、互いに相補的な配列を有することが好ましい。前記G−カルテット形成領域(D)における相補配列および前記結合領域(A)における相補配列は、それぞれステム形成領域(S)ということもでき、また、前者の前記G−カルテット形成領域(D)における相補配列は、前記結合領域(A)に対するステム形成領域(SA)、後者の前記結合領域(A)における相補配列は、前記結合領域(A)における相補配列は、前記G−カルテット形成領域(D)に対するステム形成領域(SD)ということもできる。前記G−カルテット形成領域(D)は、例えば、その一部が、前記相補配列、すなわち前記ステム形成領域(SA)であり、前記結合領域(A)は、例えば、その一部が、前記相補配列、すなわち前記ステム形成領域(SD)であることが好ましい。前記G−カルテット形成領域(D)における前記相補配列の位置、前記結合領域(A)における前記相補配列の位置は、それぞれ、特に制限されない。
前記核酸分子(VI)において、前記G−カルテット形成分子(D)と前記結合核酸分子(A)との間における各相補配列の長さは、特に制限されない。前記各相補配列の長さは、例えば、1〜30塩基長、好ましくは1〜10塩基長、より好ましくは1〜7塩基長である。
前記核酸分子(VI)は、例えば、前記G−カルテット形成領域(D)と前記結合領域(A)との間が、直接的または間接的に連結してもよい。前記直接的な連結は、例えば、一方の領域の3’末端と他方の領域の5’末端とが直接結合していることを意味し、前記間接的な連結は、例えば、一方の領域の3’末端と他方の領域の5’末端とが、リンカー領域を介して結合していることを意味する。
前記領域間を連結するリンカー領域を、以下、介在リンカー領域ともいう。前記介在リンカー領域は、例えば、核酸配列でもよいし、非核酸配列でもよく、好ましくは前者である。前記介在リンカー領域の長さは、特に制限されず、例えば、0〜20、1〜10塩基長、1〜6塩基長である。
前記核酸分子(VI)は、例えば、一方の末端が、前記付加リンカー領域を介して、基材に連結されてもよい。
前記核酸分子(VI)の長さは、特に制限されない。前記核酸分子(VI)の長さは、例えば、40〜120塩基長であり、好ましくは45〜100塩基長であり、より好ましくは、50〜80塩基長である。
本発明のセンサは、例えば、前記核酸分子を有する分子でもよいし、前記核酸からなる分子でもよい。
本発明のセンサは、ヌクレオチド残基を含む分子であり、例えば、ヌクレオチド残基のみからなる分子でもよいし、ヌクレオチド残基を含む分子でもよい。前記ヌクレオチドは、例えば、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドおよびそれらの誘導体である。具体的に、前記センサは、例えば、デオキシリボヌクレオチドおよび/またはその誘導体を含むDNAでもよいし、リボヌクレオチドおよび/またはその誘導体を含むRNAでもよいし、前者と後者とを含むキメラ(DNA/RNA)でもよい。前記センサは、好ましくは、DNAである。
前記ヌクレオチドは、塩基として、例えば、天然塩基(非人工塩基)および非天然塩基(人工塩基)のいずれを含んでもよい。前記天然塩基は、例えば、A、C、G、T、Uおよびこれらの修飾塩基があげられる。前記修飾は、例えば、メチル化、フルオロ化、アミノ化、チオ化等があげられる。前記非天然塩基は、例えば、2’−フルオロピリミジン、2’−O−メチルピリミジン等があげられ、具体例としては、2’−フルオロウラシル、2’−アミノウラシル、2’−O−メチルウラシル、2−チオウラシル等があげられる。前記ヌクレオチドは、例えば、修飾されたヌクレオチドでもよく、前記修飾ヌクレオチドは、例えば、2’−メチル化−ウラシルヌクレオチド残基、2’−メチル化−シトシンヌクレオチド残基、2’−フルオロ化−ウラシルヌクレオチド残基、2’−フルオロ化−シトシンヌクレオチド残基、2’−アミノ化−ウラシルヌクレオチド残基、2’−アミノ化−シトシンヌクレオチド残基、2’−チオ化−ウラシルヌクレオチド残基、2’−チオ化−シトシンヌクレオチド残基等があげられる。前記候補分子は、例えば、PNA(ペプチド核酸)、LNA(Locked Nucleic Acid)等の非ヌクレオチドを含んでもよい。
前記ポルフィリンは、特に制限されず、例えば、無置換体のポルフィリン、その誘導体があげられる。前記誘導体は、例えば、置換体のポルフィリンおよび金属元素と錯体を形成した金属ポルフィリン等があげられる。前記置換体のポルフィリンは、例えば、N−メチルメソポルフィリン(NMM)、TMPyP(5,10,15,20−テトラキス(N−メチルピリジニウム−4−イル)−21H,23H−ポルフィリン、テトラキス(p−トルエンスルホネート))等があげられる。前記金属ポルフィリンは、例えば、鉄ポルフィリン、亜鉛ポルフィリン等があげられ、具体例として、Zn−DIGP(テトラキス−(ジイソプロピル−グアニジノ)亜鉛フタロシアニン)、ZnPP9(Zinc(H)プロトポルフィリンD)等があげられる。前記ポルフィリンは、例えば、NMMが好ましい。
本発明のセンサは、例えば、前記核酸分子が遊離状態であってもよいし、前記核酸分子が固定化した状態であってもよい。後者のセンサは、例えば、前記核酸分子を前記基材に固定化し、デバイスとして使用できる。前記基材は、例えば、プレート、シート、フィルム、スワブ等の基板;ウェルプレート、チューブ等の容器;ビーズ、粒子、フィルター等があげられる。前記核酸分子は、例えば、5’末端および3’末端のいずれを固定化してもよい。
前記固定化方法は、特に制限されず、例えば、化学的結合による連結が例示できる。具体例としては、例えば、前記基材および前記核酸分子のいずれか一方に、ストレプトアビジンまたはアビジンを結合させ、他方に、ビオチンを結合させ、前者と後者との結合を利用して固定化する方法があげられる。
前記固定化方法は、例えば、この他に、公知の核酸固定化方法が採用できる。前記方法は、例えば、フォトリソグラフィーを利用する方法があげられ、具体例として、米国特許5,424,186号明細書等を参照できる。また、前記固定化方法は、例えば、前記基材上で前記核酸分子を合成する方法があげられる。この方法は、例えば、いわゆるスポット法があげられ、具体例として、米国特許5,807,522号明細書、特表平10−503841号公報等を参照できる。
前記核酸分子は、例えば、前記基材に、直接的に固定化してもよいし、間接的に固定化してもよい。前者の場合、例えば、前記核酸分子の末端において、前記核酸分子を前記基材に固定化することが好ましい。後者の場合、例えば、前記核酸分子を、固定化用のリンカーを介して、前記基材に固定化してもよい。前記リンカーは、例えば、核酸配列でもよいし、非核酸配列でもよく、前述の付加リンカー領域等があげられる。前記基材に前記核酸分子が固定化されている場合、前記核酸分子の配置部は、前記センサにおける被検出部ということもできる。
本発明のセンサは、例えば、複数の被検出部を備えてもよい。この場合、前記センサは、例えば、前記基材の表面をマトリックスに分画し、各分画領域に、前述のような被検出部を備えることが好ましい。本発明のセンサにおいて、1つの被検出部に配置するセンサの数は、特に制限されない。
本発明のセンサは、例えば、さらに、試薬を含む試薬部が配置されてもよい。前記試薬は、例えば、前記ポルフィリンを含む。前記試薬部は、例えば、前記基材に配置でき、前記基材における前記試薬部の配置部位は、例えば、前記核酸分子の配置部位と同じでもよいし、異なってもよい。後者の場合、例えば、試料の添加によって、前記試薬部の前記試薬が、前記センサに接触できればよい。
本発明のセンサの使用方法は、特に制限されず、以下のように、本発明のターゲットの分析方法に使用できる。
2.ターゲット分析方法
本発明のターゲット分析方法は、前述のように、前記本発明のターゲット分析用蛍光センサに試料を接触させる接触工程、および、ポルフィリン存在下、前記センサにおける前記G−カルテット形成領域(D)とポルフィリンとの複合体による蛍光を検出することによって、前記試料中のターゲットを検出する検出工程を含むことを特徴とする。
本発明のターゲット分析方法は、前述のように、前記本発明のターゲット分析用蛍光センサに試料を接触させる接触工程、および、ポルフィリン存在下、前記センサにおける前記G−カルテット形成領域(D)とポルフィリンとの複合体による蛍光を検出することによって、前記試料中のターゲットを検出する検出工程を含むことを特徴とする。
前記試料は、特に制限されない。前記試料は、例えば、ターゲットを含む試料、およびターゲットを含有するか否かが不明な試料のいずれでもよい。前記試料は、例えば、液体試料が好ましい。被検体が、例えば、液体の場合、前記被検体をそのまま試料として使用してもよいし、溶媒に混合した希釈液を試料として使用してもよい。被検体が、例えば、固体、粉末等の場合は、溶媒に混合した混合液、または、溶媒に懸濁した懸濁液等を、試料として使用してもよい。前記溶媒は、特に制限されず、例えば、水、緩衝液等があげられる。前記被検体は、例えば、生体、土壌、海水、川水、下水、飲食品、浄水、空気中等から採取した検体があげられる。
また、前記試料の具体例として、例えば、原乳、加工乳および粉ミルクがあげられる。前記試料中の非タンパク質または非脂質をターゲットとする場合、本発明のセンサによれば、例えば、前記試料からタンパク質および脂質を除去する前処理を行うことなく、前記試料中のターゲットを分析することができる。
本発明のセンサとして、遊離状態の前記核酸分子を使用する場合、例えば、前記容器内で、前記センサと前記試料とを接触させることが好ましい。また、本発明のセンサとして、前記基材に固定化した前記核酸分子を使用する場合、例えば、前記基材上の前記センサに、前記試料を接触させることができる。
前記検出工程は、例えば、ポルフィリン存在下、前記センサからの蛍光の検出を行う工程である。前記蛍光の検出は、例えば、目視でもよいし、蛍光強度の検出でもよい。
蛍光強度の検出において、励起波長は、例えば、350〜550nm、好ましくは350〜450nm、より好ましくは399nmであり、発光波長は、例えば、550〜700nm、好ましくは550〜650nm、より好ましくは605nmである。
本発明の分析方法において、前記ポルフィリンは、例えば、前記接触工程で、前記センサと共存させてもよいし、次の検出工程で、前記センサと共存させてもよい。前者の場合、例えば、前記センサに前記試料を接触させる前に、前記センサにポルフィリンを供給してもよいし、前記試料の接触と同時に、前記センサにポルフィリンを供給してもよい。この場合、ポルフィリンは、例えば、前述のように、前記センサの試薬部に予め配置してもよい。他方、後者の場合、前記センサに前記試料を接触させた後、前記センサにポルフィリンを供給してもよい。
ポルフィリンを前記センサに供給する場合、前記ポルフィリンの形態は、特に制限されず、例えば、液体に混合した試薬液として、前記センサに供給することが好ましい。前記ポルフィリンを混合する液体は、例えば、Tris−HCl等の緩衝液が好ましい。前記試薬液における前記ポルフィリンの濃度は、特に制限されず、例えば、50〜500mmol/Lであり、好ましくは100〜300mmol/Lである。また、前記試薬液のpHは、例えば、6〜9であり、好ましくは6.8〜9である。
前記接触工程の時間は、特に制限されず、例えば、1〜30分である。前記接触工程および前記検出工程において、前記センサと前記試料とポルフィリンとが接触してから、蛍光を検出するまでの処理時間は、例えば、1〜30分である。前記接触工程および前記検出工程の温度条件は、特に制限されず、例えば、15〜37℃である。
本発明の分析方法において、前記接触工程と前記検出工程との間に、さらに、洗浄工程を有してもよい。前記洗浄工程は、例えば、前記センサと前記試料とを接触させた後、前記センサを洗浄液で洗浄する工程である。前記洗浄工程によって、例えば、前記試料中に含まれる夾雑物を除去でき、さらに精度に優れる分析が可能となる。前記洗浄液は、特に制限されず、例えば、水、緩衝液等の水性溶媒があげられる。前記センサは、例えば、前記洗浄工程が容易に行えることから、前述のような基材に前記核酸分子が固定化されていることが好ましい。
本発明は、前述のように、G−カルテット形成領域(D)がG−カルテット構造を形成して、ポルフィリンとの複合体を形成することによって発生する蛍光を検出するため、前記センサ自体の発光の検出ともいえる。このため、本発明は、例えば、従来のセンサのように、DNAzyme等の触媒分子の触媒活性を測定するための、触媒反応用基質等は不要である。前記触媒反応用基質とは、例えば、触媒反応によって、発色、蛍光等を生じる、もしくは、それらが消失する基質等である。
3.分析用キット
本発明の分析用キットは、前述のように、センサと試薬とを含み、前記センサが、前記本発明のターゲット分析用蛍光センサであり、前記試薬が、ポルフィリンを含むことを特徴とする。本発明の分析用キットは、前記センサとポルフィリンとを含むことが特徴であり、その他の構成は何ら制限されない。
本発明の分析用キットは、前述のように、センサと試薬とを含み、前記センサが、前記本発明のターゲット分析用蛍光センサであり、前記試薬が、ポルフィリンを含むことを特徴とする。本発明の分析用キットは、前記センサとポルフィリンとを含むことが特徴であり、その他の構成は何ら制限されない。
本発明の分析用キットは、前記センサおよびポルフィリンの他に、例えば、前記緩衝液および前記基材等の構成成分を含んでもよい。
本発明の分析用キットにおいて、例えば、前記センサと前記試薬とは、例えば、それぞれ別個に収容されてもよい。また、本発明の分析用キットが、前述のように、さらに他の構成要件を含む場合、これらの構成要件は、例えば、前記センサと別個に収容されてもよい。前記センサは、例えば、前記核酸分子が前記基材に固定化されてもよいし、前記核酸分子が固定化されていなくてもよい。前記分析用キットは、例えば、さらに、使用説明書を含んでもよい。
以下、実施例等により、本発明を詳しく説明するが、本発明は、これらに限定されるものではない。
(実施例1)
結合核酸分子(A)としてメラミンアプタマー、G−カルテット形成分子(D)として一本鎖型DNAzymeとを用いて、メラミン分析用蛍光センサを作製した。
結合核酸分子(A)としてメラミンアプタマー、G−カルテット形成分子(D)として一本鎖型DNAzymeとを用いて、メラミン分析用蛍光センサを作製した。
前記核酸分子(I)に該当するメラミン分析用蛍光センサを作製した。前記蛍光センサの配列を以下に示す。下記配列において、5’側の下線部が、DNAzymeであり、3’側の下線部が、メラミンアプタマーである。そして、四角で囲んだ領域が、互いに相補的な配列であり、メラミン非存在下で、これらがステムを形成することで、前記蛍光センサはブロック型となる。
(実施例2)
前記実施例1のメラミン分析用蛍光センサを用いて、牛乳中のメラミンの検出を行った。
前記実施例1のメラミン分析用蛍光センサを用いて、牛乳中のメラミンの検出を行った。
緩衝液A:50mmol/L Tris−HCl(pH7.4)、
20mmol/L KClおよび
0.05%(w/v) TritonX−100
緩衝液B:50mmol/L Tris−HCl(pH7.4)、
20mmol/L KCl、
0.05%(w/v) TritonX−100および
50mmol/L EDTA
20mmol/L KClおよび
0.05%(w/v) TritonX−100
緩衝液B:50mmol/L Tris−HCl(pH7.4)、
20mmol/L KCl、
0.05%(w/v) TritonX−100および
50mmol/L EDTA
前記蛍光センサを前記緩衝液Bに懸濁したセンサ試薬、NMMを前記緩衝液Bに懸濁したNMM試薬を、それぞれ調製した。市販牛乳(生乳100%、商品名明治おいしい牛乳、株式会社明治)を100%サンプルとし、前記市販牛乳を前記実施例1の前記緩衝液Aで希釈したものを希釈サンプルとして使用した。
まず、1.5mLのチューブに前記センサ試薬を入れ、95℃で5分間処理した後、室温で15分間インキュベートした。つぎに、前記チューブに、前記NMM試薬と前記サンプル25μLとを添加して、室温で30分間インキュベートした。前記反応液50μLにおいて、前記センサの最終濃度は、400nmol/Lとし、NMMの最終濃度は、200nmol/Lとし、前記牛乳の最終濃度は、0(牛乳未添加)、10、20、30、40および50%とした。そして、この反応液を、プレート(商品名Greiner 384 Flat Bottom Black Polystyrol、Greiner社製)のウェルに分注し、蛍光強度を測定した。蛍光強度の測定は、測定装置(商品名TECAN infinite M1000 PRO、TECAN社)を使用し、励起波長は399nmとし、発光波長は550〜690nmとした。
これらの結果を図8に示す。図8は、発光波長域における蛍光強度を示すグラフであり、(A)が、センサ添加反応液の蛍光強度の結果であり、(B)が、センサ未添加反応液の蛍光強度の結果である。各グラフにおいて、縦軸は、蛍光強度、横軸は、発光波長を示す。図8(A)に示すように、センサ添加反応液では、図8(B)のセンサ未添加反応液よりも、605nmにおいて大きなピークが確認できた。この結果から、発光波長605nmが最も高いS/N比を示すこと、牛乳において、前記センサとNMMとの複合体による蛍光を検出できることが確認できた。
(実施例3)
前記実施例1のメラミン分析用蛍光センサを用いて、牛乳中のメラミンの検出を行った。
前記実施例1のメラミン分析用蛍光センサを用いて、牛乳中のメラミンの検出を行った。
市販牛乳(生乳100%、商品名明治おいしい牛乳、株式会社明治)を、メラミン未添加100%サンプルとし、前記市販牛乳を前記実施例1の前記緩衝液Aで希釈したものを、メラミン未添加希釈サンプルとして使用した。さらに、前記メラミン未添加100%サンプルおよび前記メラミン未添加希釈サンプルに、メラミンを添加して、メラミン添加サンプルを調製した。サンプルとして、前記メラミン未添加サンプルと前記メラミン添加サンプルを使用し、測定条件を、励起波長399nm、発光波長605nmとした以外は、前記実施例2と同様にして、センサ添加反応液とセンサ未添加反応液とについて、蛍光強度を測定した。なお、前記反応液において、前記牛乳の最終濃度は、0、10、20、30、40および50%とし、添加メラミンの最終濃度は、0、1、2、3、5mmol/Lとした。
これらの結果を図9に示す。図9は、蛍光強度を示すグラフであり、(A)が、センサ添加反応液の蛍光強度の結果であり、(B)が、センサ未添加反応液の蛍光強度の結果である。各グラフにおいて、縦軸は、蛍光強度を示す。各グラフにおいて、横軸は、サンプルの種類を示し、左から、前記反応液における牛乳の最終濃度0、10、20、30、40、50%のサンプルセットであり、各セットの5本のバーは、左から前記反応液におけるメラミンの最終濃度が0、1、2、3、5mmol/Lである。図9(B)に示すように、センサ未添加反応液は、牛乳濃度を統一した各サンプルセットにおいて、メラミン濃度にかかわらず、蛍光強度は一定であった。これに対して、図9(A)に示すように、センサ添加反応液は、各サンプルセットにおいて、メラミン濃度の増加に伴って、蛍光強度が増加した。これらの結果から、実施例の蛍光センサによれば、サンプル中のメラミンを濃度依存的に検出できることがわかった。
また、図9(A)において、各サンプルセットのメラミン0mmol/Lのサンプルは、図9(B)におけるセンサ未添加反応液の蛍光強度と同程度であった。このことから、センサ使用時バックグラウンドは低く、例えば、センサ未添加反応液の蛍光強度を、センサ添加反応液の蛍光強度から引くことで、標準化することもできることがわかった。
そこで、図9(A)のセンサ添加反応液の蛍光強度から、図9(B)のセンサ未添加反応液の蛍光強度を差し引いた結果を、図10に示す。
図10は、蛍光強度を示すグラフであり、センサ添加反応液の蛍光強度からセンサ未添加反応液の蛍光強度を差し引いた値であり、横軸は、前記反応液における牛乳の最終濃度であり、各プロットは、前記反応液におけるメラミンの最終濃度を示す。図10に示すように、牛乳終濃度が10−50%の反応液のいずれにおいても、メラミンの存在によって、蛍光強度が顕著に増加した。この結果から、サンプルの牛乳濃度にかかわらず、メラミンを検出できることがわかった。
一般的に、市場では、500ppm(4mmol/L)以上のメラミンを検出できることが求められている。図11において、添加メラミン濃度が4mmol/Lである牛乳100%をサンプルとして使用した反応液(メラミン終濃度2mmol/L、牛乳終濃度50%)について、十分な蛍光強度が得られていることから、市場で求められている精度を十分に実現していることがわかった。
以上、実施形態を参照して本願発明を説明したが、本願発明は上記実施形態に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解し得る様々な変更をすることができる。
本発明のターゲット分析用蛍光センサによれば、簡便且つ効率的に、蛍光の発生により間接的にターゲットを分析できる。このため、本発明は、例えば、臨床医療、食品、環境等の様々な分野における研究および検査に、極めて有用な技術といえる。
Claims (12)
- G−カルテット構造を形成するG−カルテット形成領域(D)とターゲットに結合するアプタマー領域(A)とを有する下記(I)の核酸分子を含み、
ターゲット非存在下、前記G−カルテット形成領域(D)のG−カルテット形成が阻害され、
ターゲット存在下、前記アプタマー領域(A)への前記ターゲットの接触により、前記G−カルテット形成領域(D)においてG−カルテット構造が形成され、前記G−カルテット形成領域(D)がN−メチルメソポルフィリンと複合体を形成することにより、前記複合体が蛍光を生じることを特徴とするターゲット分析用蛍光センサ。
(I)前記G−カルテット形成領域(D)、ブロッキング領域(B)、および前記アプタマー領域(A)をこの順序で有し、
前記ブロッキング領域(B)が、前記G−カルテット形成領域(D)における部分領域(Dp)に対して相補的であり、
前記アプタマー領域(A)における前記ブロッキング領域(B)側の末端領域(Ab)が、前記G−カルテット形成領域(D)における前記部分領域(Dp)の隣接領域(Df)に相補的であり、且つ、前記アプタマー領域(A)における前記ブロッキング領域(B)側とは反対側の末端領域(Af)に相補的である一本鎖核酸分子。 - 前記(I)の一本鎖核酸分子において、
前記G−カルテット形成領域(D)、前記ブロッキング領域(B)、および前記アプタマー領域(A)を、5’側からこの順序で有している、請求項1記載の蛍光センサ。 - 前記G−カルテット形成領域(D)と前記アプタマー領域(A)との間に、リンカー配列を有する、請求項1または2記載の蛍光センサ。
- さらに、基材を有し、
前記基材に、前記核酸分子が配置されている、請求項1から3のいずれか一項に記載の蛍光センサ。 - 前記核酸分子が、リンカー領域を介して前記基材に連結されている、請求項4記載の蛍光センサ。
- 前記基材に、さらに、試薬を含む試薬部が配置されており、
前記試薬が、N−メチルメソポルフィリンを含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の蛍光センサ。 - センサと試薬とを含み、
前記センサが、請求項1から6のいずれか一項に記載のターゲット分析用蛍光センサであり、
前記試薬が、N−メチルメソポルフィリンを含むことを特徴とするターゲット分析用キット。 - 前記センサが、前記核酸分子が基材に配置されたセンサであり、
前記基材に、さらに、前記試薬を含む試薬部が配置されている、請求項7記載のターゲット分析用キット。 - 請求項1から6のいずれか一項に記載のターゲット分析用蛍光センサに試料を接触させる接触工程、および、
ポルフィリン存在下、前記センサにおける前記G−カルテット形成領域(D)とN−メチルメソポルフィリンとの複合体による蛍光を検出することによって、前記試料中のターゲットを検出する検出工程を含むことを特徴とする、ターゲットの分析方法。 - 前記検出工程における蛍光の検出が、蛍光強度の測定である、請求項9記載の分析方法。
- 前記試料が、原乳、加工乳および粉ミルクからなる群から選択された少なくとも一つである、請求項9または10記載の分析方法。
- 前記ターゲットが、メラミンである、請求項9から11のいずれか一項に記載の分析方法。
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Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011016565A1 (ja) * | 2009-08-07 | 2011-02-10 | Necソフト株式会社 | 分析用核酸素子、それを用いた分析方法、分析用試薬および分析用具 |
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Patent Citations (1)
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---|---|---|---|---|
WO2011016565A1 (ja) * | 2009-08-07 | 2011-02-10 | Necソフト株式会社 | 分析用核酸素子、それを用いた分析方法、分析用試薬および分析用具 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
JPN6013046320; Anal. Chem., (2012), 84, [11], p.4789-4797 * |
JPN7013003457; 日本分子生物学学会年会プログラム・要旨集(Web), (2012), 35th, p.3P-0757 * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2015012060A1 (ja) * | 2013-07-23 | 2015-01-29 | Necソリューションイノベータ株式会社 | ターゲット分析用センサ、ターゲット分析用デバイス、および、これを用いたターゲットの分析方法 |
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CN111693518B (zh) * | 2019-03-14 | 2022-08-05 | 重庆工商大学 | 一种汞离子的检测方法 |
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